CN110484649A

CN110484649A - 荧光定量pcr检测粉拟青霉菌的引物和探针

Info

Publication number: CN110484649A
Application number: CN201910910660.6A
Authority: CN
Inventors: 林冬梅; 杨涛; 杨妙婷; 魏巍
Original assignee: Chengdu Map Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Chengdu Map Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-09-25
Filing date: 2019-09-25
Publication date: 2019-11-22

Abstract

本发明涉及荧光定量PCR检测粉拟青霉菌的引物和探针，属于荧光定量PCR检测技术领域。本发明提供了荧光定量PCR检测粉拟青霉菌Isaria farinosa的引物和探针，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，其中，探针核苷酸序列的5’端结合有荧光报告基团，3’端结合有荧光淬灭基团。本发明还进一步提供了粉拟青霉菌的检测方法。本发明的应用能够实现粉拟青霉菌的快速定量检测，有助于在冬虫夏草人工培育过程中降低粉拟青霉菌污染，提高蝙蝠蛾幼虫存活，为人工冬虫夏草的规模化生产提供有力保障。

Description

荧光定量PCR检测粉拟青霉菌的引物和探针

技术领域

本发明涉及荧光定量PCR检测粉拟青霉菌的引物和探针，属于荧光定量PCR检测技术领域。

背景技术

粉拟青霉菌(Isaria farinosa)又名虫草棒束孢，是一种土栖性真菌。据研究，它可以侵染几乎所有目的昆虫，是一种常见的昆虫病原真菌。由于粉拟青霉菌在世界范围内分布广泛，而且有相当广阔的寄主范围，目前已被用作一种生物因子防治农业害虫。

虽然粉拟青霉菌在生物防治方面是有益的，但是在名贵中药冬虫夏草的人工培育过程中，却是寄主昆虫蝙蝠蛾的高致死病原菌，直接影响幼虫存活率，并且在多年的实践过程中发现其病害发生呈现增强之势，对冬虫夏草的人工规模化培育造成困扰。因此，在冬虫夏草的人工培养过程中，及时发现是否有粉拟青霉菌并且找到其传播来源十分关键，如此才能及时进行防治，避免感染更多幼虫，以尽可能降低粉拟青霉菌病害。

粉拟青霉菌的传统检测方法是真菌培养与药敏性实验，但均存在耗时过长的缺陷，而且无法进行定量检测。因此，亟需提供一种能够快速、定量、准确检测粉拟青霉菌的方法，以实时监控饲养蝙蝠蛾幼虫过程中粉拟青霉菌病害的发生情况。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供荧光定量PCR检测粉拟青霉菌的引物和探针。本发明的另一目的在于提供粉拟青霉菌的检测方法。

本发明提供了荧光定量PCR检测粉拟青霉菌Isaria farinosa的引物和探针，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，其中，探针核苷酸序列的5’端结合有荧光报告基团，3’端结合有荧光淬灭基团。

进一步地，所述的荧光报告基团为FAM。

进一步地，所述的荧光淬灭基团为TAMRA。

本发明提供了所述的引物和探针在制备检测粉拟青霉菌Isaria farinose的试剂盒中的用途。

本发明提供了含有所述的引物和探针的试剂盒。

本发明提供了所述的试剂盒在检测粉拟青霉菌Isaria farinosa中的用途。

本发明提供了粉拟青霉菌Isaria farinosa的检测方法，包括如下步骤：取待测样品，提取DNA，采用所述的引物和探针进行PCR反应，将测得的Ct值代入标准曲线中，即得粉拟青霉菌含量。

进一步地，所述PCR反应的反应体系组成为：2×T5 Fast qPCR Mix、模板DNA、所述的引物和探针以及水。

优选地，所述反应体系每25ul的组成为：2×T5 Fast qPCR Mix 12.5ul、模板DNA2ul、上游引物0.5ul、下游引物0.5ul、探针0.5ul以及水9ul。

进一步地，所述PCR反应的反应条件为：50℃2min，然后95℃10min，接着95℃15s，最后60℃1min，40个循环。

本发明提供了荧光定量PCR检测粉拟青霉菌的引物和探针，并进一步提供了粉拟青霉菌的检测方法。该方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优势，能够准确及时地反映粉拟青霉菌的生物量情况，从而实现培养环境中粉拟青霉菌含量的实时监控。采用本发明提供的检测方法，有助于在冬虫夏草人工培育过程中降低粉拟青霉菌污染，提高蝙蝠蛾幼虫存活，为人工冬虫夏草的规模化生产提供有力保障。此外，粉拟青霉菌也是一种重要的生防菌，本发明检测方法的应用对利用粉拟青霉菌进行生物防治有重要意义。

附图说明

图1为实施例1中粉拟青霉菌qPCR标准曲线图；

图2为实施例1不同基质样品中粉拟青霉菌含量检测结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1荧光定量PCR检测粉拟青霉菌

获取引物与探针

从Genbank中获取粉拟青霉发表的Chit1基因序列(登录号：DQ406584.1)，利用clustalX对Genbank中发表的多种真菌Chit1基因序列(登录号：KM221003.1，KM220989.1，GU457411.1，EF203917.2)与粉拟青霉Chit1基因进行多重比对，选择特异性较大区域作为检测靶序列，再利用Primer Express v3.0和Primer Primer 5.0软件设计Tagman探针和特异性扩增引物，探针5’端标记荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团TAMRA，由成都擎科生物科技有限公司合成。

