TW201309319A - 台灣金線連之新免疫調節蛋白艾帕芙（ｉｐａｆ） - Google Patents

Abstract

台灣金線連(Anoectochilus formosanus)是重要食藥用中草藥之一，經陰離子交換管柱與蛋白質快速層析系統分離可得到新的蛋白，命名為艾帕芙(IPAF)。利用分子生物技術選殖發現艾帕芙(IPAF)之核酸序列，顯示艾帕芙(IPAF)為分子量14 kDa的蛋白，等電點約為pH 5.4，其蛋白序列具有133個胺基酸。艾帕芙(IPAF)不具凝集人類與小鼠紅血球的活性。艾帕芙(IPAF)可直接活化小鼠腹腔巨噬細胞產生腫瘤壞死因子TNF-alpha、IL-1β，增進巨噬細胞吞噬及抗原呈獻能力；同時可活化小鼠脾細胞及B淋巴球增生，增加B淋巴球表面分子CD69、MHC Ⅱ，促進B淋巴球分泌IgM。顯示艾帕芙(IPAF)具有免疫調節活性。

Description

台灣金線連之新免疫調節蛋白艾帕芙(IPAF)

本發明涉及一種由台灣金線連萃取所得之蛋白質艾帕芙(IPAF)，本發明之技術領域主要在於艾帕芙(IPAF)、艾帕芙之純化方法以及其所具功能性之發明。

金線連為蘭科(Orchidaceae)金線連屬(Anoectochilus Blume)多年生草本植物，因葉上鑲嵌金色或銀白色的網狀紋，陽光照射下，與葉脈相互產生強烈的色彩對比，故而得名。英文名為Jewel orchid，亦稱東南亞寶石蘭，另有黃花金線連、樹草蓮、金錢仔草、娃雞草、厚碇草、黃花糯子蘭、本山石松、石松、藥虎、烏參、金草等別名(劉，1994)。台灣金線蓮學名為Anoectochilus formosanus HAYATY，於植物學分類的角度來看，屬被子植物門(Angiospermae)單子葉鋼(Monocotyledoneae)蘭目(Orchidales)蘭科(Orchidaceae)開唇蘭屬(Anoectochilus)(李，1978)。

台灣金線連屬匍匐莖地生植物，具有褐紅色圓筒狀肉質莖，約8至9月抽苔，9至11月開花，每株長一穗狀花序，每一花序約有5至15朵花；花色乳黃，唇瓣花朝下，唇瓣中段兩側細裂，裂片呈線狀梳形，外型很像梳子，兩邊割約6條，長短不一。植物形態莖高約5至15公分，為直立莖褐紅色，葉柄長約1公分，葉片約4至6片，絨狀，互生，呈卵形或源卵形，表面為暗綠色，葉長約4公分，寬3公分，全株葉片數約8枚，成株則約剩4至6枚，葉周緣滾紅邊，葉面主脈5條，金或銀線狀，並佈有細小網狀支脈，葉背為紫紅色(劉等，1998)。

台灣金線連對生長環境的光線、溫度、溼度等均要求頗為嚴格。金線連性喜冷涼，最適合的生長溫度為20至24℃，若氣溫達28℃以上則生長不良，易受病蟲侵襲；5℃以下亦會造成生長停滯。金線連原生於森林內樹下半遮陰的地方，故栽培時應部分遮陰，以3,000~5000 Lux之光度最為適當。金線連為地生蘭的一種，較喜溼潤，最適合的相對濕度為75至85%，但須注意栽培介質不可過溼，否則易造成莖腐病的發生(林，1986；劉等，1987；劉等，1998)。

台灣金線連所含水分佔約87%，其中脂質及維生素C的含量較一般蔬果高，而鈣、磷、鉀、鈉及鎂等五種礦物元素含量亦高，每100公克含有鈣193毫克、磷806毫克、鉀279毫克、鎂270毫克及鈉188毫克；此外尚含有鐵57.1毫克、錳13.8毫克、鋅9.3毫克及銅2.6毫克(劉等，1987)。有學者自台灣金線連全草萃取液中，分離出棕櫚酸、軟脂素、桂皮酸、固醇類物質、葡萄喃醣、α-生育醇(α-tocopherol)、β-生育醇(β-tocopherol)，及金線連醣苷等成分(蕭等，2003)。Du等日本學者利用甲醇萃取台灣金線連溶液中，分離出丁酸葡萄苷3-O-β-D-glucopyranosyl-(3R)-4-dihydroxy butanoic acid(Du et al.,2000)。學者也利用水萃取或甲醇萃取液分離出campesterol(46.7%),stigmasterol(21.2%),β-sitosterol(32.1%),isosrborinol及三帖類化合物等成分(蕭等，2007；蕭等，2003)。研究指出從台灣金線連所分離出之金線連酮(kincenone)、黃酮類配醣體，及其衍生物具有很強之抗氧化能力，並認為金線連抗氧化能力足以比媲美銀杏葉和兒茶素(Wang et al.,2002)。金線連多醣可促進腸道益生菌Lactobacillus rhamnosus GG(ATCC53103),L. fermentum P.C.C.之增生，只是促進效果不若菊醣明顯(吳，2004)。

台灣金線連的機能性多以民俗療法中口相傳的療效為主，在近代藥典如中華本草、中藥大辭典、中華藥海、新華本草綱要、台灣植物藥材誌等典籍中記載其具有解熱、降血壓、降血糖、消炎、止咳、解毒、利尿、保肝等功效(蕭和蔡，2001)。除了藥典記載外近年來已有學者針對台灣金線連的生理活性進行科學驗證。

抗氧化能力方面，以TBA法測試台灣金線連抗脂質過氧化之能力，結果顯示台灣金線連甲醇抽取物抗脂質過氧化之效果優於水粗抽物；另外，以ESR法、Xanthine Oxidase Inhibition及Cytochrome c還原比色法等方法測定台灣金線連對於清除超氧陰離子自由基(‧O₂ ^-)之活性，結果均顯示甲醇抽取物的超氧陰離子自由基清除效果優於水萃物(林和顏，2000)。以台灣金線連水萃物餵食正常雌鼠，可降低雌鼠腦部脂質過氧化程度、提升腦glutathione peroxidase的活性，並且能抑制子宮脂質氧化；對去卵巢雌鼠，餵食台灣金線連水粗萃取物可降低腦部、腎上腺、腎臟、肺臟、子宮、主動脈等之中的脂質過氧化程度(林，2000)。人類HL60血癌細胞於H₂O₂處理下會造成細胞程序性死亡(apoptosis)，但以金線連水萃物處理可緩和此現象，且與正控制組catalase處理組效果相當(鄭，2000)。利用白血病HL-60細胞株，以過氧化氫進行細胞抗氧化試驗，結果顯示，金線連水萃取物的濃度提高(0.5-2.5 mg/mL)能減少過氧化氫誘導的HL-60細胞凋亡，而以xanthine/xanthine oxidase誘發superoxide anion(O₂ ^-)的抗氧化試驗結果也顯示，金線連水萃具有清除超氧陰離子自由基的能力(Wang et al.,2005b)。

毒性與安全性方面，以大鼠連續90天經口服0.5 g/kg或2.0 g/kg台灣金線連水粗萃取物之毒性試驗，結果顯示雄性2.0 g/kg組出現體重減輕、輕微酮尿；雌性2.0 g/kg組則出現中性球減少、乳酸去氫酶活性及磷濃度下降情況，但並無實質上病理組織變化，因此大鼠經連續90天口服台灣金線連水粗萃取物之安全劑量在0.5 g/kg以下(Lin et al.,2000)。對妊娠期及授乳期母鼠依目測觀察顯示台灣金線連水粗萃取物無致畸胎作用，且對新生兒數的生長也沒有影響(施，2001)。

