CN107541559A - 一种用于纯合黑羽鸡培育的引物组及纯合黑羽鸡培育方法 - Google Patents
一种用于纯合黑羽鸡培育的引物组及纯合黑羽鸡培育方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于纯合黑羽鸡培育的引物组和利用所述引物组的纯合黑羽鸡培育方法，所述引物组包含第一引物组、第二引物组和第三引物组，其中，第一引物组用于检测MC1R基因是否发生突变，第二引物组和第三引物组用于检测TYR基因是否被插入逆转录病毒导致出现隐性白羽基因。所述培育方法使用所述第一引物组、第二引物组和第三引物组，同时对MC1R基因和TYR基因进行检测，筛选出基因型为EE(对应MC1R基因)和CC(对应TYR基因)的黑羽鸡，为纯合子，剔除了隐性白羽基因，与其他品系配套时既可以保证子代不会出现白羽个体，又可以保证黑羽表型的均一性，在保证育种企业产品一致性的基础上，很好的保护育种企业的育种素材。
Description
技术领域
本发明属于家禽育种技术领域，具体涉及一种用于纯合黑羽鸡培育的引物组及纯合黑羽鸡培育方法。
背景技术
我国家禽遗传资源众多，2011版《中国畜禽遗传资源志—家禽志》中共收录189个，其中鸡107个。莱芜黑鸡主要分布在山东省莱芜地区，现经过人工选育和自然选择已成为有明显特色的地方品种，莱芜黑鸡全身被毛黑色，着生紧密，具有金属光泽，单冠红色，头颈挺举，尾羽高耸，背部似“U”字形，具有黑毛、黑腿、黑脚、黑嘴、黑眼、红冠、白耳，五黑一白一红的特点；善攀爬，易飞翔，体格健壮，抗病能力强，食性杂，体型小，生长缓慢，肌肉发达，肉质鲜美，酮体洁白美观，骨细中空，皮薄肉厚，滑嫩爽口；据山东农业大学报道，莱芜黑鸡每克肌肉中亚油酸含量48.92mg，亚麻酸含量17.91mg，红肌纤维含量23.55mg，公鸡温补阳气，母鸡适益阴血，具有很高的营养价值和经济价值。
市场需求推动了优质鸡育种的发展，一个好的育种素材对育种来说至关重要，由国外引进的鸡种多为显性白羽型，与中国地方土鸡杂交后代多为白羽型，中国消费者不喜欢白羽鸡。有关鸡羽色遗传相对复杂，进行羽色纯化需要一个较长的过程，显性白羽作为育种素材对于中国地方优质土鸡种的育种显然不利。隐性白羽相对于中国地方鸡种的有色羽为隐性，同中国地方鸡杂交后代羽色与中国地方鸡羽色一样，但是由于隐性白羽基因的存在，进一步杂交后的后代可能会出现白羽个体。又因为隐性白羽无法直接体现在表现型上，无法通过表现型进行人工筛除，给鸡种的选育工作带来极大的不便。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于纯合黑羽鸡培育的引物组及纯合黑羽鸡培育方法，所述引物组包含第一引物组、第二引物组和第三引物组，其中，第一引物组用于检测MC1R基因是否发生突变，第二引物组和第三引物组用于检测TYR基因是否被插入逆转录病毒导致出现隐性白羽基因。使用所述第一引物组、第二引物组和第三引物组，同时对MC1R基因和TYR 基因进行检测，筛选出基因型为EE(对应MC1R基因)和CC(对应TYR基因) 的黑羽鸡，为纯合子，剔除了隐性白羽基因，与其他品系配套时既可以保证子代不会出现白羽个体，又可以保证黑羽表型的均一性，在保证育种企业产品一致性的基础上，很好的保护育种企业的育种素材。
本发明的目的是提供一种用于纯合黑羽鸡培育的引物组。
本发明的再一目的是提供一种利用所述引物组的纯合黑羽鸡培育方法。
本发明中，使用到的基因包括MC1R基因和TYR基因，其中：
黑素皮质素受体1(melanocortin 1-receptor，MC1R)基因在控制黑色素形成过程中起重要作用，其位于Extension black位点，MC1R为G蛋白耦合的受体黑素皮质素受体家族之一，是其家族成员中最小的一个受体，编码蛋白主要作用于黑色素细胞，与a-MSH(alpha melnocyte stimulating hormone receptor)结合提高环腺苷酸水平，形成真黑色素。鸡不同的MC1R基因型对应不同的羽色。
鸡的羽色表现为从白色到纯黑等各种颜色，其遗传基础较为复杂。鸡的白羽分为显性白羽和隐性白羽，而其中隐性白羽又有多种，酪氨酸酶(TYR)基因控制的隐性白羽是其中重要的一种。TYR基因位于常染色体上，正常的TYR基因控制的性状是有色羽，当TYR基因中插入了一个逆转录病毒时导致出现隐性白羽。
