CN104711366A - 一种药物性耳聋基因多通道荧光pcr检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，针对药物耳聋相关基因mtDNA 12S rRNA：1555A>G、1494C>T、1095T>C、827A>G上共四个位点设计2对特异性引物和4条TaqMan探针，以管家基因β-Actin作为内参，设计1对特异性引物和探针，以监测样本模板、反应体系的有效性，避免出现假阴性，同时阴性、阳性质控的设定保证检测结果准确性。本发明首次实现了应用多通道荧光PCR方法在同一个反应管中同时检测药物性耳聋的四个突变位点，该方法操作简便快速、准确、高通量、成本低，闭管操作避免交叉污染，使得耳聋筛查目的性强、筛查范围广，有效预防药物性耳聋发生，易于推广及应用。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域，尤其涉及基于多通道荧光PCR法对药物性耳聋基因检测的试剂盒。
背景技术
耳聋是临床常见的残疾疾病之一，在临床上根据听觉系统所受影响的性质、原因和病变部位可将耳聋分为三类：传导性耳聋(外耳或中耳病变)、感音神经性耳聋(内耳病变)、混合性耳聋。研究资料显示感音神经性耳聋、混合性耳聋与遗传密切相关，由遗传导致的耳聋约占耳聋的60％以上。
携带药物性耳聋突变基因的个体对氨基糖甙类抗生素敏感，应用此类药物可导致听力大幅下降，甚至出现临床上常见的“一针致聋”现象。
氨基糖甙类药物相关的耳聋占总耳聋患者的20％-30％，研究发现，发病机制与线粒体mtDNA 12S rRNA基因有关，遗传方式为细胞质遗传。mtDNA 12S rRNA基因的多种突变方式均能引起药物性耳聋，其中1555A>G、1494C>T、1095T>C、827A>G是最常见突变。由于突变使线粒体DNA更加容易与氨基糖甙类药物结合，抑制线粒体的氧化磷酸化过程造成耳毒性，使携带者听力下降或是原有听力下降程度更加严重。通过对mtDNA 12S rRNA基因常见突变位点检测，可避免和有效减缓药物性耳聋的发生。
随着基因检测技术的发展以及对听力健康的关注，目前市场上检测耳聋的试剂盒所用的方法主要有基因芯片法、溶解曲线法、ARMS-PCR法、RFLP法。芯片法一般需要提取、PCR扩增、杂交、洗涤、扫描等步骤，操作较复杂耗时长，对操作者和实验场地要求较高。溶解曲线法对仪器的温控性要求很高，要求仪器具有高分辨率溶解曲线分析(HRM)功能，而我们常用的ABI系列荧光定量PCR仪一般缺少此功能。ARMS-PCR法和RFLP法需要对PCR产物进行电泳分析，不适于临床应用。因此，提供一种效率高、成本低、适于临床检测的试剂盒是目前亟待解决的技术难题。
发明内容
针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒能专一地检测药物性耳聋中常见的四个位点，一个PCR反应管内可对这四个位点同时进行检测，明确高突变率位点的类别，确定低突变率位点范围，且操作简便快捷，结果客观可控性强，效率高、成本低，闭管操作防污染，适用多通道荧光PCR仪，是临床上进行药物性耳聋检测的强有力产品。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，以mtDNA 12S rRNA基因的1555A>G、1494C>T、1095T>C、827A>G突变为检测对象，设计特异性引物和探针，所述特异性引物包括用于扩增1555A>G、1494C>T的引物1，其序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；用于扩增1095T>C、827A>G的引物2，其序列如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；所述探针用于特异性检测mtDNA 12S rRNA基因的1555、1494、1095、827位点是否含有突变，其探针序列分别如序列表中SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8所示。
具体的，由于1555和1494两个位点在mtDNA 12S rRNA基因上的距离相近，故共用一对引物(引物1)，以避免引物过多造成干扰，正向引物选在1494位点上游保守区，反向引物选在1555位点下游保守区，扩增片段长度为177bp；1095、827两个位点共用一对引物(引物2)，正向引物选在827位点上游保守区，反向引物选在1095位点下游保守区，扩增片段长度为387bp。所述引物序列如下：
引物1F：5'-GGCCCTGAAGCGCGTACA-3' (SEQ ID NO:1)
引物1R：5'-AAGTGTAAGTTGGGTGCT-3' (SEQ ID NO:2)
引物2F：5'-ATCAAGCACGCAGCAATG-3' (SEQ ID NO:3)
