CN104711366A - 一种药物性耳聋基因多通道荧光pcr检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒,针对药物耳聋相关基因mtDNA 12S rRNA:1555A>G、1494C>T、1095T>C、827A>G上共四个位点设计2对特异性引物和4条TaqMan探针,以管家基因β-Actin作为内参,设计1对特异性引物和探针,以监测样本模板、反应体系的有效性,避免出现假阴性,同时阴性、阳性质控的设定保证检测结果准确性。本发明首次实现了应用多通道荧光PCR方法在同一个反应管中同时检测药物性耳聋的四个突变位点,该方法操作简便快速、准确、高通量、成本低,闭管操作避免交叉污染,使得耳聋筛查目的性强、筛查范围广,有效预防药物性耳聋发生,易于推广及应用。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域,尤其涉及基于多通道荧光PCR法对药物性耳聋基因检测的试剂盒。
背景技术
耳聋是临床常见的残疾疾病之一,在临床上根据听觉系统所受影响的性质、原因和病变部位可将耳聋分为三类:传导性耳聋(外耳或中耳病变)、感音神经性耳聋(内耳病变)、混合性耳聋。研究资料显示感音神经性耳聋、混合性耳聋与遗传密切相关,由遗传导致的耳聋约占耳聋的60%以上。
携带药物性耳聋突变基因的个体对氨基糖甙类抗生素敏感,应用此类药物可导致听力大幅下降,甚至出现临床上常见的“一针致聋”现象。
氨基糖甙类药物相关的耳聋占总耳聋患者的20%-30%,研究发现,发病机制与线粒体mtDNA 12S rRNA基因有关,遗传方式为细胞质遗传。mtDNA 12S rRNA基因的多种突变方式均能引起药物性耳聋,其中1555A>G、1494C>T、1095T>C、827A>G是最常见突变。由于突变使线粒体DNA更加容易与氨基糖甙类药物结合,抑制线粒体的氧化磷酸化过程造成耳毒性,使携带者听力下降或是原有听力下降程度更加严重。通过对mtDNA 12S rRNA基因常见突变位点检测,可避免和有效减缓药物性耳聋的发生。
随着基因检测技术的发展以及对听力健康的关注,目前市场上检测耳聋的试剂盒所用的方法主要有基因芯片法、溶解曲线法、ARMS-PCR法、RFLP法。芯片法一般需要提取、PCR扩增、杂交、洗涤、扫描等步骤,操作较复杂耗时长,对操作者和实验场地要求较高。溶解曲线法对仪器的温控性要求很高,要求仪器具有高分辨率溶解曲线分析(HRM)功能,而我们常用的ABI系列荧光定量PCR仪一般缺少此功能。ARMS-PCR法和RFLP法需要对PCR产物进行电泳分析,不适于临床应用。因此,提供一种效率高、成本低、适于临床检测的试剂盒是目前亟待解决的技术难题。
发明内容
针对上述现有技术存在的不足,本发明的目的是提供一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒,该试剂盒能专一地检测药物性耳聋中常见的四个位点,一个PCR反应管内可对这四个位点同时进行检测,明确高突变率位点的类别,确定低突变率位点范围,且操作简便快捷,结果客观可控性强,效率高、成本低,闭管操作防污染,适用多通道荧光PCR仪,是临床上进行药物性耳聋检测的强有力产品。
为实现上述目的,本发明采用下述技术方案:
一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒,以mtDNA 12S rRNA基因的1555A>G、1494C>T、1095T>C、827A>G突变为检测对象,设计特异性引物和探针,所述特异性引物包括用于扩增1555A>G、1494C>T的引物1,其序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示;用于扩增1095T>C、827A>G的引物2,其序列如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示;所述探针用于特异性检测mtDNA 12S rRNA基因的1555、1494、1095、827位点是否含有突变,其探针序列分别如序列表中SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8所示。
具体的,由于1555和1494两个位点在mtDNA 12S rRNA基因上的距离相近,故共用一对引物(引物1),以避免引物过多造成干扰,正向引物选在1494位点上游保守区,反向引物选在1555位点下游保守区,扩增片段长度为177bp;1095、827两个位点共用一对引物(引物2),正向引物选在827位点上游保守区,反向引物选在1095位点下游保守区,扩增片段长度为387bp。所述引物序列如下:
引物1F:5'-GGCCCTGAAGCGCGTACA-3' (SEQ ID NO:1)
引物1R:5'-AAGTGTAAGTTGGGTGCT-3' (SEQ ID NO:2)