根据本发明的用于纯合黑羽鸡培育的引物组，所述引物组包含第一引物组、第二引物组和第三引物组，其中：
如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述第一引物组的正向引物为5’ -GCCGCCATCCTCAAGAAC-3’，反向引物为5’-GAGAGGGAGGACACGATGGA-3’；
如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，所述第二引物组的正向引物为5’ -GTTGCCTCTGGCTCTATT-3’，反向引物为5’-TTTCTGTGAGTAAGGGTTG’ -3；
如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示，所述第三引物组的正向引物为5’ -TTGTTGGAGGCTGGGTAT-3’反向引物为5’-ATGGGCTTGCTTGAGGTA-3’。
其中，所述第一引物组用于扩增MC1R基因中273位点的片段，经本申请的发明人研究发现，MC1R基因的第273位可能存在突变(如图1所示)，从“G”突变为“A”，从而将基因型从“e”变为“E”。如图2和图3所示，图 2和图3箭头所示的位点为同一位点，能够明显看出在图3的标记处有波峰的交叠，说明此处的位点存在多种碱基，此处有基因突变，基因型为“Ee”，而图2中的标记处，未出现波峰的交叠，说明此处的位点只存在一种碱基，此处没有突变，基因型为“EE”。故设计第一引物组从MC1R基因中将含有此位点的片段扩增出来进行测序，从而得到MC1R基因的突变情况。
需要说明的是，测序是测的MC1R基因的序列，进而对比MC1R基因的第 273位点的碱基，而不是扩增产物的第273位点碱基类型(扩增产物的长度为 217bp)。
所述第二引物组和第三引物组用于检测TYR基因是否插入有逆转录病毒导致出现隐性白羽基因，所述第二引物组的正向引物根据插入鸡TYR基因的逆转录病毒核昔酸序列设计，反向引物根据鸡TYR基因的外显子5核普酸序列设计；所述第三引物组的正向引物根据TYR基因内含子4的核普酸序列设计，反向引物根据TYR基因的外显子5的核昔酸序列设计。扩增后，如图4所示，当只有第三引物组的扩增产物时，说明不含有逆转录病毒序列，不含有隐性白羽基因，基因型为“CC”；当所述第二引物组和第三引物组的扩增产物均有时，说明含有逆转录病毒序列，为杂合子，基因型为“Cc”。
根据本发明利用所述引物组的纯合黑羽鸡培育方法，所述培育方法包括以下步骤：
A、提取待鉴定鸡的基因组DNA，分别使用所述第一引物组、第二引物组和第三引物组进行扩增，得到扩增产物；
B、根据步骤A得到的扩增产物，鉴别待鉴定鸡的基因型，筛选得到纯合黑羽鸡。
使用上述引物组和鉴别方法，能够同时对MC1R基因和TYR基因进行检测，筛选出基因型为EE(对应MC1R基因)和CC(对应TYR基因)的黑羽鸡，为纯合子，剔除了隐性白羽基因，与其他品系配套时既可以保证子代不会出现白羽个体，又可以保证黑羽表型的均一性，在保证育种企业产品一致性的基础上，很好的保护育种企业的育种素材。
根据本发明所述的培育方法，其中，所述待鉴定鸡为莱芜黑鸡，且表现型为黑羽，胫、喙青黑色，皮肤白色。也就是说，使用黑羽鸡作为待鉴定鸡，首先排除了隐性白羽纯合子的可能，减小了筛选的难度和强度。
根据本发明所述的培育方法，其中，使用所述第一引物组扩增时，扩增体系为：总体积为20μL，包括Tris-HCL33.5mM、(NH4)2SO4 8.0mM、MgCl2 1.5 mM、TWEEN-20 0.05％、dNTPs 0.2mM、正向引物和反向引物各3.3ng/μl、Taq DNA聚合酶2.0单位和模版DNA 50ng；扩增程序为：在94℃温度下预变性 2min；然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性45s，在62℃下退火45s，在72℃温度下延伸60s；完成30个循环之后，在72℃延伸8min，即完成PCR扩增程序并在4℃下保存。
