CN104419755A - 一种快速检测金银花成分掺伪量的方法 - Google Patents

一种快速检测金银花成分掺伪量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测金银花成分掺伪的方法。该方法是利用焦磷酸测序技术对金银花及其伪品山银花的标志性核酸位点进行定量分析，已达到获得中成药、保健品、食品中金银花成分掺伪结果。本发明的检测方法在3h之内即可完成金银花成分掺伪鉴定工作，具有简单易行、灵敏度高、快速、费用低、便于推广等特点，为中药掺伪鉴定开辟了广阔的前景。

Description

一种快速检测金银花成分掺伪量的方法
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及中成药、食品、保健品中金银花成分掺伪量的检测方法，是一种利用焦磷酸测序技术对金银花及其伪品标志性核酸位点定量检测的方法。
背景技术
来源纯正、品质优良的药用植物资源是中药现代化和标准化生产的重要前提之一。近年来不断出现中药材掺伪事件，不仅损害了中医药的信誉和消费者的信心，更使误病害人，造成巨大的经济损失。本发明以大宗药材金银花为材料，基于DNA条形码标记中Sentinel-base位点，结合焦磷酸测序分析技术，建立快速、高通量、自动化的金银花掺伪鉴别方法，为规范、监管药材市场提供技术支撑。
焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是应用于DNA序列分析的新一代技术。在遗传分析中，可以提供核酸序列信息的分子检测技术是“黄金标准”，其权威性比其他DNA分析方法如Northem杂交，基因芯片和实时定量PCR(Taqman探针)技术更好。其原理是：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。该技术用于测量短DNA链序列，是目前唯一能实时得到定量序列结果的技术，兼有PCR技术的灵敏性和测序技术的准确性，具有准确性高，重复性好，自动化程度高，操作简单的特点，非常适合用于对蔬菜杂交品种种子纯度的鉴定。迄今为止，尚未有成功利用焦磷酸测序技术鉴定中药掺伪量的报道。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种金银花成分掺伪量检测方法，为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：
用于检测金银花成分掺伪量的PCR扩增及焦磷酸测序特异性引物，包括引物正向序列：5’-Biotin-ATTATTTATCCTCCCCCTTTTATC-3’，反向引物序列：5’-AACATTTCCGCTCAGATCTATTT-3’，测序引物序列：5’-GATGAGAAATATAACGAATT-3’。
本发明所述快速检测金银花成分掺伪量的方法，该方法以供试样品基因组DNA为模板，对已知目标片段进行PCR扩增分析，结合应用焦磷酸测序技术对标志性核酸位点进行AQ分析及掺伪量计算，其包括如下步骤：
(1)采用引物正向、反向序列的2条PCR特异引物及MasterMix，加入供试样品模板DNA进行PCR扩增；其中的PCR扩增反应体系：扩增反应的总体积为50μL，其各种成分分别为：2×Master Mix25μL，10μmol／L引物各1μL，模板DNA2μL，用灭菌去离子水补齐至50μL；
反应程序：95℃预变性10min，94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸45S，循环50次，最后72℃延伸7min，4℃保存；
(2)采用焦磷酸测序特异性引物，对供试样品的PCR扩增产物进行焦磷酸测序分析；其中的焦磷酸测序反应体系：测序反应的总体积为100μL，其中各种成分分别为：PCR产物50μL，Sepharose Beads3μL，Binding Buffer47μL，10μmol／L测序引物1.2μL，Annealing Buffer38.8μL；
(3)测序时间8～10min，测序结束后使用“AQ”模式对标志性核酸位点进行分析，通过观察第二个测序碱基“T”和第三个测序碱基“G”的等位基因频率判定样品中金银花含量掺伪情况，其中“T”碱基频率为样品中金银花伪品的含量，“G”碱基频率为样品中金银花正品的含量，两者之和等于一。
本发明所述的检测方法，其中的Binding Buffer47μL指的是：10mmol／L Tris-HCl，2mol／L NaCl，l mmol／L EDTA，0.1％Tween20，pH7.6的溶液；Annealing Buffer38.8μL指的是：20mmol／L Tris-AC，2mmol／LMgAc2，pH7.6的溶液。