引物2F:5'-ATCAAGCACGCAGCAATG-3' (SEQ ID NO:3)
引物2R:5'-GTGTTCTGGCGAGCAGTTT-3' (SEQ ID NO:4)
需要说明的是:引物的优劣会直接影响到PCR扩增的特异性与成功与否,本发明所设计的引物序列保守,长度适宜,可避免产生非特异性扩增,同时一对引物可以扩增两个位点,避免引物过多造成干扰,影响扩增效率;这远非是常规的引物设计所能得到的。
所述探针序列如下:
1555P:5’-TTATATAGAGGAGGCAA-3’ (SEQ ID NO:5)
1494P:5’-CCCGTCACTCTCCTCAAGT-3’ (SEQ ID NO:6)
1095P:5’–CCACTATGCTCAGCCCTAAACC-3’ (SEQ ID NO:7)
827P:5’–CAGCAGTGATTAGCCTTTAGC-3’ (SEQ ID NO:8)
所述探针还分别连接有荧光发光基团和荧光淬灭基团,其中,用于检测1555、1494、1095、827位点的探针的荧光发光基团分别为VIC、ROX、Cy5、TAMRA;各探针的荧光淬灭基团均为BHQ-1。
该药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒,还包括用于监测扩增模板的有效性的1对β-Actin内参引物和1条内参探针,其序列分别如序列表中SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQID NO:11所示。
具体的,β-Actin内参引物的序列如下:
β-ActinF:5'-CACCCAGCACAATGAAGA-3' (SEQ ID NO:9)
β-ActinR:5'-AAGGTGGACAGCGAGGC-3' (SEQ ID NO:10)
内参探针的序列为:
β-ActinP:5'-CTCCTGAGCGCAAGTACTCCGTG-3' (SEQ ID NO:11)
所述内参探针的荧光发光基团为FAM,荧光淬灭基团为BHQ-1。
该药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒,还包括有阴性质控、阳性质控,阴性质控为连入T载体的内参基因、正常mtDNA 12S rRNA基因部分序列,其序列如序列表中SEQ IDNO:12所示;阳性质控为连入T载体的内参基因、含1555、1494、1095、827突变位点部分序列,其序列如序列表中SEQ ID NO:13所示。质控的设立可保证检测结果在控,避免假阴性、假阳性的出现。
具体的,一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒,由DNA提取液、PCR反应液、阴性质控和阳性质控组成,其中,每50μl PCR反应液的组成为:10×PCR缓冲液5.0μl、MgCl22.0~5.0mM、dNTPs 0.5~1.5mM、引物0.2~2.0μM、探针0.1~1.0μM、Taq酶2.0~4.0U、UNG酶0.5~1.0U,加水至50μl。所述引物为引物1、引物2和内参引物;所述探针为4条检测是否含有突变的探针和1条内参探针。UNG酶的加入有效去除PCR扩增前的U-DNA污染。
采用该药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒进行检测的方法,步骤为:
将待检测样品的DNA提取液、PCR反应液、阴性质控和阳性质控加入到PCR反应管内,混匀后置于荧光定量PCR仪上进行PCR扩增反应,PCR反应条件如下:50℃2min;95℃3min;95℃15s,60℃45s,40个循环,每个循环在60℃采集荧光;根据扩增曲线的信号情况定性判断是否存在突变。
首先阴性质控、阳性质控的检测结果应与预期相符,即阴性质控仅有FAM曲线扩增,无其它荧光曲线扩增,阳性质控FAM、VIC、ROX、Cy5、TAMRA曲线均有扩增。只有阴性质控、阳性质控扩增曲线结果与预期相符后,才可对样本孔进行分析。
若样品孔采集到FAM信号,表明内参基因扩增正常,样本DNA是有效的;
若样品孔未采集到FAM信号,表明内参基因扩增失败,样本DNA无效或仪器存在问题,本次检测结果无效;
若样品孔有FAM、VIC信号,无ROX、Cy5、TAMRA信号,表明样本为1555突变;
若样品孔有FAM、ROX信号,无VIC、Cy5、TAMRA信号,表明样本为1494突变;
若样品孔有FAM、Cy5信号,无VIC、ROX、TAMRA信号,表明样本为1095突变;
若样品孔有FAM、TAMRA信号,无VIC、ROX、Cy5信号,表明样本为827突变。
本发明的有益效果:
(1)本发明的检测试剂盒中引入管家基因肌动蛋白β-Actin作为内参对照,设计1对特异引物和1条特异探针,扩增片段长度为94bp,在同一PCR管内与待测位点引物同时扩增,以检测样本DNA的有效性、监测PCR体系的有效性,除此之外,还可检测样品孔或仪器是否存在问题,防止出现假阴性。