一、标准曲线制作

(1)将实验室收集的粉拟青霉菌Isaria farinosa菌种在玫瑰红钠营养琼脂培养基中培养。玫瑰红钠营养琼脂培养基成分含胨，葡萄糖，磷酸二氢钾，硫酸镁，玫瑰红钠，琼脂。于20～28℃培养5～7天待其长出菌落，液氮研磨后再用真菌基因组DNA快速提取试剂盒(生产厂商：上海斯信，货号：69104)提取其DNA，送样测序鉴定。取经鉴定为粉拟青霉菌的样品，将其分离纯化培养出菌落，提取DNA，测得其浓度后放入4℃冰箱中保存备用。

(2)将粉拟青霉菌标准品DNA进行浓度梯度稀释，分别得到浓度为1,10^-1,10^-2,10^-3,10^-4,10^-5,10^-6ug/ml的标准品DNA溶液，稀释后的DNA作为qPCR的模板DNA。同时设置阴性对照，阴性对照模板为水，目的是为了检查样品是否被污染，提高荧光定量检测可信度。

(3)分别对上述标准品DNA溶液进行荧光定量PCR，将上述稀释后的样品每个做3个平行，获得3个Ct值，再取Ct值得到平均值。qPCR反应程序以及反应体系如下：

qPCR扩增程序：50℃2min，然后95℃10min，95℃15s，最后60℃1min，共40个循环；

PCR体系：25ul

2×T5 Fast qPCR Mix 12.5ul

上游引物(SEQ ID No.1，5’—3’)：

TGAGTCTCCTCAAGAAATCGAT 0.5ul

下游引物(SEQ ID No.2，5’—3’)：

GCATTTGCGAAGCCAGTA 0.5ul

荧光探针(SEQ ID No.3，5’—3’)：

FAM-AGTCACCGCTTTGGCTACGCCAAT-TAMRA 0.5ul

模板DNA 2ul

水 9ul

不同浓度的标准品DNA经过qPCR检测，获得其Ct平均值。根据Ct平均值绘制标准曲线，见图1；横坐标表示粉拟青霉菌拷贝数的Log值，纵坐标表示Ct值；曲线表示粉拟青霉菌的拷贝数与qPCR检测Ct值存在线性关系。从图1可以看出，标准曲线线性关系较好，可用于下一步定量分析。

二、样品测定

对冬虫夏草人工培育的常用基质进行测试。设置三个实验组，分别为小金土，土+椰，土+饲料，其中，小金土为采集于阿坝州小金县美兴镇的高原腐殖质土壤(海拔高度为2367m)，土+椰为小金土和椰糠各50％w/w混合而成，土+饲料为小金土和胡萝卜各50％w/w混合而成。

(1)将样品进行冷冻干燥，准确称取样品30mg用于DNA制备。

(2)真菌基因组DNA快速提取试剂盒(生产厂商：上海斯信，货号：69104)提取样品DNA，并测量浓度。

(3)qPCR检测，设置三个平行样品，并设置阴性对照，阴性对照模板为水。qPCR反应程序以及反应体系如下：

PCR体系：25ul

2×T5 Fast qPCR Mix 12.5ul

上游引物(SEQ ID No.1，5’—3’)：

TGAGTCTCCTCAAGAAATCGAT 0.5ul

下游引物(SEQ ID No.2，5’—3’)：

GCATTTGCGAAGCCAGTA 0.5ul

荧光探针(SEQ ID No.3，5’—3’)：

FAM-AGTCACCGCTTTGGCTACGCCAAT-TAMRA 0.5ul

模板DNA 2ul

水 9ul

(4)测得不同样品Ct值后，根据Ct值通过标准曲线计算不同样品中粉拟青霉的菌体量，结果见图2；其中横坐标表示不同的基质样品，纵坐标表示qPCR检测的粉拟青霉菌含量(Copy/ug)。从图2可以看出，采用本发明方法可定量检测不同基质中的粉拟青霉菌含量。

需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。

序列表

<110> 成都图径生物科技有限公司

<120> 荧光定量PCR检测粉拟青霉菌的引物和探针

<130> A190958K

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgagtctcct caagaaatcg at 22

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcatttgcga agccagta 18

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agtcaccgct ttggctacgc caat 24

Claims

1.荧光定量PCR检测粉拟青霉菌Isariafarinosa的引物和探针，其特征是：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，其中，探针核苷酸序列的5’端结合有荧光报告基团，3’端结合有荧光淬灭基团。

2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征是：所述的荧光报告基团为FAM。

3.如权利要求1所述的引物和探针，其特征是：所述的荧光淬灭基团为TAMRA。

4.权利要求1～3任意一项所述的引物和探针在制备检测粉拟青霉菌Isaria farinosa的试剂盒中的用途。

5.含有权利要求1～3任意一项所述的引物和探针的试剂盒。

6.权利要求5所述的试剂盒在检测粉拟青霉菌Isariafarinosa中的用途。

7.粉拟青霉菌Isariafarinosa的检测方法，其特征是：包括如下步骤：取待测样品，提取DNA，采用权利要求1～3任意一项所述的引物和探针进行PCR反应，将测得的Ct值代入标准曲线中，即得粉拟青霉菌含量。

8.如权利要求7所述的检测方法，其特征是：所述PCR反应的反应体系组成为：2×T5Fast qPCRMix、模板DNA、权利要求1～3任意一项所述的引物和探针以及水。

9.如权利要求8所述的检测方法，其特征是：所述反应体系每25ul的组成为：2×T5Fast qPCR Mix 12.5ul、模板DNA2ul、上游引物0.5ul、下游引物0.5ul、探针0.5ul以及水9ul。

10.如权利要求7所述的检测方法，其特征是：所述PCR反应的反应条件为：50℃2min，然后95℃10min，接着95℃15s，最后60℃1min，40个循环。