CN107604089A - 一种鉴别石斛属植物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鉴别石斛属植物的方法，属于分子标记技术领域。本发明对样本进行总DNA提取；之后用ITS5F/4R引物扩增，接着使用CodonCode Aligner对扩增产物测序峰图进行校对拼接，去除低质量序列及引物区，用ClustalXv2.0进行多重序列比对后，去除俩端的多余序列，将处理后的序列使用Mega6.0软件计算序列的K‑2‑P距离，分析比较序列的种内种间遗传距离，并构建系统进化树，从而通过对不同种石斛的ITS序列的聚类来区分石斛物种。本发明解决了现有技术存在难以用传统的表型特征或理化分析等方法来鉴别石斛属植物的技术问题，能够快速、简便并且准确地鉴别石斛属植物。

Description

一种鉴别石斛属植物的方法

技术领域

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种鉴别石斛属植物的方法。

背景技术

石斛是兰科(Orchidaceae)最大的属之一，我国石斛属植物有74种2变种。石斛性味甘，微寒；归胃、肾经；具有益胃生津、滋阴清热的功效，是我国名贵中药材，其中可作药用的有40多种，《中国药典》2005年版只收载了金钗石斛、铁皮石斛Dendrobium officinale和马鞭石斛（流苏石斛）三种；2010年版规定石斛为金钗石斛、鼓槌石斛Dendrobiumchrysotoxum或流苏石斛的栽培品及其同属植物近似种的新鲜或干燥茎，铁皮石斛单独列为一种；2015年版规定石斛为金钗石斛、鼓槌石斛或流苏石斛的栽培品及其同属植物近似种的新鲜或干燥茎。

石斛属植物种类繁多，有些常见的物种易于区分，如鼓槌石斛、铁皮石斛、肿节石斛及棒节石斛等，但不少种类形态非常相似，难以区分，给石斛属植物的物种鉴别带来一定的困难。并且石斛属药材经过干燥和加工处理，单凭外部形态很难鉴别，导致石斛市场复杂混乱。陈科力等指出传统中药材普遍采用基源鉴定、形态鉴定、显微鉴定、理化鉴定等方法及传统的通过眼观、手摸、口尝等方法来鉴定（陈科力 等. 中药鉴定方法学发展历程[J].中国中药杂志, 2014, 39(7): 1203-1208.）。虽然这些方法中有的简便、直捷，但是人为干扰因素较多，主观性较强，如手摸、口尝，基源鉴定却要求鉴定者具备系统的分类学知识、较强的植物分类能力及一定的鉴定经验，这对中药材的分类鉴定及其相关知识的整理和交流都带来了许多困难，并且在植物的生长发育过程中，其性状和成分容易受到环境、生长期等诸多因素的影响。因此仅凭借这些传统的鉴定方法是不可能将中药材及其混伪品、伪品很好地鉴别开来的（陈士林 等. 中药鉴定学新技术新方法研究进展[J]. 中国中药杂志,2012, 37(8): 1043-1055；程芳婷 等. 地黄属植物的DNA条形码研究[J]. 植物科学学报,2015, 33(1): 25-32.）。

DNA分子标记技术可以弥补和克服传统鉴定方法上的一些缺陷和难题。但是，每一种分子标记技术都有其自身的特点和适用范围，普遍存在通用性差的问题。目前，DNA条形码技术是利用相对较短的标准DNA片段对物种进行快速准确鉴定的一门技术，得到了大多数专家学者的认可，在物种鉴定中得到了广泛而有效的应用，可快速、准确地鉴别植物种类（Li XW etal. Plant DNA barcoding: from gene to genome[J]. Biol Rev,2015, 90:157-166.）；该技术在中药材鉴定中得到了广泛的应用和快速发展，在药用植物及植物源药材鉴定等方面均取得了突出成绩（Yang JB etal. Applying plant DNA barcodes toidentify species of Parnassia(Parnassiaceae)[J]. Mol Ecol Resour, 2012, 12:267-275.），加快了中药鉴定标准化的进程。

