CN107475359A - 一种药食同源药材酸枣仁及其混伪品的dna条形码鉴定方法 - Google Patents

一种药食同源药材酸枣仁及其混伪品的dna条形码鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种酸枣仁真伪鉴定方法，所述方法包括如下步骤：1)待测样品DNA提取，提取的DNA序列经过PCR扩增，再经CodonCode Aligner拼接，获得psbA‑trnH序列；2)和酸枣仁psbA‑trnH序列进行K2P遗传距离和系统聚类树比较；3)如待测样品的种内最大K2P遗传距离小于其与伪品最小种间K2P遗传距离，或经系统聚类树比较为同一支，则待测样品为真品。

Description

一种药食同源药材酸枣仁及其混伪品的DNA条形码鉴定方法
技术领域
本发明属于分子鉴定技术领域，尤其是涉及酸枣仁及其混伪品的DNA条形码鉴定方法
背景技术
酸枣仁为鼠李科植物酸枣Ziziphusjujube Mill.var.spinosa(Bunge)HuexH.F.Chou的干燥成熟种子。始载于《神农本草经》，列为上品，在历版的《中华人民共和国药典》中均有收录，主产于我国北方地区，具有养心补肝，宁心安神，敛汗，生津的功效，中医临床上常用的传统中药之一。由于其有助眠、降血压、降血脂、保护心脏、保护眼睛等保健功效，久服能“安五脏，轻身延年”，是卫生部颁布的第一批药食同源两用品之一，广泛用于药品及保健食品中。然而随着近年来酸枣仁的野生资源减少、价格上涨、市场需求量增加，市场上出现以滇刺枣Ziziphus mauritiana Lam.(理枣仁)，北枳椇Hoveni adulcis Thunb.(拐枣仁)，兵豆Lens culinaris，紫荆Cercis chinensis的种子掺杂掺伪的现象。滇刺栆常称为“理枣仁”或“进口酸枣仁”，由于其价格低、与酸枣仁药材的外观形态相似，在药材市场中存在将其充当或掺入酸枣仁的假冒、掺伪现象。
目前，张军武、李俊卿等采用外观性状、显微鉴别、薄层鉴别、紫外光谱鉴别对酸枣仁及其混伪品进行鉴别，刘萍等采用RAPD鉴别酸枣仁及其混淆品(刘萍等.酸枣仁与其混淆品及伪品的RAPD分析[J].解放军药学学报,2006,22(1):67.)，然而这些鉴定方法均存在一定的缺陷：外观性状及显微性状对技术人员的专业技术能力要求较高，更多地依赖于技术人员的经验；薄层鉴别与紫外光谱本质上是依据某一化学成分的有无或多少进行区分，而药材由于种植、采收或加工原因导致其化学成分含量发生变化而易导致薄层鉴定、紫外光谱的结果不稳定；RAPD存在片段的基因组来源不明(细胞核或细胞器)以及凝胶电泳迁移率相同的谱带的核苷酸同源性等情形易造成干扰，此外，RAPD反应条件繁杂而严格，扩增产物的稳定性难以控制等问题存在。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种DNA条形码鉴定方法来对酸枣仁及其混伪品进行鉴别。
DNA条形码技术是近年来在物种鉴定领域发展起来的一种新方法，由于其具有重复性好、通用性强、不依赖于药材形态、不受环境因素影响的特点，可弥补传统鉴定方法的不足，正在逐渐发展成为一项成熟、稳定的鉴别手段，现已广泛应用于中药材的物种鉴定。作为国际常用的DNA条形码分子标记之一，叶绿体基因非编码区中的psbA-trnH序列的鉴定效率已在肉苁蓉、巴戟天、远志、肉桂等中药材中得到了验证。本研究基于psbA-trnH序列对44份酸枣仁及其混伪品样本进行DNA条形码分子鉴定研究，为保障药食同源的酸枣仁的用药安全与临床疗效提供新的鉴定方法。
发明内容
本发明基于叶绿体基因非编码区中的psbA-trnH序列对44份酸枣仁及其混伪品样本进行DNA条形码分子鉴定研究，为保障药食同源的酸枣仁的用药安全与临床疗效提供新的鉴定方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种酸枣仁真伪鉴定方法，包括如下步骤：
