CN110229927A - 一种基于dna条形码鉴定黑果枸杞的方法及其应用 - Google Patents

一种基于dna条形码鉴定黑果枸杞的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于DNA条形码鉴定黑果枸杞的方法。所述鉴定黑果枸杞的DNA条形码基因序列为LRITS2(the second internal transcribed spacer，第二个核糖体RNA内转录间隔区)/LRpsbA‑trnH(叶绿体基因psbA和trnH之间的一段非编码区)。所述鉴定黑果枸杞的DNA条形码序列LRITS2/LRpsbA‑trnH可以同时应用或任选其中之一。本发明能高效、精准地鉴定黑果枸杞原料。防止类似的混淆品或伪品，同时，可用于果粉、果实碎末等的鉴定，为保障食品安全和消费者权益具有重要的应用价值和较大的社会效益。

Description

一种基于DNA条形码鉴定黑果枸杞的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术鉴定方法，具体涉及植物物种的生物技术鉴定方法，尤其涉及一种基于DNA条形码鉴定黑果枸杞的方法及其应用。
背景技术
黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)为茄科(Solanaceae)枸杞属(Lycium)多年生多棘刺灌木，主要分布于中国的陕西省北部、宁夏自治区、甘肃省、青海省、新疆自治区和西藏自治区，中亚、高加索和欧洲亦有分布。然而，市场上经常以喀什小檗(Berberiskaschgarica Rupr.)和白刺(Nitraria tangutorum Bobr.)的干果等冒充黑果枸杞。因此，为保障食品原料的安全和消费者的合法权益，对黑果枸杞的果实和果实粉末进行准确、有效地鉴定是极其有必要的。
植物DNA条形码分子鉴定技术是基于DNA条形码(基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列)来进行特种鉴定的一种分子生物学技术。它是传统的形态学鉴定方法的补充，能够在植物形态不完整或缺乏形态结构(如，粉末)时对植物进行精准和有效地鉴定。由于其具有进化速率快、易扩增的特点，核糖体中的ITS2(第二个核糖体RNA内转录间隔区)和叶绿体中的psbA-trnH(叶绿体基因psba和trnh之间的非编码区)序列已经被推荐为首先的植物DNA条形码序列，它们能够在特种水平上对植物进行有效、精准的鉴定《植物DNA条形码技术》(任保青等,2010)。
食品原料的准确的鉴定是安全生产、食品安全和消费者权益保障的基础。已有研究表明，ITS2序列在种级水平上鉴定植物的分辨率可达到92％以上，psbA-trnH序列的分辨率达到63％以上(Validation of the ITS2Region as a Novel DNA Barcode forIdentifying Medicinal Plant Species)(Species identification of Alnus(Betulaceae)using nrDNA and cpDNA genetic markers)。因此，结合ITS2和psbA-trnH序列能够有效、准确地对植物物种进行鉴定，可将ITS2和psbA-trnH序列作为黑果枸杞DNA条形码的标准序列。
在实际的生产中，本发明人在采购黑果枸杞原料时，经常遇到的问题是无法保证原料的完整性，这给原料的形态学鉴定带来了较大的困难。因此，探寻更科学、准确的鉴定方法是首要任务。以ITS2和psbA-trnH序列作为黑果枸杞鉴定的标准序列，并应用到其果实和果粉的鉴定，目前尚未见到相关的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计采用生物技术鉴定黑果枸杞的方法。
本发明提供一种基于DNA条形码鉴定黑果枸杞的方法。
本发明所采用的技术方案是：
所述鉴定黑果枸杞的DNA条形码基因序列为LRITS2(the second internaltranscribed spacer，第二个核糖体RNA内转录间隔区)或LRpsbA-trnH(叶绿体基因psbA和trnH之间的一段非编码区)。
所述鉴定黑果枸杞的DNA条形码序列LRITS2/LRpsbA-trnH可以同时应用或任选其中之一。
具体的，本发明基于DNA条形码鉴定黑果枸杞的方法包括下列步骤：
(一)DNA的提取
分别取0.5g的黑果枸杞(采购自中国青海诺木洪)干净无霉变的果实和果实粉样本，作好标记后迅速放入液氮中，储存于-80℃冰箱中，备用。
样品基因组DNA采用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取方法如下：