保肝功能方面，以乙醯氨基酚(Acetaminophen)誘發大白鼠肝細胞毒性，證實台灣金線連之氯仿(CH₃Cl₃)及乙酸乙酯(EtOAC)有機分劃層在200 μg/mL時具有明顯的保肝作用；在急性肝損傷部分，台灣金線連乙酸乙酯有機分劃層及水粗抽取物具有降低肝功能指數(sGOT、sGPT)之能力；另外，將大白鼠以腹腔注射半乳糖氨(D-galactosamine)模擬急性肝炎病症，則經投予100 μg/mL台灣金線連乙酸乙酯有機分劃層後亦可降低肝指數，而在肝臟組織病理病變的觀察中，亦顯示台灣金線連乙酸乙酯有機分劃層具有修護肝細胞的作用；在慢性酒精性肝炎之保肝活性研究結果顯示大白鼠連續投予絕對酒精28天，其肝指數及肝細胞脂質過氧化指標MDA濃度明顯上升，而台灣金線連之水粗抽物及甲醇粗抽物可降低肝指數及MDA含量(林和顏，2000)。以四氯化碳(CCl₄)誘導雄性Wistar大鼠肝纖維化，再以口投方式投予台灣金線連水粗萃取物，可舒緩四氯化碳所誘發的肝臟重量減輕、蛋白質含量減少、膠原蛋白(hydroxyproline)增加、出現腹水現象及大鼠體重減輕等症狀(林，2000)。體外試驗結果顯示台灣金線連對肝癌細胞HepG2、Hep3B、Mal5、SK均有抑制其生長的效果(謝，2002)。

提昇免疫功能及抗腫瘤方面，台灣金線連水粗萃取物在抗發炎及抗過敏試驗方面，對於fMLP引發嗜中性白血球釋放β-glucuronidase和lysozyme的體外試驗和compound 48/80引發肥大細胞釋放β-glucuronidase和histamine的體外試驗均有顯著的抑制作用(林，2000)。體外試驗方面，2003年有實驗證實經餵食二週1,500 mg/kg台灣金線連有效分劃的老鼠其NK cell毒殺能力增加、活化態(CD69⁺) T輔助型淋巴細胞的細胞次族群有顯著性增加、經ConA刺激48小時的腸系淋巴細胞，所釋出IFN-γ顯著性增加。在體外試驗中，以台灣金線連有效分劃刺激RAW 264.7細胞，細胞的吞噬能力、亞硝酸鹽(Nitrite)的釋出量、IL-2及IFN-γ分泌量皆顯著性增加，故可推測其台灣金線連有效分劃能增強小鼠的非特異性免疫(徐，2003)。而金線連水溶性多醣也有類似功效，2004年時有研究指出利用每日口服台灣金線連水溶性多醣，為期五週，試驗台灣金線連多醣對宿主非特異性免疫功能及腸道淋巴細胞之影響。結果顯示，經長期餵食台灣金線連多醣後之小鼠，周邊血液中淋巴細胞的比率漸趨恆定與對照組無明顯差異，自然殺手細胞的活性與周邊血液中吞噬細胞的活性則呈現下降的趨勢。且進一步評估台灣金線連水溶性多醣對於吞噬作用之影響，結果顯示台灣金線連水溶性多醣會抑制RAW264.7巨噬細胞株的吞噬能力，但不會降低被LPS刺激後所分泌之與發炎反應有關的細胞激素(吳，2004)。以白蛋白(ovalbumon,OVA)過敏原誘發老鼠呼吸道過敏反應的動物模式，在小鼠呼吸道發炎後給予經標準方式萃取之台灣金線連水萃物，結果證實標準方式水萃台灣金線連能降低CD4⁺ T細胞分化為Th2細胞之能力，促進IL-12,INF-γ的分泌，使IL-4,IgE、巨噬細胞、嗜酸性細胞表現量下降，由上述結果推論經標準方式水萃台灣金線連可抑制氣喘性過敏反應的發生(Hsieh et al.,2010)。以腹腔沖洗取得腫瘤冬眠期小鼠之腹腔免疫細胞與腫瘤細胞共同培養，並加入金線連萃取物進行體外試驗，結果顯示台灣金線連萃取物能有效抑制腫瘤細胞之生長。而持續注射台灣金線連於腫瘤冬眠期小鼠之體內實驗顯示，台灣金線連對於延長腫瘤冬眠期有若干的效果，並可延長腫瘤復發後之老鼠的生存期限。而分析台灣金線連對於體內免疫細胞的subpopulation的影響變化方面，也證實其對於免疫細胞如B lymphocytes,T lymphocytes也有某些程度的活化效果，綜合結果推測台灣金線連主要以促進NK cells的活化進而消滅腫瘤細胞，來達到抗癌的效果(張，2003)。此外，也有學者指出台灣金線連會誘導MCF-7人類乳癌細胞的細胞凋亡(Shyur et al.,2004)並具有抑制A型流行性感冒病毒之活性(劉等，1993)。

台灣金線連具多樣的生理活性，但其主要的活性成分尚不清楚。本發明乃自台灣金線連中發現蛋白質艾帕芙(IPAF)與其對於之免疫調節功能。

由先前技術與研究之檢索可知台灣金線連具有多樣的生理活性，但前人研究與分析多著重在多醣成分方面，對其活性成分並無清楚可知之定論，而本發明自台灣金線連中純化發現台灣金線連中之具生理活性之蛋白質，將其命名為艾帕芙(Immunomodulatory Protein from Anoectochilus formosanus,簡稱IPAF)，且發現其對動物體具免疫調節之功效。

一、艾帕芙(IPAF)係以離子交換管柱進行萃取所得，其所用純化艾帕芙之技術如下：台灣金線連成株(第1圖)秤取600 g，洗淨、切碎後，浸泡於萃取液中，並以果汁機均質，經分離步驟後，粗萃取液用以30%飽和固體硫酸銨沉澱蛋白，所沉澱蛋白質透析完全，將其通過DE-52陰離子交換管柱，以0~1 M NaCl溶液梯度沖提出管柱上的台灣金線連蛋白，最後測定收集液在280 nm下的吸光。可得兩個主要吸收峰，如第2圖之所示，將第一吸收峰命名IPAF，且進一步以蛋白質快速層析系統(fast protein liquid chromatography,FPLC)進行純化，依據分離所得到之蛋白陰離子吸附的特性，選擇Hi-Trap Q管柱，予以純化，如第3圖。

二、以SDS-PAGE電泳、醣蛋白染色分析(periodic acid-Schiff stain)、等電點交集電泳(ion focuding electrophoreisis)以及紅血球凝集活性分析進行艾帕芙(IPAF)之特性確認。

(一)　台灣金線連免疫調節蛋白艾帕芙(IPAF)特性之分析(1)　經由SDS-PAGE分析，由第4圖可見台灣金線連免疫調節蛋白艾帕芙(IPAF)之分子量約為14kDa。

(2)　將SDS-PAGE分析所得之電泳膠片進行醣蛋白染色，由第5圖可看出艾帕芙(IPAF)與Schiff reagent反應後，並沒有顯現紫色的電泳帶，因此艾帕芙(IPAF)並非為醣蛋白。

(3)　將艾帕芙(IPAF)蛋白進行紅血球凝集活性試驗，此種蛋白與Balb/C小鼠血液混和觀察血液的凝集情形結果第6圖所示，由第6圖中可發現純化出之艾帕芙(IPAF)在蛋白質原濃度及稀釋濃度1.18、0.59、0.298、0.149、0.075、0.038(mg/mL)時，與金針菇免疫調節蛋白FIP-fve(有明顯紅血球凝集活性之免疫調節蛋白)比對，結果發現艾帕芙(IPAF)無血球凝集活性。

三、本發明於台灣金線連免疫調節蛋白艾帕芙(IPAF)之功能性方面，以活化小鼠腹腔巨噬細胞產生細胞激素、增進吞噬能力及抗原呈獻能力的測定，與活化小鼠脾細胞、B淋巴球，對其免疫調節功能進行證明。

(一)　艾帕芙(IPAF)活化小鼠腹腔巨噬細胞

(1)　將艾帕芙(IPAF)與小鼠腹腔巨噬細胞共同培養二十四小時之後，以ELISA法測定養液中的TNF-alpha濃度，以評估艾帕芙(IPAF)活化小鼠腹腔巨噬細胞，產生腫瘤壞死因子TNF-alpha的效果，結果如第7圖所示。將小鼠腹腔巨噬細胞以艾帕芙(IPAF)活化二十四小時後，濃度1.25 μg/mL時即有刺激巨噬細胞產生TNF-alpha的能力，TNF-alpha產生量為990.49 pg/mL，且艾帕芙(IPAF)濃度於1.25~20 μg/mL下對於TNF-alpha之產量具劑量效應(dose-dependent manner)(第7圖)。此結果顯示艾帕芙(IPAF)可直接活化小鼠腹腔巨噬細胞，促使其分泌腫瘤壞死因子TNF-alpha。

