CN108998565A - 一种台湾金线莲的分子特异性标记引物及其鉴别方法 - Google Patents

一种台湾金线莲的分子特异性标记引物及其鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种台湾金线莲的分子特异性标记引物及其鉴别方法。形态学鉴定方法和HPLC指纹图谱鉴定方法很难实现台湾金线莲种质资源的快速、准确鉴定。本发明一种台湾金线莲的分子特异性标记引物的核苷酸序列如下：上游引物IAF001‑F：5’‑CAATTGGCCCCTCTTGATTGAGGC‑3’；下游引物IAF001‑R：5’‑ATTTCAGGGCGTCACCTGCGACA‑3’。本发明利用上游引物IAF001‑F和下游引物IAF001‑R，通过常规PCR扩增，电泳检测，即可快速、准确的鉴别出台湾金线莲样品。本发明操作简便，耗时短，半日即可完成，且结果准确，是形态学方法辨别台湾金线莲的有效辅助手段。

Description

一种台湾金线莲的分子特异性标记引物及其鉴别方法
技术领域
本发明涉及一种鉴别台湾金线莲Anoectochilus formosanus Hayata的分子特异性标记引物，以及利用该分子特异性标记引物对台湾金线莲进行快速鉴别的方法。
背景技术
台湾金线莲(Anoectochilus formosanus Hayata)，又名台湾银线兰，是兰科开唇兰属(Anoectochilus Bl.)多年生珍稀药用植物，主要分布于台湾和广东地区。台湾金线莲素有“金草”、“神药”等美称，具有重要的药用价值、经济价值和观赏价值。植株富含维生素C及钙、磷、钠、钾、镁、铁、锰、锌、铜等元素，又可作为营养保健食品。台湾金线莲全草入药，具有消炎、解热、止血、降压、利尿、强心及滋补等功效。因此，台湾金线莲具有广阔的开发利用前景。在自然条件下，台湾金线莲种子发芽率极低，繁殖困难，生长发育缓慢，再加上人为过度采挖和生态环境的破坏，野生台湾金线莲资源趋于枯竭，目前已处于濒危状态。台湾金线莲(A.formosanus)与其同属近缘种金线莲(A.roxburghii)和滇越金线莲(A.chapaensis)的形态特征非常相似，利用形态学鉴别方法很难将台湾金线莲(A.formosanus)与其它两种金线莲区分开。因而，在过去的很多年里，将金线莲A.roxburghii和滇越金线莲A.chapaensis错误鉴定为台湾金线莲A.formosanus的情况时有发生。
目前，对以上3种植物辨别的方法主要是依据宏观上差异并不是很显著的叶或茎的性状，以及化学成分层面的差异。例如，易骏等人采用徒手切片、显微观察和数码照相方法，通过比较分析不同植物基原金线莲的植物形态特征、根、茎、叶的横切面组织构造及其组织特征，金线莲干燥药材粉末特征，对台湾金线莲、金线莲和滇越金线莲进行了生药鉴别(易骏等，不同植物基原金线莲生药鉴别，中草药，2015，46：3570-3576)；胡珊梅等人采用高效液相色谱法，通过构建HPLC指纹图谱进行了金线莲和台湾金线莲之间的鉴别(胡珊梅等，一种金线莲指纹图谱的建立方法及福建金线莲和台湾金线莲指纹图谱，中国发明专利，专利申请号：201210203783.4)。然而，形状特征及化学成分含量容易受生境、气候、生理状况等因素的影响，而常常导致主观辨别上的偏差。因此，形态学鉴定方法和HPLC指纹图谱鉴定方法不但操作繁琐，而且很难实现台湾金线莲种质资源的快速、准确鉴定。
DNA分子标记技术弥补和克服了传统形态学鉴定和化学指纹图谱鉴定方法的一些缺陷和难题。DNA分子标记不受环境及基因表达与否的限制，该技术能对不同发育时期的个体、任何组织器官甚至细胞作检测，可以通过基因序列差异比较分析为植物鉴别、系统分类提供直接的证据。真核生物的核糖体基因rRNA的内转录间隔区(Internal TranscribedSpacer,ITS)的保守性非常强。种内ITS序列相对一致，而种间差异比较明显，这一特点使得ITS序列不仅适合于属内物种间的系统发育分析，而且非常适合于植物物种的分子鉴定。对台湾金线莲(A.formosanus)与其同属近缘种金线莲(A.roxburghii)和滇越金线莲(A.chapaensis)的ITS区序列测序结果显示，A.formosanus、A.roxburghii和A.chapaensis的ITS(ITS1-5.8S-ITS2)序列长度均为654bp。因此，很难运用通用ITS引物(ITS4/ITS5)通过PCR扩增、普通电泳对3个相似种进行快速、准确鉴别。
发明内容
本发明的第一个目的针对现有技术的不足，提供一种台湾金线莲A.formosanus的分子特异性标记引物，该分子特异性标记引物序列如下：
上游引物IAF001-F：5’-CAATTGGCCCCTCTTGATTGAGGC-3’，如SEQ ID NO.1所示；
下游引物IAF001-R：5’-ATTTCAGGGCGTCACCTGCGACA-3’，如SEQ ID NO.2所示；
