CN104404129B - Dna条形码鉴别溪黄草及其近属的方法 - Google Patents

Dna条形码鉴别溪黄草及其近属的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种包括唇形科植物溪黄草和线纹香茶菜的IST2基因序列片段的基因库。本发明还提供一种鉴别唇形科植物溪黄草和线纹香茶菜植物物种的方法，所述方法包括将待鉴别植物物种的植物样品的IST2基因或其序列片段与本发明的基因库进行比较的步骤。本发明还提供IST2基因或其序列片段在鉴别唇形科植物线纹香茶菜和唇形科植物溪黄草中的用途。本发明证明了IST2序列具有通用、易扩增、易比对的特点，并且在唇形科植物线纹香茶菜与唇形科植物溪黄草中，具有良好的扩增性和鉴别效果。

Description

DNA条形码鉴别溪黄草及其近属的方法
技术领域
本发明属于植物物种鉴定领域，具体而言，本发明涉及唇形科植物溪黄草和线纹香茶菜的物种鉴别方法。
背景技术
中药溪黄草是广东福建一带居民传统用药，其利湿退黄，用于肝炎、急慢性胆囊炎、痢疾等疾病的治疗，并作为凉茶日常保健食用。
在中药界，部分中药材的名字与其基原，即植物分类学名字不一致。中药溪黄草就存在着这种状况，民间传统使用的中药溪黄草是唇形科植物线纹香茶菜[拉丁名为Rabdosia lophanthoides(Buch.-Ham.ex D.Don)H.Hara或Isodon striatus(Benth.)Kudo]及其变种纤花香茶菜[拉丁名为Rabdosia lophanthoides(Buch.-Ham.ex D.Don)H.Hara var.graciliflora(Benth.)H.Hara或lsodon lophanthoides(Buch.-Ham.exD.Don)H.Hara var.graciliflora(Benth.)H.Hara]；同时，由于没有相关标准规范，在药材市场上有唇形科植物溪黄草[拉丁名为Isodon serra(Maxim.)Kudo或Rabdosia serra(Maxim.)H.Hara]混同使用；另外，相关学术专著及地方标准专著中收录的溪黄草的基原不一致，关于基原的确定及品种的鉴别都有矛盾之处：《常用中草药手册》、《广东中兽医常用草药》、《全国中草药汇编》(上册)、《中药大辞典》及广东、广西、湖南等地方的中药材标准，均记载为溪黄草的基原是线纹香茶菜Isodon lophanthoides(Buch.-Ham.ex D.Don)Hara)，其中《广东省中药材标准》第二册同时将植物溪黄草Rabdosia serra(Maxim.)H.Hara作为基原之一收录进去，但是在植物鉴别中，溪黄草Rabdosia serra(Maxim.)H.Hara的一些生药特征不符合标准。(本专利申请下文中所述“溪黄草”均指的是唇形科植物溪黄草[拉丁名为Isodon serra(Maxim.)Kudo或Rabdosia serra(Maxim.)H.Hara]，而不是中药溪黄草)
植物溪黄草与线纹香茶菜为双子叶植物唇形科下的两个种，新鲜的植株上两者的茎、叶等形态外观上差异大，但经干燥或切段后两者不易分辨。在市场流通的中药材通常为干品。有效的鉴别方法既能区别植物溪黄草与线纹香茶菜，又能在基原的确立研究中提供部分技术手段。
目前针对这两种植物及饮片的鉴别方法有性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定等方法。这些现有技术对操作人员的经验依赖度高，而传统鉴定方法的理论基础建立于分类群的性状特征分析，这些性状特征是与环境紧密相关的表现型，在鉴别时易受环境因素影响及样品形态和材料部位的限制，出现误差。
中药的品种真伪鉴别直接关系到用药安全及临床疗效。因此，目前迫切需要提供能够准确鉴定溪黄草植物物种、从而能够帮助准确用药的新方法。
分子生物学鉴定是目前应用DNA分子标记技术来鉴定中药原植物及其药材和饮片的新方法。简而言之，从分子遗传角度来看，物种的表现型归根结底应追溯到基因型的差异，即在DNA序列上的差异。因此，对基因组序列差异的比较研究为植物分类和鉴定提供了最本质的依据。
