CN104164513B

CN104164513B - 一种快速鉴定油葵新葵19号品种纯度的试剂盒

Info

Publication number: CN104164513B
Application number: CN201410434784.9A
Authority: CN
Inventors: 段维; 杨涛; 王沛政; 朱文彬; 刘文杰; 李晓雷; 卫泽
Original assignee: XINJIANG CONDY AGRI-GENETICS Co Ltd
Current assignee: XINJIANG CONDY AGRI-GENETICS Co Ltd
Priority date: 2014-08-29
Filing date: 2014-08-29
Publication date: 2016-03-16
Anticipated expiration: 2034-08-29
Also published as: CN104164513A

Abstract

本发明公开了一种快速鉴定油葵新葵19号品种纯度的试剂盒。通过建立包括油葵SSR技术最佳程序，PCR扩增反应各组分的优化组合和扩增试剂盒，以及扩增条带的显色程序；以商品油葵品种新葵19号及其双亲的DNA为模板，进行大量SSR引物分子标记的筛选和重复，获得了鉴定出能够同时区分父本、母本和杂交种的引物标记399和425，这2个引物标记可有效用于鉴定上述新葵19号杂交种种子的纯度，辨别种子的真伪，利于油葵杂交种种子高效准确的质量控制，加快新葵19号商品种子的质量检测进程。可有效用于鉴定油葵杂交种种子的纯度，辨别种子的真伪，将从DNA提取到分子标记纯度验证时间缩短到一工作日内，具有重要应用价值。

Description

一种快速鉴定油葵新葵19号品种纯度的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体说，本发明具体涉及一种快速鉴定油葵新葵19品种纯度的试剂盒的技术领域。

背景技术

向日葵(HelianthusannuusL.)是世界五大经济作物之一，具有耐盐碱、耐干旱、耐瘠薄的特性，也是我国北方地区的主要油料作物，其作为油料或蛋白质资源日益受到人们的重视。我国有相当一部分干旱瘠薄低产田及盐碱地，因而向日葵在农业生产上占有重要地位。世界各国在向日葵杂优利用研究方面普遍开展三系研究，我国从20世纪70年代开展向日葵杂优利用研究，并在农业生产中开始利用杂交种。

随着向日葵育种技术的不断发展和杂交品种的大面积推广，品种鉴定已成为新品种保护及保护农民利益的重要手段。传统的品种鉴定多用形态学方法，是根据作物的形态特征和农艺生理特征鉴定特定的基因型，它是一种最原始的品种纯度检验方法，简单、直观、易观测记载，长期以来形态标记是鉴定杂交向日葵品种的主要手段，但随着育种新技术的不断发展，品种间的形态学差异越来越小，能用于鉴定的形态性状已显不足，增加了鉴定的困难；而且此法鉴定时间长，费用高。近年来，蛋白质和DNA多态性检测技术迅速发展，尤其是DNA多态性检测技术以其检测材料少、时间短、结果稳定性好、重复性高、技术简单、成本低而逐渐成为目前检测的主流方法。

DNA分子检测技术基于DNA分子的缺失、插入、易位、倒位、重排或由于存在长短与排列不一的重复序列机制而产生的多态性(Polymorphismdiversityorfingerprints)，从本质上能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段。杂交向日葵品种纯度鉴定应用的分子检测技术有RFLP技术、RAPD技术、SSR技术、AFLP技术。RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)是由Grodzicker(1974)最早创立的，该技术是利用限制性内切酶酶解不同生物体的DNA分子后，用特异性探针进行Sothern分子杂交，通过放射自显影来揭示DNA的多态性。由于RFLP标记对DNA的需要量较大(5-10ug)，质量要求较高，技术较为复杂，程序繁多，周期长，费用较高，多态有限，对材料需求量大巨有放射性同位素的潜在污染和危害，因而目前尚不宜于用于品种的纯度鉴定。RAPD(RandomlyAmplifiedPolymorphicDNA)技术是以基因组DNA为模板，以一个随机的寡核普酸序列为引物，一般为9-l0bp碱基，通过PCR扩增反应，产生不连续的DNA产物，再经过脂糖凝胶电泳得到多态性的DNA谱带。RAPD技术主要特点是反应灵敏，多态性强，具有简便、快速的优点，既有大量的随机引物可供筛选使用，又不受种属的限制，因而被广泛用于多种作物的品种纯度鉴定。AFLP(AmplifyFragmentlengthPoiymorphism)技术扩增片断长度多态性是RFLP和RAPD两项技术的结合，是由荷兰科学家Zabean等人发明的一项专利技术。AFLP技术具较好的重复性，但操作复杂，步骤多，对实验技能和仪器精度要求均很高，难以在作物品种纯度鉴定上普及。SSR标记在人类及植物的基因组中，均存在着由1-4个碱基对组成的简单重复序列(Simplesequencerepeats,简称SSR)，又称之为微卫星(Microsatellite)，SSR技术已广泛应用于玉米、水稻等作物的品种纯度鉴定，SSR最大的优点在于其扩增产物在进行测序胶电泳分离时具有单碱基的高分辨率，能检测到很高的多态性，遗传信息量较大，并具有较好的稳定性和重演性。