(1)研钵用液氮预冷，CTAB提取液于65℃预热，灭菌的2mL离心管置于冰上，备用。
(2)将样品放于研钵，加0.01g PVP(聚乙烯吡咯烷酮)后，加液氮研磨至粉末，边研磨边加入液氮；
(3)将粉末转入2mL离心管内，离心管内预加入800μL预热的CTAB提取液，1μL巯基乙醇(2‰)，于65℃水浴1h，每隔10min轻摇一次，使其混合；
(4)向混合液中加入相同体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混合液，轻颠倒使其充分反应10min后，于4℃，12000rpm离心15min；
(5)离心后取上清，加2.5μL的RNase(RNA酶)(10mg/mL)，37℃保温1h，加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)，轻摇混匀10min，4℃，12000rpm离心15min。重复洗脱1次；
(6)离心后取上清，置入新的2mL EP离心管，加入2/3上清液体积的于-20℃预冷的异丙醇，1/10体积3M NaAC(醋酸钠)(pH＝5.2)，混匀，-20℃放置1h或者过夜；
(7)取出放于冰上10min，4℃，12000rpm离心10min，弃上清；
(8)沉淀物用70％的乙醇(200μL)漂洗，12000rpm离心5min，漂洗3次后，置于超净台晾干30min，用ddH2O溶解；
提取好的DNA样品用NanoDrop 2000检测，并稀释为30ng/μL，储存于-20℃冰箱中，备用。
(二)PCR扩增
(1)PCR扩增引物和筛选
ITS2和psbA-trnH的通用引物(表1)由上海擎科生物科技有限公司合成：
表1 ITS2和psbA-trnH的通用引物
表2 DNA条形码反应体系
配制表1中20μL体系的PCR反应混合物。在1.5mL EP管中分别加入表2中物质，混匀后放入PCR扩增仪中，即得到DNA条形码基因序列为LRITS2和(或)LRpsbA-trnH；
PCR循环反应条件设置如下：94℃，5min；30循环，(94℃1min，55℃1min，72℃1.5min)；72℃，7min；
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外凝胶成像系统下观察扩增结果(图1)，扩增结果表明，ITS2和psbA-trnH序列的长度均在500bp，二者均可用于样本的DNA条形码分子鉴定。而且二者可以同时应用或任选其中之一。
本发明的另一目的是提供了DNA条形码序列ITS2或psbA-trnH序列在鉴定黑果枸杞中的应用。
本发明采用the best match、the nearest genetic distance、系统进化树法和特征位点法对本发明公布的两条DNA条形码序列进行验证，结果表明，该两条DNA条形码序列都可以作为黑果枸杞鉴定的标准序列，可以有效地应用于鉴定黑果枸杞。
本发明得到的黑果枸杞的DNA条形码序列可以作为黑果枸杞DNA条形码分子鉴定方法的标准检测序列，能够高效、精准地鉴定黑果枸杞原料。与传统的形态学鉴定相比，DNA条形码鉴定方法具有更广泛的应用价值和前景。在实际的生产过程中，市场销售的黑果枸杞原料有时会掺入形态特征类似的混淆品或伪品，同时，部分原料可能无法保证具有完整的形态学特征，如，果粉、果实碎末等，这给传统的形态学鉴定带来了挑战。针对上述问题，采用DNA条形码鉴定方法，可以高效、准确地对原料进行鉴定。采用条形码分子鉴定技术对植物原料进行鉴定，是对传统形态学鉴定方法的有效补充，同时，对保障食品安全和消费者权益具有重要的应用价值和较大的社会效益。
附图说明
图1 ITS2和psbA-trnH序列扩增结果
图2实施例2 LRITS2与ITS2(a)和LRpsbA-trnH与psbA-trnH(b)序列的遗传距离
图3实施例3 LRITS2与ITS2(a)和LRpsbA-trnH与psbA-trnH(b)序列的系统进化树分析
图4实施例4 LRITS2与ITS2(a)和LRpsbA-trnH与psbA-trnH(b)序列的特征位点
具体实施方式
下面利用实施例对本发明进行近一步说明：
实施例使用的原料除另有说明外，均通过市售得到。
取采购的黑果枸杞干燥的果实(市售得到，来自自中国青海诺木洪)和果实粉样本进行验证。
实施例1
1.DNA的提取
分别取0.5g的干净无霉变的果实和果实粉样本，作好标记后迅速放入液氮中，储存于-80℃冰箱中，备用。
样品基因组DNA采用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取并稍做修改。具体方法如下：
(1)研钵用液氮预冷，CTAB提取液于65℃预热，灭菌的2mL离心管置于冰上，备用。
(2)将样品放于研钵，加0.01g PVP(聚乙烯吡咯烷酮)后，加液氮研磨至粉末，边研磨边加入液氮。
