CN110734998A

CN110734998A - 用于nfc橙汁和fc橙汁鉴别的引物、方法和试剂盒

Info

Publication number: CN110734998A
Application number: CN201911064812.1A
Authority: CN
Inventors: 陈颖; 韩建勋; 张九凯; 邢冉冉; 孙瑞雪
Original assignee: China inspection and Quarantine Research Institute
Current assignee: China inspection and Quarantine Research Institute
Priority date: 2019-11-04
Filing date: 2019-11-04
Publication date: 2020-01-31
Anticipated expiration: 2039-11-04
Also published as: CN110734998B

Abstract

本发明涉及用于鉴别NFC橙汁和FC橙汁的寡核苷酸引物。本发明还涉及用于鉴别NFC橙汁和FC橙汁的PCR检测方法，所述方法包括使用针对NFC橙汁与FC橙汁的特异性寡核苷酸引物。本发明还涉及用于准确鉴别NFC橙汁和FC橙汁的常规PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括用于常规PCR检测NFC橙汁和FC橙汁的特异性寡核苷酸引物。使用本发明的常规PCR检测方法和试剂盒，能够特异、灵敏、准确地鉴别市售NFC橙汁和FC橙汁。

Description

用于NFC橙汁和FC橙汁鉴别的引物、方法和试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于NFC橙汁和FC橙汁鉴别的寡核苷酸引物，用于鉴别NFC橙汁和FC橙汁的常规PCR检测方法，用于快速鉴别NFC橙汁和FC橙汁的常规PCR检测试剂盒以及特异性寡核苷酸引物在市售NFC橙汁和FC橙汁检测中的应用。

背景技术

果汁行业曾是世界饮料行业发展最为迅速的板块之一，但近几年随着人们健康意识的逐渐增强，高糖、高热量的果汁饮料销量逐渐下降，果汁行业总体呈增长疲软状态；仅贴合消费者营养健康和纯天然要求的100%纯果汁市场占有率在逐步提升。目前果汁领域将纯果汁进一步分为100%复原果汁（from concentrate，FC）和非复原果汁（not fromconcentrate，NFC）两大类。据2015年我国出台的《GB/T 31121-2014 果蔬汁类及其饮料》国家标准规定可知，采用机械方法直接制成的为原榨果汁即非复原果汁；在浓缩果汁中加入其加工过程中除去的等量水分复原而成的为复原果汁。由于消费者日益注重果汁产品的口感，接近原果品质的NFC果汁竞争优势日益显现。据2017年AIJN发布的果汁市场报告显示，美国NFC果汁的年产量约为175万吨，巴西NFC果汁年产量为120万吨，西方发达国家NFC果汁市场占有率达50%～70%；在巨大利益的驱使下，不法商贩枉顾道德与法律的约束，用假冒伪劣果汁欺骗消费者。FC果汁与NFC果汁原料一致，性质相近，不易区分，但价格差异较大，例如，NFC橙汁的价格约为FC橙汁价格的1.5倍。因此，FC果汁往往会成为NFC果汁的替代品。果汁掺假在食品掺假中占有重要的比重，尤其是橙汁，据统计，1980～2010年，橙汁掺假率达4%，在7种最常见的食品掺假目标中位于第5位。

由于受到原料产地、灌溉方式、品种以及果汁加工方式、贮藏条件种种因素的影响，不同品牌、批次、国家的橙汁差异较大，加大了真实属性鉴别的难度；DNA相对稳定，因此，从DNA层面，利用分子生物学的方法可对橙汁进行快速、高效鉴别，且特异性强，灵敏度高，不受上述因素的影响。国内外大量报道了采用PCR方法鉴定不同源性成分果汁的相关文献，相对来说，鉴定方法已经趋于成熟。但是利用PCR技术基于DNA降解程度的差异来鉴别NFC橙汁与FC橙汁尚未报道。

