CN107130041A - 一种用于鉴定中药材合欢花的引物对及其应用 - Google Patents

一种用于鉴定中药材合欢花的引物对及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107130041A
CN107130041A CN201710421455.4A CN201710421455A CN107130041A CN 107130041 A CN107130041 A CN 107130041A CN 201710421455 A CN201710421455 A CN 201710421455A CN 107130041 A CN107130041 A CN 107130041A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer pair
flos albiziae
primer
seq
chinese herbs
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710421455.4A
Other languages
English (en)
Inventor
李建华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Li Liangji Health Industry Co Ltd
Original Assignee
Suzhou Li Liangji Health Industry Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Li Liangji Health Industry Co Ltd filed Critical Suzhou Li Liangji Health Industry Co Ltd
Priority to CN201710421455.4A priority Critical patent/CN107130041A/zh
Publication of CN107130041A publication Critical patent/CN107130041A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定中药材合欢花的引物对及其应用，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。(1)本发明所述引物对克服了传统合欢药材采用性状、显微、理化等鉴定方法的弊端，提供了一种准确、操作简便的鉴定方法；(2)本发明所述引物对具有特异性高、灵敏度好，稳定性强的优点。

Description

一种用于鉴定中药材合欢花的引物对及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段鉴定中药的方法，具体为一种用于鉴定中药材合欢花的引物对及其应用。
背景技术
合欢皮和合欢花为常用的解郁安神药，其基原植物均为豆科合欢属，植物合欢分别以皮和花入药，树皮入药为“合欢皮”，花序或花蕾入药为“合欢花”或“合欢米”。现代药理学研究表明合欢皮有镇静安神、抗生育、抗肿瘤等活性。合欢花有镇静催眠、抗抑郁、抗菌、抗氧化等作用。合欢药材市场需求量大，在商品药材中发现合欢皮、合欢花均存在一定的混伪现有。合欢皮主要的混伪品是山合欢皮，从各地药材市场及部分省市药店中收集的样品中存在以山合欢皮代替合欢皮的现象。二者亲缘关系较近，药材性状极为相似，但2010版《中国药典》只把合欢皮作为正品收载，山合欢皮属于混伪品，古代本草中也没有山合欢代替合欢用药的记载。同时，秦皮、海桐皮与合欢皮药材性状相似，也容易混淆。合欢花的主要混伪品为山合欢花做合欢花出售的现象，在广东等地区以广东合欢花做合欢花药用，北合欢花、广东合欢花与合欢花药材性状差异大，因药材名混乱，而造成误用，需加以纠正。
因此，为规范合欢药材的使用，保证临床用药安全准确，迫切需要准确有效的鉴定方法。目前，合欢药材的鉴定大多采用性状、显微、理化等传统鉴定方法。
发明内容
本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，保证合欢药材用药的安全有效，获得一种稳定性好，特异性高的分子鉴定试剂盒，本发明提供了一种用于鉴定中药材合欢花的引物对及其应用。
技术方案：一种用于鉴定中药材合欢花的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
优选的，所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
表1引物对及发卡结构序列
所述引物对在制备鉴定中药材合欢花试剂盒中的应用。
优选的，所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
优选的，所述试剂盒鉴定中药材合欢花的步骤包括：
(1)提取合欢花样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释50～500倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
优选的，所述合欢花样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
优选的，所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
有益效果：(1)本发明所述引物对克服了传统合欢药材采用性状、显微、理化等鉴定方法的弊端，提供了一种准确、操作简便的鉴定方法；(2)本发明所述引物对具有特异性高、灵敏度好，稳定性强的优点。
附图说明
图1是实施例1～3PCR鉴定结果电泳图；
其中M为分子量为2000的Maker；1为实施例1PCR产物鉴定结果；2为实施例2PCR产物鉴定结果；3为实施例3PCR产物鉴定结果。
具体实施方式
实施例1
一种用于鉴定中药材合欢花的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定中药材合欢花试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定中药材合欢花的步骤包括：
(1)提取合欢花样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释50倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述合欢花样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
实施例2
一种用于鉴定中药材合欢花的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定中药材合欢花试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定中药材合欢花的步骤包括：
(1)提取合欢花样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释500倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述合欢花样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
实施例3
一种用于鉴定中药材合欢花的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定中药材合欢花试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定中药材合欢花的步骤包括：
(1)提取合欢花样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释300倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释35倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述合欢花样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
如图1所示，将实施例1～3的扩增产物进行电泳检测，条带清晰可见，产物单一。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州市李良济健康产业有限公司
<120> 一种用于鉴定中药材合欢花的引物对及其应用
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgcgataca acctgtcaat 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gacgcttctc cagagaacaa t 21
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggccttgcgc gcatagat 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgagaccgga gtacatca 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tccaaaagga ccaagcgatc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gccaagtccg gatcgttagc 20
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg 40