本发明所述的检测方法，其中每条引物分别配制成浓度为100μmol／L的贮存液，工作浓度为10μmol／L。
本发明所述的检测方法，模板DNA指的是从待测样品提取的基因组DNA。
本发明所述的检测方法，焦磷酸测序全过程为：测序引物与PCR扩增的DNA模板相结合。然后将其与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶，以及底物APS和荧光素一起孵育；四种dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)之一被加入反应体系，如与模扳配对(A-T，C—G)，此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团(PPi)释放出来。而且释放出来的PPi的量与和模板结合的dNTP的量成正比；ATP硫酸化酶在三磷酸腺苷双磷酸酶存在的情况下催化PPi形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号，光信号由CCD摄像机检测，并由可见光信号峰表示。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比；然后加入下一种dNTP。最终待测序列顺序，即可从反应光强的信号峰中读出。
为了能更加清楚的说明本发明的测定方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明。
1、原理
本方法应用一种新型的核酸测序方法其原理是：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。本发明的测序方法具有准确性高，重复性好，自动化程度高和操作简单等优点。
2、引物设计
本发明依据金银花及其常见伪品的差异性片段设计2条PCR扩增特异性引物和1条焦磷酸测序引物。引物由上海生物工程公司合成。
表1引物序列表如下：
引物名称 序列(5′to3′)
JapT-PF1 Biotin-ATTATTTATCCTCCCCCTTTTATC
JapT-PR1 AACATTTCCGCTCAGATCTATTT
JapT-PS1 GATGAGAAATATAACGAATT
3、反应条件
PCR扩增反应试剂需要Master Mix、PCR扩增引物及模板DNA。测序反应试剂需要PCR扩增产物、Sepharose Beads、Binding Buffer、测序引物及Annealing Buffer，需要有焦磷酸测序仪，测序时间8～10min。
材料与方法：
(1)试剂：Promega公司生产的Master Mix溶液；上海生工合成的特异性扩增引物和测序引物；Biotage公司生产的Sepharose Bead。
(2)扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为50μL，其各种成分分别为：2×Master Mix25μL，10μrnol／L引物各1μL，模板DNA2μL，用灭菌去离子水补齐至50μL；反应程序：95℃预变性10min，94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸45S，循环50次，最后72℃延伸7min，4℃保存。
(3)测序反应体系：测序反应的总体积为100μL，其中各种成分分别为：PCR产物50μL，Sepharose Beads3μL，Binding Buffer47μL(10mmol／LTris-HCl，2mol／L NaCl，1mmol／L EDTA，0.1％Tween20，pH7.6)，10μmol／L测序引物1.2μL，Annealing Buffer38.8μL(20mmol／L Tris-AC，2mmol／LMgAc2，pH7.6)；
(4)测序时间8～10min，测序结束后使用“AQ”模式对标志性核酸位点进行分析，通过观察第二个测序碱基“T””和第三个测序碱基“G”的等位基因频率判定样品中金银花含量掺伪情况，其中“T”碱基频率为样品中金银花伪品的含量，“G”碱基频率为样品中金银花正品的含量，两者之和等于一。
本发明用于金银花成分掺伪量的检测方法，具有以下优点：
(1)本发明的金银花成分掺伪量检测方法与常规的测定方法的对比，其操作简便：程序化操作，能获得量化结果。
(2)精准性：该发明是以焦磷酸测序技术为基础，具有很高的准确性。
(3)快速高效：3h之内即可完成金银花成分掺伪量检测工作；
