CN107580629A - 芸苔属事件lbflfk和lbfdau及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供转基因芸苔属事件LBFLFK和LBFDAU及其后代，和包含这些事件的诊断性DNA的细胞、种子和植物。本发明也提供人工寡核苷酸引物和探针，其可以用于在样品中诊断LBFLFK事件和LBFDAU事件及其后代；并提供在样品中检测LBFLFK事件和LBFDAU事件及其后代的存在的方法。本发明还提供衍生自LBFLFK事件和LBFDAU事件的油和商业产品。

Description

芸苔属事件LBFLFK和LBFDAU及其检测方法
本申请要求2014年11月14日提交的美国临时专利申请序列号62/079,622和2015年9月29日提交的美国临时专利申请序列号62/234373的优先权，所述文献的完整公开内容通过引用方式并入本文。
作为本公开的组成部分，序列表作为文本文件与本说明书同时提交。序列表的主题通过引用的方式完整并入本文。
技术领域
本发明涉及生物技术和农业领域，并且更具体地，涉及包含事件LBFLFK或事件LBFDAU的转基因芸苔属植物、其后代植物、种子和从中衍生的油和粕(meal)。本发明还涉及用于检测生物样品中存在事件LBFLFK或事件LBFDAU的方法，所述方法利用每个事件独有的核苷酸序列。
发明背景
近年来已经日益确立了极长链多不饱和脂肪酸(“VLC-PUFA”或“PUFA”)对人类和动物营养的健康益处。特别地，ω3PUFA二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)在神经发育、免疫应答和炎症反应中发挥作用。此外，含有EPA和DHA的膳食补充剂用来减轻心血管和神经学病变，并且可以用于治疗一些癌症。
EPA和DHA的当前商业来源是鱼油。但是，海洋储备正在削减，并且需要EPA和DHA的备选来源以满足日益增长的需求。已经做出许多努力以开发产生VLC-PUFA(包括EPA和DHA)的转基因油籽植物。参见，例如，WO 2004/071467、WO 2013/185184、WO 2015/089587，Ruiz-Lopez等人,(2014)Plant J.77,198-208。但是，以商业意义的水平产生EPA和DHA的转基因油籽植物尚未商业化。
已经在WO2001/059128、WO2004/087902和WO2005/012316中描述了编码显示出Δ-6-延伸酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件描述来自展叶剑叶藓(Physcomitrellapatens)的这种酶。
已经在WO2002026946和WO2003/093482中描述了编码显示出Δ-5-去饱和酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件描述来自破囊壶菌属物种(Thraustochytrium sp.)的这种酶。
已经在WO2005/012316、WO2005/083093、WO2006/008099和WO2006/069710中描述了编码显示出Δ-6-去饱和酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件描述来自托瑞蚝球藻(Ostreococcus tauri)的这种酶。
已经在WO2005/012316、WO2005/007845和WO2006/069710中描述了编码显示出Δ-6-延伸酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件描述来自假微型海链藻(Thalassiosirapseudonana)的这种酶。
已经例如在WO2006100241中描述了编码显示出Δ-12-去饱和酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件描述来自大豆疫霉(Phytophthora sojae)的这种酶。
已经在WO2005/012316和WO2007/096387中描述了编码显示出Δ-5-延伸酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件描述来自托瑞蚝球藻的这种酶。
已经例如在WO2008/022963中描述了编码显示出ω3-去饱和酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件描述来自畸雌腐霉(Phytium irregulare)的这种酶。
已经例如在WO2005012316和WO2005083053中描述了编码显示出ω3-去饱和酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件描述来自致病疫霉(Phytophthora infestans)的这种酶。
已经例如在WO2002026946中描述了编码显示出Δ-4-去饱和酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件描述来自破囊壶菌属物种(Thraustochytrium sp.)的这种酶。
WO2003078639和WO2005007845中描述了编码来自路氏巴夫藻(Pavlova lutheri)的Δ-4去饱和酶的多核苷酸。