该分子特异性标记引物组合的获取方法如下：首先采用常规PCR技术，对台湾金线莲A.formosanus与其2个相似种(金线莲A.roxburghii和滇越金线莲A.chapaensis)样本的核糖体ITS区序列进行克隆、测序。然后对测序获得的3个相似物种的ITS序列进行碱基差异比对，并在此基础上开发设计出分子特异性标记引物组合(IAF001-F/R)。该分子特异性标记引物组合(IAF001-F/R)具有极高的专一性，利用该分子特异性标记引物组合对台湾金线莲A.formosanus、金线莲A.roxburghii和滇越金线莲A.chapaensis进行PCR扩增，可以从台湾金线莲A.formosanus样品中获得分子量为573bp大小的特异性DNA片段。
本发明的第二个目的是提供利用上述分子特异性标记引物组合对台湾金线莲A.formosanus与两个相似种(金线莲A.roxburghii和滇越金线莲A.chapaensis)进行快速鉴别的方法。
本发明采用上述分子特异性标记引物的上游引物(IAF001-F)、下游引物(IAF001-R)作为PCR扩增引物，以被测植株样品的DNA为模板，进行PCR扩增。然后，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳结果出现573bp的特异性DNA条带，则被测植株样品为台湾金线莲A.formosanus；若电泳结果未出现573bp的DNA条带，则被测植株样品不是台湾金线莲A.formosanus。
具体的所述方法如下：
(1)样品总基因组DNA提取：剪取被测植物样品(台湾金线莲A.formosanus、金线莲A.roxburghii、滇越金线莲A.chapaensis)叶片0.1g放入研钵，加入液氮磨碎至粉末，然后，利用UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(订购于上海生工生物工程股份有限公司)提取被测植物样品的基因组DNA。所得DNA用0.8％琼脂糖胶进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测浓度，稀释至50ng/μL。
(2)PCR扩增：以步骤(1)提取的被测植物样品DNA为模板DNA，以所述分子特异性标记的上游引物(IAF001-F)、下游引物(IAF001-R)作为扩增引物(引物由上海生工生物工程有限公司合成)，进行PCR扩增。
PCR扩增体系(总体积25μL)：2.5μL的10×PCR Buffer(含Mg2+)，1.0μL的dNTPs(10mM)，1.0μL上游引物IAF001-F(10μM)，1.0μL下游引物IAF001-R(10μM)，0.5μL的Taq酶(2U/μL)，1.0μL模板DNA(50ng/μL)，18.0μL的ddH2O。
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；32个循环(94℃变性45s，63℃退火50s，72℃延伸1.5min)；最后于72℃下延伸7min。
(3)取8μL步骤(2)所得的PCR扩增产物，利用1.2﹪琼脂糖凝胶进行电泳检测。然后，利用凝胶成像分析仪拍照，得到电泳图。若电泳图通道出现分子量为573bp的特异性DNA电泳条带，则被测植物样品为台湾金线莲，若电泳图上未出现573bp的特异性DNA电泳条带，则被测植物样品不是台湾金线莲。
本发明提供的分子特异性标记引物和鉴别方法适用于台湾金线莲A.formosanus、两个相似种(金线莲A.roxburghii和滇越金线莲A.chapaensis)样品及其他近似植株的鉴别；由于通过本发明进行台湾金线莲A.formosanus、金线莲A.roxburghii、滇越金线莲A.chapaensis的检测准确率极高，而引入其他近似植株后，检测准确率可能有所下降。台湾金线莲A.formosanus、金线莲A.roxburghii、滇越金线莲A.chapaensis的外形相近，难以通过形态学特征进行区分，但三者与其他植株的外形相差较大，能够通过形态学特征进行区分。故使用本发明进行检测前，应当由工作人员根据被测植物样品的形态学特征(外形特征)，判断被测植物样品是否属于台湾金线莲A.formosanus、金线莲A.roxburghii、滇越金线莲A.chapaensis中的一种，若从形态学特征上能够判断出被测植物样品不是台湾金线莲A.formosanus、金线莲A.roxburghii、滇越金线莲A.chapaensis中的一种，则无需进行本发明中的PCR扩增、电泳检测，直接判断被测植物样品不是台湾金线莲A.formosanus。从而在达到简化检测步骤的同时提高检测精度的效果。
本发明主要有益效果表现为：
本发明提供的分子特异性标记引物(IAF001-F/R)可以对台湾金线莲A.formosanuss与其他相似植株的检测鉴别。特别是针对台湾金线莲A.formosanuss、金线莲A.roxburghii、滇越金线莲A.chapaensis的检测鉴别，精度极高。并且本发明操作简单、准确，灵敏度高，是形态特征辨别台湾金线莲A.formosanuss的有效辅助手段。
附图说明
