CN114317797B - 用于地黄属植物鉴定的dna条形码序列组合及鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于地黄属植物鉴定的DNA条形码序列组合及鉴定方法，该DNA条形码序列组合由R255序列和ITS序列拼接构成；R255序列的核苷酸序列记为SEQ ID No1，ITS序列的核苷酸序列记为SEQ ID No2。本发明用于地黄属植物鉴定的DNA条形码序列组合，具有引物通用性好和高度的变异性，可以提供丰富的特异位点，且PCR扩增反应时对模板的要求很低，易于操作，在药用植物DNA条形码鉴定中具有较大的优势。
Description
技术领域
本发明属于植物品种鉴定方法技术领域，具体涉及用于地黄属植物鉴定的DNA条形码序列组合及鉴定方法。
背景技术
地黄属隶属列当科，为多年生草本植物，包含有地黄、茄叶地黄、裂叶地黄、天目地黄、湖北地黄、高地黄等，仅有1种地黄分布在朝鲜和日本，其余种类均为中国特有种。地黄是最常用的、最重要的中药材之一，用于血虚萎黄，心悸怔忡，月经不调，崩漏下血，肝肾阴虚，腰膝酸软，骨蒸潮热，盗汗遗精，内热消渴，眩晕，耳鸣，须发早白等症。明代医药学家李时珍所著的《本草纲目》对地黄的药用价值进行详细描述。研究表明地黄含有环烯醚萜类、紫罗兰酮类、苯乙醇苷类、三萜类、黄酮类、糖类、地黄苷、二氢梓醇苷、桃叶珊瑚苷、麦角甾苷、5-羟甲基糠醛、酪醇、梓醇、梓醇苷、多种氨基酸等。其具有广泛的药理作用，如降血糖、抗高血压、抗骨质疏松、抗肿瘤、抗过敏、保护心血管系统、抗炎止血、提高人们的免疫力。
生物多样性的重要组成部分是物种多样性，对物种精准的鉴定及其物种数目的准确统计是保护物种多样性和可持续发展的前提和基础，地黄属中地黄是现在学术领域研究最多的中药之一，同时在医疗和养生方面也是应用最广泛的中药之一。但该属植物分布范围广，外观形态变化较大，传统分类主要依赖于形态学标准，这需要专门的知识和主观判断。如何快速有效分辨是该属那个物种，区分真伪药材，仍面临较大困难。因此急需新的、标准化的、高效的物种鉴定手段，将地黄属的各个物种区分开来。
目前，针对地黄的鉴定都还局限于形态结构的区别，如果待检测样品是缺损的叶子或根茎的一小部分，这需要专门的技术人员凭经验给出定论。日渐兴起的分子生物学给物种鉴定带来了新方法，一种是基于聚合酶链式反应分子标记技术，如RAPD技术等，但是目前为止以此技术做出的分子标记全都是鉴定地黄这个种，而没有鉴定地黄属其它物种。另外一种分子标记就是DNA条形码，目前研究最多的是基于叶绿体基因和核基因ITS序列的组合DNA条形码。公开发表文章的有psbA-trnH+ITS的DNA条形码和trnS-trnG+ITS的DNA条形码。但只说psbA-trnH+ITS的DNA条形码可区分地黄这个物种，并没说是否可作为鉴定整个地黄属各个物种。trnS-trnG+ITS的DNA条形码可作为鉴定地黄属各个物种的标准条形码序列，但是叶绿体基因trnS-trnG片段插入缺失比例较高，种内变异较大，序列比对时可能出现一定的错误率，使用的局限性较大。
发明内容
本发明的目的是提供用于地黄属植物鉴定的DNA条形码序列组合，采用组合条形码序列R255+ITS对地黄属进行精准鉴定。
本发明的另一目的是提供DNA条形码序列组合鉴定地黄属植物的方法。
本发明所采用的技术方案是，用于地黄属植物鉴定的DNA条形码序列组合，该DNA条形码序列组合由R255序列和ITS序列拼接构成；R255序列的核苷酸序列记为SEQ ID No1，ITS序列的核苷酸序列记为SEQ ID No2。
本发明所采用的另一技术方案是，DNA条形码序列组合鉴定地黄属植物的方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1，提取待测样品DNA；采用DNA提取试剂盒进行样品DNA的提取；或者采用CTAB法提取样品DNA；
步骤2，使用ITS序列的引物以及R255序列的引物分别进行PCR扩增反应，分别得到待测样品R255序列的扩增产物和待测样品ITS序列的扩增产物；
步骤3，将扩增产物分别做凝胶电泳，将有明亮单一条带的样品进行双向测序，分别得到待测样品R255序列和待测样品ITS区序列。
步骤4，将待测样品R255双向测序的两条序列导入软件拼接成一条序列，得到的待测样品R255的序列，将待测样品ITS双向测序两条序列导入软件拼接成一条序列，得到的待测样品ITS的序列；
步骤5，将待测样品R255序列和记为SEQ ID No1的R255核苷酸序列比对切齐，待测样品ITS序列和记为SEQ ID No2的ITS核苷酸序列比对切齐。
步骤6，将得到的比对好的R255序列和ITS区序列依次导入软件拼接在一起形成组合条形码序列R255+ITS。
步骤7，将组合条形码序列R255+ITS，再导入软件构建系统发育树，待测样品和某个种聚在一起，则说明待测样品是该物种。
本发明的特点还在于，步骤2中，核基因R255的PCR扩增条件：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，57℃退火45秒，72℃延伸l分钟，35个循环，72℃延伸6分钟，4℃保温。核基因ITS的PCR扩增条件：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸l分钟，35个循环，72℃延伸5分钟，4℃保温。
本发明的有益效果是，本发明用于地黄属植物鉴定的DNA条形码序列组合，具有引物通用性好和高度的变异性，可以提供丰富的特异位点，且PCR扩增反应时对模板的要求很低，易于操作，在药用植物DNA条形码鉴定中具有较大的优势。
附图说明
图1是实施例中基于距离法构建的地黄属植物系统发育树；
图2是本发明的标准DNA基因条形码构建的系统发育树。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
ITS序列位于核糖体DNA的基因转录间隔区，引物通用性好，序列数量多，具有高度的变异性，可以提供丰富的特异位点；R255序列是具有双亲遗传背景的单拷贝核基因，可直接区分直系同源和旁系同源，R255基因片段长度适中，且提供的遗传信息较多。
针对以上两点情况，本发明提供的用于地黄属植物鉴定的DNA条形码序列组合及鉴定方法，其采用组合条形码序列R255+ITS对地黄及地黄属物种进行精准鉴定，通过聚类分析，能够更加准确的鉴别地黄及地黄属植物，为地黄属中药材的物种识别提供分子生物学证据。
如图2所示，标准DNA基因条形码构建的系统发育树，包括RpBK裂叶地黄(湖北保康)；RpZS裂叶地黄(湖北竹山)；RpHL裂叶地黄(陕西后柳)；RhYC湖北地黄(湖北宜昌)；RsCK茄叶地黄(重庆城口)；RcLS天目地黄(浙江丽水)；RcTX天目地黄(安徽棠溪)；RcAH天目地黄(安徽绩溪)；RgTA地黄(山东泰安)；RgAK地黄(四川隘口)；RgCZ地黄(山西长治)；RgCC地黄(甘肃崇信)；Tr崖白菜(外类群)。
实例中未注明的具体技术或条件，按照本领域内的文献所描述的技术条件，或者按照产品说明书进行，本实例所使用的试剂或仪器未注明生产厂商者均可通过购买获得，试剂均为分析纯。
待测样品的数量没有限制，仅用10个待测样品示例。此实施例也是一个验证例，故已知样品物种名称，而真正的物种鉴定是不知样品的物种名称，全凭构建系统发育树，进行聚类分析，待测样品和哪个种聚在一起，就是该物种。
实施例：地黄属样品R255序列和ITS序列的获得
1、待测样品的DNA提取：随机从不同产地收集地黄属样品，如表1所示。
表1实验样品采集信息
(2)采用CTAB法对表1的待测样品进行DNA提取，如下：
1)取200mg干燥的待测样品置于2ml的离心管里，加入维生素C、PVP和2个小钢珠，以每秒28赫兹的频率在研磨器上研磨3min。
2)将1000ul预处理提取液(STE)加入离心管中，颠倒2分钟，使混合均匀，静置10min后放于离心机中，以8000转/min的速度常温下离心10min，将上清液倒掉，将该步骤重复一次。
3)向混合液倒入800ul 65℃预热的CTAB，颠倒使其混和均匀，65℃水浴锅中温浴45min，为使其混和均匀每隔15min上下颠倒离心管混合样品。向混合液中倒入600ul氯仿-异戊醇(24:1)，缓慢颠倒10min，之后以8000转/min的速度常温下离心10min，用微量移液器将上清液转移到2.0ml的离心管中，将该步骤重复一次。
4)用微量移液器将上清液转移至1.5ml的离心管中，先将800ul4℃保存的无水乙醇加入管中，然后再加入2-3滴NaCl溶液。将离心管放在-20℃冰箱中60min后，以每分钟2000转的速度4℃下离心10min，倒掉废液，得到沉淀。