1)待测样品DNA提取，提取的DNA经过PCR扩增，再经CodonCode Aligner拼接，获得psbA-trnH序列；
2)和酸枣仁psbA-trnH序列进行K2P遗传距离和系统聚类树比较；
3)如待测样品的种内最大K2P遗传距离小于其与伪品最小种间K2P遗传距离，或经系统聚类树比较为同一支，则待测样品为真品。
本发明还包括本发明鉴定方法的建立方法，所述建立方法包括如下步骤：
步骤(1)提取包括酸枣仁真品和酸枣仁伪品的DNA,提取的DNA序列经过PCR扩增，再经CodonCode Aligner拼接，获得psbA-trnH序列，DNA的提取方法为：酸枣仁真品和酸枣仁伪品，种子切碎，研磨成粉状，水浴，采用苯酚：氯仿：异戊醇的混合溶剂进行总DNA的提取；
步骤(2)根据psbA-trnH序列计算酸枣仁真品和酸枣仁伪品种内和种间遗传距离，并根据psbA-trnH序列构建系统聚类树；
步骤(3)以酸枣仁真品和酸枣仁伪品最小种间K2P遗传距离大于酸枣仁真品种内最大K2P遗传距离为指标，以及系统聚类树的支系为指标，得到酸枣仁真伪鉴定方法。
其中步骤(1)的方法如下：
将研磨好的粉末转移到含有0-0.1％β-巯基乙醇的缓冲液1的离心管中，迅速颠倒混匀后，将离心管放在56～65℃水浴中2-6h；
加入苯酚：氯仿：异戊醇体积比0-25：1-24：0-1，充分混匀，离心得上清液；将上清转移到新离心管中，向上清中加入异丙醇析出DNA，形成絮状沉淀，离心；弃上清，加入70-75％乙醇洗涤沉淀物，离心；弃去上清液乙醇，得DNA沉淀物干燥灭菌；双蒸水溶解DNA沉淀物，加入核糖核酸酶A并在35-40℃处理10-20min，除去RNA，即得总DNA。
步骤(1)所述的缓冲液1包括：浓度2％的CTAB 1g、100mmol/L的Tris·Cl 5mL、20mmol/L的EDTA 2mL、1.4mol/L的NaCl4.09g、2％的PVP1g加双蒸馏水到50ml。步骤(1)所述的PCR扩增反应体系如下：10×PCR缓冲液2.5μL、25mM MgCl22.00μL、2.5μmol·L-1引物各1.0μL、DNA模板量为3μL、2.5mM dNTP2.00μL、Taq(5U/μL)0.20μL，其余体积用灭菌的双蒸馏水补至25μL。
步骤(1)所述的PCR扩增引物如下：
正向引物:5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'，
反向引物：5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'。
步骤(1)中PCR扩增条件如下：94℃变性4-5min，经过35-40个循环，72℃延伸10min；琼脂糖凝胶电泳检测PCR情况，所述循环是指94℃变性30-45s，55℃-60退火45-90S72℃延伸145-60S)
步骤(1)中所述的酸枣仁伪品为枳椇子、理枣仁的药材或兵豆、紫荆子的种子。本发明进一步包括一种鉴定酸枣仁的DNA条形码，其特征在于，碱基序列如SEQ ID NO.1或SEQID NO.2所示。
本发明进一步包括一种酸枣仁伪品枳椇子的DNA条形码，其特征在于，碱基序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明鉴定方法的建立方法，进一步地，步骤(1)所述的总DNA的提取。优选采用高通量组织研磨仪(scientz-48,China)研磨120s(50Hz)成粉末状。采用高通量组织研磨仪相较液氮研磨省时省力，也可避免研钵清洗的不够干净而出现交叉污染的情况。
本发明鉴定方法的建立方法，进一步地，步骤(1)将研磨好的粉末转移到含有0-0.1％β-巯基乙醇的缓冲液1的离心管中，迅速颠倒混匀后，将离心管放在56～65℃水浴中2-6h(优选65℃水浴2h)。当在水浴过程中每15min颠倒离心管一次以混合样品。所述的0-0.1％β-巯基乙醇是抗氧化剂，目的是防止酚类氧化成醌类，防止褐化，使样品中的酚类杂质更容易去除。