丁小余等(丁小余 等. 枫斗类石斛rDNA ITS区的全序列数据库及其序列分析鉴别[J].药学学报，2002，37(7)：567-573.)对枫斗类石斛rDNA ITS区的全序列数据库及其序列做了分析鉴别，建立了21种枫斗类石斛的rDNA ITS区全序列数据库。刘静等(刘静 等.基于ITS序列的中国药用石斛及其混伪品的分子鉴定[J].中国中药杂志，2009, 34(22):2853-2856.)分析了17种药用石斛的rDNA ITS全序列，发现属间的遗传距离为0.295，石斛种间的平均遗传距离为0.142，种内各居群间的平均遗传距离为0.002。邵世光等(邵世光等. 枫斗类石斛cpDNA psbA-trnH的序列分析与鉴别[J].药学学报，2009，44(10): 1173-1178.)对15种常见的枫斗类石斛的psbA-trnH序列进行分析与鉴定，未发现所检测的枫斗类石斛居群间在psbA-trnH区的序列存在差异。黄海等(黄海 等. 石斛属植物DNA条形码序列的筛选[J].热带作物学报，2010，31(10):1769-1777.)筛选石斛属植物DNA形码序列(ITS、matK、trnH-psbA、rbcL)，表明ITS序列不仅种内变异和种间变异最大，而且有明显的barcoding gap，种内变异和种间变异重合较少，能较好地区分不同种类的石斛，可考虑作为石斛属DNA barcoding鉴定候选序列之一；但是，在所分析的4个候选序列中，没有任何一个单一序列能完全鉴别出不同种类的石斛属植物。

前人对石斛属的研究比较多，为石斛的精确鉴定及其种质资源的合理开发和利用提供了重要的依据。NCBI数据库中具有大量的石斛属植物遗传信息数据，ITS基因序列的变异特征以及它们在系统发育关系和物种鉴定等方面应用已经有了不少的报道，但前人关于石斛属植物的研究样本比较少，达不到较好的重复性，使得数据及结论不够全面、不够完善、甚至有相互矛盾的地方。石斛属植物中，有些常见的物种易于区分，如鼓槌石斛、铁皮石斛、肿节石斛及棒节石斛等，但不少种类形态非常相似，难以鉴别。因此如何克服现有技术的不足是目前分子标记技术领域亟需解决的问题。

发明内容

为解决现有技术存在难以用传统的表型特征或理化分析等方法来鉴别石斛属植物的技术问题，本发明提供了一种鉴别石斛属植物的方法，能既方便又能准确地鉴别石斛属植物。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种鉴别石斛属植物的方法，包括如下步骤：

（1）对待鉴定样本进行总DNA提取；

（2）以步骤（1）提取的总DNA为模板，用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR扩增，获得扩增产物；

（3）使用CodonCode Aligner对扩增产物测序峰图进行校对拼接，去除低质量序列及引物区，用ClustalXv2.0进行多重序列比对后，去除俩端的多余序列，处理后的序列用于下一步的序列分析；使用Mega6.0软件计算序列的K-2-P距离，分析比较序列的种内种间遗传距离，并构建系统进化树，从而通过对不同种石斛的ITS序列的聚类来区分石斛物种。

进一步，优选的是，所述PCR 扩增的体系为：ddH₂O 8.5μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，SEQ ID NO.1所示引物 2.5μmol/L 1μL，SEQ ID NO.2所示引物 2.5μmol/L 1μL，模板DNA 50ng/μL 2.0μL，总计25μL。

进一步，优选的是，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；然后进入循环，每个循环94℃变性50sec，54℃退火30 sec，72℃延伸60 sec，共30个热循环，最后延伸72℃延伸7min；4℃冷却后取出。

进一步，优选的是，待鉴定样本叶片按照CTAB法提取总DNA，使用RNA酶A纯化总DNA样本后，用紫外分光光度计测定260nm和280nm下的光密度值，当测得DNA纯度达到OD260/OD280在1.6-1.8之间，则进行步骤（2）PCR反应，反之，则需要重新提取DNA。

本发明对于使用的软件操作没有具体限制，按照本领域的常规使用方法即可。

本发明对采集到的12个石斛属物种的109样本，其中每个物种包含8-10个样本，使用ITS序列进行物种鉴别，以使实验数据具有足够的可靠性，从而为确保其种质资源的正确性及保障临床用药的安全提供重要的分子依据。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

（1）本发明解决现有技术存在难以用传统的表型特征或理化分析等方法来鉴别石斛属植物的技术问题。

（2）本发明在前期采集了12个石斛属物种109个样本，每个物种具有8-10个不同居群的样本，使得具有较好的重复性，从而使得DNA条形码对石斛属植物的鉴别更加真实有效。

