CN106244694A - 同时应用两种限制性内切酶实现真菌鉴别的方法 - Google Patents

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张文娟
魏锋
马双成
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Abstract

本发明涉及一种新的冬虫夏草及相关产品鉴别检测方法，尤其是同时应用两种限制性内切酶实现真菌鉴别的方法。所述方法包括在DNA序列分析的基础上，找到两个限制性内切酶位点，用来实现冬虫夏草菌和其他真菌的鉴别。本发明的方法可应用于冬虫夏草及虫草相关产品质量控制、真菌鉴别相关实验研究等方面。

Description

同时应用两种限制性内切酶实现真菌鉴别的方法
技术领域
本发明属于医疗技术领域，涉及一种新的冬虫夏草及相关产品鉴别检测方法，尤其涉及同时应用两种限制性内切酶实现真菌鉴别的方法。
背景技术
冬虫夏草(Cordyceps sinensis，即Ophiocordyceps sinensis)是寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体，主要见于海拔3200-5000米、气候较为寒冷的高山草甸和峡谷，目前发现仅分布在我国青藏高原地区的西藏、青海、四川、云南、甘肃五省区，以及不丹、印度、尼泊尔的喜马拉雅山南麓的部分地区，野生资源有限，是一种珍贵稀有的传统中药材，在我国的药用历史已有500多年。现代科学研究证明，冬虫夏草的主要化学成分为核苷类、氨基酸类、多糖类、醇类以及一些无机元素等，具有免疫调节，抗炎，抗氧化，抗肿瘤等生物学效应。冬虫夏草不仅作为一种中药材被收录到中国药典，也同样作为一种日常保健品被亚健康人群和慢性病病人所青睐，市场需求日益增长。由于近年来过度采挖，野生资源急剧减少，价格畸高，优质冬虫夏草的市场价高达400元/克；另一方面，广大民众对于“冬虫夏草”和“虫草”的概念混淆不清，在利益驱使下，一些不法商家借机以假乱真、欺骗消费者的现象屡见不鲜。CCTV焦点访谈栏目曾以“冬虫夏草，乱象丛生”为题报道了这一混乱的市场状况，一时引起社会广泛关注，迫切要求我们加强市场监管。而现行《中国药典》(2015年版)关于“冬虫夏草”的标准规定只有“性状”和“含量测定”两项，缺乏客观、准确、专属性强的鉴别标准。
发明内容
为了提供更为客观、准确、专属性强的冬虫夏草及相关产品鉴别检测手段，本发明提供了一种同时应用两种限制性内切酶实现真菌鉴别的方法。
冬虫夏草近缘种是原药材混伪品的主要来源。常见的近缘种有古尼虫草、亚香棒虫草、新疆虫草、戴氏虫草、凉山虫草、蛹虫草6个品种。鉴于从基因角度进行真伪鉴别最为准确，本发明人根据冬虫夏草和近缘虫草真菌种类不同，采用基于ITS的PCR-RFLP方法对其进行鉴别。
聚合酶链式反应-限制性内切酶长多态性法(PCR-RFLP)是在PCR的基础上，利用限制性内切酶的特性，即识别特定双链DNA序列并在特定位点进行切割，如果酶切位点发生了突变，便不能被切割；片段是否被切割可以通过琼脂糖凝胶电泳法检测。该方法客观，灵敏，重现性好，专属性强，已被用于《中国药典》川贝母的检测。本发明人通过对样品测序获得的ITS序列以及GenBank数据库中多种虫草真菌的ITS序列进行分析，确定了用于鉴别的两个限制性内切酶位点；之后对不同产地的冬虫夏草和近缘虫草样品进行PCR-RFLP法检测，证明方法可行。此外，本发明人分析了GenBank数据库中一些真菌的ITS序列，发现该方法能够鉴别冬虫夏草菌与至少17种真菌。
本发明提供了一种同时应用两种限制性内切酶实现真菌鉴别的方法，其中所述两种限制性内切酶为Xho I和Sac II。
根据本发明的具体实施方式，所述真菌为冬虫夏草和其近缘虫草及其他真菌。
例如，所述真菌为冬虫夏草(包括其无性型——中华被毛孢)和古尼虫草、亚香棒虫草、蛹虫草、戴氏虫草、凉山虫草、新疆虫草，以及其它真菌，包括Cordyceps sobolifera、Cordyceps brittlebankisoides、Cordyceps brongniartii、Cordyceps nutans、Cordyceps cicadae、Tolypocladium caledonica、Ligularia hodgsonii、Paecilomycessinensis、Mortierella SP、Gliocladium roseum、Cephalosporium sinensis等。