5)向离心管中重复加入500ul 70％的乙醇两次，充分洗涤沉淀。将离心管放置于室温4-6h，风干沉淀。向离心管中加入200ul TE溶液，在室温中放置5分钟后，以每分钟12000转的速度常温下离心2分钟，使其充分混匀，-20℃保存，得到待测样品DNA。
2、PCR扩增
(1)对表1中的样品所得的待测样品DNA分别进行R255序列和ITS序列扩增反应。R255序列有两对引物，一对为正向引物F1和反向引物R1，具体为：F1：GACAGAAACGAACCAGGAGG R1：GGGACACGTAGGCTTCAAGAT，另一对为正向引物F2和反向引物R2，具体为：F2:ATCCCTGAGCGATTTCCT R2：TCTACTGATGTGAGCCGTTAT，使用R255序列引物F和引物R对待测DNA样品分别进行R255序列进行扩增反应，得到待测样品R255扩增产物。ITS区序列的正向引物F和反向引物R，具体为：F：TCCTCCGCTTATTGATATGC R:GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG使用ITS序列引物对待测样品DNA进行ITS序列进行扩增反应，得到待测样品ITS扩增产物。
(2)PCR反应体系：PCR扩增的反应体系总体积为20μL，1μL的20-30ng/uL模板DNA，正反向引物各0.3μL(1μmol/L)，10μL的2×Taq PCR MasterMix(包含0.3U Taq DNA聚合酶，1mmol/L的dNTP，40mmol/L的Tris-HCl(pH 8.3)，6mmol/L的MgCl2)，8.4μL双蒸水(ddH2O)。
(3)PCR扩增反应过程依次为：核基因R255的PCR扩增条件：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，57℃退火45秒，72℃延伸l分钟，35个循环，72℃延伸6分钟，4℃保温。核基因ITS的PCR扩增条件：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸l分钟，35个循环，72℃延伸5分钟，4℃保温。
PCR扩增反应后，做凝胶电泳，以1％浓度的琼脂糖凝胶检测DNA的纯度及浓度，有明亮单一条带的进行测序。测序的引物与上述PCR引物一致。为确保DNA条形码序列的可靠性，需要进行正反测序，然后将正反测序结果导入BioEdit软件。看峰图界面的峰形，如果不好需要重新测序。如果好继续拼接，一般要去除开头或结尾的套峰杂峰，分别进行拼接获得待测样品R255序列和ITS序列。
将待测样品R255序列和记为SEQ ID No1的R255核苷酸序列分别导入BioEdit软件，待测样品R255序列的头尾要和记为SEQ ID No1的R255核苷酸序列比对切齐；将待测样品ITS序列和记为SEQ ID No2的ITS核苷酸序列分别导入BioEdit软件，待测样品ITS序列的头尾要和记为SEQ ID No2的ITS核苷酸序列比对切齐，将比对切齐的R255序列和ITS序列分别导入TaxonDNA软件进行序列拼接，得到R255+ITS序列。将R255+ITS序列导入MEGA软件，用NJ法构建系统发育树，待测样品和某个种聚在一起，则是该物种。
将得到的系统发育树的物种名改成中文名，如图1所示，样品1、样品2、样品3和天目地黄聚在一起，说明样品1、样品2、样品3是天目地黄；样品4、样品5、样品6、样品7和地黄聚在一起，说明样品4、样品5、样品6、样品7是地黄，样品8、样品9、样品10和裂叶地黄聚在一起，说明样品8、样品9、样品10是裂叶地黄。
<110> 西北大学
<120> 用于地黄属植物鉴定的DNA条形码序列组合及鉴定方法
<130> 无
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 216
<212> SEQ ID No1
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
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RcAH3. tggaacaagt tcagaagttt atgggaattg gaatgcrcct gaggcagttacagctgctgc cgtaatttac tgtttgcgct gtttggtgga
RcAH5. tggaacaagt tcagaagttt atgggaattg gaatgcgcct gaggcagttacagctgctgc cgtaatttac tgtttgcgct gtttggtgga
RcLS4. tggaacaagt ccagaagttt atgggaattg gaatgcgcct gaggcagttacagctgctgc cgtaatttac tgtttgcgct gtttggtgga
RcLS5. tggaacaagt ccagaagttt atgggaattg gaatgcgcct gaggcagttacagctgctgc cgtaatttac tgtttgcgct gtttggtgga
RcTX4. tggaacaagt ccagaagttt atgggaattg gaatgcgcct gaggcagttacagctgctgc cgtaatttac tgtttgcgct gtttggtgga
RgAK2. tggaacaagc ccagaagttt atgggaattg gaatgcgcct gaggcagttacagctgctgc cgtaatttac tgtttgcgct gtttggtgga
RgAK3. tggaacaagc ccagaagttt atgggaattg gaatgcgcct gaggcagttacagctgctgc cgtaatttac tgtttgcgct gtttggtgga
RgCC4. tggaacaagc ccagaagttt atgggaattg gaatgcgcct gaggcagttacagctgctgc cgtaatttac tgtttgcgct gtttggtgga
RgCZ5. tggaacaagc ccagaagttt atgggaattg gaatgcgcct gaggcagttacagctgctgc cgtaatttac tgtttgcgct gtttggtgga
RgTA1. tggaacaagc ccagaagttt atgggaattg gaatgcgcct gaggcagttacagctgctgc cgtaatttac tgtttgcgct gtttggtgga
RhYC1. tggaacaagt ccagaagttt atgggaattg gaatgcgcct gaggcagttacagctgctgc cgtaatttac tgtttgcgct gtttggtgga
RhYC2. tggaacaagt ccagaagttt atgggaattg gaatgcgcct gaggcagttacagctgctgc cgtaatttac tgtttgcgct gtttggtgga
RhYC3. tggaacaagt ccagaagttt atgggaattg gaatgcgcct gaggcagttacagctgctgc cgtaatttac tgtttgcgct gtttggtgga
RhYC4. tggaacaagt ccagaagttt atgggaattg gaatgcgcct gaggcagttacagctgctgc cgtaatttac tgtttgcgct gtttggtgga
RhYC5. tggaacaagt ccagaagttt atgggaattg gaatgcgcct gaggcagttacagctgctgc cgtaatttac tgtttgcgct gtttggtgga
RpBK3. tggaacaagt ccagaagttt atgggaattg gaatgcgcct gaggcagttacagctgctgc cgtaatttac tgtttgcgct gtttggtgga
RpBK5. tggaacaagt ccagaagttt atgggaattg gaatgcgcct gaggcagttacagctgctgc cgtaatttac tgtttgcgct gtttggtgga
RpHL4. tggaacaagt ccagaagttt atgggaattg gaatgcgcct gaggcagttacagctgctgc cgtaatttac tgtttgcgct gtttggtgga