因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高的NFC橙汁与FC橙汁检测方法，以有效区分两类橙汁。

发明内容

本发明的一个目的在于，提供准确鉴别NFC橙汁和FC橙汁的特异性寡核苷酸引物。

本发明的另一个目的在于，提供准确鉴别NFC橙汁和FC橙汁的常规PCR检测方法。

本发明的另一个目的在于，提供准确鉴别NFC橙汁和FC橙汁的常规PCR检测试剂盒。

本发明的还一个目的在于，提供的特异性寡核苷酸引物在准确鉴别NFC橙汁和FC橙汁中的应用。

针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明的发明人根据甜橙叶绿体matK基因序列设计了能特异性鉴别NFC橙汁和FC橙汁的寡核苷酸引物对，能从样品DNA中高效特异扩增出一段仅存在NFC橙汁而不存在于FC橙汁的特异性基因片段。根据本发明的一个实施方案，本发明提供用于常规PCR方法鉴别NFC橙汁和FC橙汁的特异性寡核苷酸引物对，所述引物对是根据甜橙叶绿体matK基因在NFC橙汁和FC橙汁中的降解程度差异性的特点而设计的。所述引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物为matK-F：ACGACTTCCTATACCCACT（SEQ ID No.1），所述下游引物为matK-R：ACCGGAAAGATAGCCCAGA（SEQ ID No.2）。在一个实施方案中，本发明提供的NFC橙汁与FC橙汁特异性检测组合物，所述组合物包含特异性寡核苷酸引物对。在一个优选的实施方案中，本发明提供了用于常规PCR方法定性鉴别NFC橙汁和FC橙汁的组合物，所述组合物包含NFC橙汁特异性寡核苷酸引物对，其中所述NFC橙汁特异性引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.1，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No.2。

根据本发明的另一个实施方案，本发明提供NFC橙汁和FC橙汁的常规PCR定性鉴别方法，所述方法包括针对NFC橙汁的特异性寡核苷酸引物对，所述引物对是根据matK基因在NFC橙汁和FC橙汁中的降解程度具有差异性的特点而设计的。在一个实施方案中，本发明的NFC橙汁和FC橙汁定性鉴别的常规PCR检测方法中，所使用的NFC橙汁特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物碱基序列SEQ ID No.1，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No.2。在一个实施方案中，所述的PCR扩增条件为95℃预变性10 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环。

根据本发明的另一个实施方案，本发明提供用于准确鉴别NFC橙汁和FC橙汁的试剂盒，所述试剂盒包括本发明用于常规PCR方法鉴别NFC橙汁和FC橙汁的特异性寡核苷酸引物对和使用说明书。在本发明的试剂盒优选实施方案中，本发明的NFC橙汁和FC橙汁定性鉴别特异性寡核苷酸引物对是根据matK基因在NFC橙汁和FC橙汁中的降解程度具有差异性的特点而设计的。在一个实施方案中，所述试剂盒的NFC橙汁特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.1，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No.2。根据本发明的另一个实施方案，本发明提供用于准确鉴别NFC橙汁和FC橙汁的特异性寡核苷酸以及使用说明书。在试剂盒的一个优选实施方案中，所述试剂盒中包含NFC橙汁特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.1、SEQ ID No.2。在优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于准确鉴别NFC橙汁和FC橙汁的常规PCR扩增条件描述。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的说明书中给出的PCR扩增条件是95℃预变性10 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环。在一个具体的实施方案中，本发明用于NFC橙汁和FC橙汁定性鉴别的试剂盒还包括对照品。优选地，对照品包括阳性对照和空白对照。

