CN1487092A - 中药伊贝母分子生物学鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药鉴定技术领域，是用于鉴定伊贝母分子鉴定方法。发明方法设计的伊贝母聚合酶链反应的鉴定引物DNA序列为：FpdPa：5′－ACC GTG TTCACG ATT GCC TCA GG－3′，FpdPb：5′－TCC GGG TCT CTT GAG CCC CTT G－3。伊贝母的聚合酶链反应－限制性酶切图谱分子鉴定方法(PCR－RFLP)所用的PCR扩增引物序列为：ITS－P1：5’－CGT AAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA－3’，ITS－P3：5’－GCT ACG TTC TTC ATC GAT－3’；伊贝母的特征DNA碱基序列为：5’－TTCGCGATTG CCTCAGGGCGCTCCGGACAC GG－3’；限制性内切酶Eco81 I及其同切酶可识别并切割该序列。本发明能够实现伊贝母的快速、准确地鉴别。
Description
一、技术领域：
本发明涉及中药材种质的品质鉴定技术领域。
二、背景技术：
中药伊贝母为百合科植物伊犁贝母Fritillaria pallidiflora Schrenk的干燥鳞茎，具有清肺、化痰、散结之功效，用于肺热咳嗽，胸闷痰粘，瘰疬，痈肿等症的治疗。伊贝母疗效好，生物碱含量高，毒性低，具有很好的市场前景。目前，除原产地新疆外，伊贝母在我国北方部分省份的引种栽培已获得成功。由于伊贝母毒性低，市场价格较高，为防止用毒性较高的其它种类贝母冒充伊贝母的不良市场行为，需要寻找可靠的将伊贝母与其它贝母相区别的鉴别方法。然而，用通常的型态及显微等鉴定方法难以将伊贝母与其它种类的贝母区别开来。通过比较各种贝母的一段DNA的碱基序列，找到了伊贝母与其它种类贝母DNA序列的差别，这种差别可通过以下两种方法加以区别：(1)鉴别性PCR鉴别方法；(2)聚合酶链反应(PCR)与限制性内切酶反应的片段多态性(RFLP)鉴别方法。但这两种鉴别对于不同的物种，其所用的引物、限制性内切酶的种类及鉴别方法都不相同。
三、发明内容：
本发明的目的是提供二种准确鉴别伊贝母的鉴别性PCR分子鉴定方法(方法1)、PCR-RFLP分子鉴定方法(方法2)，方法1包括伊贝母的特征DNA碱基序列、一对通用PCR引物、一对鉴别性PCR引物及其鉴定方法。方法2包括伊贝母的特征DNA碱基序列、一对PCR引物、一种限制性内切酶酶切位点及其鉴定方法。
本发明的技术方案如下：首先从各药材中提取总DNA，然后利用方法1或方法2进行鉴别。
方法1
本发明设计的伊贝母聚合酶链反应的鉴定引物DNA序列为：
引物1：FpdPa：5′-ACC GTG TTC ACG ATT GCC TCA GG-3′
引物2：FpdPb：5′-TCC GGG TCT CTT GAG CCC CTT G-3
用全自动DNA合成仪按上述鉴定引物的DNA序列进行合成，即可得到鉴定引物的白色粉未结晶。
中药材伊贝母聚合酶链反应鉴定的方法为：
(1)药材DNA提取：按常规进行，用无离子水将供试品DNA模板浓度调节至0.2～0.5μg/μL。
(2)模板DNA质量的鉴定：用另一对通用引物鉴别模板DNA的质量，该对引物可扩增各种植物的nrDNAITS区序列。引物的DNA序列为：ITS-P1：5’-CGTAAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA-3’，ITS-P2：5’-TTA TTG ATA TGC TTA AAC TCAGCG GG-3’(Takaiwa F，Oono K，Sugiura M.Nucleotide sequence of the 17S-25Sspacer region from rice rDNA.Plant Mol Biol，1985，4：355-364)；引物浓度为30pmol/μl，除将反应体系中引物1、引物2改为ITS-P1、ITS-P2外，其它各物品用量同(3)；除复性温度改为53℃外，扩增反应条件同(4)；电泳分析同(5)。若得到阳性扩增，则表明模板合格，可进行后续步骤的检验；若无扩增条带，则需改进DNA提取条件，待获得合格的模板后再进行后续步骤的检验。
(3)鉴别性PCR：引物用无离子水溶解并稀释至30pmol/μL。以反应体系均以30μL为参考点，各物品的用量为：
10×TaqDNA聚合酶缓冲液 3μl
MgCl2(25mM) 2.4μl
dNTP(10mM) 0.6μl
引物1、引物2各 0.5μl