近年来，随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已广泛用于药用植物遗传多样性、系统学、分类学研究，并逐渐渗透到中草药的鉴定领域，推动了中草药鉴定研究的发展。DNA分子作为遗传信息的载体，信息含量大，在同种内具有高度的遗传稳定性，且不受外界环境因素和生物发育阶段及器官组织差异的影响，因此用DNA分子特征作为遗传标记进行中草药鉴别具有更为准确可靠，非常适用于近缘种、易混淆品种、珍稀品种等的植物鉴定。
目前，用于中草药鉴定的分子标记技术主要有“限制性片段长度多态性”(RFLP)技术、“随机扩增多态DNA”(RAPD)技术、“微卫星”(SSR)技术、ISSR标记技术、“扩增片段长度多态性”(AFLP)技术等等，及DNA条形码技术(DNA barcoding)。其中，DNA条形码鉴定是分子鉴定的最新进展，其定义为利用基因组中一段公认标准的、相对较短的DNA片段来对物种进行快速、准确地识别和鉴定分子诊断新技术。其优势在于，只需一个或少数几个合适的基因片段即可对整个属、科的绝大部分物种进行准确的鉴别；鉴别速度更快；重复性和稳定性高；实验过程简单化、标准化，更易实现物种鉴别的自动化。DNA条形码鉴定技术是传统鉴别方法的有效补充，能够实现中药基原鉴定的标准化，有助于缓解传统鉴定人才缺乏的现状。
在利用DNA条形码技术鉴定植物时，DNA条形码的筛选及确定是重要一环。通常，DNA条形码筛选有以下标准：(1)标准的短片段；(2)要有足够的变异可将物种分开来，种间差异比较大，便于进行种与种的区分，种内序列变异尽量小，从而使种间和种内变异有一个明晰的界定；(3)序列两段相对保守，以方便引物的设计。
因为缺乏通用引物使其成功扩增，植物核基因组的大多数单拷贝基因和它们的内含子首先被排除作为条形码的候选者。另有研究者提出，核DNA的内部转录空间ITS和ITS2则可能成为潜在的DNA条形码序列。并且，叶绿体基因组的基因及其内含子的研究发现，psbA-trnH的非编码区和ITS可能作为潜在的DNA条形码序列用于鉴定多样性的被子植物物种。还有人提出，matK基因可以作为通用条形码鉴定有花植物，而matK和psbA-trnH两者都适用于肉豆蔻科植物。因此，迄今为止，对于适用于植物鉴定的DNA条形码，目前已先后提出了matK、psbA-trnH、rbcL、rpoC1、rpoB、matK、ITS2等序列，但是没有一个条形码能在所有植物科属种内适用。
已有一些研究者尝试将DNA分子生物学鉴定方法用于鉴定溪黄草，如利用RAPD技术来进行鉴定。RAPD技术是第二代分子标记技术，没有DNA条形码技术稳定。并且，虽然研究者不断地完善DNA条形码技术在植物物种鉴定中的应用，但是由于目前还有报道任何一条DNA条形码可以适用所有植物的鉴别，因此对具体的植物物种，仍需要进行实验来寻找到合适的基因序列作为DNA条形码使用。
基于上述情况，目前如要利用DNA条形码技术来对唇形科植物线纹香茶菜与唇形科植物溪黄草进行准确鉴定，需要对可能使用的DNA条形码进行筛选，找到最适合的基因序列作为DNA条形码。
发明内容
本发明的一个目的是提供最适合鉴别溪黄草和线纹香茶菜的DNA条形码，即特定的DNA序列。
本发明的另一个目的是，通过采集已确定物种的溪黄草、线纹香茶菜(包括变种纤花香茶菜)原产地的多份样品，建立溪黄草、线纹香茶菜的DNA条形码基因库。
本发明的又一个目的是，通过将新的待检样品与该DNA条形码基因库的基因片段进行比对，建立该未知样品的鉴别方法。
本发明的再一个目的是，提供该DNA条形码或基因库在溪黄草和线纹香茶菜中的用途。
本发明的具体技术方案如下：
一方面，本发明人经过大量实验，就溪黄草、线纹香茶菜和纤花香茶菜的DNA条形码基因的筛选，从ITS2、matK、psbA-trnH3个序列中筛选出最适合溪黄草、线纹香茶菜鉴别的DNA条形码，即ITS2基因或ITS2基因的序列片段。
ITS2为高等植物的核糖体DNA的组成部分，为第二内转录间隔区。目前，核基因组序列在药用植物鉴定和品质研究中的应用主要集中在编码核糖体RNA基因(nrDNA)重复区内。高等植物细胞核中nrDNA是一些高度重复的串联序列组成的多基因家族，每个重复单位从5’端开始，包括外转录间隔区(ETS)、18S基因、第一内转录间隔区(ITS1)、58S基因、第二内转录间隔区(ITS2)和26S基因，重复单位之间为基因间隔区(IGS)或称为非编码区(NTS)。nrDNA的编码区序列(18S、58S和26S基因)为高度保守区，序列差异主要表现在非编码区序列上，而ITS区是中度保守区，序列的变异度处于两者之间。nrDNA高度保守的编码区序列主要用于种、属以上分类层次的研究中，非编码区序列(ETS、IGS/NTS)和中度保守的重复序列则比较适合于近缘类群和居群间关系的研究。