(2)由于1555、1494两个位点在mtDNA 12S rRNA基因上的位置比较集中,本发明采取将上述两个位点共用一对引物,有效避免了引物过多造成的干扰。
(3)由于1095、827两个位点在mtDNA 12S rRNA基因上的位置比较集中,本发明采取将上述两个位点共用一对引物,有效避免了引物过多造成的干扰。
(4)本发明分别针对内参基因、1555、1494、1095、827位点的共四条探针进行不同荧光标记,内参基因-FAM,1555-VIC,1494-ROX,1095-Cy5,827-TAMRA。首先根据内参基因的特异荧光曲线有无判断样本DNA是否有效,进而根据VIC、ROX、Cy5、TAMRA特异荧光曲线有无可具体明确1555、1494、1095、827位点是否存在突变,从而对与药物性耳聋相关的高致病率位点进行有效确认。本发明应用不同的荧光基团标记探针,从而在同一个PCR反应管中既可明确区分高突变率位点又可检出不常见突变位点,提高检测覆盖率。
(5)本发明首次实现了应用多通道荧光PCR方法在同一个反应管中同时检测药物性耳聋的四个突变位点,该方法操作简便快速、准确、高通量、成本低,闭管操作避免交叉污染,使得耳聋筛查目的性强、筛查范围广,有效预防药物性耳聋发生,易于推广及应用。
附图说明
图1为阴性质控的PCR扩增曲线;
图2为阳性质控的PCR扩增曲线;
图3为正常人样本PCR扩增曲线;
图4为1555突变型样本PCR扩增曲线;
图5为1494突变型样本PCR扩增曲线。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步的说明,应该说明的是,下述说明仅是为了解释本发明,并不对其内容进行限定。
实施例1:一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒组成及其检测方法
1.试剂盒的组成:
DNA提取液1管(5.0ml)、PCR反应液1管(1.1ml)、阴性质控1管(50μl)、阳性质控1管(50μl);
每50μl PCR反应液的组成为:10×PCR缓冲液5.0μl、MgCl23.0mM、dNTPs 1.0mM、引物1.0μM、探针0.5μM、Taq酶3.0U、UNG酶1.0U,加水至50μl。
其中,引物包括有引物1、引物2和内参引物,其序列分别为:
引物1F:5'-GGCCCTGAAGCGCGTACA-3' (SEQ ID NO:1)
引物1R:5'-AAGTGTAAGTTGGGTGCT-3' (SEQ ID NO:2)
引物2F:5'-ATCAAGCACGCAGCAATG-3' (SEQ ID NO:3)
引物2R:5'-GTGTTCTGGCGAGCAGTTT-3' (SEQ ID NO:4)
β-ActinF:5'-CACCCAGCACAATGAAGA-3' (SEQ ID NO:9)
β-ActinR:5'-AAGGTGGACAGCGAGGC-3' (SEQ ID NO:10)
探针为4条检测是否含有突变的探针和1条内参探针,其序列分别为:
1555P:5’-TTATATAGAGGAGGCAA-3’ (SEQ ID NO:5)
1494P:5’-CCCGTCACTCTCCTCAAGT-3’ (SEQ ID NO:6)
1095P:5’–CCACTATGCTCAGCCCTAAACC-3’ (SEQ ID NO:7)
827P:5’–CAGCAGTGATTAGCCTTTAGC-3’ (SEQ ID NO:8)
β-ActinP:5'-CTCCTGAGCGCAAGTACTCCGTG-3' (SEQ ID NO:11)
对上述探针进行荧光标记,上述探针分别连接有荧光发光基团和荧光淬灭基团,其中,用于检测1555、1494、1095、827位点的探针的荧光发光基团分别为VIC、ROX、Cy5、TAMRA;内参探针的荧光发光基团为FAM;各探针的荧光淬灭基团均为BHQ-1。
阴性质控为连入T载体的内参基因、正常mtDNA 12S rRNA基因部分序列,其序列如序列表中SEQ ID NO:12所示,具体为:
cacccagcacaatgaagatcaagatcattgctcctcctgagcgcaagtactccgtgtggatcggcggctccatcctggcctcgctgtccaccttatcaagcacgcagcaatgcagctcaaaacgcttagcctagccacacccccacgggaaacagcagtgattaacctttagcaataaacgaaagtttaactaagctatactaaccccagggttggtcaatttcgtgccagccaccgcggtcacacgattaacccaagtcaatagaagccggcgtaaagagtgttttagatcaccccctccccaataaagctaaaactcacctgagttgtaaaaaactccagttgacacaaaatagactacgaaagtggctttaacatatctgaacacacaatagctaagacccaaactgggattagataccccactatgcttagccctaaacctcaacagttaaatcaacaaaactgctcgccagaacacggccctgaagcgcgtacacaccgcccgtcaccctcctcaagtatacttcaaaggacatttaactaaaacccctacgcatttatatagaggagacaagtcgtaacatggtaagtgtactggaaagtgcacttggacgaaccagagtgtagcttaacacaaagcacccaacttacactt
阳性质控为连入T载体的内参基因、含1555、1494、1095、827突变位点部分序列,其序列如序列表中SEQ ID NO:13所示,具体为:
cacccagcacaatgaagatcaagatcattgctcctcctgagcgcaagtactccgtgtggatcggcggctccatcctggcctcgctgtccaccttatcaagcacgcagcaatgcagctcaaaacgcttagcctagccacacccccacgggaaacagcagtgattagcctttagcaataaacgaaagtttaactaagctatactaaccccagggttggtcaatttcgtgccagccaccgcggtcacacgattaacccaagtcaatagaagccggcgtaaagagtgttttagatcaccccctccccaataaagctaaaactcacctgagttgtaaaaaactccagttgacacaaaatagactacgaaagtggctttaacatatctgaacacacaatagctaagacccaaactgggattagataccccactatgctcagccctaaacctcaacagttaaatcaacaaaactgctcgccagaacacggccctgaagcgcgtacacaccgcccgtcactctcctcaagtatacttcaaaggacatttaactaaaacccctacgcatttatatagaggaggcaagtcgtaacatggtaagtgtactggaaagtgcacttggacgaaccagagtgtagcttaacacaaagcacccaacttacactt
2.检测方法:
1)基因组DNA提取:
全血:取200μl EDTA抗凝血至1.5ml新的无菌EP管中,加入600μl双蒸水,振荡混匀,室温放置10min;期间混匀2-3次,12000rpm离心5min,弃上清;加入200μl DNA提取液(使用前充分混匀,使颗粒悬浮),100℃水浴8min;12000rpm离心5min,取上清用于检测。
干血斑:取直径约为3mm血片于1.5ml新的无菌EP管中,加入500μl双蒸水,漩涡振荡,室温放置5min;12000rpm离心1min,弃上清;加入200μlDNA提取液(使用前充分混匀,使颗粒悬浮),100℃水浴8min,取出振荡15-30s;12000rpm离心5min,取上清用于检测。
2)加样、PCR扩增:
分装45μl PCR反应液于PCR反应管内,分装管数=n+2(注:n为待测样本数,2为用于阴性质控、阳性质控的管数);分别加入5μl待测DNA模板、阴性/阳性质控,混匀后置于荧光定量PCR仪上进行PCR扩增反应;反应程序为50℃2min;95℃3min;95℃15s,60℃45s,40个循环,每个循环在60℃采集荧光。
3)结果分析:
根据扩增曲线的信号情况定性判断是否存在突变。首先阴性质控、阳性质控的检测结果应与预期相符,即阴性质控仅有FAM曲线扩增,无其它荧光曲线扩增,如图1所示,阳性质控FAM、VIC、ROX、Cy5、TAMRA曲线均有扩增,如图2所示。只有阴性质控、阳性质控扩增曲线结果与预期相符后,才可对样本孔进行分析。
若样品孔采集到FAM信号,如图3所示,表明内参基因扩增正常,样本DNA是有效的;
若样品孔未采集到FAM信号,表明内参基因扩增失败,样本DNA无效或仪器存在问题,本次检测结果无效;
若样品孔有FAM、VIC信号,无ROX、Cy5、TAMRA信号,如图4所示,表明样本为1555突变;
若样品孔有FAM、ROX信号,无VIC、Cy5、TAMRA信号,如图5所示,表明样本为1494突变;
若样品孔有FAM、Cy5信号,无VIC、ROX、TAMRA信号,表明样本为1095突变;
若样品孔有FAM、TAMRA信号,无VIC、ROX、Cy5信号,表明样本为827突变。
试验证明,本发明的试剂盒的检测准确率为100%,假阳性率为0,假阴性率为0,结果准确可靠。本发明试剂盒的检测时间约1小时,与现有的检测试剂盒相比,简单快速;而且,本试剂盒检测所需仪器价格相对较低且较普遍,故检测成本相对较低。
Claims (10)
