CN107142333B - 一种用于鉴别西红花的荧光pcr检测引物组、试剂盒及检测方法和应用 - Google Patents

一种用于鉴别西红花的荧光pcr检测引物组、试剂盒及检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴别西红花的荧光PCR检测引物组、试剂盒及检测方法和应用。本发明通过设计西红花的特异性引物和通用引物，采用实时SYBRGreen荧光染料法鉴别西红花真伪，无需特别的优化条件，简便易行，成本较低而且能克服现有技术的不足。本发明所需要的DNA用量少，操作简便，闭管操作减少污染。在DNA提取的前提下，可在2小时内完成西红花的检测。另外，本发明涉及的方法还具有直观、安全、通量大、特异性强的特点，能够实时、快速、准确的进行DNA扩增反应和样品检测。总之，本发明可用于西红花真伪的快速鉴别，具有较高的可行性和应用前景，为中草药西红花市场的健康稳定发展具有重要的意义。

Description

一种用于鉴别西红花的荧光PCR检测引物组、试剂盒及检测方 法和应用
技术领域
本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种用于鉴别西红花的荧光PCR检测引物组、试剂盒及检测方法和应用。属于分子生物学检测技术领域。
背景技术
2015版《中国药典》规定：西红花为鸢尾科植物番红花Crocus sativus L.的干燥柱头。西红花，又名藏红花、番红花，是一种名贵的中药材，具有强大的生理活性，其柱头在亚洲和欧洲作为药用，有镇静、祛痰、解痉作用，用于胃病、调经、麻疹、发热、黄胆、肝脾肿大等的治疗。由于西红花价格十分昂贵，被誉为“植物黄金”，由于受利益的驱使，部分不法商贩会利用其他植物的花柱或花丝冒充西红花销售。据报道，常见的掺假伪品主要有:红花(Carthamus tinctorius L.)的干燥花，莲藕(Nelumbo nucifera G)的藕须，利用胡萝卜丝和玉米须进行染色等冒充正品西红花。这些伪品在临床上达不到西红花的治疗效果，因此，建立快速、准确的鉴别西红花的方法，对其市场监管、保证临床用药安全具有十分重要的意义。
目前，对于中草药的鉴别主要集中于性状、显微、理化、化学和生物学鉴定五大领域。随着分子生物学技术的发展，一些基于DNA的生物学鉴定手段逐渐丰富起来，DNA分子法主要是利用显示生物特征的各种生物物种所具有的不同DNA序列信息进行鉴别，它可以突破依据感官检测的局限性，与传统分析方法相比，更加具有客观性和准确性。李顺旭等通过利用气相色谱法检测西红花有效成分来区分其正伪品，但对于源性真伪鉴定来说，该方法只能鉴定出所含的生理生化成分，但是无法准确分别出不同种类的源性成分的来源。黄丰等利用RAPD技术鉴别西红花真伪，虽然无需进行杂交、基因克隆和测序等步骤，但是该方法在扩增的过程中容易出现扩增效率差，条带模糊或难以辨认的情况。
中草药DNA条形码作为中草药真伪鉴定的“有效身份证”。专利(CN201110132089)采用ISSR技术通过指纹图谱鉴定西红花干品。中国专利(CN104630327A)利用PsbA-trnH和rbcL基因设计特异引物进行多重PCR检测西红花。这些传统的DNA分子检测方法对DNA提取质量要求较高，并且灵敏度和假阳性比率相对较高，判定上存在较大误差，开管操作易污染。目前，对于植物的鉴定大多采用ITS2、PsbA-trnH和rbcL基因设计引物，但并不是有了该基因设计引物所有的问题就可以迎刃而解，针对具体的成分和植物源性进行进一步研究才可以得到最终问题的解决。本发明通过对西红花不同的基因筛选不同引物，发现ITS2基因扩增效率更高，与红花等伪品序列差异性大，西红花种内变异小，更适合西红花鉴别。而近年来实时荧光PCR技术的飞速发展大大提高了检测的灵敏度、特异性和准确性，由于荧光定量整个检测过程为闭管操作，所以有效的减少了实验过程中的污染的危险，目前广泛应用于各个领域。利用实时荧光PCR检测西红花真伪未见相关报道。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种用于鉴别西红花的荧光PCR检测引物组、试剂盒及检测方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种用于鉴别西红花的荧光PCR检测引物组，包括：
(1)用于鉴别西红花的荧光PCR检测特异性引物，其核苷酸序列如下：
正向引物序列ZhhF：5'-ACATCGTTGTTTGTGCCTACTC-3'，如SEQ ID NO.1所示；
反向引物序列ZhhR：5'-GGACGGTTCCTTCTTCTTATTC-3'，如SEQ ID NO.2所示；
(2)一种用于鉴别红花实时荧光PCR检测特异性引物，其核苷酸序列如下：
正向引物序列HHF:5'-GGGAAGTGTTTGGTTTGGGAC-3'，如SEQ ID NO.3所示：