本发明人经过筛选研究发现，相比于其它基因诸如matK、psbA-trnH，ITS2序列具有通用、易扩增、易比对的特点。并且，但本发明人发现，在唇形科植物线纹香茶菜和唇形科植物溪黄草中，ITS2基因有良好的扩增性和鉴别效果，可以作为DNA条形码而用于鉴别上述植物物种。
因此，本发明在此方面提供ITS2基因或其序列片段在鉴别唇形科植物线纹香茶菜和唇形科植物溪黄草中的用途。其中，所述ITS2基因序列片段优选通过采用下述序列作为引物从待鉴别植物样品的基因组DNA中扩增得到：SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38。
另一方面，本发明提供了包括溪黄草和线纹香茶菜(包括变种纤花香茶菜)的ITS2基因序列片段的基因库。具体而言，首先采集溪黄草、线纹香茶菜原产地的多份样品，以植物传统分类学方法鉴别各自的物种，然后分别提取其基因组DNA，以其基因组DNA为模板，采用特定引物序列、优选SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38扩增样品的ITS2基因序列片段，由此建立包括溪黄草和线纹香茶菜的ITS2基因序列片段的基因库。所述基因库包括下述序列编号所示的ITS2基因序列片段：SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36。其中，SEQ ID NO.1-8为以植物传统分类学方法鉴定为溪黄草样品各自的ITS2基因序列片段；SEQ ID NO.9-10为以植物传统分类学方法鉴定为线纹香茶菜样品各自的ITS2基因序列片段；SEQ ID NO.11-36为以植物传统分类学方法鉴定为线纹香茶菜(变种纤花香茶菜)样品各自的ITS2基因序列片段。
又一方面，本发明提供了溪黄草和线纹香茶菜植物物种的鉴别方法，所述方法包括下述步骤：
1)提取待鉴别植物的基因组DNA；
2)以步骤1)得到的基因组DNA为模板，扩增ITS2基因或其序列片段；
3)将步骤2)得到的ITS2基因或其序列片段与本发明提供的基因库进行比较，从而鉴别所述待鉴别植物的物种。
在本发明提供的鉴别方法中，步骤1)中可以采用任何植物基因组DNA提取方法或商业提取试剂盒进行。根据本发明的具体实施方式，取待鉴别植物的样品例如叶片，使用75％乙醇水溶液擦洗表面后晾干，称取5mg-2g，经液氮研磨后，用植物基因组DNA提取试剂盒进行提取。
步骤2)中可以采用任何可扩增ITS2基因或其序列片段的条件进行。根据本发明的具体实施方式，在扩增待鉴别植物样品的ITS2基因序列片段时，其引物及扩增条件如下所示：
引物——
SEQ ID NO.37(正向)：ATGCGATACTTGGTGTGAAT
SEQ ID NO.38(反向)：GACGCTTCTCCAGACTACAAT
反应体系——
ExTaqMix25μl，上、下游引物各1.0μl，DNA模版3.0μl，加灭菌蒸馏水至50μl
反应程序——
95℃，5min；94℃-30s，56℃-1min，72℃-45s，40次循环；72℃-10min检测、测序和结果处理——
采取琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物。电泳后，PCR产物应在相应的DNA条形码序列长度位置出现一条目的条带，阴性对照应无条带。将有PCR扩增条带的样品送测序公司进行DNA序列测定，使用DNA测序仪对目的条带进行双向测序，PCR扩增引物作为测序引物。测序结果采用序列拼接软件CodonCode Align er V2.06(CodonCode Co，USA)校对拼接，去除低质量序列及引物区，序列方向应与PCR扩增正向引物方向一致。
在步骤3)中，在将步骤2)得到的ITS2基因或其序列片段与本发明提供的基因库进行比较时，相似度最高或匹配度最高或遗传距离最小的对应物种即为待鉴别植物的物种。可以通过将待鉴别植物的序列与基因库内已有的序列之间的进行比对，获得多个序列间的相似性，得出其物种类别。BLAST分析、距离法、建树法都是基于序列比对鉴别物种的方法。