(2)　將艾帕芙(IPAF)與小鼠腹腔巨噬細胞共同培養二十四小時之後，以ELISA法測定養液中的IL-1β濃度，以評估艾帕芙(IPAF)活化小鼠腹腔巨噬細胞，產生介白素-1β(IL-1β)的效果，結果如第8圖所示。將小鼠腹腔巨噬細胞以艾帕芙(IPAF)活化二十四小時後，濃度1.25 μg/mL時即有刺激巨噬細胞產生IL-1β的能力，IL-1β產生量為46.67 pg/mL，而正控制組LPS亦能刺激RAW 264.7巨噬細胞產生約88.73 pg/mL(第8圖)，且艾帕芙(IPAF)濃度於1.25~20 μg/mL下對於IL-1β之產量具劑量效應(第8圖)。此結果顯示艾帕芙(IPAF)可誘導小鼠腹腔巨噬細胞分泌細胞激素IL-1β。

(3)　將艾帕芙(IPAF)與小鼠腹腔巨噬細胞共同培養二十四小時之後，和帶螢光之大腸桿菌反應兩小時，並以流式細胞儀(Flow cytometry)評估艾帕芙(IPAF)活化小鼠腹腔巨噬細胞進行吞噬之能力，結果如第9圖所示。將小鼠腹腔巨噬細胞以濃度20 μg/mL之艾帕芙(IPAF)活化二十四小時後，巨噬細胞吞噬活性增強，平均幾何螢光強度為241(第9圖)。此結果顯示艾帕芙(IPAF)可促進小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力。

(4)　將艾帕芙(IPAF)與小鼠腹腔巨噬細胞共同培養二十四小時之後，以anti-MHCⅡ抗體進行標的，並以流式細胞儀(Flow cytometry)評估艾帕芙(IPAF)活化小鼠腹腔巨噬細胞進行抗原呈獻之能力，結果如第10圖所示。將小鼠腹腔巨噬細胞以濃度20 μg/mL之艾帕芙(IPAF)活化二十四小時後，巨噬細胞表面MHCⅡ分子增加，平均幾何螢光強度為168(第10圖)。此結果顯示艾帕芙(IPAF)可增強小鼠腹腔巨噬細胞抗原呈獻能力。

(二)　艾帕芙(IPAF)可活化小鼠脾細胞

(1)　將艾帕芙(IPAF)與小鼠脾細胞共同培養七十二小時之後，利用BrdU Assay測定小鼠脾細胞的增生反應。BrdU assay是利用BrdU取代uridine，當細胞增生分裂時，讓分裂中的細胞攝取BrdU，再以對BrdU具特異性之抗體辨識被細胞uptake之BrdU分子，因此BrdU可被抗體偵測出來，據此來推斷細胞的增生效應。結果如第11圖所示，於1μg/mL低濃度即能明顯刺激小鼠脾細胞增生，並於1~4 μg/mL濃度下具有劑量效應，而在艾帕芙(IPAF)濃度8 μg/mL時可達到最佳的刺激細胞增生效果，提高小鼠脾細胞的BrdU攝取量(第11圖)。因此，艾帕芙(IPAF)可活化小鼠脾細胞，刺激小鼠脾臟細胞進行增生。

(三)　艾帕芙(IPAF)可活化小鼠B淋巴球

(1)　將艾帕芙(IPAF)與純化之小鼠B淋巴球(B220⁺)共同培養七十二小時之後，利用PI染劑及流式細胞儀測定小鼠脾細胞的增生反應。利用PI染劑對DNA的專一連結特性，將細胞中的DNA染上PI染劑，當細胞處於增生分裂時，染色體套數會大於2N，PI螢光強度較高，再以流式細胞儀偵測螢光強度，推斷細胞的增生效應。結果如第12圖所示，艾帕芙(IPAF)於8 μg/mL濃度下即能明顯刺激小鼠B淋巴球增生，DNA套數大於2N之細胞達5.84%(第12圖)。因此，艾帕芙(IPAF)可活化小鼠B淋巴球，刺激小鼠B淋巴球進行增生。

(2)　將艾帕芙(IPAF)與小鼠B淋巴球共同培養二十四小時之後，以anti-CD69抗體進行標的，並以流式細胞儀(Flow cytometry)評估艾帕芙(IPAF)對於小鼠B淋巴球之活化效果，結果如圖十三所示。將小鼠B淋巴球以濃度30 μg/mL之艾帕芙(IPAF)活化二十四小時後，具有CD69分子之B淋巴球數量增加，達到B淋巴球總數之20.3%(第13圖)。此結果顯示艾帕芙(IPAF)可活化小鼠B淋巴球。

(3)　將艾帕芙(IPAF)與小鼠B淋巴球共同培養二十四小時之後，以anti-MHC Ⅱ抗體進行標的，並以流式細胞儀(Flow cytometry)評估艾帕芙(IPAF)對於小鼠B淋巴球之活化效果，結果如第14圖所示。將小鼠B淋巴球以濃度30 μg/mL之艾帕芙(IPAF)活化二十四小時後，具有MHC Ⅱ分子之B細胞數量增加，達到B淋巴球總數之51.4%(第14圖)。此結果顯示艾帕芙(IPAF)可活化小鼠B淋巴球。

(4)將艾帕芙(IPAF)與小鼠B淋巴球共同培養二十四、四十八、七十二小時之後，以ELISA法測定養液中的IgM濃度，以評估艾帕芙(IPAF)活化小鼠B淋巴球，產生抗體IgM的效果，結果如第15圖所示。將小鼠B淋巴球以濃度30 μg/mL之艾帕芙(IPAF)活化，於四十八小時後IgM產量較對照組高(第15圖)，且艾帕芙(IPAF)活化時間48~72小時之內，對於IgM之產量具時間效應(第15圖)。此結果顯示艾帕芙(IPAF)可刺激小鼠B淋巴球產生IgM。

四、本發明於台灣金線連免疫調節蛋白艾帕芙(IPAF)之胺基酸序列方面，利用Edman reaction N端定序、RACE等方法進行艾帕芙(IPAF)的分子選殖與胺基酸序列之定序。

(一)　艾帕芙(IPAF)的分子選殖與氨基酸序列

(1)　將艾帕芙(IPAF)蛋白經過SDS-PAGE電泳分離後，轉漬至PVDF膜上，進行艾帕芙(IPAF)之N端胺基酸序列分析。結果發現艾帕芙(IPAF)之N端胺基酸序列依序如SEQ ID 1。

(2)　在選殖艾帕芙(IPAF)之基因方面，先抽取新鮮台灣金線連之total RNA，再利用反轉錄反應製作台灣金線連mRNA之互補DNA(cDNA)，作為選殖的模版(template)。之後利用3'-RACE技術，以PCR方式釣取艾帕芙(IPAF)之基因，而3'-RACE反應的引子由艾帕芙(IPAF)之N端胺基酸序列反推可能的核酸密碼組設計而得。

(3)　由艾帕芙(IPAF)之N端胺基酸序列，設計其可能的對應引子(mapping primer)如SEQ ID 2，利用3'-RACE技術進行選殖。由艾帕芙(IPAF)端第一個胺基酸至第七個胺基酸所設計出之引子(SEQ ID 2)，以3'-RACE反應後，電泳分析得到一約700 base pairs之核酸片段(第16圖)。

(4)　將3'-RACE所得之700 base pairs之核酸片段進行TA cloning，選殖入pGEMT Easy載體之後，分析此700 base pair片段的核酸序列，得到a36-700之序列。再將a36-700之序列轉譯為胺基酸之序列序列(SEQ ID 3)，並與艾帕芙(IPAF)之胺基酸序列比較，發現13個由Edman reaction所取得的胺基酸序列與a36-700轉譯之胺基酸序列完全相同，兩者胺基酸序列之同質性達100%(第17圖)，表示兩者極高度相似。

(5)　利用a36-700序列進一步設計b18引子(SEQ ID 4)，以5'-RACE技術，選殖艾帕芙(IPAF) N端胺基酸之前的核酸序列，結果如第18圖所示，得到約600 base pair之片段。

(6)　將5'-RACE所得之600 base pairs之核酸片段進行TA cloning，選殖入pGEMT Easy載體之後，分析此600 base pair片段的核酸序列，得到b18-600之序列。再將b18-600之序列轉譯為胺基酸之序列，並與艾帕芙(IPAF)之胺基酸序列比較，選殖所得的序列與N端定序所得的序列之結果完全相同(第19圖)。