反向引物序列HHR:5'-CCGTTAGGGTCTTTAGAGAGGAAT-3'，如SEQ ID NO.4所示：
(3)用于鉴别西红花及其伪品的荧光PCR检测通用引物，其核苷酸序列如下：
正向引物序列HHUF：5'-GCGACTCTCGGCAACGGATA-3'，如SEQ ID NO.5所示；
反向引物序列HHUR：5'-GTGACGCCCAGGCAGACG-3'，如SEQ ID NO.6所示。
一种用于鉴别西红花的荧光PCR检测试剂盒，包括上述荧光PCR检测引物组，以及西红花DNA提取液和多重实时荧光PCR反应扩增体系。
作为优选的技术方案之一，所述PCR检测试剂盒还包括西红花阳性对照品、阴性对照品(红花等伪品)和空白对照品(双蒸水)。
作为优选的技术方案之一，所述多重实时荧光PCR反应扩增体系采用20μL反应体系，包括：2×SYBRGreen Mix 10μL，各正向引物或反向引物2μM分别取1μL，50×Rox 0.4μL，DNA(浓度1～50ng/μL)模板取2.0μL，用双蒸水补足至20μL，如表1所示。
表1.PCR反系扩增体系
Figure BDA0001355724720000021
Figure BDA0001355724720000031
上述引物组或试剂盒在鉴别西红花中的应用。
一种用于鉴别西红花的检测方法，具体步骤如下：
(1)从待测样品中提取DNA为模板，选择靶基因；
(2)利用上述的引物组作为PCR扩增引物，并使用上述试剂盒进行PCR扩增；
(3)设立阳性对照、阴性对照及空白对照，分析实验结果，给出第n个循环时的荧光增加值ΔRn与扩增曲线Ct值，根据特异性引物和通用引物的荧光信号及扩增曲线Ct值来判定是否含有西红花成分。
作为优选的技术方案之一，步骤(1)中DNA的提取使用植物基因组试剂盒，并按其说明书进行提取。
作为优选的技术方案之一，步骤(1)中靶基因选自内转录间隔区ITS2基因，相比于植物其他基因在核糖体rDNA整体结构功能上的特殊，既具有一定的保守性，又具有较高的可变性，其序列在不同种类、或同种的不同个体中都可能存在较大差异，故利用ITS2序列作为西红花鉴别靶基因特异性强且准确性高。
作为优选的技术方案之一，步骤(2)进行PCR扩增时，在至少3通道型号的荧光定量PCR仪上进行，扩增程序：95℃，2min；95℃，10s；64℃，35s，在此收集荧光信号，40个循环。根据不同型号的PCR仪的不同要求可以对标记荧光号进行相应的调整。
本发明的有益效果：
普通的PCR扩增虽然能够克服传统形态学和显微鉴别存在的问题，但是需要经过琼脂糖凝胶电泳进行判断，相对操作误差较大且溴化乙锭污染，检测周期长，不能进行实时快速检测。本发明通过设计西红花的特异性引物和通用引物，采用实时SYBRGreen荧光染料法鉴别西红花真伪，无需特别的优化条件，简便易行，成本较低而且能克服现有技术的不足。
本发明所需要的DNA用量少，操作简便，闭管操作减少污染。在DNA提取的前提下，可在2小时内完成西红花的检测。另外，本发明涉及的方法还具有直观、安全、通量大、特异性强的特点，能够实时、快速、准确的进行DNA扩增反应和样品检测。总之，本发明可用于西红花真伪的快速鉴别，具有较高的可行性和应用前景，为中草药西红花市场的健康稳定发展具有重要的意义。
附图说明
图1.当西红花ZhhF/R特异引物、红花特异引物HHF/R及通用引物HHUF/R同时有扩增曲线时，说明待检样本为同时检测出正品西红花和伪品红花。
图2.当ZhhF/R特异引物没有扩增曲线，HHUF/R通用引物有扩增曲线时，说明待检样本为西红花的伪品。
图3.正品西红花的熔解曲线图，ZhhF/R特异引物和通用引物的熔解曲线同时存在且峰单一。
图4.西红花伪品的熔解曲线图，ZhhF/R特异引物基本无熔解曲线峰值，通用引物有熔解曲线，峰值不单一。
图5.正品西红花ZhhF/R特异引物灵敏度扩增曲线图，检测限为0.01ng。
图6.伪品红花HHF/R特异引物灵敏度扩增曲线图，检测限为0.01ng。
图7.通用引物HHUF/R灵敏度扩增曲线图，检测限为0.01ng。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
本发明中所用实验材料、试剂与仪器如下：
实验材料：
正品西红花及常见伪品红花购自省中医药研究院附属医院；藕须、玉米须、胡萝卜丝、菊花购自济南市某超市；白术、人参、党参、生地、石斛等植物由山东东阿国胶堂有限公司；另外，市售西红花药材随机选取15份购自济南市某药材市场。以上样品均经过中草药DNA条形码技术基因测序进行比对验证。
所用试剂：
植物DNA提取试剂盒，DNA分子量MakerDL2000、电泳上样缓冲液等PCR反应试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。引物由生工生物工程(上海)有限公司负责合成。2×SYBRGreen Mix为DBI Bioscience品牌。DNA测序由山东省农业科学院生物技术中心测序中心完成。
