CN1238369C - 道地性金银花聚合酶链反应－限制性酶切图谱鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药材种质的品质鉴定技术领域，目的是提供一种准确鉴别道地(河南、山东)与非道地(其他产区)产区金银花的聚合酶链反应-限制性酶切图谱分子鉴定方法(PCR-RFLP)。道地产区金银花的特征DNA碱基序列为：5’-GCCCCCCCGC CCCGCCTCCC ACAGGGTCGC G-3’；限制性内切酶EcoN I及其同切酶可识别并切割该序列。鉴定过程如下：提取药材DNA；用一对引物进行PCR扩增；用限制性内切酶EcoN I或其同切酶消化PCR产物；琼脂糖凝胶电泳分析结果；通过与道地性金银花PCR-RFLP特征结果相比较，即可判断供试品是否为道地性金银花药材。
Description
一、技术领域：
本发明涉及中药材种质的品质鉴定技术领域。
二、背景技术：
金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或初开的花，有较强的抗菌作用，对多种急、慢性炎症等有较好的疗效。金银花药材有明显的道地性，如通过我们对氯原酸含量的初步测定表明，道地产区河南和山东金银花的绿原酸含量普遍高于其它非道地产区，显示药材质量与地域、生境等密切相关。然而，非道地产区与道地产区的金银花无法通过形态、显微等特征加以区别。由于道地产区河南、山东两居群与非道地产区各居群之间地域分布的相互隔离、自然条件的差异性而导致不同居群之间存在进化上的微小差异，因而在DNA序列上显示出部分差别，这种差别可通过聚合酶链反应(PCR)与限制性内切酶反应的片段多态性(RFLP)加以区别。PCR-RFLP用于近缘种的鉴别已经有许多成功的范例，如国外对四种巴尔通体属病原菌进行快速鉴别。但这种鉴别对于不同的物种，其所用的引物、限制性内切酶的种类及鉴别方法都不相同。
三、发明内容：
本发明的目的是提供一种准确鉴别道地(河南、山东)与非道地(其他产区)产区金银花的PCR-RFLP分子鉴定方法，包括道地性金银花的特征DNA碱基序列、一种限制性内切酶酶切位点及其鉴定方法。
本发明的技术方案如下：首先从各药材中提取总DNA，利用一对引物，用PCR方法扩增一段DNA片段，经纯化后，对该片段进行DNA序列测定，建立各样品的DNA序列数据库，在比较数据库DNA序列的基础上，得到道地产区金银花的特征DNA碱基序列为：5’-GCCCCCCCGC CCCGCCTCCCACAGGGTCGC G-3’，针对道地与非道地产区金银花DNA序列的差异，选择合适的DNA限制性内切酶酶切位点，通过分析聚合酶链反应产物的限制酶切图谱差异，达到快速、准确鉴别道地与非道地产区金银花的目的。对需要鉴定的金银花样品，提取其DNA，在给定的PCR条件下，用一对引物(LjP1、LjP2；TakaiwaF，Oono K，Sugiura M.Nucleotide sequence of the 17S-25S spacer region from ricerDNA.Plant Mol Biol，1985，4：355-364)，供试品能够扩增出一段DNA片段；用限制性内切酶EcoN I或其同切酶对供试品的PCR扩增产物进行酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳检测，将会出现708、461、247bp的条带，道地产区461bp的条带显著亮于或近等于708bp的条带，非道地产区708bp的条带显著亮于461bp的条带。当供试样品经用本法进行PCR扩增，并对PCR产物进行限制性内切酶酶切后，经琼脂糖凝胶电泳观察DNA片段的大小及亮度，便可准确地鉴定道地及非道地产区的金银花。本发明设计的用于鉴别道地产区金银花PCR-RFLP分子鉴定方法是采用以下步骤：
a、药材DNA的提取：按常规进行，用无离子水将供试样品的DNA浓度调节至0.1～0.3μg/μl；
b、扩增DNA片段，即进行聚合酶链反应，用于聚合酶链反应的一对引物的DNA序列为：
LjP1：5’-CGT AAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA-3’
LjP2：5’-TTA TTG ATA TGC TTA AAC TCA GCG GG-3’
c、PCR扩增产物中加入限制性内切酶EcoN I或其同切酶进行酶切，限制性内切酶EcoN I或其同切酶的酶切位点为：CCTNN^NNNAGG；
d、琼脂糖凝胶电泳分析；
e、鉴定结果的判断，若461bp的条带显著亮于或近等于708bp的条带则供试品为道地产区的金银花，若708bp的条带显著亮于461bp的条带则供试品为非道地产区的金银花。