1.一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,以mtDNA 12S rRNA基因的1555A>G、1494C>T、1095T>C、827A>G突变为检测对象,设计特异性引物和探针,所述特异性引物包括用于扩增1555A>G、1494C>T的引物1,其序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示;用于扩增1095T>C、827A>G的引物2,其序列如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示;所述探针为特异性检测mtDNA 12S rRNA基因的1555、1494、1095、827位点是否含有突变,其探针序列分别如序列表中SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8所示。
2.如权利要求1所述的一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,所述探针还分别连接有荧光发光基团和荧光淬灭基团,其中,用于检测1555、1494、1095、827位点的探针的荧光发光基团分别为VIC、ROX、Cy5、TAMRA;各探针的荧光淬灭基团均为BHQ-1。
3.如权利要求1所述的一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,还包括用于监测扩增模板的有效性的1对β-Actin内参引物和1条内参探针,其序列分别如序列表中SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示。
4.如权利要求3所述的一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,所述内参探针为荧光标记的探针,其荧光发光基团为FAM,荧光淬灭基团为BHQ-1。
5.如权利要求1所述的一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,还包括有阴性质控、阳性质控;
所述阴性质控为连入T载体的内参基因、正常mtDNA 12S rRNA基因部分序列,其序列如序列表中SEQ ID NO:12所示;阳性质控为连入T载体的内参基因、含1555、1494、1095、827突变位点部分序列,其序列如序列表中SEQ ID NO:13所示。
6.一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,其具体组成为:DNA提取液、PCR反应液、阴性质控和阳性质控;其中,每50μl PCR反应液的组成为:10×PCR缓冲液5.0μl、MgCl22.0~5.0mM、dNTPs 0.5~1.5mM、引物0.2~2.0μM、探针0.1~1.0μM、Taq酶2.0~4.0U、UNG酶0.5~1.0U,加水至50μl。
7.如权利要求6所述的一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,所述引物为引物1、引物2和内参引物,其序列分别如序列表中SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10所示。
8.如权利要求6所述的一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,所述探针为4条检测是否含有突变的探针和1条内参探针,其序列分别如序列表中SEQ IDNO:5至SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:11所示。
9.如权利要求6所述的一种药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,所述阴性质控为连入T载体的内参基因、正常mtDNA 12S rRNA基因部分序列,其序列如序列表中SEQ ID NO:12所示;阳性质控为连入T载体的内参基因、含1555、1494、1095、827突变位点部分序列,其序列如序列表中SEQ ID NO:13所示。
10.权利要求1-9任一项所述的药物性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒的检测方法,其特征在于,步骤如下:将待检测样品的DNA提取液、PCR反应液、阴性质控和阳性质控加入到PCR反应管内,混匀后置于荧光定量PCR仪上进行PCR扩增反应,PCR反应条件如下:50℃2min;95℃3min;95℃15s,60℃45s,40个循环,每个循环在60℃采集荧光;根据扩增曲线的信号情况定性判断是否存在突变。
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