CN114438248B

CN114438248B - 基于scar分子标记鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的方法

Info

Publication number: CN114438248B
Application number: CN202210156994.0A
Authority: CN
Inventors: 蒋研风羊; 晁志; 郑如文; 谢雪那; 刘宏; 黄荣; 杜海泳
Original assignee: Guangzhou Baiyunshan Guanghua Pharmacy Co ltd
Current assignee: Guangzhou Baiyunshan Guanghua Pharmacy Co ltd
Priority date: 2022-02-21
Filing date: 2022-02-21
Publication date: 2024-04-16
Anticipated expiration: 2042-02-21
Also published as: CN114438248A

Abstract

本发明公开了一种基于SCAR分子标记鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的方法，所述SCAR分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述引物对的正向引物的序列如SEQ ID No.2所示，反向引物的序列如SEQ ID No.3所示。本发明的SCAR分子标记、以及引物对，可以特异性地、准确地鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡，为竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的开发利用与保护提供研究基础，亦可为其它中药材遗传特性和鉴别提供借鉴。

Description

基于SCAR分子标记鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的方法

技术领域

本发明属于药材检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的SCAR分子标记、引物对、以及基于SCAR分子标记鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的方法。

背景技术

柴胡属是分类和系统发育研究中的一个“困难”类群，在柴胡属的植物鉴定中，常以小总苞片的宽度、叶的形状、伞幅的多少及果实棱槽油管数等常作为主要分类依据。而对于柴胡药材而言，由于药材之间形态、结构极近似，性状、显微(组织构造和粉末)等传统鉴定方法有比较大的难度，即使是有丰富经验的专业人员或药师，也费时费力，并且不能保证精确无误。

竹叶柴胡，性味苦寒，具有散风退热、疏肝解郁之功效，可用于感冒发热。西南地区惯用竹叶柴胡的全草入药，其曾在一定时期作为正品柴胡来使用。竹叶柴胡及其变种窄竹叶柴胡为目前市场上药材柴胡的主要三大来源之一。但不同种柴胡药材的临床疗效并不相同，在使用时还应与正品北柴胡、狭叶柴胡加以区分。

在普通DNA条形码鉴定技术中，ITS、trnH-psbA、matK、rbcL和rps16等DNA分子标记为柴胡属植物的分类鉴定与系统学研究提供了重要依据。然而，虽然柴胡属的单系性已经得到分子证据的支持，但属内不同物种间的系统发育关系目前仍然存在争议。

中药资源准确的基原鉴定，是保证用药安全有疗效的关键。因此，建立一种准确、快速、可靠的柴胡药材鉴定方法，对保障柴胡药材的质量及用药安全具有重要意义。

在柴胡属叶绿体基因组中富含大量的遗传信息，如大量单核苷酸多态性位点(SNP)、插入缺失位点、结构变异位点和拷贝数变异位点，这也将对柴胡属植物分类、药材鉴定研究有重要的指导意义。

SCAR(Sequence characterized amplified regions，序列特征扩增区域)标记技术，是用特异引物对基因组DNA进行扩增，获得可以反映标记性状的特异DNA片段的技术，通常在不同的个体之间表现为存在或缺失，在图谱中通常为单一条带的有或无，简单、结果可靠、成本低，可用于作物杂交育种、品种鉴定和混伪品的鉴别当中。

提供一种基于SCAR分子标记的、适合于鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的方法非常有意义。

发明内容

基于此，本发明的目的之一在于提供一种鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的SCAR分子标记，该SCAR分子标记可以特异地、准确地鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡。

实现上述发明目的的具体技术方案包括如下：

一种鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的SCAR分子标记，所述SCAR分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了上述SCAR分子标记在鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡中的应用。

本发明还提供了一种鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的引物对，所述引物对包括：如SEQ ID No.2所示的正向引物和如SEQ ID No.3所示的反向引物。

本发明还提供了上述引物对在鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡中的应用。

本发明还提供了上述引物对在制备鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的制剂中的应用。

本发明还提供了一种鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的制剂，所述制剂包括上述引物对。

在其中一些实施例中，所述制剂为试剂盒。

本发明还提供了一种鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的方法。

实现上述发明目的的具体技术方案包括如下：

一种鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的方法，包括以下步骤：

(1)、以待鉴定柴胡样品的DNA为模板，上述引物对为引物，进行PCR扩增；

(2)、对PCR扩增产物进行电泳检测，鉴定待鉴定柴胡样品是否为竹叶柴胡或窄竹叶柴胡。

在其中一些实施例中，步骤(1)中所述PCR扩增的反应体系为：模板1.5μL～2.5μL、上游引物0.3μL～0.5μL、下游引物0.3μL～0.5μL；Taq Mix 5μL～7μL；去离子水加至15μL。