引物2R：5'-GTGTTCTGGCGAGCAGTTT-3' (SEQ ID NO:4)
需要说明的是：引物的优劣会直接影响到PCR扩增的特异性与成功与否，本发明所设计的引物序列保守，长度适宜，可避免产生非特异性扩增，同时一对引物可以扩增两个位点，避免引物过多造成干扰，影响扩增效率；这远非是常规的引物设计所能得到的。
所述探针序列如下：
1555P:5’-TTATATAGAGGAGGCAA-3’ (SEQ ID NO:5)
1494P:5’-CCCGTCACTCTCCTCAAGT-3’ (SEQ ID NO:6)
1095P:5’–CCACTATGCTCAGCCCTAAACC-3’ (SEQ ID NO:7)
827P:5’–CAGCAGTGATTAGCCTTTAGC-3’ (SEQ ID NO:8)
所述探针还分别连接有荧光发光基团和荧光淬灭基团，其中，用于检测1555、1494、1095、827位点的探针的荧光发光基团分别为VIC、ROX、Cy5、TAMRA；各探针的荧光淬灭基团均为BHQ-1。
该药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，还包括用于监测扩增模板的有效性的1对β-Actin内参引物和1条内参探针，其序列分别如序列表中SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQID NO:11所示。
具体的，β-Actin内参引物的序列如下：
β-ActinF:5'-CACCCAGCACAATGAAGA-3' (SEQ ID NO:9)
β-ActinR:5'-AAGGTGGACAGCGAGGC-3' (SEQ ID NO:10)
内参探针的序列为：
β-ActinP:5'-CTCCTGAGCGCAAGTACTCCGTG-3' (SEQ ID NO:11)
所述内参探针的荧光发光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ-1。
该药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，还包括有阴性质控、阳性质控，阴性质控为连入T载体的内参基因、正常mtDNA 12S rRNA基因部分序列，其序列如序列表中SEQ IDNO:12所示；阳性质控为连入T载体的内参基因、含1555、1494、1095、827突变位点部分序列，其序列如序列表中SEQ ID NO:13所示。质控的设立可保证检测结果在控，避免假阴性、假阳性的出现。
具体的，一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，由DNA提取液、PCR反应液、阴性质控和阳性质控组成，其中，每50μl PCR反应液的组成为：10×PCR缓冲液5.0μl、MgCl22.0～5.0mM、dNTPs 0.5～1.5mM、引物0.2～2.0μM、探针0.1～1.0μM、Taq酶2.0～4.0U、UNG酶0.5～1.0U，加水至50μl。所述引物为引物1、引物2和内参引物；所述探针为4条检测是否含有突变的探针和1条内参探针。UNG酶的加入有效去除PCR扩增前的U-DNA污染。
采用该药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒进行检测的方法，步骤为：
将待检测样品的DNA提取液、PCR反应液、阴性质控和阳性质控加入到PCR反应管内，混匀后置于荧光定量PCR仪上进行PCR扩增反应，PCR反应条件如下：50℃2min；95℃3min；95℃15s，60℃45s，40个循环，每个循环在60℃采集荧光；根据扩增曲线的信号情况定性判断是否存在突变。
首先阴性质控、阳性质控的检测结果应与预期相符，即阴性质控仅有FAM曲线扩增，无其它荧光曲线扩增，阳性质控FAM、VIC、ROX、Cy5、TAMRA曲线均有扩增。只有阴性质控、阳性质控扩增曲线结果与预期相符后，才可对样本孔进行分析。
若样品孔采集到FAM信号，表明内参基因扩增正常，样本DNA是有效的；
若样品孔未采集到FAM信号，表明内参基因扩增失败，样本DNA无效或仪器存在问题，本次检测结果无效；
若样品孔有FAM、VIC信号，无ROX、Cy5、TAMRA信号，表明样本为1555突变；
若样品孔有FAM、ROX信号，无VIC、Cy5、TAMRA信号，表明样本为1494突变；
若样品孔有FAM、Cy5信号，无VIC、ROX、TAMRA信号，表明样本为1095突变；
若样品孔有FAM、TAMRA信号，无VIC、ROX、Cy5信号，表明样本为827突变。
本发明的有益效果：
(1)本发明的检测试剂盒中引入管家基因肌动蛋白β-Actin作为内参对照，设计1对特异引物和1条特异探针，扩增片段长度为94bp，在同一PCR管内与待测位点引物同时扩增，以检测样本DNA的有效性、监测PCR体系的有效性，除此之外，还可检测样品孔或仪器是否存在问题，防止出现假阴性。