根据本发明的具体实施方式，将待鉴别样品的ITS2基因序列片段与此基因库的所有ITS2基因片段进行比对，获得待鉴别植物的序列与基因库内已有的多个序列之间的多个最小变异值，再跟已计算出的溪黄草和线纹香茶菜的种内最大变异值比较，进行结果判定。如：根据实施例1所述，溪黄草ITS2基因和线纹香茶菜ITS2基因的种内最大变异值分别为“4.8”和“1.4”，采用序列比对的计算机软件，如MatGat2.01、MEGA5、Vector NTI Suite组件AlignX等，对待鉴别植物的序列与基因库内的线纹香茶菜的多个序列之间逐个两两比对，得到多个序列间最小变异值，这些值等于或低于1.4，则对应物种为线纹香茶菜；同样采用计算机软件计算待鉴别植物的序列与基因库内的溪黄草的多个序列之间的遗传距离，得到多个序列间最小变异值，这些值等于或低于4.8，则对应物种为溪黄草。
具体而言，首先，将从待鉴别样品获得的ITS2基因序列片段峰图文件导入CodonCode Aligner V3.7进行拼接，然后人工检查拼接效果，包括(1)调整序列正反向(edit—reverse complement)，(2)去除引物或其他边界序列(sample—trim vector…)，(3)查看剩余碱基质量值(qual需要大于等于20)，最后导出一致序列为标准条形码数据。然后，将此标准条形码数据与ITS2基因序列片段的基因库的数据一起导入序列比对软件(MatGat2.01)，选择默认计分矩阵(Scoring Matrix:blosum50)进行多重比对(align)，保存计算结果(Similarity table)，数值保留小数点后一位，根据后续软件TaxonGap所需格式调整(两个txt文件，一个是物种名称目录，一个为物种DNA序列比对结果，即相似性矩阵)。接下来，利用软件TaxonGap2.4.1查看鉴别结果。在软件主界面导入物种名称目录(Files—Data Files—Load)，在Biomarker选项下导入物种DNA序列比对结果(Biomarker—Add—Load—Save)，其他次要参数可参考软件说明书进行设置。运行软件后(Run—Execute)获得结果，在txt文件的适宜图中，查看待检样品序列与溪黄草、线纹香茶菜(包括变种纤花香茶菜)各个样品序列分别对应的“种间最小变异值”(假设待鉴别样品是一个新物种)，若待检样品序列与溪黄草各样品的序列片段之间的最小变异值(即“种间最小变异值”)等于或小于4.8，即可判定该待检物种为溪黄草；若待检样品与线纹香茶菜各样品的序列片段之间的最小变异值(即“种间最小变异值”)为1.4，即可判定该待检物种为线纹香茶菜。
也可以采用诸如下述其它方法，这几种方法也是通过序列比对、比较匹配度或比较相似性等，确认物种之间的归属：
BLAST分析——
来源于未知样品的DNA条形码序列(query sequence)与DNA条形码数据库(reference library)进行比对，如果在DNA条形码数据库中找到完全一样的序列(reference sequence)，那么未知样品就是该reference sequence对应的物种；反之未知样品在数据库中不存在。可利用下面的方法进一步鉴定，在这种情况下，需要重点关注与未知样品DNA条形码序列最相关10个序列的物种，或者比对中出现频率最高的物种，可以将未知样品确定为某一科属。同时该方法也可直接与GenBank数据库进行比对，以保证利用全球最新的核苷酸数据指导鉴定。
距离法——
计算未知样品DNA条形码序列(query sequence)与数据库中每一个序列(reference sequence)的遗传距离，未知样品应为具有最小平均遗传距离(meandistance)的物种或者具有最小遗传距离(nearest distance)的物种。遗传距离的阈值(threshold)是在“构建药用植物DNA条形码鉴定平台”过程中确定的，理论上对同一个物种，取样涵盖了其全部的地理分布(不同居群)和同一居群中的足够个体，该阈值可以准确反映该物种的遗传变异大小，也有利于更好地确定未知样品的物种，但考虑到研究成本，一般认为同一物种取样最好包括5个居群，每个居群2个个体。
建树法——
先应用CLUSTAL进行MSA，选用合适的遗传距离模型(一般用K2P距离模型)计算种内和种间的遗传距离，应用MEGA或PAUP等软件构建NJ、UPGMA、MP等系统发育树，检验未知样品的DNA条形码序列(query sequence)与数据库中序列(reference sequence)聚类在一起的物种，根据聚类情况进一步确定物种。