（3）本发明通过建立的12种石斛属植物的DNA条形码，能轻易地将各物种区分开来。

（4）本发明通过对12种石斛属植物的ITS片段的PCR测序分析，发现这十二种石斛的种内遗传距离小于种间遗传距离，并且在构建的系统发育树上相同物种的不同样本均各自聚为一支（图1），因此，可以通过对不同种石斛的ITS序列的聚类能准确地区分石斛属植物。

（5）本发明利用高效自动化技术测序，即缩短了实验时间又降低了繁杂的人工测序劳作，易于对扩增样本进行标准化分析，提高了数据的可靠性。

附图说明

图1为基于ITS序列构建石斛属植物的NJ树。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

以下实施例无特别说明为常规方法。

本发明的主要仪器：

DYY一8C型电泳仪(北京六一仪器厂)；台式冷冻离心机（Beckman Coulter）；PCR仪（MJResearch (Waltham, MA, USA) PTC200-well thermal cycler）；紫外分光光度计(UV-2550型，SHIMADZU公司)、凝胶成像系统等。

实施例1 石斛属植物条形码的构建

1、石斛属植物样本的采集

本发明在前期采集了12个石斛属物种109个样本，每个物种具有8-10样本，使得具有较好的重复性，从而使得DNA条形码对石斛属植物的鉴别更加真实有效。所采集的石斛属物种样本均经植株形态鉴定确认，详见表1。

2、样本DNA的提取

样本各0.5g，分别按照改进的CTAB法（Doyle J. DNA protocols for plants-CTABtotal DNA isolation. In: Hewitt GM, Johnston A, eds. Molecular techniques intaxonomy. Berlin: Springer, 1991, 283-293.）提取基因组DNA(见第二章)。提取的DNA经RNA酶纯化后，用紫外分光光度计测定260nm和280nm下的光密度值，当测得DNA纯度达到OD260/OD280在1.6-1.8之间，则用于PCR反应。扩增反应在PCR仪上进行。如果用紫外分光光度计测定260nm和280nm下的光密度值，测得DNA纯度没有达到OD260/OD280在1.6-1.8之间，表明DNA纯度不够，易造成扩增不成功，需重新提取DNA。

3、选择目标片段引物

选择ITS5F/4R片段作为扩增的目标片段（由上海生工生物有限公司合成），RNA酶、2×Taq PCR Master Mix，均购自昆明傲雪商贸有限公司；

引物为ITS5F/4R引物，所述的ITS5F/4R引物由上游引物ITS5F和下游引物ITS4R组成，所述的上游引物ITS5F的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物ITS4R的碱基序列如SEQID NO：2所示。

4、PCR扩增

样本DNA加入ITS5F/4R引物进行扩增，反应热循环程序为：94℃预变性5min；然后进入循环，每个循环94℃变性50sec，54℃退火30 sec，72℃延伸60 sec，共30个热循环，最后延伸72℃延伸7min；4℃冷却后取出；扩增反应在PCR仪上进行。PCR反应体系(25μL)：ddH₂O8.5μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，上游引物(2.5μmol/L) 1μL，下游引物(2.5μmol/L) 1μL，模板DNA (50ng/μL) 2.0μL。

5、PCR产物纯化及测序

将扩增成功的PCR产物（出现明显PCR条带）送至上海生工测序中心进行纯化后使用ABI3730XL测序仪(Applied Biosystems Co.,USA)单向或双向测序。

6、数据处理和分析

采用序列拼接软件Codoncode Aligner (CodonCode Co.,USA)对测序峰图进行校对拼接，去除低质量序列及引物区，利用clustalX v2.0(Higgins D.G)进行多序列比对，去除俩端的多余序列，处理后的序列用于下一步的序列分析。使用Mega6.0软件计算序列的K-2-P距离，分析比较序列的种内种间遗传距离，并构建系统进化树，通过对不同种石斛的ITS序列的聚类来区分石斛物种。

7、结果与分析

（1）PCR扩增效率和测序成功率

PCR扩增效率和测序成功率是评价DNA条形码序列的一个重要指标，实验表明，ITS5F/4R片段在石斛属植物中扩增非常容易，测序成功率高，适合做为石斛属植物的条形码序列。