本发明鉴定方法的建立方法，优选的，步骤(1)中所述加入苯酚：氯仿：异戊醇体积比25：24：1，充分混匀，离心得上清液，将上清转移到新离心管中，向上清中加入异丙醇析出DNA，形成絮状沉淀，离心；弃上清，加入70-75％乙醇洗涤沉淀物，离心；弃去上清液乙醇，得DNA沉淀物干燥灭菌；双蒸水溶解DNA沉淀物，加入核糖核酸酶A并在35-40℃处理10-20min，除去RNA，即得总DNA。
本发明鉴定方法的建立方法，进一步优选的，将上清转移到新1.5ml离心管中，向上清中加入1倍体积异丙醇(可加入1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2))，充分颠倒混匀，使DNA从溶液中析出，形成絮状沉淀(可室温或-20℃放置1-2h促进DNA沉淀)；4℃离心，12000rpm，20min；弃上清，加入70℅乙醇，颠倒混匀，至沉淀悬起；4℃，12,000rpm离心5min，再用70％乙醇洗涤一次；4℃，12,000rpm离心5min，弃酒精，将剩余的液体尽量吸净并干燥，加入适量灭菌后双蒸水溶解DNA；如果DNA溶解困难，可以37℃温育30min；DNA溶解后，可按样品体积加入1/10体积的浓度为10mg/ml的RNase A并在37℃处理10min，除去RNA，即得总DNA。
其中所述苯酚是pH＝8.0的tris-cl饱和苯酚。
本发明鉴定方法的建立方法，步骤(1)所述的缓冲液1是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并与核酸形成复合物缓。配制方法为浓度2％的CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)(w/v)1g、100mmol/L的Tris·Cl(PH 8.0)5mL、20mmol/L的EDTA(PH 8.0)2mL、1.4mol/L的NaCl4.09g、2％的PVP 1g加双蒸馏水到50ml。
当CTAB较难溶解，需65度加热溶解，并每隔30min摇晃试剂。
本发明鉴定方法的建立方法，步骤(1)所述的PCR扩增反应体系：10×PCR缓冲液2.5μL、25mM MgCl22.00μL、2.5μmol·L-1引物各1.0μL、DNA模板量为3μL、2.5mM dNTP2.00μL、Taq(5U/μL)0.20μL，其余体积用灭菌的双蒸馏水补至25μL。
本发明鉴定方法的建立方法，提取的DNA需要经过PCR扩增及测序，方法如下：
以提取的总DNA为模板，采用psbA-trnH序列的通用引物fwd-rev进行PCR扩增，其中正向引物fwd:5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'，反向引物rev：5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'；反应体系：2×Taq PCR MasterMix(PC0902.，北京艾德莱)12.5μL，引物各1.0μL(2.5μmol·L-1)、DNA模板量为3μL，其余体积用灭菌的ddH2O补至25μL；反应条件：94℃变性4min，经过35个循环(94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min)，72℃延伸10min；通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR情况，采用ABI 3730XL测序仪(AppliedBiosystems Co.，USA)进行双向测序。
本发明鉴定方法的建立方法，PCR扩增及测序后需要对所得DNA的进行处理以获得psbA-trnH序列：