图1是采用本发明提供的分子特异性标记引物(IAF001-F/R)对台湾金线莲A.formosanus、金线莲A.roxburghii、滇越金线莲A.chapaensis进行PCR扩增得到的电泳图。其中，M：DNA分子量标准Trans2K DNA Marker(订购于北京全式金生物技术有限公司)；C：阴性对照；通道1～4：金线莲A.roxburghii；通道5～8：台湾金线莲A.formosanus；通道9～12：滇越金线莲A.chapaensis。电泳图显示只有台湾金线莲A.formosanus的所有样品扩增出分子量为573bp大小的特异性DNA电泳条带。
图2是采用本发明提供的分子特异性标记引物(IAF001-F/R)对10份不同台湾金线莲个体样品的总基因组DNA进行PCR扩增得到的电泳图。其中，M：DNA分子量标准Trans2KDNA Marker；C：阴性对照；通道1～10：对应为10个不同台湾金线莲个体的样品。电泳图显示10个不同台湾金线莲个体样品均能扩增出分子量为573bp大小的特异性DNA电泳条带。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：台湾金线莲的分子特异性标记引物(IAF001-F/R)的获取(1)样品基因组DNA提取
剪取台湾金线莲A.formosanus与其2个相似种(金线莲A.roxburghii和滇越金线莲A.chapaensis)样品的新鲜叶片0.1g放入研钵，立即加入液氮研磨至粉末，然后运用UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)进行样品总基因组DNA提取。所得基因组DNA用0.8％琼脂糖胶进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测浓度，稀释至50ng/μL，4℃保存，用于后续PCR扩增反应。
(2)分子特异性标记引物IAF001-F/R获得
以步骤(1)提取的被测植物样品DNA作为模板DNA，以核糖体ITS区序列的通用引物(ITS4：5’-TCCTTCCGCTTATTGATATGC-3’，如SEQ ID NO.3所示；ITS5：5’-GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG-3’，如SEQ ID NO.4所示)为PCR扩增引物，进行常规PCR扩增。然后，通过琼脂凝胶电泳、切胶纯化、TA克隆及测序分析，获得台湾金线莲A.formosanus与其2个相似种(金线莲A.roxburghii和滇越金线莲A.chapaensis)的ITS序列。获得ITS序列的方式为送上海生工生物工程股份有限公司测序。然后，对测序获得的3个相似物种的ITS序列进行序列比对，以及碱基差异分析，并在此基础上开发设计出分子特异性标记引物组合IAF001-F/R(IAF001-F：5’-CAATTGGCCCCTCTTGATTGAGGC-3’；IAF001-R：5’-ATTTCAGGGCGTCACCTGCGACA-3’)。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
实施例2：台湾金线莲的分子特异性标记引物(IAF001-F/R)在台湾金线莲鉴别中的应用
(1)待测样品总基因组DNA的提取
剪取0.1g被测植物样品(叶片)放入研钵。迅速加入液氮研磨至粉末。然后，利用从上海生工生物工程股份有限公司购买的UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒提取被测植物样品的总基因组DNA，用0.8％琼脂糖凝胶对所得总基因组DNA进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测DNA浓度，稀释至50ng/μL，-20℃冰箱存放备用。
(2)分子特异性标记引物(IAF001-F/R)的PCR扩增
以步骤(1)提取的被测植物样品DNA为模板，以分子特异性标记引物的上游引物(IAF001-F：5’-CAATTGGCCCCTCTTGATTGAGGC-3’)、下游引物(IAF001-R：5’-ATTTCAGGGCGTCACCTGCGACA-3’)作为扩增引物(引物由上海生工生物工程有限公司合成)，进行PCR扩增。
PCR反应体系(总体积25μL)：2.5μL的10×PCR Buffer(含Mg2+)，1.0μL的dNTPs(10mM)，1.0μL上游引物IAF001-F(10μM)，1.0μL下游引物IAF001-R(10μM)，0.5μL的Taq酶(2U/μL)，1.0μL的模板DNA(50ng/μL)，18.0μL的ddH2O。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；32个循环(94℃变性45s，63℃退火50s，72℃延伸1.5min)；最后于72℃下延伸7min。
(3)电泳检测：取8μL步骤(2)中所得的PCR扩增产物，利用1.2﹪琼脂糖凝胶进行电泳检测，得到电泳图。