已知外来基因构建体在植物中的表达受插入基因的染色体位置影响，并且转基因构建体在植物基因组中不同位置处的存在可能影响内源基因表达和植物的表型。由于这些原因，需要筛选大量从特定构建体产生的转基因事件，旨在鉴定一个或多个供商业化的“原种”事件(elite events)，所述的原种事件显示出最佳的转基因表达，而无不利特征。原种事件具有所需水平和样式的转基因表达，并且可以用于将转基因构建体通过常规育种方法经有性远交而渐渗至有商业意义的遗传背景中。这类杂交的后代维持原始原种事件的转基因构建体表达特征。使用这种策略可以在适应于本地生长条件的大量品种中确保可靠的基因表达。
为了渐渗(introgression)、解除管制和质量控制目的，必需能够检测原种事件中转基因构建体的存在，在有性杂交的后代中和在其他植物中均如此。此外，也可以监测谷物、粕和食品中转基因构建体的偶然存在以确保符合监管要求。
可以使用已知的核酸检测方法如聚合酶链反应(PCR)或使用核酸探针的DNA杂交，检测转基因构建体的存在。这些检测方法可指向频繁使用的遗传元件，如启动子、终止子、标记基因等。这些方法可能无法用于区分含有相同遗传元件的不同事件，除非还已知与插入的构建体毗邻的染色体DNA(“侧翼DNA”)的序列。对于众多的已经商业化的基因修饰产品，事件特异性测定试验是已知的。负责批准包含特定原种事件的转基因植物使用的监管机构也要求事件特异性检测试验。转基因植物事件-特异性测定试验在例如美国专利号6,893,826；6,825,400；6,740,488；6,733,974；6,689,880；6,900,014；6,818,807；和8,999,411中已有描述。
发明概述
在一个实施方案中，本发明提供包含转基因芸苔属事件LBFLFK的芸苔属植物，所述事件LBFLFK以ATCC名称“PTA-121703”保藏。芸苔属事件LBFLFK含有双元T-质粒VC-LTM593-1qcz rc的两个插入，所述插入命名为LBFLFK基因座1和LBFLFK基因座2。此实施方案的芸苔属植物包括与芸苔属事件LBFLFK不可区分的后代(所述不可区分的限度为后代还可以含有至少一个与LBKLFK基因座1或LBFLFK基因座2相对应的等位基因)。此实施方案的芸苔属植物包含独特于每个LBFLFK插入的基因组DNA/转基因接头点和因此独特的接头区域：对于LBFLFK基因座1，接头区域具有至少SEQ ID NO:4的多核苷酸序列或至少SEQ IDNO:5的多核苷酸序列；对于LBFLFK基因座2，接头区域具有至少SEQ ID NO:13的多核苷酸序列或至少SEQ ID NO:14的多核苷酸序列。在此实施方案中还包括从芸苔属事件LBFLFK及其后代衍生的种子、植物部分、植物细胞和植物产品。
在另一个实施方案中，提供针对每个LBFLFK插入检测芸苔属事件LBFLFK基因组DNA/转基因接头区域存在的组合物和方法：对于LBFLFK基因座1，接头区域具有至少SEQ IDNO:4的多核苷酸序列或至少SEQ ID NO:5的多核苷酸序列；对于LBFLFK基因座2，接头区域具有至少SEQ ID NO:13的多核苷酸序列或至少SEQ ID NO:14的多核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供从芸苔属事件LBFLFK和/或其后代产生的商业产品，包括卡诺拉油(canola oil)和粕(meal)。
在另一个实施方案中，本发明提供包含转基因芸苔属事件LBFDAU的芸苔属植物，所述事件LBFDAU以ATCC名称“PTA-122340”保藏。芸苔属事件LBFDAU含有双元T-质粒VC-LTM593-1qcz rc的两个插入，所述插入命名为LBFDAU基因座1和LBFDAU基因座2。此实施方案的芸苔属植物包括与芸苔属事件LBFDAU不可区分的后代(所述不可区分的限度为后代还可以含有至少一个与插入的转基因DNA相对应的等位基因)。此实施方案的芸苔属植物包含独特于每个插入的基因组DNA/转基因接头点和因此两个独特的接头区域：对于LBFDAU基因座1，接头区域具有至少SEQ ID NO:22的多核苷酸序列或至少SEQ ID NO:23的多核苷酸序列；对于LBFDAU基因座2，接头区域具有至少SEQ ID NO:31的多核苷酸序列或至少SEQ IDNO:32的多核苷酸序列。此实施方案也包括从芸苔属事件LBFDAU及其后代衍生的种子、植物部分、植物细胞和植物产品。
在另一个实施方案中，提供用于检测芸苔属事件LBFDAU基因组DNA/转基因接头区域存在的组合物和方法；LBFDAU基因座1的接头区域具有至少SEQ ID NO:22的多核苷酸序列或至少SEQ ID NO:23的多核苷酸序列，并且LBFDAU基因座2的接头区域具有至少SEQ IDNO:31的多核苷酸序列或至少SEQ ID NO:32的多核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供从芸苔属事件LBFDAU和/或其后代产生的商业产品，包括卡诺拉油和粕。
附图简述
图1是双元转化载体VC-LTM593-1qcz rc图谱，所述载体用来产生包含事件LBFLFK的芸苔属植物和包含事件LBFDAU的芸苔属植物。
图2显示在包含芸苔属事件LBFLFK的植物的基因组中T-DNA基因座1的组织架构。SEQ ID NO:4对应于基因座1T-DNA插入物SEQ ID NO:3和右边界侧翼序列SEQ ID NO:6的接头区域。SEQ ID NO:5对应于基因座1T-DNA插入物SEQ ID NO:3和左边界侧翼序列SEQ IDNO:7之间的接头区域。
图3显示在包含芸苔属事件LBFLFK的植物的基因组中T-DNA基因座2的组织架构。SEQ ID NO:13对应于基因座2T-DNA插入物SEQ ID NO:12和右边界侧翼序列SEQ ID NO:15的接头区域。SEQ ID NO:14对应于基因座2T-DNA插入物SEQ ID NO:12和左边界侧翼序列SEQ ID NO:16的接头区域。