采用CodonCode Aligner V3.7.1(CodonCodeCo.,USA)对测序峰图进行校对拼接，去除低质量区及引物区，获得psbA-trnH序列。所有序列采用MEGA 6.0(MolecularEvolutionary Genetics Analysis.，USA)进行分析比对，基于Kimura two-Parameter(K2P)模型计算种内、种间遗传距离，用邻接法(Neighbor Joining，NJ)构建系统发育树，并Bootstrap(1000次重复)检验各支的支持率。(A与其混伪品B的最小种间K2P距离大于A的种内最大K2P距离时，可以说明A与B两个种可以采用距离法区分开。没有具体的界限值。)上述结果以对照药材及专家鉴定过的酸枣仁及其混伪品的基原植物来进行验证，结果有效。
经过以上步骤得到psbA-trnH序列后，本发明获得了酸枣仁真品和伪品的DNA条形码，使用DNA条形码可以进行酸枣仁真品和伪品的鉴定。
基原植物也可以采用DNA条形码技术，方法和步骤同上。(在总DNA提取的过程中，不需要将基原植物切碎，直接从研磨开始)。基原植物是指中药材的植物基源，每一种中药材名称和植物名称可能不一样，但之间有个对应，某一种中药材可能来源于几种相近的植物，那么这几种植物都成为这种中药材的基原植物。
获得高质量的中药材基因组DNA是中药材DNA条形码技术研究的前提和基础。与新鲜叶片组织等相比，中药材受炮制及次生代谢产物的影响，其DNA提取相对比较困难。本发明中对种子样品，采用将其切碎再研磨的方法，以保证样品研磨彻底；采用两次苯酚：氯仿：异戊醇(体积比25：24：1)的漂洗过程，能有效去除裂解混合液当中的蛋白质；苯酚能使蛋白质变性，并在其变性后能将变性的蛋白质溶解；氯仿也是蛋白质的变性剂，并能稳定水溶液与苯酚层之间的界面；异戊醇可防止混合时产生泡沫，可以有效去除蛋白质。不同产地、不同批次的样品均成功获得其DNA，其PCR产物均测序成功并获得高质量的psbA-trnH序列。本研究成功地直接从酸枣仁药材中提取DNA使得开展中药材DNA条形码鉴定研究更具现实意义。
试验例
植物DNA条形码技术，通常采用的有rbcL、matK、ITS2、psbA-trnH基因序列，由于rbcL、matK的鉴定效率主要在属水平，因此本发明主要对ITS2、psbA-trnH的鉴定效率进行了筛选，筛选过程如下：
1.ITS2序列
选择4份酸枣仁样品(样本号06AZ820151126364、65、67、73)，采用以上方法进行DNA提取，以提取的DNA为模板，进行ITS2序列的通用引物序列进行ITS2序列扩增。其中正向引物为2F:5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’,反向引物为3R:5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。反应体系：2×Taq PCR MasterMix(PC0902.，北京艾德莱)12.5μL，引物各1.0μL(2.5μmol·L-1)、DNA模板量为3μL，其余体积用灭菌的ddH2O补至25μL；反应条件：94℃变性5min，经过40个循环(94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s)，72℃延伸10min；琼脂糖凝胶电泳检测PCR情况，采用ABI 3730XL测序仪(Applied Biosystems Co.，USA)进行双向测序。
将测序所得的峰图使用CodonCode Aligner V3.7.1(CodonCode Co.,USA)校对拼接，去除引物区及低质量区，基于隐马尔可夫模型HMMer，使用网站(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/)注释除去5.8S和28S区，从而获得ITS2序列。
将所得序列进行相似性搜索法进行鉴定，比对结果如下图1所示。图中酸枣仁样品06AZ820151126365的ITS2序列同时以100％的比对率比对到酸枣Ziziphus jujubavar.spinosa和枣Ziziphusjujuba，其他3个样品的比对结果与样品06AZ820151126365的比对结果相同，说明基于相似性搜索法的ITS2序列不能成功鉴定酸枣。