本发明的效果是：可解决道地与非道地产区金银花的鉴定难题，提供鉴定所需的一对PCR引物、PCR反应条件、道地产区金银花的特征DNA碱基序列、一种限制性内切酶。与非道地金银花相比，道地性金银花所含的有效成分有明显差别，其药效强于非道地药材，因此市场上道地性金银花的价格高于非道地药材。然而，道地与非道地金银花难以通过形态、显微等特征来加以区别，因此，急需找到一种可靠的鉴别方法。本发明利用道地与非道地药材DNA序列的差异，建立了快速、便捷、可靠的PCR-RFLP鉴别方法，对于保证金银花的药材质量，打击假冒道地产区金银花的市场行为具有重要的价值。
四、附图说明
附图1：道地产区(河南、山东)及非道地产区(其他地区)金银花PCR-RFLP产物琼脂糖凝胶电泳图谱。A1：河南封丘、A2：河南新密、A3：山东费县、A4：山东平邑、B1：江苏南京、B2：湖南省、B3：广东广州、B4：贵州贵阳、B5：重庆武隆、B6：云南昆明、MK：100bp DNA Ladder；500：500bp位置、700：700bp位置。
五、具体实施方式：
a、DNA的提取：按常规进行，用无离子水将供试样品的DNA浓度调节至0.1～0.3μg/μl；
a、聚合酶链反应：
(1)聚合酶链反应以30μl为参考，各种物品的用量分别为：
10×PCR缓冲液 3μl
MgCl2(25mM) 2.4μl
dNTP(各10mM) 0.6μl
引物LjP1、LjP2(30pmol/μl) 各0.5μl
供试品DNA模板 1～2μl
TaqDNA聚合酶 1U(0.2μl)
无离子水 补齐至30μl
混匀后高速离心数秒
(2)PCR反应条件：反应在PCR仪上进行，反应条件为：
97℃予变性4min，然后按以下条件进行30循环：
变性97℃ 15秒
复性53℃ 40～50秒
延伸72℃ 30～50秒
循环结束后在72℃保持10分钟补齐，反应结束后在4℃保存。
(3)PCR产物的电泳检测：取上述反应液4μl，与1μl载样缓冲液混合，用1.5％琼脂糖凝胶(含0.5μg/μl溴化乙锭，即EB)电泳检测扩增结果，各种DNA样品均能扩增出一条约708bp的DNA条带；
b、聚合酶链反应产物的限制性内切酶酶切反应：
DNA限制性内切酶酶切反应：反应液参考体积为20μl，其中各种物品的用量为：
PCR产物 10μl
10×R+限制性内切酶缓冲液 2μl
限制性内切酶EcoN I 2～5U
无离子水补齐至 20μl
将反应液置37℃保温3～4小时，反应结束后置于65℃水浴10分钟，使酶失活；
d、电泳观察酶切结果：酶切产物用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/μl的溴化乙锭，即EB)，在80V电压下电泳1～2小时，观察电泳结果；
e、测定结果的判断，使用限制性内切酶EcoN I或其同切酶对聚合酶链反应扩增产物进行酶切，产生对道地与非道地产区金银花具有鉴别性特征的酶切DNA片段长度及条带亮度图谱。若供试品461bp的条带显著亮于或近等于708bp的条带则为道地产区的金银花，若708bp的条带显著亮于461bp的条带则为非道地产区的金银花，见附图1。
道地性金银花聚合酶链反应-限制性酶切图谱鉴定方法
<110>中国药科大学
<120>道地性金银花聚合酶链反应-限制性酶切图谱鉴定方法
<160>1
<210>1
<211>31
<212>DNA
<213>金银花(Lonicera japonica Thunb.)
<400>1
gcccccccgc cccgcctccc acagggtcgc g
Claims (2)
1一种道地性金银花特有的DNA碱基序列，其特征在于DNA序列为：5’-GCCCCCCCGC CCCGCCTCCC ACAGGGTCGC G-3’。
2一种道地性金银花聚合酶链反应-限制性酶切图谱鉴定方法，其特征在于能够识别道地产区金银花特有DNA碱基序列的限制性内切酶EcoN I及其同切酶对聚合酶链反应产物消化后的琼脂糖凝胶电泳的特征图谱，鉴定过程为：
(1)、药材DNA的提取：按常规进行，用无离子水将供试样品的DNA浓度调节至0.1～0.3μg/μl；
(2)、扩增DNA片段，即进行聚合酶链反应，用于聚合酶链式反应的一对引物的DNA序列为：
LjP1：5’-CGT AAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA-3’
LjP2：5’-TTA TTG ATA TGC TTA AAC TCA GCG GG-3’
(3)、扩增产物中加入限制性内切酶EcoN I或其同切酶进行酶切，限制性内切酶EcoN I或其同切酶的酶切位点为：CCTNN^NNNAGG；
(4)、琼脂糖凝胶电泳分析；
(5)、鉴定结果的判断：若461bp的条带显著亮于或近等于708bp的条带则供试品为道地产区的金银花；若708bp的条带显著亮于461bp的条带则供试品为非道地产区的金银花。
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