按照上述方法，四个金线莲A.roxburghii样本、四个台湾金线莲A.formosanus样本和四个滇越金线莲A.chapaensis样本进行PCR扩增及电泳检测，并以无菌水作为阴性对照。所得电泳检测图见附图1，其中，编号5～8的台湾金线莲A.formosanus样本，其扩增出分子量为573bp大小的特异性DNA电泳条带；而编号为1～4的金线莲A.roxburghii样品和编号为9～12的滇越金线莲A.chapaensis样本未扩增出该条带。这表明本专利提供的分子特异性标记引物(IAF001-F/R)具有极高的专一性，可以用于台湾金线莲的快速、准确鉴别。
实施例3：分子特异性标记引物(IAF001-F/R)的进一步验证
为了进一步验证本发明提供的分子特异性标记引物(IAF001-F/R)的稳定性和应用范围，利用该分子特异性标记引物(IAF001-F/R)对10份来自不同台湾金线莲个体的样品总基因组DNA进行PCR扩增，以及琼脂糖凝胶电泳检测。所得电泳图如附图2所示(图中，通道M为DNA分子量标准Trans2K DNA Marker；C为阴性对照；通道1～10：对应为10个不同台湾金线莲个体的样品)。附图2显示所有台湾金线莲样品都能扩增出573bp大小的特异性DNA电泳条带，说明本发明提供的分子特异性标记引物(IAF001-F/R)具有很好的稳定性和应用范围。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 杭州师范大学
<120> 一种台湾金线莲的分子特异性标记引物及其鉴别方法
<130> 1
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 1
caattggccc ctcttgattg aggc 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 2
atttcagggc gtcacctgcg aca 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 3
tccttccgct tattgatatg c 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 4
ggaaggagaa gtcgtaacaa gg 22

Claims (5)

1.一种台湾金线莲的分子特异性标记引物，其特征在于：该分子特异性标记引物的核苷酸序列如下：
上游引物IAF001-F：5’-CAATTGGCCCCTCTTGATTGAGGC-3’；
下游引物IAF001-R：5’-ATTTCAGGGCGTCACCTGCGACA-3’。
2.利用分子特异性标记引物对台湾金线莲进行鉴别的方法，其特征在于：具体步骤如下；
步骤一、提取被测植物样品的基因组DNA；
步骤二、以步骤一提取的被测植物样品基因组DNA为模板DNA，以分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增；
步骤三、对步骤二获得的PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳结果出现573bp大小的特异性DNA电泳条带，则被测植物样品为台湾金线莲；若电泳结果未出现573bp的特异性DNA电泳条带，则被测植物样品不是台湾金线莲；
所述分子特异性标记引物序列为：
上游引物IAF001-F：5’-CAATTGGCCCCTCTTGATTGAGGC-3’；
下游引物IAF001-R：5’-ATTTCAGGGCGTCACCTGCGACA-3’。
3.如权利要求2所述的利用分子特异性标记引物对台湾金线莲进行鉴别的方法，其特征在于：在步骤一执行前，由工作人员根据被测植物样品的形态学特征，判断被测植物样品是否属于台湾金线莲A.formosanus、金线莲A.roxburghii、滇越金线莲A.chapaensis中的一种；若从形态学特征上判断出被测植物样品不是台湾金线莲A.formosanus、金线莲A.roxburghii、滇越金线莲A.chapaensis中的一种，鉴别直接结束，判断被测植物样品不是台湾金线莲。
4.如权利要求2所述的利用分子特异性标记引物对台湾金线莲进行鉴别的方法，其特征在于：步骤二中，所述的PCR扩增体系(总体积为25μL)为：2.5μL的10×PCR Buffer(含Mg2 +)，1.0μL的dNTPs(10mM)，1.0μL的上游引物IAF001-F(10μM)，1.0μL的下游引物IAF001-R(10μM)，0.5μL的Taq酶(2U/μL)，1.0μL的模板DNA(50ng/μL)，18.0μL的ddH2O。
5.如权利要求2所述的利用分子特异性标记引物对台湾金线莲进行鉴别的方法，其特征在于：步骤二中，所述的PCR扩增程序为：94℃预变性5min；32个循环(94℃变性45s，63℃退火50s，72℃延伸1.5min)；最后于72℃下延伸7min。
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胡删梅 等: "珍稀中草药金线莲的RAPD研究", 中草药, vol. 31, no. 12, pages 944 - 946 *

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