Claims (7)

1.一种用于鉴定中药材合欢花的引物对，其特征在于，所述引物对及其序列为：P1，SEQID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
2.根据权利要求1所述的一种用于鉴定中药材合欢花的引物对，其特征在于，所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
3.权利要求1或2所述引物对在制备鉴定中药材合欢花试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒鉴定中药材合欢花的步骤包括：
(1)提取合欢花样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释50～500倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述合欢花样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
CN201710421455.4A 2017-06-07 2017-06-07 一种用于鉴定中药材合欢花的引物对及其应用 Pending CN107130041A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710421455.4A CN107130041A (zh) 2017-06-07 2017-06-07 一种用于鉴定中药材合欢花的引物对及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710421455.4A CN107130041A (zh) 2017-06-07 2017-06-07 一种用于鉴定中药材合欢花的引物对及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107130041A true CN107130041A (zh) 2017-09-05

Family

ID=59734981

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710421455.4A Pending CN107130041A (zh) 2017-06-07 2017-06-07 一种用于鉴定中药材合欢花的引物对及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107130041A (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106191294A (zh) * 2016-08-26 2016-12-07 中山市中智药业集团有限公司 一种利用dgge鉴定混合中药粉末组成物种的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106191294A (zh) * 2016-08-26 2016-12-07 中山市中智药业集团有限公司 一种利用dgge鉴定混合中药粉末组成物种的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SUBBASHREE APARAJITA AND GYANA RANJAN ROUT: "Molecular analysis of Albizia species using AFLP markers for conservation strategies", 《JOURNAL OF GENETICS》 *
ZHIYING SUN AND SHILIN CHEN: "Identification of cortex herbs using the DNA barcode nrITS2", 《JOURNAL OF NATURAL MEDICINES》 *
赵莎 等: "应用ITS2条形码鉴定中药材合欢皮、合欢花及其混伪品", 《中国中药杂志》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103468709B (zh) 霍山石斛的叶绿体基因组及种质鉴定方法
CN104611424B (zh) 快速鉴别三叶青及其多种伪混品的pcr‑rflp方法
CN101831494A (zh) 一种含贝母的中成药中川贝母的分子生物学鉴定方法
CN105274245B (zh) 一种鉴定多花黄精的方法及其专用引物对
CN107130041A (zh) 一种用于鉴定中药材合欢花的引物对及其应用
CN105349534A (zh) 一种用于竹节参分子鉴定的引物及序列特异扩增区域（scar）的方法
Xu et al. Authentication of official Da-huang by sequencing and multiplex allele-specific PCR of a short maturase K gene
CN105734047A (zh) 石斛盛开期花瓣总rna提取方法
CN102181538B (zh) 辅助鉴定锁阳属植物的方法及其专用引物
CN102226217A (zh) 鉴别冬虫夏草真伪的pcr引物对、试剂盒及方法
CN105087564B (zh) 鉴别草珊瑚与3种混淆品的分子特异性标记引物及方法
CN107164486A (zh) 一种用于鉴定中药川贝母的引物对及其应用
CN105506159A (zh) 一种用特异性pcr引物检测花椒的方法
CN106399557A (zh) 毛酸浆的分子特异性标记引物及鉴别方法
CN107130039A (zh) 一种用于鉴定凉山虫草的引物对及其应用
Chen et al. Characterization of botanical origin of selected popular purple Eleutherococcus tea grown in Yunnan province of China and quantification of Its anthocyanins using spectrophotometric method
CN107164490A (zh) 一种用于鉴定浙贝母的引物对及其应用
CN107326069A (zh) 一种用于鉴定柴胡的引物对及其应用
CN107130038A (zh) 一种用于鉴定中药当归的引物对及其应用
Nasarodin et al. ITS2 secondary structure data improves authentication of Moringa oleifera tea products when using with DNA barcoding
CN103173563A (zh) 一种快速鉴别文山三七与易混品屏边三七的pcr-rflp方法
CN104480213A (zh) 一种用于鉴定中药木通的引物对及其应用
CN107227347A (zh) 一种用于鉴定中药人参的引物对及其应用
CN107164487A (zh) 一种用于鉴定中药红豆杉的引物对及其应用
Srivastava et al. Molecular identification of Verbascum thapsus L.(Ban Tambaaku) and its ITS sequence comparison with other Verbascum L. species

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170905