(7)　比對串接a36-700與b18-600之核酸序列，並輔以nested PCR確認，得到艾帕芙(IPAF)之核酸序列與胺基酸序列，如SEQ ID 5。其表現之部分由SEQ ID 5之第76個核酸至第477個核酸為止，並經轉譯為133個胺基酸序列，其胺基酸序列如SEQ ID 5第26個胺基酸序列至第158個胺基酸序列。

本發明的其他特性將在下面詳細揭示具體實施例觀察後變得顯而易見。

實施例一：艾帕芙(IPAF)之純化 1.自台灣金線連成株純化艾帕芙(IPAF)

艾帕芙(IPAF)的純化流程包括硫酸銨沈澱、分離、離子交換層析等步驟，所有的步驟均於4℃下進行。

(1)　粗萃取

首先取台灣金線連成株(第1圖)約600克，清水沖洗乾淨復水後，以5公升0.05 M β-mercaptoethanol/5%冰醋酸extraction buffer浸泡之，並置於4℃冰箱中浸泡過夜。浸泡時，為避免台灣金線連因為比重過低而浮出水面，故以乾淨塑膠袋內裝適量extraction buffer，綁緊袋口，置於浸泡液表面，使台灣金線連完全浸泡到extraction buffer。次日利用果汁機(waring blender)將已浸泡過夜的台灣金線連成株進行破碎，果汁機破碎過程為避免機體生熱導致蛋白變性的可能性，破碎過程亦於4℃冰箱內進行，破碎時間為3分鐘，間歇暫停3分鐘，間歇暫停期間輔以冰浴處理，總破碎時間約為15分鐘。隨後再利用超音波震盪機進行震盪破碎，震盪總時間為20分鐘，每震盪10秒間歇10秒，接著以超高速冷凍離心機(RC5C)，於4℃以14,000×g(GSA rotor)離心50分鐘。離心完之後收集上清液，以110 mm濾紙進行抽氣過濾去除雜質，將所收集的濾液加入固態硫酸銨至90%飽和濃度沈澱蛋白質後於4℃攪拌過夜。翌日再以16,000×g(GSA rotor)離心50分鐘，取其沈澱物，加入等量10 mM的Tris-HCl溶液(pH 8.2)，溶解沈澱物後移入透析膜(MW 6000-8000)中，以相同的10 mM Tris-HCl緩衝溶液(pH 8.2)進行透析，透析時間為四天，其間更換十次緩衝液，首日四次，之後每日兩次。完成透析後，取出透析袋中溶液，以12,000×g(GSA rotor)在4℃下離心50分鐘，以抽氣過濾方法去除不溶性雜質。取上清液得到台灣金線連蛋白之粗萃取液。

(2)　離子交換樹脂分離

將台灣金線連蛋白之粗萃取液加入大量緩衝溶液稀釋，避免因為萃取液中所含的大量多醣物質造成管柱堵塞。注入預先以10 mM Tris-HCl溶液(pH 8.2)平衡過的DE-52陰離子交換管柱。再以10 mM的Tris-HCl緩衝液沖提出無法結合於管柱上的物質，然後用0~1 M氯化鈉溶液線性沖提(gradient elution)與管柱結合的蛋白質，上述管柱所流出溶液皆以分液收集器收集，每管收集3 mL，以分光光度計初步測定其280 nm流出液之吸光值，初步推測其蛋白質濃度，收集有吸收波峰部分之蛋白質流出液，待進一步做分離及分析。

(3)　脫鹽及濃縮

經由離子交換樹脂分離所得到的蛋白質溶液，於4℃下選擇Pharmacia Biotech公司之蛋白質快速層析系統(fast protein liquid chromatography,FPLC) Hitrap desalting column進行脫鹽。收集脫鹽後之溶液，以蛋白質濃縮離心過濾膜(Amicon Ultra-15)進行濃縮，以縮小溶液總體積並提高蛋白質濃度。

(4)　膠體篩濾分析

將分離步驟所得之蛋白，藉由安馬遜(Amersham Biosciences)公司出品之AKTA蛋白質快速層析系統(fast protein liquid chromatography,FPLC)進行純化，依據分離得到之蛋白陰離子吸附的特性，選擇Hi-Trap Q管柱，予以純化。

材料：eluting buffer: 50 mM phosphate buffer,0.15 M NaCl,pH 7.0;sample：事先以0.22 μm filter過濾；Protein standards: Amersham Molecular size standards for gel filtration of proteins。

層析：以Amersham Akta FPLC系統進行膠體篩濾層析，流速0.7 mL/min，管柱中的凝膠是由膠體溶液凝結而成的固體物質，內部具有網狀篩孔，利用球狀凝膠內的篩孔，使樣本分子流過填充凝膠的管柱時，大分子無法進入凝膠篩孔，而只流經凝膠及管柱間的孔隙，很快就可以流出管柱，較小的分子則進入凝膠內的篩孔，故在管柱內的停留時間較長，由此區分大小不同的分子量大小的蛋白來達到分離的效果。

事先以25 ml 0.5 M的NaOH，接著以25 ml DI清洗column，最後以50 ml eluting buffer平衡。每次注入1 ml蛋白液，以eluting buffer沖提，並以分液收集器收集，並測其在280 nm波長的吸光度，可得一個蛋白質吸收峰(第3圖)，所獲得的收集液以12%十二烷基硫酸鈉之聚乙醯胺膠SDS-PAGE電泳分析。

實施例二：膠體電泳分析(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)

(一)　十二烷基硫酸鈉之聚乙醯胺膠SDS-PAGE之製備

(1)板膠的裝置：利用Bio-Rad公司出品之MiniProtein3裝置進行電泳。

(2)　配置12%十二烷基硫酸鈉之聚乙醯胺膠separating gel：取polyacrylamide 3 mL，加入1.5M Tris-HCl，pH 8.8緩衝液1.9 mL，10% SDS 0.1 mL，混和均勻後，再加入新鮮配置的過硫酸銨(APS)溶液50 μL，TEMED 5.5 μL，最後再加入蒸餾水2.5 mL。將上述配置的凝膠溶液，注入以準備好的玻璃裝置中，待其使凝膠液面形成後，續做stacking gel。

(3)　配置3%十二烷基硫酸鈉之聚乙醯胺膠polyacrylamide的stacking gel：取polyacrylamide 0.5 mL，加入1.5M Tris-HCl，pH 6.8緩衝液0.76 mL，10% SDS 30 μL，混和均勻後，用減壓幫浦抽去氣泡，再加入新鮮配置的過硫酸銨溶液30 μL，TEMED 3.4 μL，最後再加入蒸餾水1.76 mL。將上述配置的凝膠溶液，注入已凝膠完成的separating gel上方，並放一梳狀模版(comb)，待凝聚後便可形成容納蛋白樣品的U型槽。

(二) Tank緩衝液的製備：

取3 g的Tris-base，加入14.4 g之glycine，再加入10 mL的10% SDS溶液，再加蒸餾水至1000 mL，配成0.1% SDS，25 mM Tris-glycine緩衝溶液，pH 8.3。

(三)　蛋白質樣品之處理：

取濃度為1 mg/mL之台灣金線連蛋白質溶液100 μL，加入10 μL的10% SDS溶液，加入5 μL的β-mercaptoethanol，再加入2 μL 1.5 M Tris-HCl，pH 8.8緩衝液，一滴甘油及2 μL 0.05%溴酚藍(bromophenol blue)，100℃，10分鐘。採用Low range rainbow marker 標準蛋白比對分子量，含ovalbumin(45 kDa)，carbonic anhydrase(30 kDa)，soybean trypsin inhibitor(20.1 kDa)，lysozyme(14.4 kDa)，aprotinin(6.5kDa)。

(四)　電泳之操作方法：

將做好之板膠固定到電泳裝置上，將有凹面玻璃朝向電泳槽，取下梳狀模版，則於板膠上形成U型槽，用tray緩衝液注滿上下電泳槽，取約30 μL的蛋白質樣品溶液加入膠體之U型槽中，接上電極，先以50 V的電流通過，直至溴酚藍指示劑移行至spearating gel與stacking gel交界處時，改用100 V的電流，待指示劑移行至距板底約一公分時，停止通電，將spearating gel取出，置於盤中進行染色及褪色。