成对序列比对法——
通过以上方法仍不能将未知样品鉴别到种时，可以将未知样品与密切相关的10个物种的reference sequence进行成对比对，通过分析碱基变异位点来鉴别物种，或判断为新种，或判断为reference library中尚未收录的物种。
相比于现有技术，本发明作出了以下贡献和有益效果：
首先，本发明对溪黄草、线纹香茶菜和纤花香茶菜的基因条形码进行筛选，从ITS2、matK、psbA-trnH3个基因序列中筛选出最适合鉴别溪黄草和线纹香茶菜的DNA条形码，即ITS2基因或其序列片段。相比于其他基因，ITS2序列具有通用、易扩增、易比对的特点。并且，本研究发现，在唇形科植物线纹香茶菜与唇形科植物溪黄草中，ITS2具有良好的扩增性和鉴别效果。
第二，本发明经过采集溪黄草、线纹香茶菜和线纹香茶菜(变种纤花香茶菜)原产地的多份样品，得到了包括ITS2基因片段的基因库，从而建立了溪黄草和线纹香茶菜(包括变种纤花香茶菜)的标准ITS2序列基因库。
第三，基于上述发现，本发明还建立了新样品的鉴别方法，包括将新的待鉴别样品与此基因库的基因片段进行比对，判断新样品的物种。特别是通过计算种内种间变异值；对于基因库内的溪黄草和线纹香茶菜(包括变种纤花香茶菜)序列，已经计算出溪黄草和线纹香茶菜(包括变种纤花香茶菜)各自的种内最大变异值和两个物种间的种间最小变异值，当新的待鉴别样品与此基因库的基因片段进行比对后，得到多个序列间最小变异值(即“种间最小变异值”)，这些值等于或小于已计算出的某物种的种内最大变异值，可视为与其同一物种。此鉴别方法可以鉴别溪黄草和线纹香茶菜的全草、器官及饮片。相比于溪黄草和线纹香茶菜的现有鉴别方法，本发明的方法具有对于样品的完整程度要求低，鉴别指标可以量化的优点。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示了本发明提供的DNA条形码鉴定方法效果图，其以植物物种为类别，采用TaxonGap法。其中种间最小变异值显示为深色条；种内最大变异值显示为浅色条，Rs代表物种溪黄草，Rlvg代表物种纤花香茶菜，Rl代表物种线纹香茶菜。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1DNA条形码的筛选和包括IST2基因序列片段的基因库的建立
本实施例就溪黄草、线纹香茶菜和线纹香茶菜(变种纤花香茶菜)的DNA条形码基因的筛选，从ITS2、matK、psbA-trnH3个序列中筛选出最适合溪黄草和线纹香茶菜鉴别的DNA条形码，即IST2基因序列片段。此外，本实施例建立了包括溪黄草和线纹香茶菜(包括变种纤花香茶菜)的IST2基因序列片段的基因库。
1仪器、材料与试药
1.1材料
在7个采样点(广东，福建)，收集了溪黄草、线纹香茶菜和线纹香茶菜(变种纤花香茶菜)共36份样品，详细情况见下表1。下述条形码筛选实验以植物叶片为材料。
表1样品信息表
1.2试剂与仪器
采用了植物基因组DNA提取试剂盒(北京天根生物技术有限公司)；10×PCRBuffer缓冲液、Tris碱(上海爱紫特生物科技有限公司)；Taq DNA聚合酶、dNTP(TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司)；PCR扩增引物合成(华大基因)；D-37520型台式离心机(德国Eppendorf公司)；PTC-100型PCR仪(美国MJ Research公司)；DDY-Ⅲ型电泳仪(北京六一仪器厂)；凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)。
2方法
2.1DNA的提取
材料收集后，用变色硅胶进行干燥。实验时取约10mg植物组织，经液氮研磨后，用植物基因组DNA提取试剂盒进行提取。本实验植物基因组DNA提取均采用“天根”植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型目录号：DP305)，具体操作步骤如下：
1)取植物新鲜组织约100mg或干重组织约30mg，加入液氮充分研磨。
2)将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μl65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1％)，迅速颠倒混匀，将离心管放在65℃水浴20分钟，水浴过程中颠倒离心管以混匀样品数次。