所用仪器：
ABI 7500荧光定量PCR仪为ABI公司产品，Takara PCR仪为宝生物工程(大连)有限公司产品。5424D型高速离心机为Eppendorf公司产品。
实施例1
1、西红花及伪品样本DNA提取：
采用植物DNA提取试剂盒提取，具体操作步骤见试剂盒说明书。提取的基因组DNA经紫外分光光度计测定其纯度和浓度。测定OD260/OD280值均为1.8～1.9左右，浓度在10ng/μL以上，说明DNA纯度较高，浓度适中，符合PCR扩增要求。
2、靶基因的选择和引物的设计：
ITS2序列是介于5.8S和28S rRNA基因之间的非编码序列，因其在核糖体rDNA整体结构功能上的特殊，既具有一定的保守性，又具有较高的可变性，其序列在不同种类、或同种的不同个体中都可能存在较大差异，因此，利用ITS2序列作为西红花鉴定靶基因具有既简明又可靠的特性。
基于DNA条形码技术原理选择ITS2基因为目标靶基因，在Genbank搜索并下载西红花及常见伪品ITS2基因序列，通过Mega5.0分析软件比对设计特异引物和通用引物，各核苷酸序列见表2。
表2.引物序列
Figure BDA0001355724720000051
3、西红花的荧光检测：
选用20μL的实时荧光PCR扩增体系，反应体系见表1。
4、PCR扩增条件为：PCR扩增条件为：95℃2min；95℃10s，64℃，35s，在此收集荧光信号，40个循环。
5、结果分析：每次试验设立阳性对照、阴性对照及空白对照，试验结束后打开分析软件，分析实验结果，给出ΔRn(第n个循环时的荧光增加值)与扩增曲线Ct值，根据特异引物和通用引物的荧光信号及扩增曲线Ct值来判定待测样品是否为西红花及伪品红花。结果见图1，当西红花ZhhF/R特异引物、红花特异引物HHF/R及通用引物HHUF/R同时有扩增曲线时，说明待检样本为同时检测出正品西红花和伪品红花。图2结果显示，当ZhhF/R特异引物没有扩增曲线，HHUF/R通用引物有扩增曲线时，说明待检样本为西红花的伪品。
实施例2特异性验证
利用本发明设计的引物，分别以西红花、红花、藕须、玉米须、胡萝卜丝、菊花、白术、人参、党参、生地、石斛等植物总基因组DNA为模板，进行实时荧光PCR检测，验证其引物的特异性。其结果见表3，图3为正品西红花的熔解曲线图，ZhhF/R特异引物和通用引物HHUF/R的熔解曲线同时存在且峰单一；图4为西红花伪品的熔解曲线图，ZhhF/R特异引物基本无熔解曲线峰值，通用引物HHUF/R有熔解曲线，峰值不单一。以上结果表明本研究所设计的引物具有很强的特异性。
表3.特异性验证试验
Figure BDA0001355724720000061
实施例3灵敏度实验
按照实施例1，将西红花的基因组DNA定量到50ng，按10×梯度稀释，每个梯度均取2.0μL为模板量(即：10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng)，进行实时荧光定量PCR检测，评估本发明的检测限。见图5～7，结果表明本方法定量检测限为0.01ng，说明本发明所提供的方法具有很高的灵敏度。
实施例4实际样本检测
利用本发明提供的试剂盒及检测方法对市售的15份样本进行实时荧光PCR检测，并与测序结果进行比对验证，以验证方法的使用价值。由表4中可以看出，该方法与测序结果完全一致，市售西红花样品中检出7份伪品。同时，通过中草药DNA条形码检测，需要时间较长，不能达到实时检测效果，而且一些相近物种较难区分。本发明设计的方法，能够2小时内完成对样本的准确快速鉴别，且灵敏度高。该检测方法适合于待测样品中西红花源性成分的检测。
表4.实际样本检测
Figure BDA0001355724720000071
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农业科学院生物技术研究中心
<120> 一种用于鉴别西红花的荧光PCR检测引物组、试剂盒及检测方法和应用
<130> 2017
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 正向引物ZhhF
<400> 1
acatcgttgt ttgtgcctac tc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 反向引物序列ZhhR
<400> 2
ggacggttcc ttcttcttat tc 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 正向引物序列HHF
<400> 3
gggaagtgtt tggtttggga c 21
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 反向引物序列HHR