Taq DNA聚合酶 1.0～2.0单位
供试品DNA模板 1.0～2.0μl
无离子水 加到30μl
(4)PCR循环：在PCR仪上，95℃予变性2～4min，然后按下列参数进入30循环：
变性95℃ 20～40秒
复性67～72℃ 20～40秒
延伸72℃ 20～40秒
循环结束后在72℃保持2～4分钟补齐。
(5)电泳观察：取出PCR反应液4μl与加样缓冲液1μl混合，2％琼脂糖凝胶电泳(含0.5％溴化乙锭，即EB)检测扩增结果。
如总的反应体积不为30μl，反应物品的用量以30μl反应剂量的比例为参考点，相应地增加或减少。
若有阳性扩增，则供试品为伊贝母；若为阴性，即无扩增条带，则供试品不为伊贝母。
方法2
利用一对引物，用PCR方法扩增一段DNA片段，该片段中伊贝母的特征DNA碱基序列为：5’-TTCGCGATTG CCTCAGGGCG CTCCGGACAC GG-3’，针对伊贝母与其它种贝母DNA序列的差异，选择合适的DNA限制性内切酶酶切位点，通过分析聚合酶链反应产物的限制酶切图谱差异，达到快速、准确鉴别伊贝母目的。对需要鉴定的贝母样品，提取其总DNA，在给定的PCR条件下，用一对引物(ITS-P1、ITS-P3)进行PCR扩增，供试品能够扩增出一段DNA片段；用限制性内切酶Eco81 I或其同切酶对供试品的PCR扩增产物进行酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳检测，伊贝母会出现126，178bp的条带，而其它种类的贝母不出现上述两条带。当供试样品经用本法进行PCR扩增，并对PCR产物进行限制性内切酶酶切后，经琼脂糖凝胶电泳观察DNA片段的大小，便可准确地鉴定伊贝母或非伊贝母药材。本发明设计的用于鉴别伊贝母PCR-RFLP分子鉴定方法是采用以下步骤：
(1)药材DNA的提取：按常规进行，用无离子水将供试样品的DNA浓度调节至0.2～0.5μg/μl；
(2)扩增DNA片段，即进行聚合酶链反应，用于聚合酶链反应的一对引物的DNA序列为：
ITS-P1：5’-CGT AAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA-3’
ITS-P3：5’-GCT ACG TTC TTC ATC GAT-3’
(3)PCR扩增产物中加入限制性内切酶Eco81 I或其同切酶进行酶切，限制性内切酶Eco81 I或其同切酶的酶切位点为：CCTNAGG；
(4)琼脂糖凝胶电泳分析；
(5)鉴定结果的判断，若出现126，178bp条带则供试品为伊贝母。
本发明的效果是：可解决伊贝母与其它种贝母相区别的鉴定难题，方法1提供伊贝母的特征DNA碱基序列、一对通用PCR引物、一对鉴别性PCR引物及其鉴定方法；方法2提供鉴定所需的一对PCR引物、PCR反应条件、伊贝母的特征DNA碱基序列、一种限制性内切酶。与伊贝母相比，其它种类的贝母所含的有效成分有明显差别，伊贝母毒性小，因此市场上伊贝母的价格较高。然而，伊贝母与其它种贝母难以通过形态、显微等特征来加以区别，因此，需要找到一种可靠的鉴别方法。本发明利用伊贝母与其它种贝母药材DNA序列的差异，建立了快速、便捷、可靠的鉴别性PCR及PCR-RFLP鉴别方法，对于保证伊贝母的药材质量，打击假冒伊贝母的市场行为具有重要的价值。
四、具体实施方式：
方法1：
首先从贝母类药材不同种的原植物中提取总DNA，用PCR方法扩增多个基因片段并分别纯化，对各纯化片段进行DNA序列分析，建立伊贝母及其近缘种、混淆种的DNA序列数据库，在比较数据库的基础上，选择合适的DNA片段，针对药材伪、混品出现的情况，设计一对鉴别性PCR引物：
引物1：FpdPa：5′-ACC GTG TTC ACG ATT GCC TCA GG-3′
引物2：FpdPb：5′-TCC GGG TCT CTT GAG CCC CTT G-3
用全自动DNA合成仪按上述鉴定引物的DNA序列进行合成，即可得到鉴定引物的白色粉未结晶。
采用上述引物对伊贝母的真伪进行鉴别，以反应体系30μl为例，采用以下步骤进行浙贝母的鉴别性聚合酶链反应：
(1)药材DNA提取：按常规进行，用无离子水将供试品DNA模板浓度调节至0.2～0.5μg/μL。