3)加入700μl氯仿，充分混匀，12000rpm(～13400*g)离心5分钟。
4)小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μl缓冲液GP2，充分混匀。
5)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm(～13400*g)离心30秒，弃掉废液。
6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12000rpm(～13400*g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW，12000rpm(～13400*g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12000rpm(～13400*g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(～13400*g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm(～13400*g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
2.2PCR扩增
植物组DNA提取产物进行PCR扩增，引物由华大基因合成，DNA聚合酶等原料购自宝生物工程(大连)有限公司。具体引物序列、反应体系及反应程序如下表2所示。
表2引物序列、反应体系及反应程序
2.3测序
PCR扩增产物交由华大基因测序(部分序列由基迪奥公司测序)，得测序峰图。峰图质量标准为所有碱基质量值(QV)大于20，即99％正确率以上。
2.4数据处理
测序结果采用序列拼接软件CodonCode Aligner V3.7(CodonCode Co，USA)校对拼接，去除低质量序列及引物区，获得所有标准条形码数据。将得到所有标准条形码数据导入序列比对软件(MatGat2.01)，选择默认计分矩阵(Scoring Matrix:blosum50)进行多重比对(align)，保存计算结果(Similarity table)(数值保留小数点后一位)，根据后续软件TaxonGap所需格式调整(两个txt文件，一个是物种名称目录，一个为物种DNA序列比对结果，即相似性矩阵)，利用软件TaxonGap2.4.1进行鉴定效果分析。
3.结论
3.1各序列测序成功率统计
样品共计41份，经过基因提取、扩增及测序后的结果显示：ITS2序列测序成功36条(见表1)，matK序列成功29条，psbA-trnH序列成功37条。以ITS2序列测序成功率最高，实际操作中易用。
3.2序列鉴定效果
在软件TaxonGap2.4.1下进行结果分析。在软件主界面导入物种名称目录(Files—Data Files—Load)，在Biomarker选项下导入物种DNA序列比对结果(Biomarker—Add—Load—Save)，其他次要参数可参考软件说明书进行设置。运行软件后(Run—Execute)获得结果。如图1所示，某标记(Biomarker)条件下物种对应的种内最大变异值(Heterogeneity)即示意图上的浅色条长度值，对应的种间最小变异值(Separability)即示意图上的深色条长度值，对应的最近距离物种名称(Closest Object)即示意图上深色条旁边的物种名称。若物种的种内最大变异值(Heterogeneity)值小于种间最小变异值(Separability)，则意味着两个物种可以鉴别开。。图1中Rs为溪黄草的缩写，Rl为线纹香茶菜的缩写，Rlvg为纤花香茶菜的缩写。图1中的结果显示，对于ITS2序列，溪黄草的种内部的最大变异值为4.8，线纹香茶菜和纤花香茶菜种内最大变异值为1.4，溪黄草与线纹香茶菜种间最小变异值为15.1；对于psbA-trnH序列，溪黄草的种内最大变异值为3.9，线纹香茶菜和纤花香茶菜种内最大变异值为0；溪黄草与线纹香茶菜种间最小变异值为25.4。具体见下表3。
表3溪黄草与线纹香茶菜的种内最大变异值和种间最小变异值
3.3结论
3.3.1matK序列测序成功率较低，不适于本实验的物种鉴别。