(五)　染色與褪色：

(1)　染色液之製備：取1.25 g之Coomassie Brilliant Blue，溶於227 mL甲醇及46 mL醋酸，再加入蒸餾水至500 mL，混和均勻後，過濾備用。

(2)　褪色液之配製：取75 mL醋酸、50 mL甲醇，加蒸餾水至總體積1000 mL混和備用。

(3)　電泳後之板膠：浸於染色液三十分鐘，倒出染色液，換褪色溶液，更換數次褪色液後，便可見凝膠上蛋白所在處呈現藍色。

經由SDS-PAGE分析，由第4圖得知台灣金線連蛋白艾帕芙(IPAF)之分子量約為14 kDa。

實施例三：醣蛋白染色分析(periodic acid-Schiff stain)

蛋白質經十二烯酸鈉之聚乙醯胺膠SDS-PAGE分析後，將膠體浸於固定液(TCA solution)中固定三十分鐘，用水沖洗數次，浸於過碘酸-醋酸液[1%過碘酸(w/v)，3%醋酸(w/w)]中六十分鐘，再以蒸餾水洗三次，每次十分鐘，然後浸於Schiff reagent中，避光在4℃反應五十分鐘，可見呈色，然後以脫色劑(10%醋酸)洗數次，至脫去背景顏色，再用蒸餾水洗數次，浸於50%甲醇液保存或乾燥。

經由此實施例可得第5圖，由圖中可看出艾帕芙(IPAF)可與Schiff reagent反應，並無顯現紫色的電泳帶，因此艾帕芙(IPAF)並非為醣蛋白。

實施例四：紅血球凝集活性分析

取健康Balb/c小鼠的血液約200 μL加上PBS，低速離心(以上步驟作三次)，最後以PBS稀釋成1.5%(v/v)血液。用96孔的微量操作盤，取0.1 mL的樣品蛋白質，以PBS做濃度1.18、0.59、0.298、0.149、0.075、0.038(mg/mL)連續稀釋，再加上1.5%(v/v)血液50 μL，混合均勻後靜置二小時。用肉眼觀察凝集活性。凝集活性是以凝集效價titer說明：定義是以觀察到紅血球凝集時蛋白質的最低濃度。以此步驟進行艾帕芙(IPAF)之分析發現其不具血液凝集之活性。

此實施例係將艾帕芙(IPAF)蛋白進行紅血球凝集活性試驗，此種蛋白與Balb/c小鼠血液混和觀察血液的凝集情形結果如第6圖所示，由第6圖中可發現純化出之艾帕芙(IPAF)在蛋白質原濃度及稀釋濃度1.18、0.59、0.298、0.149、0.075、0.038(mg/mL)時，與金針菇免疫調節蛋白FIP-fve(有明顯紅血球凝集活性之免疫調節蛋白)比對，結果發現此種蛋白均沒有凝集活性。

實施例五：細胞激素TNF-alpha的測定

小鼠腹腔巨噬細胞的分離：將預先腹腔注射0.1 mL thioglycollate之腹腔發炎Balb/C小鼠以二氧化碳犧牲，小鼠腹腔注入磷酸緩衝液(phosphate buffered solution,PBS)，洗出腹腔細胞，在室溫下於1,600 rpm離心十分鐘，加入適量DMEM培養基沖散細胞並將細胞充分混合均勻，放入96孔培養盤中，於37℃,5% CO₂培養箱培養三小時，將細胞培養液吸除，再以磷酸緩衝液(phosphate buffered solution,PBS)清洗去除非貼附性細胞及組織殘渣，貼附於盤底的細胞即為腹腔巨噬細胞。

TNF-alpha的定量利用必帝公司(BD Pharmingen)出品之TNF-alpha OptEIA Set進行。

將小鼠腹腔巨噬細胞(2.5×10⁶ cells/well)以12孔培養盤，分別加入艾帕芙(IPAF)，使其末濃度為0、1.25、5、20(μg/mL)，並於37℃,5%二氧化碳培養箱共同培養二十四小時。

試劑：(a) capture antibody：anti-mouse TNF-alpha antibody.(b) detection antibody: biotinylated anti-mouse TNF-alpha antibody.(c) enzyme reagent: avidin-horseradish peroxidase conjugate.(d) blocking buffer: PBS with 10 % FBS.(e) assay diluent: PBS with 10 % FBS.(f) wash buffer: PBS with 0.05 % Tween 20.

將coating capture antibody注入96孔分析盤(96-well ELISA plate)上，每一個well加入100 μL的capture antibody後，於4℃靜置一晚。隔天以wash buffer清洗盤子三次。將blocking buffer加入以降低非特異性的干擾，於37℃作用一小時後，以wash buffer清洗清洗盤子三次。加入細胞培養液100 μL，於37℃作用一小時後，以wash buffer清洗清洗盤子三次。加入Detection Antibody及Enzyme Reagent(avidin-HRP) 100 μL，於37℃作用一小時，以ABTS溶液呈色之，以佰歐瑞(Bio-Rad)公司出品之Bio-Rad Model 3550-UV ELISA Reader測其在405 nm的吸光值。每次實驗皆有三重複並與標準曲線比對，以測得樣品濃度計算其產生量。

經實施後發現，將小鼠腹腔巨噬細胞以艾帕芙(IPAF)活化二十四小時後，濃度1.25 μg/mL時即有刺激巨噬細胞產生TNF-alpha的能力，TNF-alpha產生量為990.49 pg/mL，且艾帕芙(IPAF)濃度於1.25~20 μg/m之間，對於TNF-alpha之產量具劑量效應(dose-dependent manner)(第7圖)。此結果顯示艾帕芙(IPAF)可直接活化小鼠腹腔巨噬細胞，促使其分泌腫瘤壞死因子TNF-alpha。

實施例六：細胞激素IL-1β的測定

IL-1β的定量利用Pirce Biotechbology出品之IL-1β ELISA kit進行。

將小鼠腹腔巨噬細胞(2.5×10⁶ cells/well)以12孔培養盤，分別加入艾帕芙(IPAF)，使其末濃度為0、1.25、5、20(μg/mL)，並於37℃,5%二氧化碳培養箱共同培養二十四小時，測定IL-1β含量。

於IL-1β precoated well中加入50 μL之biotinylated antibody reagent及50 μL之standard(0,15.6,62.5,250,1000 pg/mL)或細胞培養液，在室溫下靜置2小時，以wash buffer清洗三次後加入100 μL之streptavidin-HRP concentrate，於室溫下靜置30分鐘，以wash buffer清洗三次，加入100 μL之premixed TMB substrate後於室溫下暗反應30分鐘，加入100 μL之stop solution，測定450 nm之吸光值。

經實施後發現將，小鼠腹腔巨噬細胞在經過艾帕芙(IPAF)二十四小時活化後，濃度1.25 μg/mL時即有刺激巨噬細胞產生IL-1β的能力，IL-1β產生量為46.67 pg/mL，而正控制組LPS亦能刺激小鼠腹腔巨噬細胞產生約88.73 pg/mL(第8圖)。此結果顯示艾帕芙(IPAF)可誘導小鼠腹腔巨噬細胞分泌細胞激素IL-1β。

實施例七：小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性分析

巨噬細胞吞噬活性利用Invitrogen出品之Vybrant^TM Phagocytosis kit進行。

將小鼠腹腔巨噬細胞(5×10⁶ cells/well)以6孔培養盤，分別加入艾帕芙(IPAF)，使其末濃度為20 μg/mL，並於37℃,5%二氧化碳培養箱共同培養二十四小時，將細胞以塑膠刮刀刮起，即可進行細胞吞噬活性分析。

取10X HBSS加入Vybrant^TM Phagocytosis套組中FITC螢光大腸桿菌混和均勻，移至離心管並加入去離子水稀釋。將以艾帕芙(IPAF)活化後的小鼠腹腔巨噬細胞1×10⁶ cells加入0.5 mL螢光大腸桿菌，於37℃黑暗環境反應2小時候洗去未被吞噬之大腸桿菌，再使用流式細胞儀分析大腸桿菌螢光。

經實施後發現，將20 μg/mL艾帕芙(IPAF)與小鼠腹腔巨噬細胞共同培養二十四小時之後，巨噬細胞吞噬活性增強，平均幾何螢光強度為241(第9圖)。此結果顯示艾帕芙(IPAF)可促進小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力。