RpHL5. tggaacaagt ccagaagttt atgggaattg gaatgcgcct gaggcagttacagctgctgc cgtaatttac tgtttgcgct gtttggtgga
RpZS3. tggaacaagt ccagaagttt atgggaattg gaatgcgcct gaggcagttacagctgctgc cgtaatttac tgtttgcgct gtttggtgga
RsCK1. tggaacaagc ccagaagttt atgggaattg gaatgcgcct gaggcagttacagctgctgc cgtaatttac tgtttgcgct gtttggtgga
RsCK2. tggaacaagc ccagaagttt atgggaattg gaatgcgcct gaggcagttacagctgctgc cgtaatttac tgtttgcgct gtttggtgga
RsCK3. tggaacaagc ccagaagttt atgggaattg gaatgcgcct gaggcagttacagctgctgc cgtaatttac tgtttgcgct gtttggtgga
RsCK4. tggaacaagc ccagaagttt atgggaattg gaatgcgcct gaggcagttacagctgctgc cgtaatttac tgtttgcgct gtttggtgga
RsCK5. tggaacaagc ccagaagttt atgggaattg gaatgcgcct gaggcagttacagctgctgc cgtaatttac tgtttgcgct gtttggtgga
Tr.tggaacaagc gcagaagttt atgggaattg gaattcacca gaggcagtta cagctgctgctgtaatttac tgtctgcgct gtttggtgga
<212> SEQ ID No2
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
RcAH3. tggggtcgcg gtcgtaagcg cgaatggctc gcacaattgg gtctgtgacgatgcccgagc agacgacgtc gtccggcacg acagcacgcg agttgagtgt
RcAH5. tggggtcgcg gtcgtaagcg cgaatggctc gcacaattgg gtctgtgacgatgcccgagc agacgacgtc gtccggcacg acagcacgcg agttgagtgt
RcLS4. tggggtcgcg gtcgtaagtg cgaatggctc gcacaattgg gtctgtgacgatgcccgagc agacgacgtc gtccggcacg acagcacgcg agttgagtgt
RcLS5. tggggtcgcg gtcgtaagtg cgaatggctc gcacaattgg gtctgtgacgatgcccgagc agacgacgtc gtccggcacg acagcacgcg agttgagtgt
RcTX4. tggggtcgcg gtcgtaagcg cgaatggctc gcacaattgg gtctgtgacgatgcccgagc agacgacgtc gtccggcacg acagcacgcg agttgagtgt
RgAK2. tggggtcgcg gtcgtaagcg cgaatgactc gcaccattgg gtctgtgacgatgcccgaga agacgacgtc gtccggcacg acagcacgcg agttgagtgt
RgAK3. tggggtcgcg gtcgtaagcg cgaatgactc gcaccattgg gtctgtgacgatgcccgaga agacgacgtc gtccggcacg acagcacgcg agttgagtgt
RgCC4. tggggtcgcg gtcgtaagcg cgaatgactc gcaccattgg gtctgtgacgatgcccgaga agacgacgtc gtccggcacg acagcacgcg agttgagtgt
RgCZ5. tggggtcgcg gtcgtaagcg cgaatgactc gcaccattgg gtctgtgacgatgcccgaga agacgacgtc gtccggcacg acagcacgcg agttgagtgt
RgTA1. tggggtcgcg gtcgtaagcg cgaatgactc gcaccattgg gtctgtgacgatgcccgaga agacgacgtc gtccggcacg acagcacgcg agttgagtgt
RhYC1. tggggtcgcg gtcgtaagcg cgaatgtctc gcacaattgg gtctgtgacgatgcccgagc agacgacgtc gtccggcacg acagcacgcg agttgagtgt
RhYC2. tggggtcgcg gtcgtaagcg cgaatgtctc gcacaattgg gtctgtgacgatgcccgagc agacgacgtc gtccggcacg acagcacgcg agttgagtgt
RhYC3. tggggtcgcg gtcgtaagcg cgaatgtctc gcacaattgg gtctgtgacgatgcccgagc agacgacgtc gtccggcacg acagcacgcg agttgagtgt
RhYC4. tggggtcgcg gtcgtaagcg cgaatgtctc gcacaattgg gtctgtgacgatgcccgagc agacgacgtc gtccggcacg acagcacgcg agttgagtgt
RhYC5. tggggtcgcg gtcgtaagcg cgaatgtctc gcacaattgg gtctgtgacgatgcccgagc agacgacgtc gtccggcacg acagcacgcg agttgagtgt
RpBK3. tggggtcgcg gtcgtaagcg cgaatgactc gcaccattgg gtctgtgacgatgcccgagc agacgacgtc gtccggcacg acagcacgcg agttgagtgt
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RsCK1. tggggtcgcg gtcgtaagcg cgaatgactc gcaccattgg gtctgtgacgatgcccgaga agacgacgtc gtccggcacg acagcacgcg agttgagtgt
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RsCK3. tggggtcgcg gtcgtaagcg cgaatgactc gcaccattgg gtctgtgacgatgcccgaga agacgacgtc gtccggcacg acagcacgcg agttgagtgt
RsCK4. tggggtcgcg gtcgtaagcg cgaatgactc gcaccattgg gtctgtgacgatgcccgaga agacgacgtc gtccggcacg acagcacgcg agttgagtgt
RsCK5. tggggtcgcg gtcgtaagcg cgaatgactc gcaccattgg gtctgtgacgatgcccgaga agacgacgtc gtccggcacg acagcacgcg agttgagtgt
Tr.ggtaggaagc gcaattggct cacgccattg ggtctttaac gatggacgag cggacgacgtcgcccggcac gacagcacgc gagttgagtt tgcttcaacc
RcAH3. tcaaccacca ctggtcgtga cgtgcgccgc cgcgggatcg catttgggccagccgcgcaa caccgcgcac gggaggccat tatccgcccc cacccaacga
RcAH5. tcaaccacca ctggtcgtga cgtgcgccgc cgcgggatcg catttgggccagccgcgcaa caccgcgcac gggaggccat tatccgcccc cacccaacga