根据本发明的再一个实施方案，本发明提供本发明的用于常规PCR方法鉴别NFC橙汁和FC橙汁的特异性寡核苷酸引物在鉴别样品中NFC橙汁成分中的应用。在一个优选的实施方案中，本发明提供样品中NFC橙汁的特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2。在另一个实施方案中，本发明还提供本发明的试剂盒在NFC橙汁FC橙汁定性鉴别中的应用。优选地，在本发明的上述应用中，所述方法包括本发明的NFC橙汁特异性寡核苷酸引物对。更优选的，在本发明的上述应用中，所述试剂盒包括本发明的NFC橙汁特异性寡核苷酸引物对在鉴别NFC橙汁和FC橙汁中的应用。

本发明以甜橙DNA为检测基础，根据matK基因在NFC橙汁和FC橙汁中的降解程度具有差异性的特点，设计和筛选引物，利用常规PCR法定性鉴别NFC橙汁和FC橙汁。

本发明的常规PCR方法是从DNA层面出发，不受原料产地、灌溉方式、品种以及果汁加工方式、贮藏条件种种因素的影响。本发明的按照引物序列制成的试剂盒，用于NFC橙汁和FC橙汁的定性鉴别，具有灵敏度高、特异性强、结果稳定可靠的优点。使用本发明的PCR检测方法和PCR检测试剂盒，可用于定性鉴别NFC橙汁和FC橙汁，其简单、快速、特异且灵敏的特点适应于不同国家、不同品牌、不同批次的NFC橙汁和FC橙汁的有效鉴别。

附图说明

图1显示的是常规PCR鉴别3种自制NFC橙汁和3种自制FC橙汁的结果，其中使用特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.1和SEQ ID No.2检测。箭头指示标志带，标志带的有或无可以对NFC橙汁和FC橙汁进行鉴别。泳道1和8分别为阳性对照（鲜榨橙汁）和空白对照（无菌水），泳道2、4、6为NFC橙汁，泳道3、5、7为FC橙汁。

图2是对常规PCR鉴别NFC橙汁和FC橙汁的灵敏度进行评价，将自制FC橙汁和NFC橙汁混合，使NFC橙汁和FC橙汁体积比为100%、80%、60%、40%、20%、0%。

图3是对本发明的NFC橙汁特异性引物对扩增片段在自制NFC橙汁中的贮藏稳定性进行评价，将自制NFC橙汁于4℃下贮藏，依次为阳性对照（鲜榨橙汁）、0 d、7 d、14 d、21 d、28 d以及空白对照（无菌水）。

图4是利用本发明建立的常规PCR方法对市售6份NFC橙汁和5份FC橙汁进行检测的结果。图4A中泳道2-7为市售NFC橙汁，图4B中泳道2-6为市售FC橙汁，图4中泳道1均为阳性对照（鲜榨橙汁），图4B中泳道7为空白对照（无菌水）。

具体实施方式

通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。

实施例1

本实施例为通过如下试验对鉴别NFC橙汁和FC橙汁的引物对的特异性、灵敏度和目的片段稳定性进行评价。

通过检测matK基因间区序列，可确定NFC橙汁引物对特异性、灵敏度和目的片段稳定性。反应体系为：Taq buffer 2.5 μL，dNTP mix 2 μL，Taq酶0.2 μL，10 μmol/ μL上下游引物各0.5 μL，DNA模版（1ng/ μL）10 μL，加ddH₂O至总体积25 μL。反应程序为95℃预变性10 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环。

所使用的鉴别NFC橙汁和FC橙汁的引物序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2.

所使用的检测主要仪器：

微量移液器、梯度PCR仪器、凝胶成像仪、高速台式离心机。

检测主要试剂：

新型植物基因组提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司；Taq酶、dNTPs、PCR缓冲液、溴化乙锭、Marker（DL 2000）均购自大连宝生物公司；琼脂糖，购自北京宏捷科技有限公司；无水乙醇、异丙醇，购自北京六合通公司。

检测主要步骤：

1 DNA提取

检测样本：（1）自制的3种NFC橙汁和3种FC橙汁用于特异性分析；（2）将自制NFC橙汁和FC橙汁混合，使NFC橙汁和FC橙汁体积比为100%、80%、60%、40%、20%、0%，用于分析引物的灵敏度。（3）将自制NFC橙汁于4℃下分别贮藏0 d、7 d、14 d、21 d、28 d，用于目的片段稳定性分析。