根据本发明所述的培育方法，其中，使用所述第二引物组扩增时，扩增体系为：总体积为20μL，包括Tris-HCL33.5mM、MgCl2 25mM、dNTPs 0.2mM、正向引物和反向引物各5ng/μl、Taq DNA聚合酶2.5单位和模版DNA 50ng；扩增程序为：在94℃温度下预变性5min；然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性45s，在52℃下退火45s，在72℃温度下延伸30s；完成30个循环之后，在72℃延伸5min，即完成PCR扩增程序并在4℃下保存。
根据本发明所述的培育方法，其中，使用所述第三引物组扩增时，扩增体系为：总体积为20μL，包括Tris-HCL33.5mM、MgCl2 25mM、dNTPs 0.2mM、正向引物和反向引物各5ng/μl、Taq DNA聚合酶2.5单位和模版DNA 50ng；扩增程序为：在94℃温度下预变性5min；然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性45s，在52℃下退火45s，在72℃温度下延伸30s；完成30个循环之后，在72℃延伸5min，即完成PCR扩增程序并在4℃下保存。
上述PCR扩增体系和扩增程序，能都保证PCR快速、正常的进行。
根据本发明所述的培育方法，其中，步骤B中，鉴别的方法为：对使用所述第一引物组得到的扩增产物进行测序，检测MC1R基因第273位点的碱基类型，当碱基为“G”时，说明未发生突变，记作“e”，当碱基为“A”时，说明发生突变，记作“E”；使用电泳检测所述第二引物组和第三引物组的扩增产物，根据电泳图谱中出现条带数及大小判定结果。
根据本发明所述的培育方法，其中，所述电泳检测为琼脂糖凝胶电泳检测。
根据本发明所述的培育方法，其中，步骤A中，使用苯酚—氯仿抽提法或 CTAB法提取待鉴定鸡的基因组DNA。
根据本发明所述的培育方法，其中，步骤B中，筛选得到纯合黑羽鸡后，建立纯合黑羽鸡基础群。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种用于纯合黑羽鸡培育的引物组和利用所述引物组的纯合黑羽鸡培育方法，所述引物组包含第一引物组、第二引物组和第三引物组，其中，第一引物组用于检测MC1R基因是否发生突变，第二引物组和第三引物组用于检测TYR基因是否被插入逆转录病毒导致出现隐性白羽基因。所述培育方法使用所述第一引物组、第二引物组和第三引物组，同时对MC1R基因和TYR 基因进行检测，筛选出基因型为EE(对应MC1R基因)和CC(对应TYR基因) 的黑羽鸡，为纯合子，剔除了隐性白羽基因，与其他品系配套时既可以保证子代不会出现白羽个体，又可以保证黑羽表型的均一性，在保证育种企业产品一致性的基础上，很好的保护育种企业的育种素材。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是MC1R基因检测位点序列比对图；
图2是MC1R基因EE型图谱；
图3是MC1R基因Ee型图谱；
图4是第二引物对和第三引物对的扩增结果图。
图4中，仅检出764bp条带的个体为CC型，同时检出764bp和292bp条带的个体为Cc型。最右边泳道为DNAMarker。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
一种用于纯合黑羽鸡培育的引物组，所述引物组包含第一引物组、第二引物组和第三引物组，其中：
所述第一引物组的正向引物为5’-GCCGCCATCCTCAAGAAC-3’，反向引物为5’-GAGAGGGAGGACACGATGGA-3’；
所述第二引物组的正向引物为5’-GTTGCCTCTGGCTCTATT-3’，反向引物为5’-TTTCTGTGAGTAAGGGTTG’-3；
所述第三引物组的正向引物为5’-TTGTTGGAGGCTGGGTAT-3’反向引物为5’-ATGGGCTTGCTTGAGGTA-3’。
实施例2
一种利用实施例1所述引物组的纯合黑羽鸡培育方法，包括以下步骤：
A、挑选现有莱芜黑鸡中表型为黑羽，胫、喙青黑色，皮肤白色个体，确定为待鉴定鸡。