（2）ITS序列特征分析

所有石斛ITS序列经比对后共有692个排列位点，其中保守位点156个，约占22.5%；变异位点534个，约占77.2%；简约信息位点520个；约占75.1%。T、C、A、G碱基平均含量分别为23.4%、27.1%、23.5%、26.0%。

（3）石斛属植物种内、种间的遗传距离

理想的DNA条形码序列应当具有明显的种间变异，同时种内变异足够小。应用使用Mega6.0软件，基于K2P距离模型计算石斛属植物的种内种间遗传距离。短棒石斛的种内遗传距离均为0；杯鞘石斛的种内遗传距离为0～0.0035，平均遗传距离为0.0008；尖刀唇石斛的种内遗传距离为0；紫瓣石斛的种内遗传距离为0～0.0017，平均遗传距离为0.0003；细叶石斛的种内遗传距离为0～0.0122，平均遗传距离为0.0031；黄花石斛的种内遗传距离为0；流苏石斛的种内遗传距离为0；罗河石斛的种内遗传距离为0；线叶石斛的种内遗传距离为0～0.0087，平均遗传距离为0.0030；齿瓣石斛的种内遗传距离为0～0.0087，平均遗传距离为0.0035；美花石斛的种内遗传距离为0～0.0035，平均遗传距离为0.0012；矩唇石斛的种内遗传距离为0～0.0193，平均遗传距离为0.0047；种间遗传距离为0.0320～0.6136。综上所述，本发明中所有物种中，矩唇石斛的最大种内遗传距离最大，为0.0193，但小于最小种间遗传距离0.0320，因此所有物种的最大种内遗传距离均小于最小种间遗传距离。

（4）石斛属植物的ITS序列聚类分析

本发明中，为了直观地显示鉴定结果，基于ITS序列构建了短棒石斛、杯鞘石斛、尖刀唇石斛、紫瓣石斛、细叶石斛、黄花石斛、流苏石斛、罗河石斛、线叶石斛、齿瓣石斛、美花石斛、矩唇石斛的NJ树（如图1）。结果表明所有石斛物种均各聚为一支，并且具有较高的支持率，因此完全可以通过对不同种石斛的ITS序列的聚类来区分石斛物种。

本发明通过对ITS序列的分析比较，结果显示，ITS序列具有较好的稳定性与准确性，序列在物种内变异稳定，种间存在较大幅度的变异，易于石斛属植物的鉴别，适合做石斛属植物的DNA 条形码，该序列对于石斛属植物的鉴别具十分重要的作用。

表1本发明中所采集石斛样本的收集信息

序列表如表2所示。

表2

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<120> 一种鉴别石斛属植物的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (4)

1.一种鉴别石斛属植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）对待鉴定样本进行总DNA提取；

（2）以步骤（1）提取的总DNA为模板，用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR扩增，获得扩增产物；

（3）使用CodonCode Aligner对扩增产物测序峰图进行校对拼接，去除低质量序列及引物区，用ClustalXv2.0进行多重序列比对后，去除俩端的多余序列，处理后的序列用于下一步的序列分析；使用Mega6.0软件计算序列的K-2-P距离，分析比较序列的种内种间遗传距离，并构建系统进化树，从而通过对不同种石斛的ITS序列的聚类来区分石斛物种。

2.根据权利要求1所述的鉴别石斛属植物的方法，其特征在于所述PCR 扩增的体系为：ddH₂O 8.5μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，SEQ ID NO.1所示引物 2.5μmol/L 1μL，SEQ ID NO.2所示引物 2.5μmol/L 1μL，模板DNA 50ng/μL 2.0μL，总计25μL。

3.根据权利要求1所述的鉴别石斛属植物的方法，其特征在于所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；然后进入循环，每个循环94℃变性50sec，54℃退火30 sec，72℃延伸60sec，共30个热循环，最后延伸72℃延伸7min；4℃冷却后取出。

4.根据权利要求1所述的鉴别石斛属植物的方法，其特征在于，待鉴定样本叶片按照CTAB法提取总DNA，使用RNA酶A纯化总DNA样本后，用紫外分光光度计测定260nm和280nm下的光密度值，当测得DNA纯度达到OD260/OD280在1.6-1.8之间，则进行步骤（2）PCR反应，反之，则需要重新提取DNA。