<400> 4
ccgttagggt ctttagagag gaat 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 正向引物序列HHUF
<400> 5
gcgactctcg gcaacggata 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 反向引物序列HHUR
<400> 6
gtgacgccca ggcagacg 18

Claims (9)

1.一种用于鉴别西红花的荧光PCR检测引物组，其特征在于，包括：
（1）用于鉴别西红花的荧光PCR检测特异性引物，其核苷酸序列如下：
正向引物序列ZhhF：5' - ACATCGTTGTTTGTGCCTACTC - 3'，如SEQ ID NO.1所示；
反向引物序列ZhhR：5' - GGACGGTTCCTTCTTCTTATTC - 3'，如SEQ ID NO.2所示；
（2）用于鉴别红花的荧光PCR检测特异性引物，其核苷酸序列如下：
正向引物序列HHF：5' - GGGAAGTGTTTGGTTTGGGAC - 3'，如SEQ ID NO.3所示；
反向引物序列HHR：5' - CCGTTAGGGTCTTTAGAGAGGAAT - 3'，如SEQ ID NO.4所示；
（3）用于鉴别西红花及其伪品的荧光PCR检测通用引物，其核苷酸序列如下：
正向引物序列HHUF：5' - GCGACTCTCGGCAACGGATA - 3'，如SEQ ID NO.5所示；
反向引物序列HHUR：5' - GTGACGCCCAGGCAGACG - 3' ，如SEQ ID NO.6所示。
2.一种用于鉴别西红花的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的荧光PCR检测引物组，以及西红花DNA提取液和多重实时荧光PCR反应扩增体系。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR检测试剂盒还包括西红花阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述多重实时荧光PCR反应扩增体系采用20μL反应体系，包括：2×SYBRGreen Mix 10 μL，各正向引物或反向引物2 μM取1.0 μL，50×Rox 0.4 μL，DNA模板取2.0 μL，用双蒸水补足至20 μL。
5.权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的试剂盒在鉴别西红花中的应用。
6.一种用于鉴别西红花的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）从待测样品中提取DNA为模板，选择靶基因；
（2）利用权利要求1所述的引物组作为PCR扩增引物，并使用权利要求2所述的试剂盒进行PCR扩增；
（3）设立阳性对照、阴性对照及空白对照，分析实验结果，给出第n个循环时的荧光增加值ΔRn与扩增曲线Ct值，根据特异性引物和通用引物的荧光信号及扩增曲线Ct值来判定是否含有西红花成分。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中DNA的提取使用植物基因组试剂盒，并按其说明书进行提取。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中靶基因选自内转录间隔区ITS2基因。
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）进行PCR扩增时，在至少3通道型号的荧光定量PCR仪上进行，扩增程序：95℃，2min；95℃，10s；64℃，35s，在此收集荧光信号，40个循环；根据不同型号的PCR仪的不同要求可以对标记荧光号进行相应的调整。
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Title
Developing an SCAR and ITS reliable multiplex PCR-based assay for safflower adulterant detection in saffron samples;Saeid Babaei等;《Food Control》;20140131;第35卷(第1期);第324页左栏第3段，第325页左栏第5段，第327页左栏第2段 *
基于特异性聚合酶链式反应的西红花快速分子鉴别研究;郑琪等;《中国药学杂志》;20150131;第50卷(第1期);第23-28页 *

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