B、使用苯酚—氯仿抽提法提取待鉴定鸡的基因组DNA，分别使用所述第一引物组、第二引物组和第三引物组进行扩增，得到扩增产物；本实例的引物设计如表1所示；
表1.引物组序列表
使用所述第一引物组扩增时，扩增体系为：总体积为20μL，包括 Tris-HCL33.5mM、(NH4)2SO4 8.0mM、MgCl2 1.5mM、TWEEN-20 0.05％、dNTPs 0.2mM、正向引物和反向引物各3.3ng/μl、Taq DNA聚合酶2.0单位和模版 DNA 50ng；扩增程序为：在94℃温度下预变性2min；然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性45s，在62℃下退火45s，在72℃温度下延伸60s；完成30个循环之后，在72℃延伸8min，即完成PCR 扩增程序并在4℃下保存。
使用所述第二引物组扩增时，扩增体系为：总体积为20μL，包括 Tris-HCL33.5mM、MgCl2 25mM、dNTPs 0.2mM、正向引物和反向引物各5 ng/μl、Taq DNA聚合酶2.5单位和模版DNA 50ng；扩增程序为：在94℃温度下预变性5min；然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性45s，在52℃下退火45s，在72℃温度下延伸30s；完成30个循环之后，在72℃延伸5min，即完成PCR扩增程序并在4℃下保存。
使用所述第三引物组扩增时，扩增体系为：总体积为20μL，包括 Tris-HCL33.5mM、MgCl2 25mM、dNTPs 0.2mM、正向引物和反向引物各5 ng/μl、Taq DNA聚合酶2.5单位和模版DNA 50ng；扩增程序为：在94℃温度下预变性5min；然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性45s，在52℃下退火45s，在72℃温度下延伸30s；完成30个循环之后，在72℃延伸5min，即完成PCR扩增程序并在4℃下保存。
C、根据步骤A得到的扩增产物，鉴别待鉴定鸡的基因型，筛选得到纯合黑羽鸡；具体筛选方式如下：
对使用所述第一引物组得到的扩增产物进行测序，检测MC1R基因第273 位点的碱基类型，当碱基为“G”时，说明未发生突变，记作“e”，当碱基为“A”时，说明发生突变，记作“E”；使用琼脂糖凝胶电泳检测所述第二引物组和第三引物组的扩增产物(当然，也可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测)，扩增后，当只有第三引物组的扩增产物时，说明不含有逆转录病毒序列，不含有隐性白羽基因，基因型为“CC”；当所述第二引物组和第三引物组的扩增产物均有时，说明含有逆转录病毒序列，为杂合子，基因型为“Cc”。
D、筛选得到纯合黑羽鸡后，建立纯合黑羽鸡基础群。
使用上述引物组和鉴别方法，能够同时对MC1R基因和TYR基因进行检测，筛选出基因型为EE(对应MC1R基因)和CC(对应TYR基因)的黑羽鸡，为纯合子，剔除了隐性白羽基因，与其他品系配套时既可以保证子代不会出现白羽个体，又可以保证黑羽表型的均一性，在保证育种企业产品一致性的基础上，很好的保护育种企业的育种素材。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东纪华家禽育种有限公司
<120> 一种用于纯合黑羽鸡培育的引物组及纯合黑羽鸡培育方法
<130> 2010
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gccgccatcc tcaagaac 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gagagggagg acacgatgga 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gttgcctctg gctctatt 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tttctgtgag taagggttg 19