(3)将粉末转入2mL离心管内，离心管内预加入800μL预热的CTAB提取液，1μL巯基乙醇(2‰)，于65℃水浴1h，每隔10min轻摇一次，使其混合。
(4)水浴后加入相同体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混合液，轻颠倒使其充分反应10min后，于4℃，12000rpm离心15min。
(5)离心后取上清，加2.5μL的RNase(10mg/mL)，37℃保温1h，加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)，轻摇混匀10min，4℃，12000rpm离心15min。重复洗脱1次。
(6)离心后取上清，置入新的2mL EP管，加入2/3上清液体积的于-20℃预冷的异丙醇，1/10体积3M NaAC(pH＝5.2)，混匀，-20℃放置1h或者过夜。
(7)取出放于冰上10min，4℃，12000rpm离心10min，弃上清。
(8)沉淀物用70％的乙醇(200μL)漂洗，12000rpm离心5min，漂洗3次后，置于超净台晾干30min，用ddH2O溶解。
提取好的DNA样品用NanoDrop 2000检测，并稀释为30ng/μL，储存于-20℃冰箱中，备用。
2.PCR扩增
(1)PCR扩增引物和筛选
ITS2和psbA-trnH的通用引物(表1)由上海擎科生物科技有限公司合成。
表1 ITS2和psbA-trnH的通用引物
配制20μL体系的PCR反应混合物。在1.5mL EP离心管中分别加入表2中物质。混匀后放入PCR扩增仪中。
PCR循环反应条件设置如下：94℃，5min；30循环，(94℃1min，55℃1min，72℃1.5min)；72℃，7min。
表2 DNA条形码反应体系
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外凝胶成像系统下观察扩增结果(图1)。扩增结果表明，ITS2和psbA-trnH序列的长度均在500bp，二者均可用于样本的DNA条形码分子鉴定，而且二者可以同时应用或任选其中之一。
(三)测序
扩增产物直接送上海擎科生物科技有限公司进行双向测序。测序后的DNA条形码序列用软件DNAMAN 5.0校对拼接，部分位点进行人工校正，并对测序结果进行验证。
依据Best close match(最优比对)法(DNA barcoding and development ofspecies-specific markers for the identification of tea mosquito bugs(Miridae:Heteroptera)in India.Environ Entomol)(Rebijith等,2012)对样本的测序结果进行验证：
黑果枸杞果实的ITS2-1序列与果粉的ITS2-2序列的测序结果完全一致(LRITS2)，与黑果枸杞的对照序列的相似度达到了98.90；
黑果枸杞果实的psbA-trnH-1序列与果粉的psbA-trnH-2序列的测序结果完全一致(LRpsbA-trnH)，与黑果枸杞的对照序列的相似度达到了98.97％。
依据测序结果，采购的黑果枸杞原料的ITS2序列和psbA-trnH序列与黑果枸杞的对照序列的相似度均达到了98％以上。据此，可判断原料的物种为黑果枸杞。
实施例2
1.DNA的提取与PCR扩增方法同实施例1
2.测序
扩增产物直接送上海擎科生物科技有限公司进行双向测序。测序后的DNA条形码序列用软件DNAMAN 5.0校对拼接，部分位点进行人工校正。
3.测序结果验证
依据The nearest distance(最小遗传距离)法对测序结果进行验证：
从NCBI GENEBANK网站上下载公开的研究人员上传的枸杞属植物的ITS2序列和psbA-trnH序列，其中ITS2序列共53条，psbA-trnH序列共6条。用MEGA 7.0对序列进行比对，并分别计算LRITS2、LRpsbA-trnH与对照序列(黑果枸杞)的遗传距离。计算结果表明LRITS2与对照序列的遗传距离最小，为0.000(图2a)；LRpsbA-trnH与对照序列的遗传距离最小，为0.009(图2b)。因此，本发明公布的两条DNA条形码可以有效地对黑果枸杞进行鉴定。
见图2 LRITS2与ITS2(a)和LRpsbA-trnH与psbA-trnH(b)序列的遗传距离。
实施例3：
依据系统进化的方法对样本的测序结果进行验证：
用MEGA 7.0对实施例3中下载的序列进行比对后，采用Maximum Likelihoodmethod(最大似然法)构建系统进化树。研究结果表明LRITS2与黑果枸杞对照序列聚类在一起，bootstrap(自展值)为86，说明该系统进化可靠(图3a)；LRpsbA-trnH与对照序列聚类在一起，bootstrap为71，说明该系统进化可靠(图3b)。因此，本发明公布的两条DNA条形码可以有效地对黑果枸杞进行鉴定。