在其中一些实施例中，步骤(1)中所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性，保持4min；94℃变性，保持30s，54℃退火，保持30s，72℃延伸，保持1min，共35个循环；72℃保持8min。

在其中一些实施例中，步骤(2)中，若PCR扩增产物出现150bp特异性条带，待鉴定柴胡样品为竹叶柴胡或窄竹叶柴胡。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用比较基因组分析方法，在竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的叶绿体基因组中发现可以用于鉴别竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的SCAR分子标记的高变异区域，并根据该SCAR分子标记，设计了特异性引物对；利用本发明的特异性引物对扩增柴胡类药材，只有竹叶柴胡或窄竹叶柴胡有唯一的、特异性条带，而其余同属柴胡类药材没有扩增条带；说明本发明的SCAR分子标记、以及引物对，可以特异性地、准确地鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡，为竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的开发利用与保护提供研究基础，亦可为其它中药材遗传特性和鉴别提供借鉴。

附图说明

图1为本发明实施例1中，比对叶绿体基因组后发现的竹叶柴胡和窄竹叶柴胡的变异位点。

图2为本发明实施例2中使用通用引物扩增柴胡样本后，琼脂糖凝胶电泳图像；其中：DNA marker(M)指示DNA长度；泳道1～5为窄竹叶柴胡，6～8为竹叶柴胡，9～14为西康柴胡，15～16为紫花鸭跖柴胡，17～18紫花大叶柴胡，19～20为大叶柴胡，21为锥叶柴胡，22为线叶柴胡，23～24为狭叶柴胡，25为三岛柴胡，26～30为银州柴胡，31为雾灵柴胡，32～48为北柴胡，49～51为黑柴胡，52～56为黄花鸭跖柴胡，57～58为小叶黑柴胡，最后的泳道为空白。

图3为本发明实施例2中使用特异引物对扩增柴胡样本后，琼脂糖凝胶电泳图像；其中：DNA marker(M)指示DNA长度；泳道1～5为窄竹叶柴胡，6～8为竹叶柴胡，9～14为西康柴胡，15～16为紫花鸭跖柴胡，17～18紫花大叶柴胡，19～20为大叶柴胡，21为锥叶柴胡，22为线叶柴胡，23～24为狭叶柴胡，25为三岛柴胡，26～30为银州柴胡，31为雾灵柴胡，32～48为北柴胡，49～51为黑柴胡，52～56为黄花鸭跖柴胡，57～58为小叶黑柴胡，最后的泳道为空白。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

在本发明的其中一个方面，提供了一种鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的SCAR分子标记，所述SACR分子标记是通过比较竹叶柴胡和窄竹叶柴胡及其近源柴胡类药材的叶绿体基因组，发现的专属于竹叶柴胡和窄竹叶柴胡的特异性区域。在柴胡属叶绿体基因组中富含大量的遗传信息，如大量单核苷酸多态性位点(SNP)、插入缺失位点、结构变异位点和拷贝数变异位点，这对柴胡属植物分类、药材鉴定研究有重要的指导意义。

由于叶绿体的遗传模式是母系的，因此使叶绿体DNA更容易追踪个体谱系。与核基因组相比，叶绿体基因组对于追踪植物分类和鉴定更为重要，并在植物物种中高度保守。因此，本发明基于叶绿体基因组序列，采用SCAR分子标记对柴胡属植物开展鉴定，比传统鉴定更简单、可靠。

本发明提供的鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的SCAR分子标记，其获取方法包括以下步骤：

(1)、提取竹叶柴胡和窄竹叶柴胡及其近缘物种如北柴胡等柴胡类药材的基因组DNA，进行高通量测序，经过组装、拼接、注释后，获取竹叶柴胡和窄竹叶柴胡及其近缘物种如北柴胡等柴胡类药材的叶绿体基因组；

(2)、使用Geneious v 20.0.4中的MAFFT插件进行序列比对，以NCBI上已经公开发表的柴胡属物种的叶绿体基因组如北柴胡(B.chinense，序列号NC046774)序列为参考，在Annotation&Predict工具栏中使用“Find Variation/SNP”模块对柴胡属植物叶绿体基因组序列中的SNPs和InDels位点进行查找。由于叶绿体基因组很大，会有很多的序列特征扩增区域，需要先找到这样的高变异域。本发明的发明人经过寻找，找到了只有在竹叶柴胡和窄竹叶柴胡的序列中出现的一段序列，因此，这段序列可作为鉴别竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的特异性区域，即为鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的SCAR分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