油葵新葵19号，是由新疆康地种业科技股份有限公司选育的产量较高、综合经济性状好、抗逆性较强的中晚熟油葵杂交种，2010年通过新疆维吾尔自治区农作物品种审定委员会审定。生育期110天左右，植株茎杆粗壮，幼苗长势强，植株生长整齐，抗旱，籽粒容重高，抗向日葵锈病，耐菌核病，抗褐斑病，抗霜霉病，抗逆性好。

综上所述，从传统的形态鉴定、生化指纹检测发展到分子水平和基因水平检测杂交向日葵品种纯度的检验技术经历了从简单到复杂而精确的过程，每一种方法都有其各自的优点和不足，因而至今在农作物种子检验规程中尚无快速的生化或DNA分子检测技术标准程序。现有技术中未见报道有关鉴定油葵新葵19号品种纯度的试剂盒。

发明内容

针对现有技术中未见报道有关快速鉴定油葵新葵19号品种纯度的试剂盒的技术现状，本发明提供一种快速鉴定油葵新葵19号品种纯度的试剂盒，利用该试剂盒可快速有效用于鉴定上述油葵杂交种种子的纯度，辨别种子的真伪。利于油葵杂交种种子高效准确的质量控制，加快油葵商品种子的质量检测进程，鉴定体系能够在短时间内对大量样品进行快速鉴定，结果准确可靠。

本发明的技术方案：通过建立了标准油葵DNA的提取试剂盒，包括油葵SSR技术最佳程序，PCR扩增反应各组分的优化组合和扩增试剂盒，以及扩增条带的显色程序；以商品油葵品种新葵19号及其双亲的DNA为模板，进行大量SSR引物分子标记的筛选和重复，获得了鉴定出能够同时区分父本、母本和杂交种的引物标记399和425，这2个引物标记可有效用于鉴定上述新葵19号杂交种种子的纯度，辨别种子的真伪，利于油葵杂交种种子高效准确的质量控制，加快新葵19号商品种子的质量检测进程。

本发明具体提供一种能够同时鉴定区分新葵19号父本、母本和杂交种的试剂盒，该试剂盒包括：

（1）油葵DNA快速提取试剂盒A配置：50mmol/LTris-HClpH8，0.7mmol/LNaCl，10mmol/LEDTA,pH8，1%CTAB，20mmol/L2-巯基乙醇。

（2）PCR扩增反应试剂盒B配置：5×反应缓冲液4ul，25mmol/LMgCl₂溶液2ul，0.1mmol/LdNTPs溶液3ul，1umol/LPrimer溶液3ul（SSR引物标记399和425），5uTaqDNA聚合酶0.2ul。

1-5ng模板DNA；反应总体积为20ul，扩增程序为95℃变性2min，94℃变性45ｓ、57℃退火45ｓ、72℃延伸60ｓ，共30个循环；72℃延伸8min。

引物标记399：

左序列CGTACGGTGTAGTTCTCATGGT；

右序列GGATCACGTGGCGTTCTATT。

引物标记425：

左序列CAAAATACCCAGGTCAAAGCA；

右序列CCTAGCTTATGGGACGTATGGA。

加样缓冲液配试剂盒C配置：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40克蔗糖定容至100ml。

利用以上试剂盒可有效用于鉴定上述油葵杂交种种子的纯度，辨别种子的真伪。SSR引物标记399扩增的新葵19号产生的母本特异条带大小为470bp，产生的父本特异标记条带大小为0bp；杂交种的DNA片段中包含父母本的特征谱带；SSR引物标记425扩增的新葵19号产生的母本特异条带大小为500bp，产生的父本特异标记条带大小为0bp；杂交种的DNA片段中包含父母本的特征谱带。可快速有效用于鉴定上述油葵杂交种种子的纯度，辨别种子的真伪，利于油葵杂交种种子高效准确的质量控制，加快油葵商品种子的质量检测进程，鉴定体系能够在短时间内对大量样品进行快速鉴定，结果准确可靠。