(2)由于1555、1494两个位点在mtDNA 12S rRNA基因上的位置比较集中，本发明采取将上述两个位点共用一对引物，有效避免了引物过多造成的干扰。
(3)由于1095、827两个位点在mtDNA 12S rRNA基因上的位置比较集中，本发明采取将上述两个位点共用一对引物，有效避免了引物过多造成的干扰。
(4)本发明分别针对内参基因、1555、1494、1095、827位点的共四条探针进行不同荧光标记，内参基因-FAM，1555-VIC，1494-ROX，1095-Cy5，827-TAMRA。首先根据内参基因的特异荧光曲线有无判断样本DNA是否有效，进而根据VIC、ROX、Cy5、TAMRA特异荧光曲线有无可具体明确1555、1494、1095、827位点是否存在突变，从而对与药物性耳聋相关的高致病率位点进行有效确认。本发明应用不同的荧光基团标记探针，从而在同一个PCR反应管中既可明确区分高突变率位点又可检出不常见突变位点，提高检测覆盖率。
(5)本发明首次实现了应用多通道荧光PCR方法在同一个反应管中同时检测药物性耳聋的四个突变位点，该方法操作简便快速、准确、高通量、成本低，闭管操作避免交叉污染，使得耳聋筛查目的性强、筛查范围广，有效预防药物性耳聋发生，易于推广及应用。
附图说明
图1为阴性质控的PCR扩增曲线；
图2为阳性质控的PCR扩增曲线；
图3为正常人样本PCR扩增曲线；
图4为1555突变型样本PCR扩增曲线；
图5为1494突变型样本PCR扩增曲线。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1：一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒组成及其检测方法
1.试剂盒的组成：
DNA提取液1管(5.0ml)、PCR反应液1管(1.1ml)、阴性质控1管(50μl)、阳性质控1管(50μl)；
每50μl PCR反应液的组成为：10×PCR缓冲液5.0μl、MgCl23.0mM、dNTPs 1.0mM、引物1.0μM、探针0.5μM、Taq酶3.0U、UNG酶1.0U，加水至50μl。
其中，引物包括有引物1、引物2和内参引物，其序列分别为：
引物1F：5'-GGCCCTGAAGCGCGTACA-3' (SEQ ID NO:1)
引物1R：5'-AAGTGTAAGTTGGGTGCT-3' (SEQ ID NO:2)
引物2F：5'-ATCAAGCACGCAGCAATG-3' (SEQ ID NO:3)
引物2R：5'-GTGTTCTGGCGAGCAGTTT-3' (SEQ ID NO:4)
β-ActinF:5'-CACCCAGCACAATGAAGA-3' (SEQ ID NO:9)
β-ActinR:5'-AAGGTGGACAGCGAGGC-3' (SEQ ID NO:10)
探针为4条检测是否含有突变的探针和1条内参探针，其序列分别为：
1555P:5’-TTATATAGAGGAGGCAA-3’ (SEQ ID NO:5)
1494P:5’-CCCGTCACTCTCCTCAAGT-3’ (SEQ ID NO:6)
1095P:5’–CCACTATGCTCAGCCCTAAACC-3’ (SEQ ID NO:7)
827P:5’–CAGCAGTGATTAGCCTTTAGC-3’ (SEQ ID NO:8)
β-ActinP:5'-CTCCTGAGCGCAAGTACTCCGTG-3' (SEQ ID NO:11)
对上述探针进行荧光标记，上述探针分别连接有荧光发光基团和荧光淬灭基团，其中，用于检测1555、1494、1095、827位点的探针的荧光发光基团分别为VIC、ROX、Cy5、TAMRA；内参探针的荧光发光基团为FAM；各探针的荧光淬灭基团均为BHQ-1。
阴性质控为连入T载体的内参基因、正常mtDNA 12S rRNA基因部分序列，其序列如序列表中SEQ ID NO:12所示，具体为：
cacccagcacaatgaagatcaagatcattgctcctcctgagcgcaagtactccgtgtggatcggcggctccatcctggcctcgctgtccaccttatcaagcacgcagcaatgcagctcaaaacgcttagcctagccacacccccacgggaaacagcagtgattaacctttagcaataaacgaaagtttaactaagctatactaaccccagggttggtcaatttcgtgccagccaccgcggtcacacgattaacccaagtcaatagaagccggcgtaaagagtgttttagatcaccccctccccaataaagctaaaactcacctgagttgtaaaaaactccagttgacacaaaatagactacgaaagtggctttaacatatctgaacacacaatagctaagacccaaactgggattagataccccactatgcttagccctaaacctcaacagttaaatcaacaaaactgctcgccagaacacggccctgaagcgcgtacacaccgcccgtcaccctcctcaagtatacttcaaaggacatttaactaaaacccctacgcatttatatagaggagacaagtcgtaacatggtaagtgtactggaaagtgcacttggacgaaccagagtgtagcttaacacaaagcacccaacttacactt