从GenBank下载枣Zizyphusjujuba的ITS2序列(GQ434736、GQ434735、KF530294)，基于ITS2序列，对酸枣及枣的ITS2序列进行多序列比对分析，比对结果如下图2所示，图中酸枣与枣的ITS2序列的同源性达98.9％，二者序列基本一致，因此ITS2序列不能有效鉴定酸枣。
2.psbA-trnH序列
对上述实验的4份酸枣仁样品(样本号06AZ820151126364、65、67、73)的DNA，采用上文提到的psbA-trnH序列的引物及反应体系进行psbA-trnH序列扩增，去除引物区及低质量区，获得酸枣仁的psbA-trnH序列。
将所得序列进行相似性搜索法进行鉴定，比对结果如下图3所示。图中酸枣仁样品06AZ820151126365的psbA-trnH序列以99％的比对率比对到酸枣Ziziphus jujubavar.spinosa，其他3个样品的比对结果与样品06AZ820151126365的比对结果相同。说明基于相似性搜索法的psbA-trnH序列能成功鉴定酸枣。
其中酸枣仁碱基序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，酸枣仁序列的psbA-trnH序列长度出现321bp及292bp连个长度的原因是psbA-trnH序列中的POLY结构导致的部分碱基缺失，有可能是一代测序中出现的机器偏差，也有可能在物种进化过程中变异产生的。
一种酸枣仁伪品枳椇子碱基序列如SEQ ID NO.3所示。
从GenBank下载枣Zizyphusjujuba的psbA-trnH序列(HG765028-30、EU075109、GQ435353)，基于psbA-trnH序列，对酸枣及枣的psbA-trnH序列进行多序列比对分析，比对结果如下图4所示。图中酸枣在序列尾端的300bp左右出现15个碱基的缺失，而枣的psbA-trnH序列不存在此缺失。据此可以说明psbA-trnH序列能成功鉴定酸枣仁。
本发明的优点：
1.本发明通过实验及数据分析发现ITS2序列不能鉴定酸枣仁，而psbA-trnH序列能够鉴定酸枣仁。
2.中药材中含量大量的蛋白质、多糖等次生代谢物质，DNA提取困难。针对不同的中药材，其DNA提取方式应做出相应的改进。本发明中的酸枣仁药材是种子类药材，含有的多糖、酚类等次生代谢产物影响DNA提取效率。针对这一问题，本发明对有关步骤做出调整，成功地直接从酸枣仁药材中提取DNA使得开展酸枣仁的DNA条形码鉴定更具现实意义。
3.本发明采用的DNA条形码技术除分析酸枣仁常见的混伪品理枣仁、枳椇子外，还分析了酸枣仁的混伪品兵豆、紫荆子，充分研究了酸枣仁及其混伪品的psbA-trnH序列特征，更全面丰富了酸枣仁的DNA条形码鉴定范围。
4.本发明通过对市售酸枣仁药材进行DNA条形码鉴定研究，发现流通于药材市场的23份酸枣仁样品经本发明方法鉴定，其中8份为理枣仁，为药食同源的药材酸枣仁提供了有力的市场鉴定的范例。
附图说明
图1酸枣仁样品06AZ820151126365的ITS2序列比对图
图2酸枣仁与枣的ITS2序列多序列比对图
图3酸枣仁样品06AZ820151126365的psbA-trnH序列比对图
图4酸枣仁与枣的psbA-trnH序列多序列比对图
图5基于psbA-trnH序列构建酸枣仁及其混伪品的邻接(NJ)树(1000次重复)
具体实施方式
选择44份研究对象：包括酸枣仁20份：其中药材15份，对照药材1份，复核样品3份以及GenBank序列(EU075108)；滇刺枣18份：包括药材8份，基原植物7份以及GenBank序列(JX856980，KR533049-50)，枳椇子药材3份；兵豆1份，来自GenBank序列(JX505962)；紫荆子2份，来自GenBank序列(GU396780，GQ434979)。滇刺枣基原物种的实验材料经中国科学院西双版纳热带植物园潘勃博士鉴定，其余实验材料经河北中医学院郑玉光教授鉴定，所有实验材料的凭证标本保存于安国数字本草检验中心有限公司中药资源研究中心，所有实验材料的psbA-trnH序列按单倍型提交至GenBank。详细信息见表1。