RcLS4. tcaaccacca ctggtcgtga cgtgcgccgc cgcgggatcg catttgggccagccgcgcaa caccgcgcac gggaggccat tatccgcccc ccacccaacg
RcLS5. tcaaccacca ctggtcgtga cgtgcgccgc cgcgggatcg catttgggccagccgcgcaa caccgcgcac gggaggccat tatccgcccc ccacccaacg
RcTX4. tcaaccacca ctggtcgtga cgtgcgccgc cgcgggatcg catttgggccagccgcgcaa caccgcgcac gggaggccat tatccgcccc cacccaacga
RgAK2. tcaaccacca ctggtcgtga cgtgcgccgc cgcgggatcg catttgggccagccgcgcaa cactgcgcac gggaggccat tatccgcccc cacccaacga
RgAK3. tcaaccacca ctggtcgtga cgtgcgccgc cgcgggatcg catttgggccagccgcgcaa cactgcgcac gggaggccat tatccgcccc cacccaacga
RgCC4. tcaaccacca ctggtcgtga cgtgcgccgc cgcgggatcg catttgggccagccgcgcaa cactgcgcac gggaggccat tatccgcccc cacccaacga
RgCZ5. tcaaccacca ctggtcgtga cgtgcgccgc cgcgggatcg catttgggccagccgcgcaa cactgcgcac gggaggccat tatccgcccc cacccaacga
RgTA1. tcaaccacca ctggtcgtga cgtgcgccgc cgcgggatcg catttgggccagccgcgcaa cactgcgcac gggaggccat tatccgcccc cacccaacga
RhYC1. tcaaccacca ctggtcgtga cgtgcgccgc cgcgggatcg catttgggccagccgcgcaa caccgcgcac gggaggccat tatccgcccc cacccaacga
RhYC2. tcaaccacca ctggtcgtga cgtgcgccgc cgcgggatcg catttgggccagccgcgcaa caccgcgcac gggaggccat tatccgcccc cacccaacga
RhYC3. tcaaccacca ctggtcgtga cgtgcgccgc cgcgggatcg catttgggccagccgcgcaa caccgcgcac gggaggccat tatccgcccc cacccaacga
RhYC4. tcaaccacca ctggtcgtga cgtgcgccgc cgcgggatcg catttgggccagccgcgcaa caccgcgcac gggaggccat tatccgcccc cacccaacga
RhYC5. tcaaccacca ctggtcgtga cgtgcgccgc cgcgggatcg catttgggccagccgcgcaa caccgcgcac gggaggccat tatccgcccc cacccaacga
RpBK3. tcaaccacca ctggtcgtga cgtgcgccgc cgcgggatcg catttgggccagccgcgcaa cgctgtgcac gggaggccat tatccgcccc cacccaacga
RpBK5. tcaaccacca ctggtcgtga cgtgcgccgc cgcgggatcg catttgggccagccgcgcaa cgctgtgcac gggaggccat tatccgcccc cacccaacga
RpHL4. tcaaccacca ctggtcgtga cgtgcgccgc cgcgggatcg catttgggccagccgcgcaa cgctgtgcac gggaggccat tatccgcccc cacccaacga
RpHL5. tcaaccacca ctggtcgtga cgtgcgccgc cgcgggatcg catttgggccagccgcgcaa cgctgtgcac gggaggccat tatccgcccc cacccaacga
RpZS3. tcaaccacca ctggtcgtga cgtgcgccgc cgcgggatcg catttgggccagccgcgcaa cgctgtgcac gggaggccat tatccgcccc cacccaacga
RsCK1. tcaaccacca ctggtcgtga cgtgcgccgc cgcgggatcg catttgggccagccgcgcaa cactgcgcac gggaggccat tatccgcccc cacccaacga
RsCK2. tcaaccacca ctggtcgtga cgtgcgccgc cgcgggatcg catttgggccagccgcgcaa cactgcgcac gggaggccat tatccgcccc cacccaacga
RsCK3. tcaaccacca ctggtcgtga cgtgcgccgc cgcgggatcg catttgggccagccgcgcaa cactgcgcac gggaggccat tatccgcccc cacccaacga
RsCK4. tcaaccacca ctggtcgtga cgtgcgccgc cgcgggatcg catttgggccagccgcgcaa cactgcgcac gggaggccat tatccgcccc cacccaacga
RsCK5. tcaaccacca ctggtcgtga cgtgcgccgc cgcgggatcg catttgggccagccgcgcaa cactgcgcac gggaggccat tatccgcccc cacccaacga
Tr.accactggtc gtgacgcgcg tcgccgcagg atcgcatttg ggccggccat gcgtccctgcgcacgggggg ccattatccg cccccacacg acgatcgcct
RcAH3. tcgccacata gggacgaggg tgggggcgac gcgatgcgtg acgcccaggcagacgtgccc tcggcctaaa ggcttcgggc gcaacttgcg ttcaaagact
RcAH5. tcgccacata gggacgaggg tgggggcgac gcgatgcgtg acgcccaggcagacgtgccc tcggcctaaa ggcttcgggc gcaacttgcg ttcaaagact
RcLS4. atcgccacat agggacgagg gtgggggcga cgcgatgcgt gacgcccaggcagacgtgcc ctcggcctaa aggcttcggg cgcaacttgc gttcaaagac
RcLS5. atcgccacat agggacgagg gtgggggcga cgcgatgcgt gacgcccaggcagacgtgcc ctcggcctaa aggcttcggg cgcaacttgc gttcaaagac
RcTX4. tcgccacata gggacgaggg tgggggcgac gcgatgcgtg acgcccaggcagacgtgccc tcggcctaaa ggcttcgggc gcaacttgcg ttcaaagact
RgAK2. tcgccacata gggacgaggg gagggggcga cgcgatgcgt gacgcccaggcagacgtgcc ctcggcctaa aggcttcggg cgcaacttgc gttcaaagac
RgAK3. tcgccacata gggacgaggg gagggggcga cgcgatgcgt gacgcccaggcagacgtgcc ctcggcctaa aggcttcggg cgcaacttgc gttcaaagac
RgCC4. tcgccacata gggacgaggg gagggggcga cgcgatgcgt gacgcccaggcagacgtgcc ctcggcctaa aggcttcggg cgcaacttgc gttcaaagac