根据具体实施方式，所述方法涉及PCR-RFLP法。
所述方法包括在DNA序列分析的基础上，找到两个限制性内切酶位点以便进行真菌的鉴别。
所述真菌鉴别适用于冬虫夏草、其近缘虫草的原药材和产品。所述产品为粉末制剂、片剂、液态制剂、人工发酵菌粉制剂。
根据发明的具体实施方式，所述方法包括植物基因组DNA提取、聚合酶链式反应法(PCR)、DNA测序、序列比对及限制性内切酶位点分析、限制性内切酶长度多态性方法(RFLP)、琼脂糖凝胶电泳法。
本发明的方法较以往传统的鉴别方法，判断客观，结果准确，重复性好，适合作为一种真伪鉴别手段，用于冬虫夏草质量控制，具有良好的应用前景。
附图说明
图1描述冬虫夏草与其它虫草ITS区序列分析。
图2为根据本发明的一种具体实施方式的琼脂糖凝胶电泳结果，其中：(a)示各种虫草PCR结果；(b)示各种虫草PCR产物的Xho I酶切结果，1-3：冬虫夏草；4：戴氏虫草；5:凉山虫草；6-9：古尼虫草；10-13：新疆虫草；14-15：蛹虫草；16-18：亚香棒虫草；B:空白对照；M:DL2000DNA分子量标记。
图3为根据本发明的一种具体实施方式的琼脂糖凝胶电泳结果，其中：(a)冬虫夏草和新疆虫草Sac II酶切位点示意图；(b)琼脂糖凝胶电泳图，示冬虫夏草与新疆虫草PCR产物的Sac II酶切结果，1-12:冬虫夏草；13-14：新疆虫草；B:空白对照；M:DL2000DNA分子量标记。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步详细的描述，这些实施例仅仅是说明性的，因此不应将其解释为对本发明范围的限制。
一、样品及序列信息
共收集到正品冬虫夏草37批。收集冬虫夏草6个近缘种21批，包括戴氏虫草、古尼虫草、新疆虫草、亚香棒虫草、蛹虫草、凉山虫草，详见表1。另从GenBank数据库下载以上各种虫草的ITS序列，详见表2。
表1、样品信息
表2、从GenBank数据库下载的ITS序列信息
二、仪器与试剂
1.1.1仪器：PCR仪(ABI VERITI)，分析天平(Mettler AB135-S)，纯水仪(Millipore公司)，电泳仪(EPS-301，Amersham)，全自动凝胶成像系统(SyngeneGeneGenius)，球磨仪(M400，Retsch)，微量紫外分光光度计，水浴锅。
1.2.1试剂：快捷型植物基因组提取试剂盒(DP321，天根生化科技有限公司)，ExTaq(DRR100B，TaKaRa)，dNTP Mixture 10mM(N0447，New England Biolabs)，SacII(R0157,New England Biolabs)GelRed(41003，Biotium)，琼脂糖(BLOWEST)，GelRed(Biotium)，Tris碱，冰醋酸，EDTANa2·2H2O(国药集团化学试剂有限公司)，引物(华大基因)ITS上游：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’，下游：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
1.2.2样品处理：分别取样品的子座和虫体部分，用酒精棉球将表面擦拭干净，晾干；用球磨仪磨成极细粉，称取30mg备用。
1.2.3DNA提取和定量分析：按照植物基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作。用微量紫外分光光度计对提到的DNA进行定量。
1.2.4聚合酶链式反应及测序：
PCR反应条件：预变性94℃5min；反应循环(35轮)94℃30s，52℃30s，72℃30s；最后延伸72℃5min。PCR反应体系25μL：DNA模板1μL，上下游引物各0.2μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，dNTP(10mM)0.6μL，反应缓冲液2.5μL，高压蒸汽灭菌的去离子水(ddH2O)补齐体系。
PCR样品送测序公司完成测序。
1.2.5序列分析：Codon Code Aligner 4.0进行序列拼接，剪切和图谱分析；MEGA5.0进行多序列比对分析。