(4)结果判定简单：鉴定结果可以直接从可见光信号峰值读出。
附图说明：
图1为扩增产物的电泳分析图谱。自左向右依次为Marker、金银花真品、金银花伪品、金银花掺伪品(50％)。
图2为金银花真品扩增产物测序结果图。
图3为金银花伪品扩增产物测序结果图。
图4为金银花掺伪品(50％)扩增产物测序结果图。
具体实施方式
为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明，在此需加以说明的是：本发明所述的引物序列见表1。金银花制品模板DNA的提取：常规CTAB法提取(见附件)。
实施例1
(1)试剂：Promega公司生产的Master Mix溶液；上海生工合成的特异性扩增引物和测序引物；Biotage公司生产的Sepharose Bead。
(2)扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为50μL，其各种成分分别为：2×Master Mix25μL，10μmol／L引物各1μL，模板DNA2μL(金银花制品DNA)，用灭菌去离子水补齐至50μL；反应程序：95℃预变性10min，94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸45S，循环50次，最后72℃延伸7min，4℃保存。
(3)测序反应体系：测序反应的总体积为100μL，其中各种成分分别为：PCR产物50μL，Sepharose Beads3μL，Binding Buffer47μL(10mmol／LTris-HCl，2mol／L NaCl，1mmol／L EDTA，0.1％Tween20，pH7.6)，10μmol／L测序引物1.2μL，Annealing Buffer38.8μL(20mmol／L Tris-AC，2mmol／LMgAc2，pH7.6)；
(4)测序结果结束后，测序结束后使用“AQ”模式对标志性核酸位点进行分析，通过观察第二个测序碱基“T”和第三个测序碱基“G”的等位基因频率判定样品中金银花含量掺伪情况，其中“T”碱基频率为样品中金银花伪品的含量，“G”碱基频率为样品中金银花正品的含量，两者之和等于一。结果表明(图2)，“T”碱基频率为0％，“G”碱基频率为100％，说明供试样品为金银花正品，没有掺入伪品成分。
实施例2
(1)试剂：Promega公司生产的Master Mix溶液；上海生工合成的特异性扩增引物和测序引物；Biotage公司生产的Sepharose Bead。
(2)扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为50μL，其各种成分分别为：2×Master Mix Buffer25μL，10μmol／L引物各1μL，模板DNA2μL(金银花制品基因组DNA)，用灭菌去离子水补齐至50μL；反应程序：95℃预变性10min，94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸45S，循环50次，最后72℃延伸7min，4℃保存。
(3)测序反应体系：测序反应的总体积为100μL，其中各种成分分别为：PCR产物50μL，Sepharose Beads3μL，Binding Buffer47μL(10mmol／LTris-HCl，2mol／L NaCl，1mmol／L EDTA，0.1％Tween20，pH7.6)，10μmol／L测序引物1.2μL，Annealing Buffer38.8μL(20mmol／L Tris-AC，2mmol／LMgAc2，pH7.6)；
(4)测序结果结束后，测序结束后使用“AQ”模式对标志性核酸位点进行分析，通过观察第二个测序碱基“T”和第三个测序碱基“G”的等位基因频率判定样品中金银花含量掺伪情况，其中“T”碱基频率为样品中金银花伪品的含量，“G”碱基频率为样品中金银花正品的含量，两者之和等于一。结果表明(图3)，“T”碱基频率为100％，“G”碱基频率为0％，说明供试样品为金银花伪品，不含正品成分。
实施例3
(1)试剂：Promega公司生产的Master Mix溶液；上海生工合成的特异性扩增引物和测序引物；Biotage公司生产的Sepharose Bead。
(2)扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为50μL，其各种成分分别为：2×Master Mix Buffer25μL，10μmol／L引物各1μL，模板DNA2μL(金银花制品基因组DNA)，用灭菌去离子水补齐至50μL；反应程序：95℃预变性10min，94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸45S，循环50次，最后72℃延伸7min，4℃保存。