表1实验样品信息表
注：复核样本指在不同实验室复查核实的样本。
实施例1酸枣仁药材的种内变异分析
酸枣仁种内不同来源样品20条序列比对后，psbA-trnH序列长度为321bp，GC含量为26.3％，酸枣仁的psbA-trnH序列种内存在9个变异位点，分别在175、176、232、246、258、261、268、274、281位点处，共8个单倍型。单倍型H1、H2样本各5个，分别同06AZ820151126363和06AZ820151126366；H3单倍型样本4个，同06AZ820151126375；H4单倍型2条，同和06AZ820151126372；H5、H6、H7、H8单倍型样本数均为1，分别为06AZ820151112501、EU075108、06AZ820151126365和06AZ820151126367(表2)。基于K2P模型计算遗传距离，酸枣仁药材的psbA-trnH序列种内平均K2P距离为0.003，种内最大K2P遗传距离为0.017。
表2酸枣仁psbA-trnH序列种内变异位点
注：*表示该位点碱基与第一行相同，-表示碱基缺失，X表示插入的碱基序列为“TCGATATCCTCTTCTCAATTTTTTTTA”。
实施例2酸枣仁药材及其混伪品的种间变异分析
滇刺栆种内不同来源样品的18条序列比对后，psbA-trnH序列长度为349bp，GC含量为25.4％。酸枣仁药材与其混伪品滇刺栆的psbA-trnH序列种间最小K2P距离为0.310，种间平均K2P距离为0.321。酸枣仁与其混伪品的最小种间距离产生于酸枣仁与北枳椇之间，为0.091，平均K2P遗传距离为0.093。酸枣仁与其混伪品的psbA-trnH序列的最小种间K2P遗传距离均大于酸枣仁的种内最大K2P遗传距离(表3)。
表3酸枣种内遗传距离及其与混伪品的种间遗传距离
实施例3酸枣仁药材及其混伪品的系统聚类分析
基于psbA-trnH序列构建酸枣仁及其混伪品的NJ系统聚类树(见图5)。图中酸枣仁与其混伪品聚为不同的支，与混伪品能明显区分开。滇刺栆、北枳椇、兵豆、紫荆均单独聚为一支，呈现良好的单系性。
本发明选取了酸枣仁及其常见混伪品理枣仁、枳椇子、兵豆、紫荆子在内的共5个物种进行DNA条形码研究。酸枣仁与其混伪品的种内、种间遗传距离分析表明，酸枣仁的种内最大遗传距离0.017远小于酸枣仁与其混伪品的最小种间距离0.091，酸枣仁种内平均遗传距离0.003远小于酸枣仁与混伪品的平均遗传距离0.093；同时，从基于psbA-trnH序列建立的酸枣仁及其混伪品的NJ树可以看出，不同来源的酸枣仁样品的psbA-trnH序列聚为一支，与混伪品聚为不同的支，明显与其混伪品鉴别开来。因此，基于通过最小距离法、建树法均能成功鉴定酸枣仁药材及其混伪品。
本发明中，从河北安国、安徽亳州药材市场及电商平台共收集23批标签为酸枣仁样品，采用基于psbA-trnH序列的DNA条形码技术鉴定，结果显示8批为其混伪品滇刺栆，其中4批购自于电商平台的标签为酸枣仁的样品经鉴定均为滇刺栆。本研究的实验结果证实酸枣仁存在滇刺栆作为混伪品的情况，同时也说明流通于药材市场，尤其是电商平台的酸枣仁药材缺乏规范有效的监管而存在质量问题。本研究利用psbA-trnH序列对药材酸枣仁及其混伪品进行了准确的鉴定，不仅保障了酸枣仁的用药安全，也为其市场监管及食品安全提供了科技支持。

Claims (10)

1.一种酸枣仁真伪鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)待测样品DNA提取，提取的DNA序列经过PCR扩增，再经CodonCode Aligner拼接，获得psbA-trnH序列；