實施例八：小鼠巨噬細胞表面MHC Ⅱ分子測定

將小鼠腹腔巨噬細胞(5×10⁶ cells/well)以6孔培養盤，分別加入艾帕芙(IPAF)，使其末濃度為20 μg/mL，並於37℃,5%二氧化碳培養箱共同培養二十四小時，將細胞以塑膠刮刀刮起，即可進行細胞表面MHC Ⅱ分子分析。

以艾帕芙(IPAF)活化後之小鼠腹腔巨噬細胞以FACS緩衝液(取10mL FBS,0.5 g sodium azide,以PBS定量至500 mL)重新懸浮，加入anti-mouse MHC Ⅱ-FITC螢光抗體，於4℃黑暗反應40分鐘，並將多餘抗體去除，再使用流式細胞儀分析FITC螢光。

實施結果發現，將小鼠腹腔巨噬細胞以濃度20 μg/mL之艾帕芙(IPAF)活化二十四小時後，巨噬細胞表面MHC Ⅱ分子增加，平均幾何螢光強度為168(第10圖)。MHC Ⅱ為巨噬細胞呈現抗原重要之分子，此結果顯示艾帕芙(IPAF)可增強小鼠腹腔巨噬細胞抗原呈獻能力。

實施例九：溴尿甘BrdU攝取之分析

小鼠脾細胞的分離：將Balb/C小鼠以乙醚迷昏後施以頸椎脫臼法，從小鼠取出完整脾臟細胞，利用載玻片磨砂部分以磨碎脾臟，置於裝有10 mL DMEM培養基中，在室溫下於1,600 rpm離心十分鐘。去除上清液，以1 mL RBC lysis buffer沖散細胞後加入9 mL PBS，離心1,600 rpm，五分鐘。去除上清液，加入10 mL DMEM培養基沖散細胞並將細胞充分混合均勻立即使用。

利用Roche BrdU cell proliferation套組進行分析，根據Vista D. T.等人1991年於Cancer research第51卷2515-2520頁及Hall P.A.等人1990年於J. Pathol.第162卷285-294頁中所提到，BrdU assay利用細胞增生需要利用DNA replication，因DNA合成是細胞增生之重要因素，DNA合成已成為一般常用來測定細胞有絲分裂及細胞增生之方法，利用BrdU(5-bromo-2'-deoxyuridine)取代thymidine來與DNA結合，與之結合後再以對BrdU具特異性之抗體辨識被細胞uptake之BrdU分子，因此BrdU可在免疫分析時被抗體偵測出來，據此來推斷細胞的增生活性。

試劑：(a) BrdU solution：取20 μL的BrdU加到2 mL的culture medium，將其配製成濃度為100 μM的BrdU。

(b) Anti-BrdU-POD：取100 μL的stock solution加入到10 mL的antibody dilution solution中備用。將 Anti-BrdU-POD粉末加入到1.1 mL的去離子水，混合十分鐘，配製成stock solution。(c) Washing solution：將十倍濃度的washing solution，取10 mL，加入到90 mL的去離子水中備用。(d) Stop solution(1M H₂SO₄)：原液濃度為18.78 M的濃硫酸(H₂SO₄)，稀釋18.78倍，使其成為1M的H₂SO₄。

將分離好之淋巴球，培養於DMEM培養基中，將細胞數目調整至5x10⁵ cells/mL，取細胞液接種於96孔培養盤中(5x10⁵ cells/well)，分別加入艾帕芙(IPAF)，使其末濃度為0、1、2、4、8、16(μg/mL)，以Con A(1 μg/mL)做為對照組。於37℃，5%二氧化碳培養箱中共同培養四十八小時。

每穴加入10 μL的BrdU試劑，在相同情況下培養二十四小時後，移除culture medium，以washing solution清洗細胞，吹乾培養盤。於每個孔洞中加入fix denat solution 200 μL，於室溫下放置三十分鐘，洗淨每穴後，再加Anti-BrdU-POD 100 μL，室溫下放置九十分鐘，最後加入呈色劑100 μL，室溫下放置十到三十分鐘，以佰歐瑞(Bio-Rad)公司出品之Bio-Rad Model 3550-UV ELISA Reader測定450 nm之吸光值。

結果如第11圖所示，艾帕芙(IPAF)於1μg/mL低濃度即能明顯刺激小鼠脾細胞增生，並於1~4 μg/mL濃度下具有劑量效應，而在艾帕芙(IPAF)濃度8 μg/mL時可達到最佳的刺激細胞增生效果，提高小鼠脾細胞的BrdU攝取量(第11圖)。因此，艾帕芙(IPAF)可活化小鼠脾細胞，刺激小鼠脾臟細胞進行增生。

實施例十：小鼠B淋巴球之細胞週期分析

小鼠B淋巴球的分離：B淋巴球分離使用Miltenyi Biotec公司出品之MACS細胞分離系統。取小鼠脾臟細胞，利用帶磁珠之anti-mouse CD19抗體與脾臟細胞共培養，專一性連接辨識之B淋巴球再以磁性管柱吸附蒐集，分離之B淋巴球純度可達95%以上。

將小鼠B淋巴球(3×10⁶ cells/well)以24孔培養盤，分別加入艾帕芙(IPAF)，使其末濃度為8 μg/mL，並於37℃,5%二氧化碳培養箱共同培養七十二小時，將細胞取出，去除殘餘培養液，即可進行細胞週期分析。

以艾帕芙(IPAF)活化後之小鼠B淋巴球(1×10⁶ cells)以150 μL FACS緩衝液(取10mL FBS,0.5 g sodium azide,以PBS定量至500 mL)重新懸浮，並加入350 μL乙醇，於-20℃下固定30分鐘，再以PI/RNase staining buffer(必帝公司BD Pharmingen公司出品)，於黑暗中反應30分鐘，再使用流式細胞儀分析PI螢光。

由試驗結果可知，艾帕芙(IPAF)於8 μg/mL濃度下與B淋巴球共培養72小時，即能明顯刺激小鼠B淋巴球增生，DNA套數大於2N之細胞達5.84%(第12圖)。因此，艾帕芙(IPAF)可活化小鼠B淋巴球，刺激小鼠B淋巴球進行增生。

實施例十一：小鼠B淋巴球表面CD69分子分析

將小鼠B淋巴球(3×10⁶ cells/well)置入24孔培養盤，加入艾帕芙(IPAF)，使其末濃度為30 μg/mL，並於37℃,5%二氧化碳培養箱共同培養二十四小時，將細胞取出，去除殘餘培養液，即可進行細胞表面CD69分子分析。

以艾帕芙(IPAF)活化後之小鼠B淋巴球(1×10⁶ cells)以FACS緩衝液(10mL FBS,0.5 g sodium azide,以PBS定量至500 mL)重新懸浮，加入PE-labeled anti-mouse CD69抗體(eBioscience公司出品)，於4℃黑暗中反應30分鐘後，去除多餘螢光抗體，再使用流式細胞儀分析螢光。

結果如第13圖所示，將小鼠B淋巴球以濃度30 μg/mL之艾帕芙(IPAF)活化二十四小時後，具有CD69分子之B淋巴球數量增加，達到B淋巴球總數之20.3%(第13圖)。此結果顯示艾帕芙(IPAF)可活化小鼠B淋巴球。

實施例十二：小鼠B淋巴球表面MHC Ⅱ分子分析

將小鼠B淋巴球(3×10⁶ cells/well)置入24孔培養盤，加入艾帕芙(IPAF)，使其末濃度為30 μg/mL，並於37℃,5%二氧化碳培養箱共同培養二十四小時，將細胞取出，去除殘餘培養液，即可進行細胞表面MHC Ⅱ分子分析。

以艾帕芙(IPAF)活化後之小鼠B淋巴球(1×10⁶ cells)以FACS緩衝液(10mL FBS,0.5 g sodium azide,以PBS定量至500 mL)重新懸浮，加入FITC-labeled anti-mouse MHC Ⅱ抗體(eBioscience公司出品)，於4℃黑暗中反應30分鐘後，去除多餘螢光抗體，再使用流式細胞儀分析螢光。

實施結果如圖十四所示。將小鼠B淋巴球以濃度30 μg/mL之艾帕芙(IPAF)活化二十四小時後，具有MHC Ⅱ分子之B淋巴球數量增加，達到B淋巴球總數之51.4%(第14圖)。此結果顯示艾帕芙(IPAF)可活化小鼠B淋巴球。

實施例十三：小鼠B淋巴球IgM分泌之分析

IgM的定量利用Bethyl Laboratories出品之Mouse IgM ELISA quantification kit進行。

將小鼠B淋巴球(3×10⁶ cells/well)置入24孔培養盤，加入艾帕芙(IPAF)，使其末濃度為30 μg/mL，並於37℃,5%二氧化碳培養箱共同培養二十四、四十八、七十二小時，將細胞離心後，取其細胞培養液進行B細胞IgM分泌之分析。

試劑：(a) capture antibody:Affinity purified Mouse IgM Coating Antibody.(b) Detection Antibody: HRP Conjugated Mouse IgM Detection Antibody.(c) coating buffer: 0.05M carbonate-bicarbonate,pH9.6.(d) blocking buffer: 50 mM Tris,0.14 M NaCl,10% FBS,pH8.0.(e) sample buffer: 50 mM Tris,0.14 M NaCl,1% BSA,0.05% Tween 20,pH8.0.(f) wash buffer: 50 mM Tris,0.14 M NaCl,0.05% Tween 20,pH8.0.