阳性质控为连入T载体的内参基因、含1555、1494、1095、827突变位点部分序列，其序列如序列表中SEQ ID NO:13所示，具体为：
cacccagcacaatgaagatcaagatcattgctcctcctgagcgcaagtactccgtgtggatcggcggctccatcctggcctcgctgtccaccttatcaagcacgcagcaatgcagctcaaaacgcttagcctagccacacccccacgggaaacagcagtgattagcctttagcaataaacgaaagtttaactaagctatactaaccccagggttggtcaatttcgtgccagccaccgcggtcacacgattaacccaagtcaatagaagccggcgtaaagagtgttttagatcaccccctccccaataaagctaaaactcacctgagttgtaaaaaactccagttgacacaaaatagactacgaaagtggctttaacatatctgaacacacaatagctaagacccaaactgggattagataccccactatgctcagccctaaacctcaacagttaaatcaacaaaactgctcgccagaacacggccctgaagcgcgtacacaccgcccgtcactctcctcaagtatacttcaaaggacatttaactaaaacccctacgcatttatatagaggaggcaagtcgtaacatggtaagtgtactggaaagtgcacttggacgaaccagagtgtagcttaacacaaagcacccaacttacactt
2.检测方法：
1)基因组DNA提取：
全血：取200μl EDTA抗凝血至1.5ml新的无菌EP管中，加入600μl双蒸水，振荡混匀，室温放置10min；期间混匀2-3次，12000rpm离心5min，弃上清；加入200μl DNA提取液(使用前充分混匀，使颗粒悬浮)，100℃水浴8min；12000rpm离心5min，取上清用于检测。
干血斑：取直径约为3mm血片于1.5ml新的无菌EP管中，加入500μl双蒸水，漩涡振荡，室温放置5min；12000rpm离心1min，弃上清；加入200μlDNA提取液(使用前充分混匀，使颗粒悬浮)，100℃水浴8min，取出振荡15-30s；12000rpm离心5min，取上清用于检测。
2)加样、PCR扩增：
分装45μl PCR反应液于PCR反应管内，分装管数＝n+2(注：n为待测样本数，2为用于阴性质控、阳性质控的管数)；分别加入5μl待测DNA模板、阴性/阳性质控，混匀后置于荧光定量PCR仪上进行PCR扩增反应；反应程序为50℃2min；95℃3min；95℃15s，60℃45s，40个循环，每个循环在60℃采集荧光。
3)结果分析：
根据扩增曲线的信号情况定性判断是否存在突变。首先阴性质控、阳性质控的检测结果应与预期相符，即阴性质控仅有FAM曲线扩增，无其它荧光曲线扩增，如图1所示，阳性质控FAM、VIC、ROX、Cy5、TAMRA曲线均有扩增，如图2所示。只有阴性质控、阳性质控扩增曲线结果与预期相符后，才可对样本孔进行分析。
若样品孔采集到FAM信号，如图3所示，表明内参基因扩增正常，样本DNA是有效的；
若样品孔未采集到FAM信号，表明内参基因扩增失败，样本DNA无效或仪器存在问题，本次检测结果无效；
若样品孔有FAM、VIC信号，无ROX、Cy5、TAMRA信号，如图4所示，表明样本为1555突变；
若样品孔有FAM、ROX信号，无VIC、Cy5、TAMRA信号，如图5所示，表明样本为1494突变；
若样品孔有FAM、Cy5信号，无VIC、ROX、TAMRA信号，表明样本为1095突变；
若样品孔有FAM、TAMRA信号，无VIC、ROX、Cy5信号，表明样本为827突变。
试验证明，本发明的试剂盒的检测准确率为100％，假阳性率为0，假阴性率为0，结果准确可靠。本发明试剂盒的检测时间约1小时，与现有的检测试剂盒相比，简单快速；而且，本试剂盒检测所需仪器价格相对较低且较普遍，故检测成本相对较低。
Claims (10)
