CN116200526A - 基于分子生物学方法鉴别亳菊的特异性引物及亳菊的鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于分子生物学方法鉴别亳菊的特异性引物及亳菊的鉴定方法，属于分子鉴定技术领域。通过广泛调查亳菊的主要栽培区、野外同域分布物种以及近缘药用物种的资料信息，然后尽可能的进行多个品种采样，然后通过比较发现亳菊特有的ITS序列特有信息位点，进一步设计特异性引物：所述特异性引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，利用该特异性引物将大大有利于中药材亳菊的快速鉴定。

Description

基于分子生物学方法鉴别亳菊的特异性引物及亳菊的鉴定 方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，通过位点特异性聚合酶链式反应的方法，在亳菊ITS序列中找到具有稳定差异的变异位点，并设计出可以鉴定亳菊的特异性引物

背景技术

菊花是菊科(Asteraceae)菊属(Chrysanthemum L.)，多年生宿根草本植物，其干燥头状花序常常作为中药，主要的功效与作用是疏散风热、平肝明目、清热解毒，用于感冒头疼、肝火上炎、血压较高、疔疮肿毒等症，是多种方剂配伍要药及中成药生产的原材料。其中原产安徽省亳州市的亳菊，是我国四大名菊之一。近年来，市场对中药材菊花需求急剧增加，但是中药材菊花种植、采收、生产加工过程缺乏管理，且由于历史和地区用药习惯等原因，同属的近缘物种与中药材基源物种或因药材性味功能相近，或因药材外形相似而互相混用，代用品、混伪品较多，导致鉴定工作尤为困难。

目前，分子鉴定技术已经广泛应用于中药材物种鉴定，分子鉴定技术是利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段对物种进行快速、准确的自动鉴定，该技术不受药材本身性状和外界因素影响，具有简便高效、重复性好、可实现对未知物种的鉴定且鉴定结果准确等优点。因此本研究设计核基因ITS片段，通过对亳菊及易混品的ITS片段进行扩增、测序并应用DNA条形码技术进行分析，为亳菊及其同属近缘种的准确鉴定提供科学依据。

在真核生物中，核糖体DNA是由核糖体基因及与之相邻的间隔区组成，其基因组序列包括18SrDNA基因，ITS1，5.8S基因，ITS2，26S/28S基因。核糖体DNA中的18S，5.8S，28S的基因组序列在大多数生物中趋于保守，在生物种间变化小，而ITS1和ITS2作为非编码区，承受的选择压力较小，相对变化较大，并且能够提供详尽的系统学分析所需要的可遗传性状。ITS已被用作区分超过21,722种植物物种的通用条形码，并被推荐用于验证中药材的真实性。该基因分布广泛，几乎存在于所有植物中，但是目前为止，亳菊的分子鉴定研究报道还未出现，因此，选择亳菊及其多个近缘种类开展分子鉴定的研究，建立一种快速有效的分子鉴别方法对于实现中药材菊花的鉴定研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的正是为了解决上述问题，首先发现了亳菊ITS序列里面的变异位点，再根据其变异位点而设计出可以鉴别亳菊的特异性引物及利用该特异性引物鉴定亳菊的方法，实现快速鉴定，提高鉴定结果的可靠性和准确率。

本发明的技术方案如下：

基于分子生物学方法鉴别亳菊的特异性引物，其特征在于，上游引物为：5’-AAACTCAAGAAGGCTCGTTTCA-3’，下游引物为：5’-TATCCGCCCCCAAAACACAC-3’。

上述引物在快速鉴别亳菊中的应用。

本发明还提供一种采用上述引物快速鉴别亳菊的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样本DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用上述上游引物、下游引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增；

(3)对步骤(2)所得反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和凝胶成像，实现对亳菊的特异性鉴别。

按上述方案，步骤(3)中，根据凝胶成像的结果对亳菊进行特异性鉴别，在有效提取待测样品DNA模板的前提下，当观察到单一明亮电泳条带，则鉴定待测样品为亳菊；当未观察到单一明亮电泳条带，则鉴定待测样品不是亳菊。

优选的，所述PCR的扩增体系为25μL，组份配比如下：2.5μmol/L正反向引物各1μL，2×TaqPCRMasterMix 12.5μL，50～100ng/L模板DNA2.0μL，ddH2O8.5μL。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