RgCZ5. tcgccacata gggacgaggg gagggggcga cgcgatgcgt gacgcccaggcagacgtgcc ctcggcctaa aggcttcggg cgcaacttgc gttcaaagac
RgTA1. tcgccacata gggacgaggg gagggggcga cgcgatgcgt gacgcccaggcagacgtgcc ctcggcctaa aggcttcggg cgcaacttgc gttcaaagac
RhYC1. tcgccacata gggacgaggg tgggggcgac gcgatgcgtg acgcccaggcagacgtgccc tcggcctaaa ggcttcgggc gcaacttgcg ttcaaagact
RhYC2. tcgccacata gggacgaggg tgggggcgac gcgatgcgtg acgcccaggcagacgtgccc tcggcctaaa ggcttcgggc gcaacttgcg ttcaaagact
RhYC3. tcgccacata gggacgaggg tgggggcgac gcgatgcgtg acgcccaggcagacgtgccc tcggcctaaa ggcttcgggc gcaacttgcg ttcaaagact
RhYC4. tcgccacata gggacgaggg tgggggcgac gcgatgcgtg acgcccaggcagacgtgccc tcggcctaaa ggcttcgggc gcaacttgcg ttcaaagact
RhYC5. tcgccacata gggacgaggg tgggggcgac gcgatgcgtg acgcccaggcagacgtgccc tcggcctaaa ggcttcgggc gcaacttgcg ttcaaagact
RpBK3. tcgccgcata gggacgagag tgggggcgac gcgatgcgtg acgcccaggcagacgtgccc tcggcctaaa ggcttcgggc gcaacttgcg ttcaaagact
RpBK5. tcgccgcata gggacgagag tgggggcgac gcgatgcgtg acgcccaggcagacgtgccc tcggcctaaa ggcttcgggc gcaacttgcg ttcaaagact
RpHL4. tcgccgcata gggacgagag tgggggcgac gcgatgcgtg acgcccaggcagacgtgccc tcggcctaaa ggcttcgggc gcaacttgcg ttcaaagact
RpHL5. tcgccgcata gggacgagag tgggggcgac gcgatgcgtg acgcccaggcagacgtgccc tcggcctaaa ggcttcgggc gcaacttgcg ttcaaagact
RpZS3. tcgccgcata gggacgagag tgggggcgac gcgatgcgtg acgcccaggcagacgtgccc tcggcctaaa ggcttcgggc gcaacttgcg ttcaaagact
RsCK1. tcgccacata gggacgaggg gagggggcga cgcgatgcgt gacgcccaggcagacgtgcc ctcggcctaa aggcttcggg cgcaacttgc gttcaaagac
RsCK2. tcgccacata gggacgaggg gagggggcga cgcgatgcgt gacgcccaggcagacgtgcc ctcggcctaa aggcttcggg cgcaacttgc gttcaaagac
RsCK3. tcgccacata gggacgaggg gagggggcga cgcgatgcgt gacgcccaggcagacgtgcc ctcggcctaa aggcttcggg cgcaacttgc gttcaaagac
RsCK4. tcgccacata gggacgaggg gggggggcga cgcgatgcgt gacgcccaggcagacgtgcc ctcggcctaa aggcttcggg cgcaacttgc gttcaaagac
RsCK5. tcgccacata gggacgaggg gagggggcga cgcgatgcgt gacgcccaggcagacgtgcc ctcggcctaa aggcttcggg cgcaacttgc gttcaaagac
Tr.tggtagggcg agagtggggg cgacgctatg tgtgacgccc aggcagacgt gccctcggcctaaaggcttc gggcgcaact tgcgttcaaa gactcgatgg
RcAH3. cgatggttca cgggattctg caattcacac caagtatcgc atttcgctacgttcttcatc gatgcgagag ccgagatatc cgttgccgag agtcgttttg
RcAH5. cgatggttca cgggattctg caattcacac caagtatcgc atttcgctacgttcttcatc gatgcgagag ccgagatatc cgttgccgag agtcgttttg
RcLS4. tcgatggttc acgggattct gcaattcaca ccaagtatcg catttcgctacgttcttcat cgatgcgaga gccgagatat ccgttgccga gagtcgtttt
RcLS5. tcgatggttc acgggattct gcaattcaca ccaagtatcg catttcgctacgttcttcat cgatgcgaga gccgagatat ccgttgccga gagtcgtttt
RcTX4. cgatggttca cgggattctg caattcacac caagtatcgc atttcgctacgttcttcatc gatgcgagag ccgagatatc cgttgccgag agtcgttttg
RgAK2. tcgatggttc acgggattct gcaattcaca ccaagtatcg catttcgctacgttcttcat cgatgcgaga gccgagatat ccgttgccga gagtcgtttt
RgAK3. tcgatggttc acgggattct gcaattcaca ccaagtatcg catttcgctacgttcttcat cgatgcgaga gccgagatat ccgttgccga gagtcgtttt
RgCC4. tcgatggttc acgggattct gcaattcaca ccaagtatcg catttcgctacgttcttcat cgatgcgaga gccgagatat ccgttgccga gagtcgtttt
RgCZ5. tcgatggttc acgggattct gcaattcaca ccaagtatcg catttcgctacgttcttcat cgatgcgaga gccgagatat ccgttgccga gagtcgtttt
RgTA1. tcgatggttc acgggattct gcaattcaca ccaagtatcg catttcgctacgttcttcat cgatgcgaga gccgagatat ccgttgccga gagtcgtttt
RhYC1. cgatggttca cgggattctg caattcacac caagtatcgc atttcgctacgttcttcatc gatgcgagag ccgagatatc cgttgccgag agtcgttttg
RhYC2. cgatggttca cgggattctg caattcacac caagtatcgc atttcgctacgttcttcatc gatgcgagag ccgagatatc cgttgccgag agtcgttttg
RhYC3. cgatggttca cgggattctg caattcacac caagtatcgc atttcgctacgttcttcatc gatgcgagag ccgagatatc cgttgccgag agtcgttttg
RhYC4. cgatggttca cgggattctg caattcacac caagtatcgc atttcgctacgttcttcatc gatgcgagag ccgagatatc cgttgccgag agtcgttttg