1.2.6酶切反应：反应体系20μL——取PCR产物10μL，加入限制性内切酶0.5μL，反应缓冲液2μL，高压蒸汽灭菌的去离子水(ddH2O)7.5μL。反应条件为37℃15min。
1.2.7琼脂糖凝胶电泳及凝胶成像：使用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，电压5V/cm，20～40min；之后使用紫外凝胶成像仪拍照并保存结果。
三、PCR-RFLP鉴别方法的建立
通过对冬虫夏草和虫草属其它种的ITS序列进行分析，发现冬虫夏草具有Xho I限制性内切酶位点，其它虫草(新疆虫草除外)不具有这一位点(图1)。琼脂糖凝胶电泳结果显示(图2)，在Xho I作用后，冬虫夏草ITS区PCR产物被切割成两个片段,位于100-500bp之间；其它虫草(新疆虫草除外)则不能被切割。新疆虫草ITS区的PCR产物被切割成两个片段,大小与冬虫夏草相近，因此二者不宜用此种限制性内切酶进行鉴别。
通过分析冬虫夏草和新疆虫草的ITS区，发现二者具有不同的Sac II酶切位点数目，分别为1个和3个，这样理论上两种虫草分别可以被切割成2个片段和4个片段。在琼脂糖凝胶电泳图中，冬虫夏草组出现2个条带，大小位于100bp-500bp之间；而新疆虫草由于两个片段大小相同，在凝胶图上几乎重合，以及一个片段过小(约为50bp)而没有在图中显示，故也表现为2个条带，但其大小与冬虫夏草组差别较大，凭肉眼可以明确辨别(图3)。
所以，本发明人选择同时应用Xho I和Sac II两种限制性内切酶，用来鉴别冬虫夏草和其近缘虫草。
四、冬虫夏草PCR-RFLP鉴别方法的适用范围
除了以上6种近缘虫草，本发明人考察了其他一些常见真菌，分析他们ITS区上，两种限制性内切酶Xho I和Sac II酶切位点的分布情况。由于这些真菌的ITS区不会兼具上述两种限制性内切酶的位点，故本发明人建立的双酶切方法，可以用来区别冬虫夏草和至少17种常见的真菌(表3)。
表3、冬虫夏草和其他17种真菌ITS序列上两种限制性内切酶的分布情况
本文对一些具体的实施例进行了详细的描述，然而这只是作为对发明目的实例说明，而不限制下述权利要求书的范围。应当理解，对本文所述具体方案的不同取代、改变和修饰都不偏离本发明权利要求所定义的内涵和外延，从而应当属于本申请所要求保护的发明范围。

Claims (7)

1.一种同时应用两种限制性内切酶实现真菌鉴别的方法，其中所述两种限制性内切酶为Xho I和Sac II。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述真菌为冬虫夏草和近缘虫草以及可用上述两种限制性内切酶所能鉴别的其它真菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述冬虫夏草包括无性型中华被毛孢,所述近缘虫草为古尼虫草、亚香棒虫草、蛹虫草、戴氏虫草、凉山虫草或新疆虫草，所述其它真菌为Cordyceps sobolifera、Cordyceps brittlebankisoides、Cordyceps brongniartii、Cordyceps nutans、Cordyceps cicadae、Tolypocladium caledonica、Ligulariahodgsonii、Paecilomyces sinensis、Mortierella SP、Gliocladium roseum、或Cephalosporium sinensis。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法涉及PCR-RFLP法。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述方法包括在DNA序列分析的基础上，找到两个限制性内切酶位点以便进行真菌的鉴别。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述真菌鉴别适用于冬虫夏草、其近缘虫草的原药材和产品。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述产品为粉末制剂、片剂、液态制剂、人工发酵菌粉制剂。
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