SEQ ID No.1：

ACTGAAGTTTCTTCATAATGCTCATTTCAGTCAAAGAAAACGTATACGGAACAACCACAAAACAAAGCCCTTTTTGTGGTTTTTTACGTGTATGGAAATCTACACAACTAAATTTAATAAAAAAAGAAGTAACAAAAAAAAAAAATAGATTCATCTTTTCTTTTTTATATCAAAGCATTTCGAAATACATAAATTGTTTTAATACAATATTTGTTAGAATTGACAGTTTAGAGTCCGATAGATCCGATTTTCAAAATCTTTTTTGTCAATTGATGTTTATTTTTCTACTTTCTTTTTCATTTTGTGTTACTTAATGACCAAACATCCTT

在本发明的其中一个方面，根据鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的SCAR分子标记，确定适合设计SCAR分子标记特异性引物的位置，按照引物设计原则，使用Primer 6软件，设计了SCAR分子标记特异性引物，正向引物和反向引物分别如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

正向引物zychF：5′-GACAGTTTAGAGTCCGATACA-3′(SEQ ID No.2)

反向引物zychR：5′-ATTGTCACTGACTACTCAGAG-3′(SEQ ID No.3)

在本发明的另一方面，提供了一种鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的方法，其是以待鉴定柴胡样本的DNA为模板，SCAR分子标记特异性引物为引物，进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果，若PCR产物中出现有150bp左右的特异性条带，则待鉴定柴胡样本为竹叶柴胡或窄竹叶柴胡。

除非另外指明，本发明的实施例中所使用的实验方法，均为本领域常规方法，实施例中所用到的各种试剂耗材，均为市售产品。

以下结合具体实施例来详细说明本发明。

实施例1鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的SCAR分子标记、以及特异性引物对

本实施例中发现了鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的SCAR分子标记，并根据该分子标记设计了特异性引物对，具体包括以下步骤：

1、获取样本的叶绿体基因组

提取58个柴胡样本的DNA，这58个样本包括5个窄竹叶柴胡、3个竹叶柴胡样本和50个其近缘物种如北柴胡等柴胡类样本。对58个样本的DNA进行高通量测序，经过组装、拼接、注释后，获取样本的叶绿体基因组(Jansen,Robert K.,et al.Methods for obtainingand analyzing whole chloroplast genome sequences.Methods in enzymology 395)。样本的具体信息如表1所示。

表1样品信息表

2、SNPs和InDels位点查找与分析

使用Geneious v 20.0.4中的MAFFT插件，对58个样本的叶绿体基因组进行序列比对，以NCBI上已经公开发表的柴胡属物种的叶绿体基因组如北柴胡(B.chinense，序列号NC046774)序列为参考(表2)。在Annotation&Predict工具栏中使用“Find Variation/SNP”模块对柴胡属植物叶绿体基因组序列中的SNPs和InDels位点进行查找潜在鉴别竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的特异性区域。通过比对叶绿体基因组后，在ycf4-cemA基因的间隔区，竹叶柴胡和窄竹叶柴胡出现一个329bp的插入(见图1)。即为鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的SCAR分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

表2柴胡属叶绿体基因组序列

3、引物对设计

确定适合设计引物的位置，按照引物设计原则，使用Primer 6软件设计正、反向的引物。将正向引物设计在InDels的位置(即SCAR分子标记，329bp的插入片段上)，反向引物设计在保守区域，获得评分高的引物。采用Oligo7对所设计的引物进行评估，并使用在线网站Primer-BLAST进行进一步的验证。将设计好的引物序列送往上海生工生物技术有限公司合成。

引物对序列如下：

正向引物zychF：5′-GACAGTTTAGAGTCCGATACA-3′(SEQ ID No.2)

反向引物zychR：5′-ATTGTCACTGACTACTCAGAG-3′(SEQ ID No.3)

实施例2利用实施例1的SCAR分子标记特异性引物鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡

在本实施例中，分别使用实施例1获得的SCAR分子标记特异性引物，以及通用引物，对表1中的竹叶柴胡和窄竹叶柴胡以及近缘物种柴胡类药材进行了鉴定，以验证SCAR分子标记特异性引物鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的特异性，具体包括以下步骤：

(1)、配制PCR反应体系

根据MasterMix使用说明配制15μL PCR反应体系。

PCR反应的扩增体系为：DNA模板2μL；上下游引物各0.5μL；天根2X Taq Mix(withdye)6μL；去离子水7μL，反应总体积为15μL。

其中DNA模板分别为表1中58个柴胡样本的DNA。上下游引物为：实施例1中的引物对(SEQ ID No.2和SEQ ID No.3)、或通用引物(SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)。

通用引物：

正向引物u-psbAF1：5′-TTCATAAGGACCACCATTGT-3′(SEQ ID No.4)

反向引物u-psbAR2：5′-TGACCGCAACTTCTGTATT-3′(SEQ ID No.5)