取样品1 mL于2 mL离心管中，加等体积异丙醇，-20℃富集30min。采用植物基因组提取试剂盒，按步骤提取样品基因组DNA。采用微量分光光度计检测提取物的浓度和纯度。

2 常规PCR鉴别所用的引物对

引物序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。

3 常规PCR反应体系：

Taq buffer 2.5 μL

dNTP mix 2 μL

Taq酶0.2 μL

10 μmol/ μL上下游引物各0.5 μL

DNA模版（1 ng/ μL）10 μL

加ddH₂O至总体积25 μL

注：每次检测均设立相应的空白对照(用配制反应体系的超纯水代替DNA模板，检测试剂是否受到污染)；

4 常规PCR反应参数

95℃预变性10 min

95℃变性30 s

55℃退火30 s

72℃延伸1 min

35个循环。

5 琼脂糖凝胶电泳分析

PCR反应结束后，利用2%的琼脂糖凝胶电泳分析结果。

如图1所示，利用常规PCR特异性鉴别NFC橙汁和FC橙汁时，3种NFC橙汁均有明亮的目标条带，3种FC橙汁未扩增出条带，阳性对照和空白对照结果正常，充分说明本实验设计的引物对NFC橙汁特异。

为确定NFC橙汁特异性引物对的灵敏度，将自制NFC橙汁和FC橙汁混合，使NFC橙汁和FC橙汁体积比为100%、80%、60%、40%、20%、0%，分别按照上述条件进行常规PCR扩增。实验结果如图2所示，该方法鉴别NFC橙汁和FC橙汁的相对灵敏度为40%（w/w）。

将自制NFC橙汁于4℃下分别贮藏0 d、7 d、14 d、21 d、28 d，用于目的片段稳定性分析。实验结果表明贮藏28 d后的NFC橙汁中均有明亮的目的片段产生（图3）。说明该目的片段稳定性较好，能满足保质期内NFC橙汁定性鉴别的要求。

实施例2

本实施例提供准确鉴别NFC橙汁和FC橙汁的试剂盒。所述试剂盒包括本发明用于常规PCR方法鉴别NFC橙汁和FC橙汁的特异性寡核苷酸引物及使用说明书。所述试剂盒包括引物对SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，所述使用说明书中给出了常规PCR扩增条件，该条件为95℃预变性10 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环。对于不同仪器，反应参数做适当调整。

为确保建立的方法具有可行性，选取11份市售橙汁样品，包括市售NFC橙汁6份，市售FC橙汁5份，与实施例1所述的方法相同，进行常规PCR检测，其中以无菌水作为试剂盒空白对照，以鲜榨橙汁DNA作为试剂盒阳性对照。

如图4所示，利用常规PCR鉴别市售NFC橙汁时，图4A中泳道2-7可以扩增出目的片段，判定为NFC橙汁，与标签相吻合，图4B中泳道2-6均无扩增，判定为FC橙汁，与标签相吻合，表明该方法能有效鉴别NFC橙汁和FC橙汁。

虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在附属权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。

Claims

1.用于常规PCR方法鉴别NFC橙汁和FC橙汁的特异性寡核苷酸引物对，其中所述引物对上游引物为: matK-F：ACGACTTCCTATACCCACT，所述下游引物为matK-R：ACCGGAAAGATAGCCCAGA。

2.通过常规PCR方法鉴别NFC橙汁与FC橙汁的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对和使用说明书。

3.准确鉴别NFC橙汁和FC橙汁的常规PCR方法，所述方法包括使用权利要求1所述的引物对和权利要求2所述的试剂盒。

4.权利要求1所述的引物对和权利要求2所述的试剂盒在鉴别NFC橙汁和FC橙汁中的应用。