同时，本发明具体提供一种快速鉴定油葵新葵19号品种纯度的方法，具体方法步骤如下：

（1）油葵DNA快速提取试剂含50mmol/LTris-HClpH8，0.7mmol/LNaCl，10mmol/LEDTA，pH8，1%CTAB，20mmol/L2-巯基乙醇。

（2）PCR扩增反应试剂含5×反应缓冲液4ul，25mmol/LMgCl₂溶液2ul，0.1mmol/LdNTPs溶液3ul，1umol/LPrimer溶液3ul（SSR引物标记399和425），5uTaqDNA聚合酶0.2ul，1-5ng模板DNA；反应总体积为20ul，扩增程序为95℃变性2min，94℃变性45ｓ、57℃退火45ｓ、72℃延伸60ｓ，共30个循环；72℃延伸8min。

（3）胶板的制备：扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度10%，待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；电泳缓冲液为1×TBE，使电泳缓冲液液面刚高出凝胶面，恒压电泳。

（4）电泳、观察和拍照：取4ml上述步骤(2)PCR扩增反应液加样缓冲液1ml，含如下成分：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40克蔗糖定容至100ml；加样后的凝胶板立即通电进行电泳，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳；电泳完毕，取出凝胶；凝胶用蒸馏水稍冲洗后，按照以下程序进行银染：固定（10%乙醇、0.5%冰乙酸）20min；银染（0.2%硝酸银水溶液）12min；蒸馏水漂洗两次；0.002%(w/v)硫代硫酸钠的水溶液漂洗；显色（1.5%氢氧化钠、0.4%甲醛）适度；在白色灯下DNA存在处显示出肉眼可辨的条带，于凝胶成像系统中拍照并保存之。

（5）上述步骤以商品油葵品种新葵19号及其双亲的DNA为模板，进行了约100对SSR物分子标记的筛选和重复，获得了鉴定出能够同时区分父本、母本和杂交种的SSR引物标记399和425。

本发明中，经以商品油葵品种新葵19号及其双亲的DNA为模板，进行大量SSR引物分子标记的筛选和重复，获得了DNA快速提取和PCR扩增反应的相关试剂盒，以及鉴定出能够同时区分父本、母本和杂交种的SSR引物标记399和425。

通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果：

（1）加快鉴定时间：本发明建立油葵DNA提取、SSR技术试剂盒，扩增效果稳定，省去了繁杂的试剂配置和特定引物筛选进程。

（2）特异性好：利用该试剂盒分别对新葵19号的母本多次后进行扩增，结果表明，各引物对各自模板均产生特异条带。

（3）重复性好：用该试剂盒进行多次重复性检测，结果表明，该方法具有很好的重复性。

附图说明

图1显示为新葵19号的399引物扩增结果图，图中从左到右依次为DNA标准分子量，即1kbDNALadder1，父本、母本、杂种。

图2显示为新葵19号的425引物扩增结果图，图中从左到右依次为父本、母本、杂种，最后为DNA标准分子量，即1kbDNALadder1。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

本发明中涉及到的主要原辅材料和设备有：

主要原辅材料：新葵19号油葵种子是由新疆康地种业科技股份有限公司提供，是成熟商品品种，本领域可以通过市场购买获得。

主要试剂设备：Tris-HCl，NaCl，EDTA，CTAB，2-巯基乙醇，TaqDNA聚合酶，dNTPs，Na₂EDTA·2H₂O，溴酚蓝，二甲苯青，蔗糖等；LRH-150-G型光照培养箱，上海仪器厂；医用高压蒸汽灭菌锅，上海医用核子仪器厂。PCR扩增仪Pcr2700、美国冷冻离心机eppendorf5810、美国分光光度计Nd1000、美国可调移液器Eppendor、美国纯水系统Milib美国。