2)和酸枣仁psbA-trnH序列进行K2P遗传距离和系统聚类树比较；
3)如待测样品的种内最大K2P遗传距离小于其与伪品最小种间K2P遗传距离，或经系统聚类树比较为同一支，则待测样品为真品。
2.如权利要求1所述鉴定方法的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)提取包括酸枣仁真品和酸枣仁伪品的DNA,提取的DNA序列经过PCR扩增，再经CodonCode Aligner拼接，获得psbA-trnH序列，DNA的提取方法为：酸枣仁真品和酸枣仁伪品，种子切碎，研磨成粉状，水浴，采用苯酚：氯仿：异戊醇的混合溶剂进行总DNA的提取；
步骤(2)根据psbA-trnH序列计算酸枣仁真品和酸枣仁伪品种内和种间遗传距离，并构建系统聚类树；
步骤(3)以酸枣仁真品和酸枣仁伪品的种间最小K2P遗传距离大于酸枣仁的种内最大K2P遗传距离为指标，以及系统聚类树的支系为指标，得到酸枣仁真伪鉴定方法。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，其中步骤(1)的方法如下：
将研磨好的粉末转移到含有0-0.1％β-巯基乙醇的缓冲液1的离心管中，迅速颠倒混匀后，将离心管放在56～65℃水浴中2-6h；
加入苯酚：氯仿：异戊醇体积比0-25：1-24：0-1，充分混匀，离心得上清液；将上清转移到新离心管中，向上清中加入异丙醇析出DNA，形成絮状沉淀，离心；弃上清，加入70-75％乙醇洗涤沉淀物，离心；弃去上清液乙醇，得DNA沉淀物干燥灭菌；双蒸水溶解DNA沉淀物，加入核糖核酸酶A并在35-40℃处理10-20min，除去RNA，即得总DNA。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，其中步骤(1)所述的缓冲液1包括：浓度2％的CTAB 1g、100mmol/L的Tris·Cl 5mL、20mmol/L的EDTA 2mL、1.4mol/L的NaCl4.09g、2％的PVP1g加双蒸馏水到50ml。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中步骤(1)所述的PCR扩增反应体系如下：10×PCR缓冲液2.5μL、25mM MgCl22.00μL、2.5μmol·L-1引物各1.0μL、DNA模板量为3μL、2.5mM dNTP2.00μL、Taq(5U/μL)0.20μL，其余体积用灭菌的双蒸馏水补至25μL。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，其中步骤(1)中的PCR扩增引物如下：
正向引物:5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'，
反向引物：5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，其中步骤(1)中PCR扩增条件如下：94℃变性4-5min，经过35-40个循环，72℃延伸10min；琼脂糖凝胶电泳检测PCR情况，所述循环是指94℃变性30-45s，55℃-60退火45-90S 72℃延伸145-60S)。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，其中步骤(1)所述的酸枣仁伪品为枳椇子、理枣仁的药材或兵豆、紫荆子的种子。
9.一种鉴定酸枣仁的DNA条形码，其特征在于，碱基序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
10.一种酸枣仁伪品枳椇子的DNA条形码，其特征在于，碱基序列如SEQ ID NO.3所示。
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