將coating buffer 1:100稀釋capture antibody，注入96孔分析盤(96-well ELISA plate)上，每一個well加入100 μL的capture antibody，於25℃放置一小時，以wash buffer清洗清洗盤子五次。將200 μL blocking buffer加入以降低非特異性的干擾，於室溫作用30分鐘後，以wash buffer清洗盤子五次。加入細胞培養液100 μL，於室溫作用一小時，以wash buffer清洗盤子五次。加入100 μL以sample buffer 1:100稀釋之Detection Antibody，於室溫下作用一小時，以wash buffer清洗盤子五次。最後以ABTS溶液呈色之，以佰歐瑞(Bio-Rad)公司出品之Bio-Rad Model 3550-UV ELISA Reader測其在405 nm的吸光值。每次實驗皆有三重複並與標準曲線比對，以測得樣品濃度來計算其產生量。

實施結果如第15圖所示。將小鼠B淋巴球以濃度30 μg/mL之艾帕芙(IPAF)活化，於四十八小時後IgM產量較對照組高(圖十五)，且隨著艾帕芙(IPAF)活化時間48~72小時下，對於IgM之產量具時間效應(第15圖)。此結果顯示艾帕芙(IPAF)可刺激小鼠B淋巴球產生IgM。

實施例十四：胺基酸序列分析

首先以SDS-PAGE膠體電泳分析自FPLC gel filtration管柱純化的艾帕芙(IPAF)樣品純度，經轉漬至PVDF膜及coomassie blue染色後，委由明欣生物科技公司利用Edman reaction原理，以ABI amino acid sequencer自動定序儀分析，可依據各胺基酸殘基之HPLC圖譜，推算樣品之N端胺基酸序列，經過分析後可知艾帕芙(IPAF)之N端序列如SEQ ID 1。

實施例十五、選殖台灣金線連蛋白艾帕芙(IPAF)之基因

(一)　台灣金線連總RNA的抽取及純化

(1)　取經新鮮台灣金線連成株，以DEPC處理之去離子水洗淨切碎後以3,500 rpm離心五分鐘，倒除上清液。收集之子實体加入四倍體積的DEPC處理之去離子水，離心後倒除上清液，重複數次，徹底洗淨台灣金線連表面。洗淨後將多餘水份濾除，收集瀝乾的子實體。

(2)　使用Qiagen RNeasy Plant Mini Kit進行RNA抽取。以液態氮研磨台灣金線連至細緻粉末狀，取100 mg冷凍之台灣金線連粉末，加入450 μL的細胞溶解緩衝液RLT，振盪使細胞裂解。將細胞溶解液移至裝上收集管的QIA shredder spin column(紫色)，13,000 rpm離心二分鐘。吸取流出液的上清部份移至微量離心管，加入0.5體積(約225 μL)的純酒精，以定量吸管混合後，移至的RNeasy mini column(粉紅色)10,000 rpm離心十五秒。倒除收集管中內流出液，加入700 μL Buffer RW1至RNeasy管中，10,000 rpm離心十五秒，清洗RNeasy管。將RNeasy管裝至另一2 mL收集管，加入500 μL Buffer RPE至RNeasy管，10,000 rpm離心十五秒，倒除收集管中內流出液，再重複Buffer RPE的清洗。換上新的收集管，再以極速離心一分鐘，清除殘留的Buffer RPE。換上新的收集管，取20 μL RNase-free去離子水滴至spin column的silica-gel膜，10,000 rpm離心一分鐘。收集column流洗出的RNA。

(3)　測定260/280 nm吸光及進行formaldehyde變性電泳，分析RNA的濃度及品質。

(二)　台灣金線連cDNA之合成

使用Invitrogen公司之ThermoscriptTM RT-PCR System進行cDNA之合成。取5 μg total RNA與1 μL Oligo(dT) 20(50 μM)，補DEPC/DI至12 μL混合均勻於37℃反應五分鐘後，置冰上冷卻。在冰上將4 μL 5X cDNA synthesis buffer，1 μL DTT(0.1 M)，1 μL RNaseOUTTM(40 U/μL)，1 μL DEPC/DI，2 μL dNTP mix(10 mM)，1 μL Thermoscript RT(15 U/μL)，混合均勻後加至先前反應的RNA混合物，於50℃反應五十分鐘後，再以85℃五分鐘終止反應。加入1 μL RNase H於已合成之cDNA中，於37℃反應二十分鐘，去除殘留之RNA。將合成好的cDNA保存於-20℃。

(三) 3'核酸序列增殖(3'Rapid amplification of cDNA end,3'RACE)

(1)　第一股3'RACE ready cDNA之合成

(a)　使用Clontech的SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit。

(b)　取約1 μg total RNA於0.2ml微量管中與1 μL 3-CDS primerA(5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30N-1N-3')混合，補DEPC/DI至5 μL，於70℃反應二分鐘，再冰浴二分鐘，此時每段RNA的poly A'端已黏合SMART II A sequence。後繼依套組操作指示加入2 μL 5X First-Strand buffer,1 μL DTT(20 mM),1 μL dNTP Mix(10 mM)及1 mL PowerScript Reverse Transcriptase共10 μL之反應體積。

(c)　於42℃恆溫箱反應1.5小時，即合成第一股cDNA。加入100 μL Tricine-EDTA Buffer稀釋3' RACE ready cDNA，加熱70℃七分鐘，並將此cDNA保存於-20℃。此為3'RACE的增殖模板。

(2) 3' RACE反應

(a) PCR使用BD AdvantageTM 2 PCR Enzyme System。

(b)　取1.25 μL 3' RACE ready cDNA當模板，加入41.5 μL PCR-Grade Water,5 μL 10X Advantage 2 PCR Buffer,1 μL dNTP Mix(10 mM),1 μL台灣金線連免疫調節蛋白基因專一性引子(10 mM primer),5 μL 10X Universal Primer A mix最後加1 μL 50X Advantage 2 Polymerase Mix。

(c) PCR使用Appplied Biosystem GeneAmp System 2400進行。增殖條件為一循環之94℃一分鐘；三十循環之94℃五秒鐘，58℃三十秒，72℃兩分鐘；一循環之72℃十分鐘，4℃暫存。

(四) 5’核酸序列增殖(5' Rapid amplification of cDNA end,5'RACE)

(1)　第一股5' RACE ready cDNA之合成

(a)　使用Clontech公司出品的的SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit。

(b)　取約1 μg total RNA於0.2 mL微量管中與1 μL 5'-CDS primer A(5'-(T)25 N-1 N-3')及1 μL SMART II A oligo(5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3')混合，補DEPC/DI至5 μL，於70℃反應二分鐘，再冰浴二分鐘，此時每段RNA的poly A'端已黏合SMART II A sequence。接著依套組操作指示加入2 μL 5X First-Strand buffer,1 μL DTT(20 mM),1 μL dNTP Mix(10 mM)及1 μL PowerScript Reverse Transcriptase共10 μL之反應體積。

(c)　於42℃恆溫箱反應1.5小時，即合成第一股cDNA。加入100 μLTricine-EDTA Buffer稀釋5' RACE ready cDNA，加熱70℃七分鐘，並將此cDNA保存於-20℃。此為5'RACE的增殖模板。