本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：快速鉴定油葵新葵19号品种纯度的试剂盒

本发明提供了鉴定出能够同时区分新葵19号父本、母本和杂交种的试剂盒，该试剂盒包括：

（1）油葵DNA快速提取试剂盒A配置：50mmol/LTris-HClpH8，0.7mmol/LNaCl，10mmol/LEDTA，pH8，1%CTAB，20mmol/L2-巯基乙醇。

引物标记399：

左序列CGTACGGTGTAGTTCTCATGGT；

右序列GGATCACGTGGCGTTCTATT）。

引物标记425：

左序列CAAAATACCCAGGTCAAAGCA；

右序列CCTAGCTTATGGGACGTATGGA。

实施例二：油葵新葵19号品种纯度的快速鉴定

一种快速鉴定油葵新葵19号品种纯度的方法，具体方法步骤如下：

实施例三：油葵新葵19号品种纯度的快速鉴定

（1）向日葵DNA提取：取上述培养1周的向日葵幼嫩真叶于研钵中，加入液氮迅速研磨使成均匀粉状，在样品未融化之前加入65℃预热的CTAB提取试剂盒500μl，充分混匀后把样液移入1.5ml离心管中，置65℃水浴50min，其间颠倒离心管数次，CTAB提取试剂盒采用50mmol/LTris-HClpH8，0.7mmol/LNaCl，10mmol/LEDTA，pH8，1%CTAB，20mmol/L2-巯基乙醇；取出样品冷却至室温，分别加入等体积的酚/氯仿(1：1)和氯仿/异戊醇(24∶1)进行抽提，4℃12000r/min离心5min；取上清液加入0.6倍体积的异丙醇混匀，于室温放置5-10min，12000r/min离心5min，去上清，用100μl70%乙醇洗涤沉淀，置无菌台吹干；用双蒸水溶解DNA沉淀，4℃保存备用。

（2）PCR扩增反应及程序：取上一步已提取的DNA1-5ng，反应总体积为20ul，试剂盒含5×反应缓冲液4ul，25mmol/LMgCl₂溶液2ul，0.1mmol/LdNTPs溶液3ul，1umol/LPrimer溶液3ul，5uTaqDNA聚合酶0.2ul，1-5ng模板DNA；扩增程序为95℃变性2min，94℃变性45ｓ、57℃退火45ｓ、72℃延伸60ｓ，共30个循环；72℃延伸8min。

（4）电泳、观察和拍照：取上述第(3)步骤PCR扩增反应液4ml加样缓冲试剂盒1ml(0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40克蔗糖定容至100ml)，加样后的凝胶板立即通电进行电泳，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳；电泳完毕，取出凝胶；凝胶用蒸馏水稍冲洗后，按照以下程序进行银染：固定（10%乙醇、0.5%冰乙酸）20min；银染（0.2%硝酸银水溶液）12min；蒸馏水漂洗两次；0.002%(w/v)硫代硫酸钠的水溶液漂洗；显色（1.5%氢氧化钠、0.4%甲醛）适度；在白色灯下DNA存在处显示出肉眼可辨的条带，于凝胶成像系统中拍照并保存之。

经上述油葵新葵19号品种纯度的快速鉴定获得以下显著的技术效果：

（1）利用该试剂盒检测时间快，只需要1-2天时间。

（2）特异性强：参见附图1，箭头所示为新葵19号的399引物扩增结果图，图中从左到右依次为DNA标准分子量，即1kbDNALadder1，父本、母本、杂种。箭头所示为新葵19号产生的母本特异标记339引物条带大小为470bp，产生的父本特异标记条带大小为0bp；杂交种的DNA片段中包含父母本的特征谱带。

参见附图2，显示为新葵19号的425引物扩增结果图，图中从左到右依次为父本、母本、杂种，最后为DNA标准分子量，即1kbDNALadder1。箭头所示为新葵19号产生的母本特异标记425引物条带大小为500bp，产生的父本特异标记条带大小为0bp；杂交种的DNA片段中包含父母本的特征谱带。

经过上述各实施例的详细试验反复验证，采用本发明提供的快速鉴定油葵新葵19号品种纯度的试剂盒进行多次重复性检测，结果表明，该方法具有很好的重复性，且具有利用该试剂盒检测时间快，只需要1-2天时间，显示出显著的特异性强。因此上述两个引物扩增产物均可以区别新葵19号母本、其杂交种、父本，可有效用于鉴定上述油葵杂交种种子的纯度，其中双引物可以有效的辨别种子的真伪。