图3 LRITS2与ITS2(a)和LRpsbA-trnH与psbA-trnH(b)序列的系统进化树分析。
实施例4：
依据Character-based tests(特征位点)法对样本的测序结果进行验证：
用MEGA 7.0对案例2中下载的序列进行比对后，统计并分析ITS2和psbA-trnH序列的变异位点(作为特征位点)。研究结果表明，LRITS2的特征位点分别在156，169，200，213，243，245，246，247，252，256，257，259，260和263，对比分析结果表明，LRITS2序列的特征位点与黑果枸杞的完全一致(图4a)；LRpsbA-trnH的特征位点分别在265，285，290，358，439和446，对比分析结果表明，LRpsbA-trnH序列的特征位点与黑果枸杞的完全一致(图4b)。因此，本发明公布的两条DNA条形码可以有效地对黑果枸杞进行鉴定。
综上所述，采用the best match、the nearest genetic distance、系统进化树法和特征位点法对本发明公布的两条DNA条形码序列进行验证，结果表明，该两条DNA条形码序列可以作为黑果枸杞鉴定的标准序列，可以有效地鉴定黑果枸杞。
本发明所述的实施例是为了解释说明本发明的技术方案，需要说明的是，本领域的普通技术人员应当理解，并可以对本发明的技术方案进行调整或改进。这些调整和改进也应在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 上海诺德生物实业有限公司
<120> 一种基于DNA条形码鉴定黑果枸杞的方法及其应用
<141> 2019-06-04
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 454
<212> DNA
<213> 黑果枸杞(Lycium ruthenicum)DNA条形码 LRITS2
<400> 1
tgcagaatcc agcgaacaat cgagtctttg aacgcaagtt gcgcccgaag ccattaggcc 60
gagggcacgt ctgcctgggc gtcacgcatc gcgtcgcccc cgcccgccgc gcccacgcta 120
tgggtcgcgg cggtgtcgcg gggcggatac tggcctcccg tgcgcctcgc gctcgcggct 180
ggcctaaatg cgagtccacg tcgacggacg tcgcggcaag tggtggttgt aacccaactc 240
tcgaagtgtc gcggctgtgc cccgtcgcgc gtttggcctc ccggaccctt ctcgcgctta 300
ggcgctccga ccgcgacccc aggtcaggcg ggattacccg ctgagtttaa gcatatcaat 360
aagcggagga aaagaaactt acgaggattc ccctagtaac ggcgagcgaa ccgggaacag 420
cccagcttta gaatcgggcg gcccccccgc ccga 454
<210> 2
<211> 510
<212> DNA
<213> 黑果枸杞(Lycium ruthenicum)DNA条形码 LRpsbA-trnH
<400> 2
ataactaccc tctagacgta gctgctatcg aagctccatc tacaaatgga taagatccca 60
gtatagtcta taggaggttt tgaaaagaaa ggagcaataa tcattttctt gttctatcaa 120
gaaggggcta ttgctccttt ctttttttct ttttatatta ttaatttacc agtattttac 180
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tgttcctctt gttgctaatg ttactatatc ttttttattt catttctaaa aaaaatcgaa 360
ttttgacttc atattcttat ctttgaaata agaaagaaga gatattttcg aactttaatc 420
ttttgttttc gaatttaaat aatgtcaaaa tggaatgaat ggaatgtaag tacgcgaggg 480
gacgcatgta gccaagagca gcaaggcagt 510

Claims (6)

1.一种基于DNA条形码鉴定黑果枸杞的方法，其特征在于，
所述鉴定黑果枸杞的DNA条形码基因序列为LRITS2/LRpsbA-trnH。