RhYC5. cgatggttca cgggattctg caattcacac caagtatcgc atttcgctacgttcttcatc gatgcgagag ccgagatatc cgttgccgag agtcgttttg
RpBK3. cgatggttca cgggattctg caattcacac caagtatcgc atttcgctacgttcttcatc gatgcgagag ccgagatatc cgttgccgag agtcgttttg
RpBK5. cgatggttca cgggattctg caattcacac caagtatcgc atttcgctacgttcttcatc gatgcgagag ccgagatatc cgttgccgag agtcgttttg
RpHL4. cgatggttca cgggattctg caattcacac caagtatcgc atttcgctacgttcttcatc gatgcgagag ccgagatatc cgttgccgag agtcgttttg
RpHL5. cgatggttca cgggattctg caattcacac caagtatcgc atttcgctacgttcttcatc gatgcgagag ccgagatatc cgttgccgag agtcgttttg
RpZS3. cgatggttca cgggattctg caattcacac caagtatcgc atttcgctacgttcttcatc gatgcgagag ccgagatatc cgttgccgag agtcgttttg
RsCK1. tcgatggttc acgggattct gcaattcaca ccaagtatcg catttcgctacgttcttcat cgatgcgaga gccgagatat ccattgccga gagtcgtttt
RsCK2. tcgatggttc acgggattct gcaattcaca ccaagtatcg catttcgctacgttcttcat cgatgcgaga gccgagatat ccgttgccga gagtcgtttt
RsCK3. tcgatggttc acgggattct gcaattcaca ccaagtatcg catttcgctacgttcttcat cgatgcgaga gccgagatat ccattgccga gagtcgtttt
RsCK4. tcgatggttc acgggattct gcaattcaca ccaagtatcg catttcgctacgttcttcat cgatgcgaga gccgagatat ccattgccga gagtcgtttt
RsCK5. tcgatggttc acgggattct gcaattcaca ccaagtatcg catttcgctacgttcttcat cgatgcgaga gccgagatat ccattgccga gagtcgtttt
Tr.ttcacgggat tctgcaattc acaccaagta tcgcatttcg ctacgttctt catcgatgcgagagccgaga tatccttgcc gagagtcatt ttgacattcg
RcAH3. acattcgaga gacatccttc cccccctcgc gcaccgcgga cggggcgatgggaggcggat gcttctttga gttttccttg gcgcatgccg cgccggggtt
RcAH5. acattcgaga gacatccttc cccccctcgc gcaccgcgga cggggcgatgggaggcggat gcttctttga gttttccttg gcgcatgccg cgccggggtt
RcLS4. gacattcgag agacatcctt ccccccctcg cgcaccgcgg acggggcgatggaaggcgga tgcttctttg agttttcctt ggcgcatgcc gcgccggggt
RcLS5. gacattcgag agacatcctt ccccccctcg cgcaccgcgg acggggcgatggaaggcgga tgcttctttg agttttcctt ggcgcatgcc gcgccggggt
RcTX4. acattcgaga gacatccttc cccccctcgc gcaccgcgga cggggcgatgggaggcggat gcttctttga gttttccttg gcgcatgccg cgccggggtt
RgAK2. gacattcgag agacatcctt tcccccctcg cgcaccgcgg acggggcgatggaaggcgga tgcttctttg agttttcctt ggcgcatgcc gcgccggggt
RgAK3. gacattcgag agacatcctt tcccccctcg cgcaccgcgg acggggcgatggaaggcgga tgcttctttg agttttcctt ggcgcatgcc gcgccggggt
RgCC4. gacattcgag agacatcctt tcccccctcg cgcaccgcgg acggggcgatggaaggcgga tgcttctttg agttttcctt ggcgcatgcc gcgccggggt
RgCZ5. gacattcgag agacatcctt tcccccctcg cgcaccgcgg acggggcgatggaaggcgga tgcttctttg agttttcctt ggcgcatgcc gcgccggggt
RgTA1. gacattcgag agacatcctt tcccccctcg cgcaccgcgg acggggcgatggaaggcgga tgcttctttg agttttcctt ggcgcatgcc gcgccggggt
RhYC1. acattcgaga gacatccttc cccccctcgc gcaccgcgga cggggcgatgggaggcggat gcttctttga gttttccttg gcgcatgccg cgccggggtt
RhYC2. acattcgaga gacatccttc cccccctcgc gcaccgcgga cggggcgatgggaggcggat gcttctttga gttttccttg gcgcatgccg cgccggggtt
RhYC3. acattcgaga gacatccttc cccccctcgc gcaccgcgga cggggcgatgggaggcggat gcttctttga gttttccttg gcgcatgccg cgccggggtt
RhYC4. acattcgaga gacatccttc cccccctcgc gcaccgcgga cggggcgatgggaggcggat gcttctttga gttttccttg gcgcatgccg cgccggggtt
RhYC5. acattcgaga gacatccttc cccccctcgc gcaccgcgga cggggcgatgggaggcggat gcttctttga gttttccttg gcgcatgccg cgccggggtt
RpBK3. acattcgaga gacatccttt ccccccctcg cgcaccgcgg acggggcgatggaaggcgga tgcttctttg agttttcctt ggcgcatgcc gcgccggggt
RpBK5. acattcgaga gacatccttt ccccccctcg cgcaccgcgg acggggcgatggaaggcgga tgcttctttg agttttcctt ggcgcatgcc gcgccggggt
RpHL4. acattcgaga gacatccttt ccccccctcg cacaccgcgg acggggcgatggaaggcgga tgcttctttg agttttcctt ggcgcatgcc gcgccggggt
RpHL5. acattcgaga gacatccttt ccccccctcg cacaccgcgg acggggcgatggaaggcgga tgcttctttg agttttcctt ggcgcatgcc gcgccggggt
RpZS3. acattcgaga gacatccttt ccccccctcg cgcaccgcgg acggggcgatggaaggcgga tgcttctttg agttttcctt ggcgcatgcc gcgccggggt