(2)模板DNA质量的鉴定：用另一对通用引物鉴别模板DNA的质量，该对引物可扩增各种植物的nrDNA ITS区序列。引物的DNA序列为：ITS-P1：5’-CGTAAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA-3’，ITS-P2：5’-TTA TTG ATA TGC TTA AAC TCAGCG GG-3’；引物浓度为30pmol/μl，除将反应体系中引物1、引物2改为ITS-P1、ITS-P2外，其它各物品用量同(3)；除复性温度为53℃外，扩增反应条件同(4)；电泳分析同(5)。若得到阳性扩增，则表明模板合格，可进行后续步骤的检验；若无扩增条带，则需改进DNA提取条件，待获得合格的模板后再进行后续步骤的检验。
(3)鉴别性PCR：引物用无离子水溶解并稀释至30pmol/μL。以反应体系均为30μL为参考点，各物品的用量为：
10×TaqDNA聚合酶缓冲液 3μl
MgCl2(25mM) 2.4μl
dNTP(10mM) 0.6μl
引物1、引物2各 0.5μl
Taq DNA聚合酶 1.0～2.0单位
供试品DNA模板 1.0～2.0μl
无离子水 加到30μl
(4)PCR循环：在PCR仪上，95℃予变性2～4min，然后按下列参数进入30循环：
变性95℃ 20～40秒
复性67～72℃ 20～40秒
延伸72℃ 20～40秒
循环结束后在72℃保持2～4分钟补齐。
(5)电泳观察：取出PCR反应4μl与加样缓冲液1μl混合，2％琼脂糖凝胶电泳(含0.5％溴化乙锭，即EB)检测扩增结果。
若有阳性扩增，则供试品为伊贝母；若为阴性，即无扩增条带，则供试品不为伊贝母。
方法2：
(1)DNA的提取：按常规进行，用无离子水将供试样品的DNA浓度调节至0.1～0.3μg/μl；
(2)聚合酶链反应：
聚合酶链反应以30μl为参考，各种物品的用量分别为：
10×PCR缓冲液 3μl
MgCl2(25mM) 2.4μl
dNTP(各10mM) 0.6μl
引物ITS-P1、ITS-P3(30pmol/μl) 各0.5μl
供试品DNA模板 1～2μl
TaqDNA聚合酶 1U(0.2μl)
无离子水 补齐至30μl
混匀后高速离心数秒
PCR反应条件：反应在PCR仪上进行，反应条件为：
95℃予变性3min，然后按以下条件进行30循环：
变性95℃ 20～40秒
复性53℃ 20～40秒
延伸72℃ 20～40秒
循环结束后在72℃保持2～4分钟补齐，反应结束后在4℃保存。
PCR产物的电泳检测：取上述反应液4μl，与1μl载样缓冲液混合，用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/μL溴化乙锭，即EB)电泳检测扩增结果，各种DNA样品均能扩增出一条约304bp的DNA条带；
(3)聚合酶链反应产物的限制性内切酶酶切反应：
DNA限制性内切酶酶切反应：反应液参考体积为20μl，其中各种物品的用量为：
PCR产物 5～10μL
10×Y+限制性内切酶缓冲液 2μL
限制性内切酶Eco81 I 5U
无离子水补齐至 20μL
将反应液置37℃保温3～4小时，反应结束后置于65℃水浴10分钟，使酶失活；
(4)电泳观察酶切结果：酶切产物用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/μl的溴化乙锭，即EB)，在4V/cm电场强度下电泳30～50分钟，观察电泳结果；
(5)测定结果的判断，使用限制性内切酶Eco81 I或其同切酶对聚合酶链反应扩增产物进行酶切，产生对伊贝母与非伊贝母具有鉴别性特征的酶切DNA片段长度图谱。若供试品出现126，178bp的两个片段，则为伊贝母；若不出现上述两个片段，则不为伊贝母。中药伊贝母分子生物学鉴定方法<110>中国药科大学<120>中药伊贝母分子生物学鉴定方法<160>6<210>1<211>23<212>DNA<213>伊贝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)<400>1accgtgttca cgattgcctc agg<210>2<211>22<212>DNA<213>伊贝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)<400>1tccgggtctc ttgagcccct tg<210>3<211>30<212>DNA<213>伊贝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)<400>1ttcgcgattg cctcagggcg ctccggacac<210>4<211>24<212>DNA<213>伊贝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)<400>1cgtaacaagg tttccgtagg tgaa<210>5<211>26<212>DNA<213>伊贝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)<400>1ttattgatat gcttaaactc agcggg<210>6<211>18<212>DNA<213>伊贝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)<400>1gctacgttct tcatcgat