2.根据权利要求1所述一种基于DNA条形码鉴定黑果枸杞的方法，其特征在于，所述鉴定黑果枸杞的DNA条形码基因序列LRITS2如SEQ ID NO.1所示的DNA序列。
3.根据权利要求1所述一种基于DNA条形码鉴定黑果枸杞的方法，其特征在于，所述鉴定黑果枸杞的DNA条形码基因序列LRpsbA-trnH如SEQ ID NO.2所示的DNA序列。
4.如权利要求1所述一种基于DNA条形码鉴定黑果枸杞的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：
(一)DNA的提取
分别取0.5g的黑果枸杞干净无霉变的果实和果实粉样本，作好标记后迅速放入液氮中，储存于-80℃冰箱中，备用；
样品基因组DNA采用CTAB法提取方法如下：
(1)研钵用液氮预冷，CTAB提取液于65℃预热，灭菌的2mL离心管置于冰上，备用；
(2)将样品放于研钵，加0.01g PVP后，加液氮研磨至粉末，边研磨边加入液氮；
(3)将粉末转入2mL离心管内，离心管内预加入800μL预热的CTAB提取液，1μL巯基乙醇，2‰，于65℃水浴1h，每隔10min轻摇一次，使其混合；
(4)向混合液中加入相同体积的酚/氯仿/异戊醇25∶24∶1混合液，轻颠倒使其充分反应10min后，于4℃，12000rpm离心15min；
(5)离心后取上清，加2.5μL的RNase，10mg/mL，37℃保温1h，加入等体积氯仿/异戊醇24∶1，轻摇混匀10min，4℃，12000rpm离心15min。重复洗脱1次；
(6)离心后取上清，置入新的2mL EP离心管，加入2/3上清液体积的于-20℃预冷的异丙醇，1/10体积3M NaAC，pH＝5.2，混匀，-20℃放置1h或者过夜；
(7)取出放于冰上10min，4℃，12000rpm离心10min，弃上清；
(8)沉淀物用70％的乙醇(200μL)漂洗，12000rpm离心5min，漂洗3次后，置于超净台晾干30min，用ddH2O溶解；
提取好的DNA样品用NanoDrop 2000检测，并稀释为30ng/μL，储存于-20℃冰箱中，备用；
(二)PCR扩增
(1)PCR扩增引物和筛选
ITS2和psbA-trnH的通用引物，表1
表1 ITS2和psbA-trnH的通用引物
表2 DNA条形码反应体系
配制表1中20μL体系的PCR反应混合物。在1.5mL EP离心管中分别加入表2中物质，混匀后放入PCR扩增仪中，即得到DNA条形码基因序列为LRITS2/LRpsbA-trnH；
PCR循环反应条件设置如下：94℃，5min；30循环，94℃1min，55℃1min，72℃1.5min；72℃，7min；
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外凝胶成像系统下观察扩增结果，扩增结果表明，ITS2和psbA-trnH序列的长度均在500bp。
5.如权利要求1所述DNA条形码序列基因ITS2或psbA-trnH基因在鉴定黑果枸杞中的应用。
6.根据权利要求5所述一种基于DNA条形码鉴定黑果枸杞的方法，其特征在于，所述鉴定黑果枸杞的DNA条形码基因序列LRITS2/LRpsbA-trnH可以同时或任选其中之一用于鉴定黑果枸杞。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110592265A (zh) * 2019-10-29 2019-12-20 江西省农业科学院蔬菜花卉研究所 一种用于茄属植物快速鉴定的dna条形码及方法
CN111690763A (zh) * 2020-04-28 2020-09-22 宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所 用于枸杞品种鉴定的dna条形码及其鉴定方法
CN111733273A (zh) * 2020-06-30 2020-10-02 宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所 Dna条形码序列及其鉴定枸杞种属的方法
CN111733272A (zh) * 2020-06-30 2020-10-02 宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所 来源于枸杞叶绿体的dna条形码及其鉴定枸杞种属的方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103323551A (zh) * 2013-06-25 2013-09-25 上海诺德生物实业有限公司 一种检测枸杞酸含量的方法
CN107475359A (zh) * 2016-06-23 2017-12-15 安国数字本草检验中心有限公司 一种药食同源药材酸枣仁及其混伪品的dna条形码鉴定方法