RsCK1. gacattcgag agacatcctt tcccccctcg cgcaccgcgg acggggcgatggaaggcgga tgcttctttt agttttcctt ggcgcatgcc gcgccggggt
RsCK2. gacattcgag agacatcctt tcccccctcg cgcaccgcgg acggggcgatggaaggcgga tgcttctttt agttttcctt ggcgcatgcc gcgccggggt
RsCK3. gacattcgag agacatcctt tcccccctcg cgcaccgcgg acggggcgatggaaggcgga tgcttctttt agttttcctt ggcgcatgcc gcgccggggt
RsCK4. gacattcgag agacatcctt tcccccctcg cgcaccgcgg acggggcgatggaaggcgga tgcttctttt agttttcctt ggcgcatgcc gcgccggggt
RsCK5. gacattcgag agacatcctt tcccccctcg cgcaccgcgg acggggcgatggaaggcgga tgcttctttt agttttcctt ggcgcatgcc gcgccggggt
Tr.agagacaccc tttcccccct cgcgcgccac aaacggggcg acgggaggcg atgcttctttgagttttcct tggcacatgc cgcgccgggg tttgttagcc
RcAH3. cgttagcccg cacgacgagc acttacgtgc acgccagcag gaagggaacgcggcgagagg ttgccccccc accacggtcc cgatgcggtt aaacatgttc
RcAH5. cgttagcccg cacgacgagc acttacgtgc acgccagcag gaagggaacgcggcgagagg ttgccccccc accacggtcc cgatgcggtt aaacatgttc
RcLS4. tcgttagccc gcacgacgag cactcacgtg cacgccagca ggaagggaacgcggcgagag gttgcccccc caccacggtc ccgatgcggt taaacatgtt
RcLS5. tcgttagccc gcacgacgag cactcacgtg cacgccagca ggaagggaacgcggcgagag gttgcccccc caccacggtc ccgatgcggt taaacatgtt
RcTX4. cgttagcccg cacgacgagc actcacgtgc acgccagcag gaagggaacgcggcgagagg ttgccccccc accacggtcc cgatgcggtt aaacatgttc
RgAK2. tcgttagccc gcacgacgag cactcacgtg cacgccagca ggaagggaacgcggcgagag gttgccccca caccacggtc ccgatgtggt taaacatgtt
RgAK3. tcgttagccc gcacgacgag cactcacgtg cacgccagca ggaagggaacgcggcgagag gttgccccca caccacggtc ccgatgtggt taaacatgtt
RgCC4. tcgttagccc gcacgacgag cactcacgtg cacgccagca ggaagggaacgcggcgagag gttgccccca caccacggtc ccgatgtggt taaacatgtt
RgCZ5. tcgttagccc gcacgacgag cactcacgtg cacgccagca ggaagggaacgcggcgagag gttgccccca caccacggtc ccgatgtggt taaacatgtt
RgTA1. tcgttagccc gcacgacgag cactcacgtg cacgccagca ggaagggaacgcggcgagag gttgccccca caccacggtc ccgatgtggt taaacatgtt
RhYC1. cgttagcccg cacgacgagc actcacgtgc acgccagcag gaagggaacgcggcgagagg ttgccccccc accacggtcc cgatgcggtt aaacatgttc
RhYC2. cgttagcccg cacgacgagc actcacgtgc acgccagcag gaagggaacgcggcgagagg ttgccccccc accacggtcc cgatgcggtt aaacatgttc
RhYC3. cgttagcccg cacgacgagc actcacgtgc acgccagcag gaagggaacgcggcgagagg ttgccccccc accacggtcc cgatgcggtt aaacatgttc
RhYC4. cgttagcccg cacgacgagc actcacgtgc acgccagcag gaagggaacgcggcgagagg ttgccccccc accacggtcc cgatgcggtt aaacatgttc
RhYC5. cgttagcccg cacgacgagc actcacgtgc acgccagcag gaagggaacgcggcgagagg ttgccccccc accacggtcc cgatgcggtt aaacatgttc
RpBK3. tcgttagccc gcacgacgag cactcacatg cacgccggca ggaagggaacgcggcgagag gttgcccccc caccacggtc ccgatgcggt taaacatgtt
RpBK5. tcgttagccc gcacgacgag cactcacatg cacgccggca ggaagggaacgcggcgagag gttgcccccc caccacggtc ccgatgcggt taaacatgtt
RpHL4. tcgttagccc gcacgacgag cactcacgtg cacgccggca ggaagggaacgcggcgagag gttgcccccc caccacggtc ccgatgcggt taaacatgtt
RpHL5. tcgttagccc gcacgacgag cactcacgtg cacgccggca ggaagggaacgcggcgagag gttgcccccc caccacggtc ccgatgcggt taaacatgtt
RpZS3. tcgttagccc gcacgacgag cactcacgtg cacgccggca ggaagggaacgcggcgagag gttgcccccc caccacggtc ccgatgcggt taaacatgtt
RsCK1. tcgttagccc gcacgacgag cactcacgtg cacgccagca ggaagggaacgcggcgagag gttgcccccc acaccacggt cccgatgtgg taaaacatgt
RsCK2. tcgttagccc gcacgacgag cactcacgtg cacgccagca ggaagggaacgcggcgagag gttgccccca caccacggtc ccgatgtggt aaaacatgtt
RsCK3. tcgttagccc gcacgacgag cactcacgtg cacgccagca ggaagggaacgcggcgagag gttgcccccc acaccacggt cccgatgtgg taaaacatgt
RsCK4. tcgttagccc gcacgacgag cactcacgtg cacgccagca ggaagggaacgcggcgagag gttgcccccc acaccacggt cccgatgtgg taaaacatgt
RsCK5. tcgttagccc gcacgacgag cactcacgtg cacgccagca ggaagggaacgcggcgagag gttgccccca acaccacggt cccgatgtgg taaaacatgt
Tr.cacacggcac acgctcgcgc gcgcgccggc aggaagggaa aacgggaaga ggttgccccccgcaccgtag cgatgagatc aaacatgttc gcggtctgc.