(3)测序反应体系：测序反应的总体积为100μL，其中各种成分分别为：PCR产物50μL，Sepharose Beads3μL，Binding Buffer47μL(10mm01／LTris-HCl，2m01／L NaCl，1mmol／L EDTA，0.1％Tween20，pH7.6)，10μrnol／L测序引物1.2μL，Annealing Buffer38.8μL(20mmol／L Tris-AC，2mmol／LMgAc2，pH7.6)；
(4)测序结果结束后，测序结束后使用“AQ”模式对标志性核酸位点进行分析，通过观察第二个测序碱基“T”和第三个测序碱基“G”的等位基因频率判定样品中金银花含量掺伪情况，其中“T”碱基频率为样品中金银花伪品的含量，“G”碱基频率为样品中金银花正品的含量，两者之和等于一。结果表明(图4)，“T”碱基频率为50％，“G”碱基频率为50％，说明供试样品中金银花成分50％为正品，50％为伪品。
附件：常规CTAB法提取金银花制品DNA
(1)取金银花制品200mg，放入研钵中，加入少量液氮迅速磨碎。液氮反复加入3～4次，磨碎成粉末为止；
(2）加入1.5mL预热至65℃的CTAB提取缓冲液，充分混合、悬浮试样(依试样不同，可适当增加缓冲液的用量)，65℃保育30min，期间不停颠倒混匀；
(3)约12000g离心10min。转移上清至一新离心管，加入1倍体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，充分混合。约12000g离心15min。转移上清至一新离心管中；
(4)加入1倍体积的氯仿：异戊醇(24：1)，充分混合。约12000g离心15min。转移上清至一新离心管中；
(5)加入2倍体积CTAB沉淀缓冲液，室温静置保育60min；12000g离心15min，弃上清；加入350μL氯化钠溶液溶解沉淀；12000g离心10min，转移上清至一新离心管。
(6)加入0.6倍体积异丙醇，倒置离心管轻柔混合，室温放置20min。12000g离心15min。弃上清。加入500μL70％乙醇溶液，并颠倒离心管数次。12000g离心10min。弃上清。
(7)干燥DNA沉淀，加30μL水或TE缓冲液溶解DNA。

Claims (3)

1.用于鉴定金银花成分掺伪量的PCR扩增及焦磷酸测序特异性引物，其特征在于，包括引物正向序列：5’-Biotin-ATTATTTATCCTCCCCCTTTTATC-3’，反向引物序列：5’-AACATTTCCGCTCAGATCTATTT-3’，测序引物序列：5’-GATGAGAAATATAACGAATT-3’。
2.一种采用权利要求1所述特异性引物，快速鉴定金银花成分掺伪量的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)采用权利要求1所述的2条PCR特异引物及Master Mix，加入供试样品模板DNA进行PCR扩增；其中的PCR扩增反应体系：扩增反应的总体积为50μL，其各种成分分别为：2×Master Mix25μL，10μmol／L引物各1μL，模板DNA2μL，用灭菌去离子水补齐至50μL；
反应程序：95℃预变性10min，94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸45S，循环50次，最后72℃延伸7min，4℃保存；
(2)采用权利要求1所述的焦磷酸测序测序特异性引物，对供试样品的PCR扩增产物进行焦磷酸测序分析；其中的焦磷酸测序反应体系：测序反应的总体积为100μL，其中各种成分分别为：PCR产物50μL，Sepharose Beads3μL，Binding Buffer47μL，10μmol／L测序引物1.2μL，Annealing Buffer38.8μL；
(3)测序时间8～10min，测序结束后使用“AQ”模式对标志性核酸位点进行分析，通过观察第二个测序碱基“T”和第三个测序碱基“G”的等位基因频率判定样品中金银花含量掺伪情况，其中“T”碱基频率为样品中金银花伪品的含量，“G”碱基频率为样品中金银花正品的含量，两者之和等于一。
3.如权利要求2所述的鉴定方法，其中每条引物分别配制成浓度为100μmol／L的贮存液，工作浓度为10μmol/L。
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