3.3.2ITS2序列可用于溪黄草和线纹香茶菜鉴别。
3.3.3以ITS2序列作为DNA条形码形成的鉴别方法中，溪黄草的“种内最大变异值”为4.8；线纹香茶菜和纤花香茶菜的“种内最大变异值”都为1.4；溪黄草与线纹香茶菜“种间最小变异值”为15.1；线纹香茶菜和纤花香茶菜的“种间最小变异值”为0，即同属一个种的两者不能区分。
3.3.4根据实验结果可看出线纹香茶菜和纤花香茶菜同属一个种无法区分，即新来的物种只要鉴别出是否是溪黄草或是否是线纹香茶菜即可，无需再针对纤花香茶菜鉴别。
3.3.5不能将线纹香茶菜与其变种纤花香茶菜鉴别开；可鉴别溪黄草和线纹香茶菜，符合中药材对于“中药基原鉴别至种”的需要。
4ITS2序列基因库
按照上文所述方法，以基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38作为引物扩增各个样品的ITS2基因序列片段，由此建立包括溪黄草和线纹香茶菜(包括变种纤花香茶菜)的ITS2基因序列片段的基因库。所述基因库包括下述序列编号所示的ITS2基因序列片段：SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36。其中，SEQ ID NO.1-8为以植物传统分类学方法鉴定为溪黄草的样品的ITS2基因序列片段；SEQ ID NO.9-10为以植物传统分类学方法鉴定为线纹香茶菜的样品的ITS2基因序列片段；SEQ ID NO.11-36为以植物传统分类学方法鉴定为线纹香茶菜(变种纤花香茶菜)的样品的ITS2基因序列片段。
实施例2未知溪黄草、线纹香茶菜植物物种的鉴别
本实施例采用本发明提供的方法对未知溪黄草和线纹香茶菜植物物种的样品进行了鉴别。
选疑似但未经鉴定的，溪黄草、线纹香茶菜的，新鲜或晒干后的全草，分为两份，一份用传统分类学方法鉴定。另一份用本发明中所用方法鉴别。
本发明中所用方法的样品准备：除特殊标明外，药材使用75％乙醇水溶液擦洗表面后晾干，称取0.01g～2g叶片备用。
采用实施例1中所述步骤提取植物组织叶片中的基因组DNA，以SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38作为引物扩增ITS2基因序列片段，条件如表2所示。如实施例1所示，进行PCR产物检测、测序、DNA条形码序列获得，然后进行下述结果判定。
将获得的ITS2基因序列片段与实施例1获得的包括ITS2基因序列片段的溪黄草和线纹香茶菜基因库比对，进行结果判定。特别是通过计算机软件计算种内种间变异值；对于基因库内的溪黄草和线纹香茶菜序列，已经计算出溪黄草和线纹香茶菜各自的种内最大变异值和两个物种间的种间最小变异值，当新的待鉴别样品与此基因库的基因片段进行比对后的序列间“种间最小变异值”等于或小于种内最大变异值，可视为同一物种。
具体而言，将待检样品获得的ITS2序列峰图文件导入CodonCode Aligner V3.7进行拼接，然后人工检查拼接效果，包括(1)调整序列正反向(edit—reverse complement)，(2)去除引物或其他边界序列(sample—trim vector…)，(3)查看剩余碱基质量值(qual需要大于等于20)，最后导出一致序列为标准条形码数据；将此标准条形码数据与ITS2碱基序列库的数据一起导入序列比对软件(MatGat2.01)，选择默认计分矩阵(Scoring Matrix:blosum50)进行多重比对(align)，保存计算结果(Similarity table)，数值保留小数点后一位，根据后续软件TaxonGap所需格式调整(两个txt文件，一个是物种名称目录，一个为物种DNA序列比对结果，即相似性矩阵)；利用软件TaxonGap2.4.1查看鉴别结果：在软件主界面导入物种名称目录(Files—Data Files—Load)，在Biomarker选项下导入物种DNA序列比对结果(Biomarker—Add—Load—Save)，其他次要参数可参考软件说明书进行设置。运行软件后(Run—Execute)获得结果，在txt文件的适宜图中，查看待检样品与溪黄草和线纹香茶菜对应的“种间最小变异值”，若待检样品与溪黄草对应的“种间最小变异值”等于或小于4.8，即可判定该待检物种为溪黄草；若待检样品与线纹香茶菜对应的“种间最小变异值”小于或等于1.4，即可判定该待检物种为线纹香茶菜。