Claims (4)
1、一种中药伊贝母聚合酶链反应鉴定引物，其特征在于：鉴定引物DNA序列为：FpdPa：5′-ACC GTG TTC ACG ATT GCC TCA GG-3′，FpdPb：5′-TCCGGG TCT CTT GAG CCC CTT G-3，用全自动DNA合成仪按上述鉴定引物的DNA序列进行合成，即得到鉴定引物的白色粉未结晶。
2、根据权利要求1所述鉴定引物鉴定中药伊贝母的方法，其特征在于中药材伊贝母聚合酶链反应(PCR)鉴定步骤为：
(1)药材DNA提取：按常规进行，用无离子水将供试品DNA模板浓度调节至0.2～0.5μg/μL。
(2)模板DNA质量的鉴定：用另一对通用引物鉴别模板DNA的质量，该对引物扩增各种植物的nrDNAITS区序列。引物的DNA序列为：ITS-P1：5’-CGTAAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA-3’，ITS-P2：5’-TTA TTG ATA TGC TTAAAC TCA GCG GG-3’；引物浓度为30pmol/μl，除将反应体系中引物改为ITS-P1、ITS-P2外，其它各物品用量同(3)；除复性温度改为53℃外，扩增反应条件同(4)；电泳分析同(5)。若得到阳性扩增，则表明模板合格，可进行后续步骤的检验；若无扩增条带，则需改进DNA提取条件，待获得合格的模板后再进行后续步骤的检验。
(3)鉴别性PCR：引物用无离子水溶解并稀释至30pmol/μL。以反应体系均为30μL为参考点，各物品的用量为：
10×TaqDNA聚合酶缓冲液 3μl
MgCl2(25mM) 2.4μl
dNTP(10mM) 0.6μl
引物FpdPa、FpdPb各 0.5μl
Taq DNA聚合酶 1.0～2.0单位
供试品DNA模板 1.0～2.0μl
无离子水 加到30μl
(4)PCR循环：在PCR仪上，95℃予变性2～4min，然后按下列参数进入30循环：
变性95℃ 20～40秒
复性67～72℃ 20～40秒
延伸72℃ 20～40秒
循环结束后在72℃保持2～4分钟补齐。
(5)电泳观察：取出PCR反应液4μl与加样缓冲液1μl混合，2％琼脂糖凝胶电泳(含0.5％溴化乙锭，即EB)检测扩增结果。
如总的反应体积不为30μl，反应物品的用量以30μl反应剂量的比例为参考点，相应地增加或减少。
若有阳性扩增，则供试品为伊贝母；若为阴性，即无扩增条带，则供试品不为伊贝母。
3一对聚合酶链反应扩增引物的DNA碱基序列，其特征在于DNA序列为：ITS-P1：5’-CGTAAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA-3’，ITS-P3：5’-GCT ACGTTC TTC ATC GAT-3’；一种伊贝母特有的DNA碱基序列，其特征在于DNA序列为：5’-TTCGCGATTG CCTCAGGGCG CTCCGGACAC GG-3’。；一种伊贝母聚合酶链反应-限制性酶切图谱，其特征在于能够识别伊贝母特有DNA碱基序列的限制性内切酶Eco81 I及其同切酶对聚合酶链反应产物消化后的琼脂糖凝胶电泳的特征图谱。
4根据权利要求3所述鉴定引物、特有DNA碱基序列及聚合酶链反应-限制性酶切图谱鉴定中药伊贝母的方法，其特征在于中药伊贝母聚合酶链反应-限制性酶切图谱(PCR-RFLP)鉴定步骤为：
(1)、药材DNA的提取：按常规进行，用无离子水将供试样品的DNA浓度调节至0.2～0.5μg/μl；
(2)、扩增DNA片段，用引物ITS-P1、ITS-P3进行聚合酶链反应(PCR)，得到聚合酶链反应扩增产物
(3)、PCR扩增产物中加入限制性内切酶Eco81 I或其同切酶进行酶切，限制性内切酶Eco81 I或其同切酶的酶切位点为：CCTNAGG；
(4)、琼脂糖凝胶电泳分析；
(5)、鉴定结果的判断：若出现126，178bp的两个片段，则供试品为伊贝母，若不出现上述两个片段，则供试品不为伊贝母。
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