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttgttggagg ctgggtat 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgggcttgc ttgaggta 18
Claims (10)
1.一种用于纯合黑羽鸡培育的引物组，其特征在于，所述引物组包含第一引物组、第二引物组和第三引物组，其中：
所述第一引物组的正向引物为5’-GCCGCCATCCTCAAGAAC-3’，反向引物为5’-GAGAGGGAGGACACGATGGA-3’；
所述第二引物组的正向引物为5’-GTTGCCTCTGGCTCTATT-3’，反向引物为5’-TTTCTGTGAGTAAGGGTTG’-3；
所述第三引物组的正向引物为5’-TTGTTGGAGGCTGGGTAT-3’反向引物为5’-ATGGGCTTGCTTGAGGTA-3’。
2.一种利用权利要求1所述引物组的纯合黑羽鸡培育方法，其特征在于，所述培育方法包括以下步骤：
A、提取待鉴定鸡的基因组DNA，分别使用所述第一引物组、第二引物组和第三引物组进行扩增，得到扩增产物；
B、根据步骤A得到的扩增产物，鉴别待鉴定鸡的基因型，筛选得到纯合黑羽鸡。
3.根据权利要求2所述的培育方法，其特征在于，所述待鉴定鸡为莱芜黑鸡，且表现型为黑羽，胫、喙青黑色，皮肤白色。
4.根据权利要求2所述的培育方法，其特征在于，使用所述第一引物组扩增时，扩增体系为：总体积为20μL，包括Tris-HCL33.5mM、(NH4)2SO4 8.0mM、MgCl2 1.5mM、TWEEN-200.05％、dNTPs 0.2mM、正向引物和反向引物各3.3ng/μl、Taq DNA聚合酶2.0单位和模版DNA50ng；扩增程序为：在94℃温度下预变性2min；然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性45s，在62℃下退火45s，在72℃温度下延伸60s；完成30个循环之后，在72℃延伸8min，即完成PCR扩增程序并在4℃下保存。
5.根据权利要求2所述的培育方法，其特征在于，使用所述第二引物组扩增时，扩增体系为：总体积为20μL，包括Tris-HCL33.5mM、MgCl2 25mM、dNTPs 0.2mM、正向引物和反向引物各5ng/μl、Taq DNA聚合酶2.5单位和模版DNA 50ng；扩增程序为：在94℃温度下预变性5min；然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性45s，在52℃下退火45s，在72℃温度下延伸30s；完成30个循环之后，在72℃延伸5min，即完成PCR扩增程序并在4℃下保存。
6.根据权利要求2所述的培育方法，其特征在于，使用所述第三引物组扩增时，扩增体系为：总体积为20μL，包括Tris-HCL33.5mM、MgCl2 25mM、dNTPs 0.2mM、正向引物和反向引物各5ng/μl、Taq DNA聚合酶2.5单位和模版DNA 50ng；扩增程序为：在94℃温度下预变性5min；然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性45s，在52℃下退火45s，在72℃温度下延伸30s；完成30个循环之后，在72℃延伸5min，即完成PCR扩增程序并在4℃下保存。
7.根据权利要求2所述的培育方法，其特征在于，步骤B中，鉴别的方法为：对使用所述第一引物组得到的扩增产物进行测序，检测MC1R基因第273位点的碱基类型，当碱基为“G”时，说明未发生突变，当碱基为“A”时，说明发生突变；使用电泳检测所述第二引物组和第三引物组的扩增产物，根据电泳图谱中出现条带数及大小判定结果。
8.根据权利要求7所述的培育方法，其特征在于，所述电泳检测为琼脂糖凝胶电泳检测。
9.根据权利要求2所述的培育方法，其特征在于，步骤A中，使用苯酚—氯仿抽提法或CTAB法提取待鉴定鸡的基因组DNA。
10.根据权利要求2所述的培育方法，其特征在于，步骤B中，筛选得到纯合黑羽鸡后，建立纯合黑羽鸡基础群。
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