(2) 5'RACE反應

(a) PCR使用BD AdvantageTM 2 PCR Enzyme System。

(b)　取1.25μL 5'RACE ready cDNA當模板，加入41.5 μL PCR-Grade Water,5 μL 10X Advantage 2 PCR Buffer,1 μL dNTP Mix(10 mM),1 μL台灣金線連免疫調節蛋白基因專一性引子(10 mM primer),5 μL 10X Universal Primer A mix最後加1 μL 50X Advantage 2 Polymerase Mix。

(c) PCR使用Appplied Biosystem GeneAmp System 2400進行。增殖條件為一循環之94℃一分鐘；三十次循環之94℃五秒鐘，58℃三十秒，72℃二分鐘；一循環之72℃十分鐘，4℃暫存。

(五) PCR產物之選殖

(1)　　核酸片段與載體的黏結反應

(a)　使用Promega公司出品之pGEM-T Easy Vector Systemr進行。

(b) PCR產物先以1.5%低熔點agarose進行核酸電泳膠片分析，自膠片中切取欲分析的核酸片段，並以Qiagen MinElute Gel Extraction Kit將單一的核酸產物純化。

(c)　將5 μL 2X Rapid ligation Buffer,1 μL pGEM-T Easy Vector,1-3 μL經純化之核酸產物,1 μL T4 DNA Ligase(3 Weiss units/μL)，補去離子水至10 μL，於4℃反應十四小時。黏結反應產物保存於-20℃。

(2)　大腸桿菌之轉型(E.coli transformation)及篩選

(a)　使用益生生技公司之ECOS 101 strain作為勝任細胞competent cell。

(b)　取2.5 μL黏結反應產物(ligation mixture)與50 μL勝任細胞振盪混合(vortex)一秒。42℃水浴四十五秒，再以振盪混合(vortex)一秒。立即將經轉形之菌液塗佈(plating)於含有50 μg/ml Ampicillin,100 μL IPTG(0.1 M),20 μL X-GAL(50 mg/mL)的選擇性培養基(LB plate: 10 g/L Bacto-tryptone,5 g/L Bacto-yeast extract,5 g/L NaCl,15 g/L agar)上。

(c)　經37℃，培養十六小時後，將培養皿置於4℃，以增加菌落的呈色反應。

(d)　自培養基上挑選成功轉形之白色菌落，並將單一菌落接種於液態培養基(LB broth)，於37℃培養十二小時。取1 μL菌液與2.5 μL 10X PCR buffer,2 μL dNTP(2.5 mM),1 μL M13 mix primer(10 μM),0.2 μL Taq polymerase(5 U/μL)，進行Colony PCR。確認帶有正確核酸片段菌落後，進行核酸定序分析。

在選殖艾帕芙(IPAF)之基因方面，先抽取新鮮台灣金線連成株之total RNA，再利用反轉錄反應製作台灣金線連mRNA之互補DNA(cDNA)，作為選殖的模版(template)。之後利用3'-RACE技術，以PCR方式釣取艾帕芙(IPAF)之基因，而3'-RACE反應的引子由艾帕芙(IPAF)之N端胺基酸序列反推可能的核酸密碼組設計而得。由艾帕芙(IPAF)之N端胺基酸序列，設計其可能的對應引子，利用3'-RACE技術進行選殖。由艾帕芙(IPAF)之N端第一個胺基酸至第七個胺基酸所設計出之引子(SEQ ID 2)，以3'-RACE反應後，電泳分析得到一約700 base pairs之核酸片段(第16圖)。將3'-RACE所得之700 base pairs之核酸片段進行TA cloning，選殖入pGEMT載體之後，分析此700 base pair片段的核酸序列，得到a36-700之序列(SEQ ID 3)。再將a36-700之序列轉譯為胺基酸之序列，並與艾帕芙(IPAF)之胺基酸序列比較，發現13個由Edman reaction所取得的胺基酸序列中，有13個與a36-700轉譯之胺基酸序列完全相同，兩者胺基酸序列之同質性達100%以上(第17圖)，表示兩者極高度相似。利用a36-700序列進一步設計b18引子(SEQ ID 4)，以5'-RACE技術，選殖艾帕芙(IPAF)之N端胺基酸之前的核酸序列，結果如第18圖所示，得到約600 base pair之片段。將5'-RACE所得之600 base pairs之核酸片段進行TA cloning，選殖入pGEMT載體之後，分析此600 base pair片段的核酸序列，得到b18-600之序列(SEQ ID 5)。再將b18-600之序列轉譯為胺基酸之序列，並與艾帕芙(IPAF)之N端胺基酸序列比較，選殖序列所得之結果完全相同(第19圖)。比對串接a36-700與b18-600之核酸序列，並輔以nested PCR確認，得到艾帕芙(IPAF)之核酸序列與胺基酸序列，如SEQ ID 5。其表現之部分由SEQ ID 5之第76個核酸至第477個核酸為止，並經轉譯為133個胺基酸序列，其胺基酸序列如SEQ ID 5第26個胺基酸序列至第158個胺基酸序列。

以上述實施例實施後可得一台灣金線連免疫調節蛋白艾帕芙(IPAF)其具有調節免疫之功用，可作為添加於食品、飲料、健康食品之用，亦或加以賦型劑與其他化學物質做為生醫材料藥劑亦或各種組合物醫藥品使用。

雖然本發明已以前述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與修改。因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

<110>許輔

<120>台灣金線連之新免疫調節蛋白艾帕芙(IPAF)

<150>TW/092136095

<151>2009-09-90

<160>5

<210>1

<211>15

<212>PRT

<213>台灣金線連(Anoectochilus formosanus)

<400>1

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>由艾帕芙蛋白1(IPAF)N端第一個胺基酸至第七個胺基酸所設計出之引子a36，以進行3'-RACE反應。

<400>2

<210>3

<211>579

<212>DNA

<213>台灣金線連(Anoectochilus formosanus)

<400>3

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>利用a36-700序列進一步設計之b18引子，用以進行5'-RACE技術。

<400>4

<210>5

<211>660

<212>DNA

<213>台灣金線連(Anoectochilus formosanus)

<400>5

第1圖係新鮮台灣金線連。

第2圖係台灣金線連蛋白質經由DE-52管柱層析純化圖。

第3圖係台灣金線連蛋白質經由FPLC Hi-Trap Q管柱層析純化圖。

第4圖係艾帕芙(IPAF)經由SDS/PAGE分析其分子量。

第5圖係艾帕芙(IPAF)之醣蛋白染色。

第6圖係艾帕芙(IPAF)之血球凝集活性測定。

第7圖係艾帕芙(IPAF)活化小鼠腹腔巨噬細胞產生腫瘤壞死因子TNF-alpha。

第8圖係艾帕芙(IPAF)活化小鼠腹腔巨噬細胞產生IL1-β。

第9圖係艾帕芙(IPAF)促進小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力。

第10圖係艾帕芙(IPAF)增加小鼠腹腔巨噬細胞表面MHC Ⅱ分子表現。

第11圖係艾帕芙(IPAF)提高小鼠脾細胞攝取Brd-U的效率，促進細胞增生效應。

第12圖係艾帕芙(IPAF)促進小鼠B淋巴球增生。

第13圖係艾帕芙(IPAF)促進小鼠B淋巴球表面分子CD69之表現。

第14圖係艾帕芙(IPAF)可促進小鼠B淋巴球表面分子MHC Ⅱ之表現。

第15圖係艾帕芙(IPAF)可促進小鼠B淋巴球分泌IgM。

第16圖係經由3’RACE技術選殖所得的a36-700片段電泳結果。

第17圖係將a36-700之序列轉譯為胺基酸之序列，並與艾帕芙(IPAF)之N端胺基酸序列比較，發現兩者胺基酸序列之同質性達100%以上。

第18圖係經由5’RACE技術選殖所得的b18-600片段電泳結果。

第19圖係將b18-600之序列轉譯為胺基酸之序列，並與艾帕芙(IPAF)之胺基酸序列與a36-700之序列轉譯為胺基酸之序列之比較。

Claims (3)

1. 一種由台灣金線連萃取出之蛋白艾帕芙(IPAF)，其特徵在於具有SEQ ID 5之胺基酸序列
2. 含有如申請專利範圍第1項之台灣金線連免疫調節蛋白艾帕芙(IPAF)之食品組合物，其特徵在於該組合物具有免疫調節功能。
3. 含有如申請專利範圍第1項之台灣金線連免疫調節蛋白艾帕芙(IPAF)之醫藥用組合物，其特徵在於該組合物具有免疫調節功能。