(2)、PCR扩增

PCR反应扩增程序设置如下：①94℃预变性，保持4min；②94℃变性，保持30s，54℃退火，保持30s，72℃延伸，保持1min，共35个循环；③72℃保持8min，最后4℃保存。

(3)、PCR结束后，进行1.2％琼脂糖凝胶电泳

步骤如下：①称取0.3g琼脂放入烧杯中，再加45mL 0.5×TAE溶液；微波炉加热至完全融化。

②冷却至合适温度后加入5μL SuperRed核苷酸染液，混匀，混匀后倒至模板内冷却，凝固的琼脂置于电泳槽内(电泳液浓度为0.5×TAE)，使电泳液没过点样孔。

③点样：取5μL PCR样品与2μL 6X Loading Buffer混匀，取5μL放入琼脂糖凝胶孔内，留1个样品孔用于点Marker；电泳后的琼脂置透射仪上观察。

(4)、结果与分析

对表1中的柴胡物种分别使用通用引物(SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)进行PCR扩增，电泳图谱如图2所示。

从图2可知，使用通用引物对58个柴胡样本进行扩增，均有250bp左右的条带，说明提取的柴胡类药材的DNA质量完好。

对表1中的柴胡物种分别使用引物对(SEQ ID No.2和SEQ ID No.3)进行PCR扩增，电泳图谱如图3所示。

从图3可知，使用引物对对58个柴胡样本进行扩增，第1～8泳道的竹叶柴胡和窄竹叶柴胡，有约150bp的条带，其它柴胡属物种均无相应扩增条带。说明本发明的引物对具有特异性，可将竹叶柴胡和窄竹叶柴胡与其他柴胡属物种鉴别开，方法准确，可以为柴胡类药材准确的基原鉴定提供依据和保障，切实保护消费者权益。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州白云山光华制药股份有限公司

<120> 基于SCAR分子标记鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的方法

<130> 1

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 329

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

actgaagttt cttcataatg ctcatttcag tcaaagaaaa cgtatacgga acaaccacaa 60

aacaaagccc tttttgtggt tttttacgtg tatggaaatc tacacaacta aatttaataa 120

aaaaagaagt aacaaaaaaa aaaaatagat tcatcttttc ttttttatat caaagcattt 180

cgaaatacat aaattgtttt aatacaatat ttgttagaat tgacagttta gagtccgata 240

gatccgattt tcaaaatctt ttttgtcaat tgatgtttat ttttctactt tctttttcat 300

tttgtgttac ttaatgacca aacatcctt 329

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacagtttag agtccgatac a 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

attgtcactg actactcaga g 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttcataagga ccaccattgt 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgaccgcaac ttctgtatt 19

Claims

1.一种鉴定竹叶柴胡和窄竹叶柴胡的SCAR分子标记，其特征在于，所述SCAR分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的SCAR分子标记在鉴定竹叶柴胡和窄竹叶柴胡中的应用。

3.一种鉴定竹叶柴胡和窄竹叶柴胡的引物对，其特征在于，所述引物对包括：如SEQ IDNo.2所示的正向引物和如SEQ ID No.3所示的反向引物。

4.权利要求3所述的引物对在鉴定竹叶柴胡和窄竹叶柴胡中的应用。

5.一种鉴定竹叶柴胡和窄竹叶柴胡的制剂，其特征在于，所述制剂包括权利要求3所述的鉴定竹叶柴胡和窄竹叶柴胡的引物对。

6.一种鉴定竹叶柴胡和窄竹叶柴胡的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述的鉴定竹叶柴胡和窄竹叶柴胡的引物对。

7.一种鉴定竹叶柴胡和窄竹叶柴胡的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、以待鉴定柴胡样品的DNA为模板，权利要求3所述的引物对为引物，进行PCR扩增；

8.根据权利要求7所述的鉴定竹叶柴胡和窄竹叶柴胡的方法，其特征在于，步骤(1)中所述PCR扩增的反应体系为：模板1.5μL~2.5μL、上游引物0.3μL~0.5 μL、下游引物0.3μL~0.5 μL；Taq Mix 5μL~7μL；去离子水加至15μL。

9.根据权利要求7所述的鉴定竹叶柴胡和窄竹叶柴胡的方法，其特征在于，步骤(1)中所述PCR扩增的反应程序为：94 ℃预变性，保持4 min；94 ℃变性，保持30s，54℃退火，保持30s，72 ℃延伸，保持1 min，共35个循环；72 ℃保持8 min。

10.根据权利要求7所述的鉴定竹叶柴胡和窄竹叶柴胡的方法，其特征在于，步骤(2)中，若PCR扩增产物出现150bp特异性条带，待鉴定柴胡样品为竹叶柴胡或窄竹叶柴胡。