1.一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，以mtDNA 12S rRNA基因的1555A>G、1494C>T、1095T>C、827A>G突变为检测对象，设计特异性引物和探针，所述特异性引物包括用于扩增1555A>G、1494C>T的引物1，其序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；用于扩增1095T>C、827A>G的引物2，其序列如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；所述探针为特异性检测mtDNA 12S rRNA基因的1555、1494、1095、827位点是否含有突变，其探针序列分别如序列表中SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8所示。
2.如权利要求1所述的一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述探针还分别连接有荧光发光基团和荧光淬灭基团，其中，用于检测1555、1494、1095、827位点的探针的荧光发光基团分别为VIC、ROX、Cy5、TAMRA；各探针的荧光淬灭基团均为BHQ-1。
3.如权利要求1所述的一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括用于监测扩增模板的有效性的1对β-Actin内参引物和1条内参探针，其序列分别如序列表中SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示。
4.如权利要求3所述的一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述内参探针为荧光标记的探针，其荧光发光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ-1。
5.如权利要求1所述的一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括有阴性质控、阳性质控；
所述阴性质控为连入T载体的内参基因、正常mtDNA 12S rRNA基因部分序列，其序列如序列表中SEQ ID NO:12所示；阳性质控为连入T载体的内参基因、含1555、1494、1095、827突变位点部分序列，其序列如序列表中SEQ ID NO:13所示。
6.一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，其具体组成为：DNA提取液、PCR反应液、阴性质控和阳性质控；其中，每50μl PCR反应液的组成为：10×PCR缓冲液5.0μl、MgCl22.0～5.0mM、dNTPs 0.5～1.5mM、引物0.2～2.0μM、探针0.1～1.0μM、Taq酶2.0～4.0U、UNG酶0.5～1.0U，加水至50μl。
7.如权利要求6所述的一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述引物为引物1、引物2和内参引物，其序列分别如序列表中SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10所示。
8.如权利要求6所述的一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述探针为4条检测是否含有突变的探针和1条内参探针，其序列分别如序列表中SEQ IDNO:5至SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:11所示。
9.如权利要求6所述的一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阴性质控为连入T载体的内参基因、正常mtDNA 12S rRNA基因部分序列，其序列如序列表中SEQ ID NO:12所示；阳性质控为连入T载体的内参基因、含1555、1494、1095、827突变位点部分序列，其序列如序列表中SEQ ID NO:13所示。
10.权利要求1-9任一项所述的药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤如下：将待检测样品的DNA提取液、PCR反应液、阴性质控和阳性质控加入到PCR反应管内，混匀后置于荧光定量PCR仪上进行PCR扩增反应，PCR反应条件如下：50℃2min；95℃3min；95℃15s，60℃45s，40个循环，每个循环在60℃采集荧光；根据扩增曲线的信号情况定性判断是否存在突变。
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