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Street:新市区北京南路416号盈科国际27楼

City:乌鲁木齐

State:新疆

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PostalCode:830011

PhoneNumber:09913820333

FaxNumber:09913819388

EmailAddress:condycondyseed.com

<110>OrganizationName:新疆康地种业科技股份有限公司

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<120>Title:一种快速鉴定油葵新葵19号品种纯度的试剂盒

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Claims

1.一种能够同时鉴定区分新葵19号父本、母本和杂交种的试剂盒,其特征在于，所述试剂盒包括油葵SSR标记，PCR扩增反应各组分的优化组合和扩增试剂盒，以及扩增条带的显色程序；以商品油葵品种新葵19号及其双亲的DNA为模板，进行大量SSR引物分子标记的筛选和重复，获得了鉴定出能够同时区分父本、母本和杂交种的引物标记399和425，具体阐述如下：

（1）油葵DNA快速提取试剂盒A配置：50mmol/LTris-HClpH8，0.7mmol/LNaCl，10mmol/LEDTA，pH8，1%CTAB，20mmol/L2-巯基乙醇；

（2）PCR扩增反应试剂盒B配置：5×反应缓冲液4ul，25mmol/LMgCl2溶液2ul，0.1mmol/LdNTPs溶液3ul,1umol/LPrimer溶液3ul，SSR引物标记399和425，5uTaqDNA聚合酶0.2ul；1-5ng模板DNA；反应总体积为20ul,扩增程序为95℃变性2min，94℃变性45ｓ、57℃退火45ｓ、72℃延伸60ｓ，共30个循环；72℃延伸8min；

引物标记399：

左序列CGTACGGTGTAGTTCTCATGGT；

右序列GGATCACGTGGCGTTCTATT；

引物标记425：

左序列CAAAATACCCAGGTCAAAGCA；

右序列CCTAGCTTATGGGACGTATGGA；

2.一种快速鉴定油葵新葵19号品种纯度的方法，其特征在于，具体鉴定方法步骤如下：

（1）油葵DNA快速提取试剂含50mmol/LTris-HClpH8，0.7mmol/LNaCl，10mmol/LEDTA，pH8，1%CTAB，20mmol/L2-巯基乙醇；

（2）PCR扩增反应试剂含5×反应缓冲液4ul，25mmol/LMgCl₂溶液2ul，0.1mmol/LdNTPs溶液3ul,1umol/LPrimer溶液3ul，SSR引物标记399和425，5uTaqDNA聚合酶0.2ul，1-5ng模板DNA；反应总体积为20ul，扩增程序为95℃变性2min，94℃变性45ｓ、57℃退火45ｓ、72℃延伸60ｓ，共30个循环；72℃延伸8min；

（3）胶板的制备：扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度10%，待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；电泳缓冲液为1×TBE，使电泳缓冲液液面刚高出凝胶面,恒压电泳；

（4）电泳、观察和拍照：取4ml上述步骤(2)PCR扩增反应液加样缓冲液1ml，含如下成分：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40克蔗糖定容至100ml；加样后的凝胶板立即通电进行电泳，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳；电泳完毕，取出凝胶；凝胶用蒸馏水稍冲洗后，按照以下程序进行银染：固定采用10%乙醇、0.5%冰乙酸20min；银染采用0.2%硝酸银水溶液12min；蒸馏水漂洗两次；0.002%硫代硫酸钠的水溶液漂洗；1.5%氢氧化钠、0.4%甲醛显色适度；在白色灯下DNA存在处显示出肉眼可辨的条带，于凝胶成像系统中拍照并保存之；

（5）上述步骤以商品油葵品种新葵19号及其双亲的DNA为模板，进行了100对SSR物分子标记的筛选和重复，获得了鉴定出能够同时区分父本、母本和杂交种的SSR引物标记399和425，

所述的引物标记399：

左序列CGTACGGTGTAGTTCTCATGGT；

右序列GGATCACGTGGCGTTCTATT；

引物标记425：

左序列CAAAATACCCAGGTCAAAGCA；

右序列CCTAGCTTATGGGACGTATGGA。