RcAH3. gcggtctgct ttgcaggttt cgacaatgat ccttccgcag gttcacctacggaaaccttg ttacgacttc tccttcctct ..
RcAH5. gcggtctgct ttgcaggttt cgacaatgat ccttccgcag gttcacctacggaaaccttg ttacgacttc tccttcctct ..
RcLS4. cgcggtctgc tttgcaggtt tcgacaatga tccttccgca ggttcacctacggaaacctt gttacgactt ctccttcctc t.
RcLS5. cgcggtctgc tttgcaggtt tcgacaatga tccttccgca ggttcacctacggaaacctt gttacgactt ctccttcctc t.
RcTX4. gcggtctgct ttgcaggttt cgacaatgat ccttccgcag gttcacctacggaaaccttg ttacgacttc tccttcctct ..
RgAK2. cgcggtctgc tttgcaggtt tcgacaatga tccttccgca ggttcacctacggaaacctt gttacgactt ctccttcctc t.
RgAK3. cgcggtctgc tttgcaggtt tcgacaatga tccttccgca ggttcacctacggaaacctt gttacgactt ctccttcctc t.
RgCC4. cgcggtctgc tttgcaggtt tcgacaatga tccttccgca ggttcacctacggaaacctt gttacgactt ctccttcctc t.
RgCZ5. cgcggtctgc tttgcaggtt tcgacaatga tccttccgca ggttcacctacggaaacctt gttacgactt ctccttcctc t.
RgTA1. cgcggtctgc tttgcaggtt tcgacaatga tccttccgca ggttcacctacggaaacctt gttacgactt ctccttcctc t.
RhYC1. gcggtctgct ttgcaggttt cgacaatgat ccttccgcag gttcacctacggaaaccttg ttacgacttc tccttcctct ..
RhYC2. gcggtctgct ttgcaggttt cgacaatgat ccttccgcag gttcacctacggaaaccttg ttacgacttc tccttcctct ..
RhYC3. gcggtctgct ttgcaggttt cgacaatgat ccttccgcag gttcacctacggaaaccttg ttacgacttc tccttcctct ..
RhYC4. gcggtctgct ttgcaggttt cgacaatgat ccttccgcag gttcacctacggaaaccttg ttacgacttc tccttcctct ..
RhYC5. gcggtctgct ttgcaggttt cgacaatgat ccttccgcag gttcacctacggaaaccttg ttacgacttc tccttcctct ..
RpBK3. cgcggtctgc tttgcaggtt tcgacaatga tccttccgca ggttcacctacggaaacctt gttacgactt ctccttcctc t.
RpBK5. cgcggtctgc tttgcaggtt tcgacaatga tccttccgca ggttcacctacggaaacctt gttacgactt ctccttcctc t.
RpHL4. cgcggtctgc tttgcaggtt tcgacaatga tccttccgca ggttcacctacggaaacctt gttacgactt ctccttcctc t.
RpHL5. cgcggtctgc tttgcaggtt tcgacaatga tccttccgca ggttcacctacggaaacctt gttacgactt ctccttcctc t.
RpZS3. cgcggtctgc tttgcaggtt tcgacaatga tccttccgca ggttcacctacggaaacctt gttacgactt ctccttcctc t.
RsCK1. tcgcggtctg ctttgcaggt ttcgacaatg atccttccgc aggttcacctacggaaacct tgttacgact tctccttcct ct
RsCK2. cgcggtctgc tttgcaggtt tcgacaatga tccttccgca ggttcacctacggaaacctt gttacgactt ctccttcctc t.
RsCK3. tcgcggtctg ctttgcaggt ttcgacaatg atccttccgc aggttcacctacggaaacct tgttacgact tctccttcct ct
RsCK4. tcgcggtctg ctttgcaggt ttcgacaatg atccttccgc aggttcacctacggaaacct tgttacgact tctccttcct ct
RsCK5. tcgcggtctg ctttgcaggt ttcgacaatg atccttccgc aggttcacctacggaaacct tgttacgact tctccttcct ct
Tr. .......... .......... .......... .......... .......... .................... .......... ..
Claims (2)
1.用于地黄属植物鉴定的DNA条形码组合，其特征在于，该DNA条形码组合由R255序列和ITS序列拼接构成；R255序列的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1所示，ITS序列的核苷酸序列如 SEQ ID NO:2所示。
2.DNA条形码组合鉴定地黄属植物的方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
步骤 1，提取待测样品DNA；
步骤2，使用ITS序列的引物以及R255序列的引物分别进行PCR 扩增反应，分别得到待测样品R255序列的扩增产物和待测样品ITS序列的扩增产物；
PCR扩增反应的反应体系总体积为 20uL，1μL的20-30ng/uL模板DNA，正反向引物各0.3μL，10μL 的2×Taq PCR MasterMix， 8.4μL的双蒸水；
R255的PCR扩增条件：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，57℃退火45秒，72℃延伸l分钟，35个循环，72℃延伸6分钟，4℃保温；
ITS的PCR扩增条件：94℃预变性5分钟， 94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸l分钟，35个循环，72℃延伸5分钟，4℃保温；
步骤3，将步骤2得到的扩增产物，分别做凝胶电泳，将有明亮单一条带的样品进行双向测序，分别得到待测样品R255序列和待测样品ITS区序列；
步骤4，将步骤3得到的待测样品R255双向测序的两条序列导入软件拼接成一条序列，得到的待测样品R255的序列，将待测样品ITS双向测序两条序列导入软件拼接成一条序列，得到的待测样品ITS的序列；
步骤5，将步骤4得到的待测样品R255序列和如SEQ ID NO:1所示的R255核苷酸序列比对切齐，待测样品ITS序列和如SEQ ID NO:2所示的ITS核苷酸序列比对切齐；
步骤6，将步骤5得到的比对好的R255序列和ITS区序列依次导入软件拼接在一起形成组合条形码序列R255+ITS；
步骤7，将步骤6得到的组合条形码序列R255+ ITS，再导入软件构建系统发育树，待测样品和某个种聚在一起，则说明待测样品是该物种。
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| 地黄属植物DNA条形码鉴定及地黄栽培起源研究;夏至等;《中草药》;20160228(第04期);第134-140页 * |
| 地黄属植物的DNA条形码研究;程芳婷等;《植物科学学报》;20150215(第01期);第28-35页 * |
| 李建芳等.地黄属核基因与叶绿体基因DNA条形码比较研究.《中草药》.2017,第48卷(第01期), * |
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