CN107523639A (zh) * 2017-09-30 2017-12-29 数字本草中医药检测有限公司 一种宁夏枸杞与枸杞鉴定用snp特异性引物及其鉴别方法
CN111378777A (zh) * 2018-12-27 2020-07-07 株式会社津村 用于鉴别生药的引物组以及使用该引物组的生药鉴别方法
CN111733273A (zh) * 2020-06-30 2020-10-02 宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所 Dna条形码序列及其鉴定枸杞种属的方法
CN111893202A (zh) * 2020-04-28 2020-11-06 宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所 一种基于dna条形码的枸杞快速鉴定方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103323551A (zh) * 2013-06-25 2013-09-25 上海诺德生物实业有限公司 一种检测枸杞酸含量的方法
CN107475359A (zh) * 2016-06-23 2017-12-15 安国数字本草检验中心有限公司 一种药食同源药材酸枣仁及其混伪品的dna条形码鉴定方法
CN107523639A (zh) * 2017-09-30 2017-12-29 数字本草中医药检测有限公司 一种宁夏枸杞与枸杞鉴定用snp特异性引物及其鉴别方法
CN111378777A (zh) * 2018-12-27 2020-07-07 株式会社津村 用于鉴别生药的引物组以及使用该引物组的生药鉴别方法
CN111893202A (zh) * 2020-04-28 2020-11-06 宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所 一种基于dna条形码的枸杞快速鉴定方法
CN111733273A (zh) * 2020-06-30 2020-10-02 宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所 Dna条形码序列及其鉴定枸杞种属的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TIANYI XIN等: "Super food Lycium barbarum (Solanaceae) traceability via an internal transcribed spacer 2 barcode", 《FOOD RESEARCH INTERNATIONAL》 *
万如等: "基于psbA － trnH 序列条形码鉴定21 份枸杞属植物", 《江苏农业科学》 *
顾选等: "基于DNA条形码-产地-形态联用的药材溯源新方法研究――以黑果枸杞1种伪品为例", 《中国中药杂志》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110592265A (zh) * 2019-10-29 2019-12-20 江西省农业科学院蔬菜花卉研究所 一种用于茄属植物快速鉴定的dna条形码及方法
CN110592265B (zh) * 2019-10-29 2023-11-24 江西省农业科学院蔬菜花卉研究所 一种用于茄属植物快速鉴定的dna条形码及方法
CN111690763A (zh) * 2020-04-28 2020-09-22 宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所 用于枸杞品种鉴定的dna条形码及其鉴定方法
CN111893202A (zh) * 2020-04-28 2020-11-06 宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所 一种基于dna条形码的枸杞快速鉴定方法
CN111733273A (zh) * 2020-06-30 2020-10-02 宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所 Dna条形码序列及其鉴定枸杞种属的方法
CN111733272A (zh) * 2020-06-30 2020-10-02 宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所 来源于枸杞叶绿体的dna条形码及其鉴定枸杞种属的方法

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