经本方法鉴别后的，得到的结论与传统方法对比，结果一致。
但经过比较，本方法对样品的要求比传统方法的要求易得。
本方法所需样品为植株上的某个易获得植物DNA的部位，新鲜植株较易获得植物DNA，通常采用叶片作为提取植物DNA的样品，不要求植物的全株或某个器官完整。
传统鉴别方法需要保持能反映特征植物植株部位，对未知溪黄草、线纹香茶菜植物物种鉴别时，需要保持茎的形态完整、叶片完整，以完成其性状鉴别和显微鉴别；在传统分类方法中，若植物植株上有花和果实，则更能反映出种间差别，但作为中药材使用时，溪黄草、线纹香茶菜都要在开花前采收，难以提供花和果实的形态；这些情况都造成了传统鉴别方法的局限性。
实施例3未知溪黄草和线纹香茶菜饮片物种的鉴别
本实施例采用本发明提供的方法对未知溪黄草和线纹香茶菜饮片物种的样品进行了鉴别。
选疑似但未经鉴定的，溪黄草和线纹香茶菜的饮片，分为两份，一份用传统分类学方法鉴定。另一份用本发明中所用方法鉴别，鉴别步骤同实施例2。
经本方法鉴别后的，得到的结论与传统方法对比，结果一致。
但经过比较，本方法对样品的要求比传统方法的要求易得。
本方法所需样品为植株上的某个易获得植物DNA的部位，虽然饮片为已经晒干和破碎后的样品，但其DNA没有得到破坏，仍然较易提取得到。
传统分类学方法鉴别需要样品保持能反映特征的植株部位，对未知溪黄草和线纹香茶菜植物物种的鉴别时，需要保持茎的形态完整、叶片完整，以完成其性状鉴别和显微鉴别；对于切段的但能满足上述要求的饮片，能够通过传统分类学方法进行鉴别，对于切制的特别破碎的饮片，若要通过传统分类学方法鉴别则存在较大的困难。在传统分类方法中，若植物植株上有花和果实，则更能反映出种间差别，但作为中药材使用时，溪黄草和线纹香茶菜都要在开花前采收，难以提供花和果实的形态；这些情况都造成了传统鉴别方法的局限性。
实施例4已知溪黄草和线纹香茶菜的器官的物种鉴别
本实施例采用本发明提供的方法对已知溪黄草和线纹香茶菜的叶片和茎的样品进行了鉴别，鉴别步骤同实施例2。
经本方法鉴别后的，得到的结论与已知结果一致。
传统方法下只拿到叶片、茎或某个器官时，难以确认其植物物种，但本方法可以对其进行鉴别。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (3)

1.一种包括唇形科植物溪黄草和线纹香茶菜的ITS2基因序列片段的基因库，所述基因库由下述序列编号所示的ITS2基因序列片段组成：SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36，其中SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8各自为溪黄草的ITS2基因序列片段，SEQ ID NO.9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36各自为线纹香茶菜的ITS2基因序列片段。
2.一种鉴别唇形科植物溪黄草和线纹香茶菜植物物种的方法，所述方法包括下述步骤：
1)提取待鉴别植物的基因组DNA；
2)以步骤1)得到的基因组DNA为模板，采用下述序列作为引物从所述待鉴别植物的基因组DNA中扩增ITS2基因序列片段：SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38；
3)将步骤2)得到的ITS2基因序列片段与根据权利要求1所述的基因库进行比对，从而鉴别所述待鉴别植物的物种；其中所述步骤3)中通过以下方式鉴别所述待鉴别植物的物种：
将步骤2)得到的ITS2基因序列片段与根据权利要求1所述的基因库内线纹香茶菜的ITS2基因序列之间进行两两比对，获得所述待鉴别植物的序列与基因库内线纹香茶菜的ITS2基因序列的多个序列间最小变异值，如果这些值均等于或低于1.4，则所述待鉴别植物为线纹香茶菜；或者将步骤2)得到的ITS2基因序列片段与根据权利要求1所述的基因库内溪黄草的ITS2基因序列之间进行两两比对，获得所述待鉴别植物的序列与基因库内溪黄草的ITS2基因序列的多个序列间最小变异值，如果这些值均等于或低于4.8，则所述待鉴别植物为溪黄草。
3.根据权利要求1所述的基因库在鉴别线纹香茶菜和溪黄草中的用途。
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