目前，关于亳菊的分子鉴定研究报道较少。本发明首次通过对亳菊及其近缘的菊属药用物种进行同地方多品种广泛取样，然后通过比较发现亳菊的ITS序列特有信息位点，进一步获得其特有的特异性引物。

本发明提供一对亳菊的特异性引物，通过特异性扩增达到区分亳菊与其他品种的目的，可以通过观察凝胶电泳的结果是否产生条带而比较直观的体现鉴定结果，同时减少了测序以及测序结果比对分析的时间。本发明通过亳菊特异性引物鉴定亳菊减少了药检人员的操作时间，压缩检验时间，提高检验效率，同时降低理论针对检验人员的专业限制。

附图说明

图1为特异性扩增电泳检测结果图，其中，M:Maker(DL2000)；K:阴性对照(H2O)。1～10：编号G-1～G-10样品。

图2为菊属药用植物所用的样品比对序列。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，测序由上海生工生物工程技术服务有限公司进行，植物基因组DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒均购自上海生工生物工程技术服务有限公司，方法均照说明书进行。

下述实施例中，亳菊新鲜样品收集均来自安徽省亳州市，样品信息见表1。

表1亳菊样品信息表

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实施例1

基于分子生物学特异性扩增鉴别亳菊的一对特异性引物，上游引物为：5’-AAACTCAAGAAGGCTCGTTTCA-3’，下游引物为：5’-TATCCGCCCCCAAAACACAC-3’。

采用上述引物快速鉴别亳菊的方法，待测样品分别选择表1中编号G-1～G-10菊花样品，进行平行实验，鉴别编G-1～G-10菊花样品是否为亳菊；具体步骤如下：

(1)总DNA的提取:取植物新鲜组织约100mg或干重组织约30mg，加入液氮充分研磨。具体步骤如下：利用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取；

(2)本发明优选采用25μL的PCR扩增体系，组份配比为：2.5μmol/L正反向引物各1μL，2×TaqPCRMasterMix 12.5μL，50～100ng/L模板DNA2.0μL，ddH2O8.5μL。本发明对扩增体系中的试剂来源没有特殊限定，扩增体系中所用试剂均可采用本领域技术人员所熟知的商用试剂。

PCR的扩增条件为：94℃预变性4min，1个循环；94℃变性15s，63.5℃退火15sec，72℃延伸15sec，33个循环；72℃延伸5min。上述扩增体系及扩增条件下所有备筛选的样本DNA序列均能成功扩增。本领域技术人员可以在上述技术方案的基础上对扩增体系和扩增条件进行适当合理调整，如改变扩增体系的体积、组分的浓度、调整扩增的温度及时间等，均属于本发明的保护范围。

(3)对步骤(2)所得反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和凝胶成像。琼脂糖凝胶的浓度1％(质量体积比)，配置琼脂糖凝胶40mL加入DNA染料GelRed 3μL和步骤(2)所得反应产物3μL，电泳检测电压为120V，电泳时间30min。凝胶电泳检测结果均如图2所示，其中编号G1观察单一明亮条带，鉴定为亳菊；其它编号的待测样品均未观察单一明亮条带，鉴定为非亳菊。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.基于分子生物学方法鉴别亳菊的特异性引物，其特征在于，上游引物为：

5’-AAACTCAAGAAGGCTCGTTTCA-3’，下游引物为：5’-TATCCGCCCCCAAAACACAC-3” 。

2.权利要求1所述特异性引物在制备鉴别亳菊试剂中的应用。

3.基于分子生物学特异性扩增快速鉴别亳菊的方法，其特征在于，主要步骤如下：(1)对待测样品进行总DNA的有效提取，得到提取的基因组DNA；(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述上游引物、下游引物进行聚合酶链式反应扩增；(3)对步骤(2)所得反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和凝胶成像，实现对亳菊的特异性鉴别。

4.根据权利要求3所述基于分子生物学特异性扩增快速鉴别亳菊的方法，其特征在于，步骤(3)中，根据凝胶成像的结果对亳菊进行特异性鉴别，当观察到单一明亮条带，则鉴定待测样品为亳菊；当未观察到单一明亮条带，则鉴定待测样品不是亳菊。

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