图4显示在包含芸苔属事件LBFDAU的植物的基因组中T-DNA基因座1的组织架构。SEQ ID NO:22对应于基因座1T-DNA插入物SEQ ID NO:21和右边界侧翼序列SEQ ID NO:24的接头区域。SEQ ID NO:23对应于基因座1T-DNA插入物SEQ ID NO:21和左边界侧翼序列SEQ ID NO:25的接头区域。
图5显示在包含芸苔属事件LBFDAU的植物的基因组中T-DNA基因座2的组织架构。SEQ ID NO:31对应于基因座2T-DNA插入物SEQ ID NO:30和右边界侧翼序列SEQ ID NO:33的接头区域。SEQ ID NO:32对应于基因座2T-DNA插入物SEQ ID NO:30和左边界侧翼序列SEQ ID NO:34的接头区域。
图6显示在田间和在温室从事件LBFLFK产生的整批(bulked)种子批的EPA和DHA含量。
图7显示在田间和在温室从事件LBFDAU产生的整批种子批的EPA和DHA含量。
图8显示在事件LBFDAU的95粒T2单粒种子中EPA+DHA合并含量的分布。
序列简述
SEQ ID NO:1是用于转化的载体VC-LTM593-1qcz rc的序列(参见图1)
SEQ ID NO:2是从LBFLFK T-DNA基因座1的插入序列(SEQ ID NO:3)和SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7代表的侧翼序列装配的44910bp序列(参见图2)。
SEQ ID NO:3是事件LBFLFK基因座1中的T-DNA插入的序列，包含左边界序列和右边界序列(参见图2)。
SEQ ID NO:4是LBFLFK基因座1RB接头区域序列，包含10bp侧翼基因组DNA和SEQID NO:3的bp 1-10(参见图2)。
SEQ ID NO:5是LBFLFK基因座1LB接头区域序列，包含SEQ ID NO:3的bp 43748-43757和10bp侧翼基因组DNA(参见图2)。
SEQ ID NO:6是LBFLFK基因座1中直至并包括T-DNA右边界的侧翼序列。核苷酸1-570是基因组DNA(参见图2)。
SEQ ID NO:7是LBFLFK基因座1中直至并包括T-DNA左边界的侧翼序列。核苷酸229-811是基因组DNA(参见图2)。
SEQ ID NO:8是适于鉴定LBFLFK事件基因座1的LBFLFK基因座1_正向引物。利用SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的组合的PCR扩增子对LBFLFK基因座1的存在为阳性。
SEQ ID NO:9是适于鉴定LBFLFK事件基因座1的LBFLFK基因座1_反向引物。利用SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的组合的PCR扩增子对LBFLFK基因座1的存在为阳性。
SEQ ID NO:10是LBFLFK基因座1_探针，该探针为FAMTM-标记的合成性寡核苷酸，在扩增反应中与SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9一起使用时，将在LBFLFK基因座1存在为阳性时释放荧光信号。
SEQ ID NO:11是从LBFLFK T-DNA基因座2的插入序列(SEQ ID NO:12)和SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:16代表的侧翼序列装配的47800bp序列(参见图3)。
SEQ ID NO:12是事件LBFLFK基因座2中的T-DNA插入的序列，包含左边界序列和右边界序列(参见图3)。
SEQ ID NO:13是LBFLFK基因座2RB接头序列，包含10bp侧翼基因组DNA和SEQ IDNO:12的bp 1-10(参见图3)。
SEQ ID NO:14是LBFLFK基因座2LB接头区域序列，包含SEQ ID NO:12的bp 43764-43773和10bp侧翼基因组DNA(参见图3)。
SEQ ID NO:15是LBFLFK基因座2中直至并包含T-DNA右边界的侧翼序列。核苷酸1-2468是基因组DNA(参见图3)。
SEQ ID NO:16是LBFLFK基因座2中直至并包含T-DNA左边界的侧翼序列。核苷酸242-1800是基因组DNA(参见图3)。
SEQ ID NO:17是适于鉴定LBFLFK事件基因座2的LBFLFK基因座2_正向引物。利用SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的组合的PCR扩增子对LBFLFK基因座2的存在为阳性。
SEQ ID NO:18是适于鉴定LBFLFK事件基因座2的LBFLFK基因座2_反向引物。利用SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的组合的PCR扩增子对LBFLFK基因座2的存在为阳性。
SEQ ID NO:19是LBFLFK基因座2_探针，该探针为FAMTM-标记的合成性寡核苷酸，在扩增反应中与SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18一起使用时，将在LBFLFK基因座2存在为阳性时释放荧光信号。
SEQ ID NO:20是从LBFDAU T-DNA基因座1的插入序列(SEQ ID NO:21)和SEQ IDNO:24和SEQ ID NO:25代表的侧翼序列装配的45777bp序列(参见图4)。
SEQ ID NO:21是事件LBFDAU基因座1中的T-DNA插入的序列，包含左边界序列和右边界序列(参见图4)。
SEQ ID NO:22是LBFDAU基因座1RB接头序列，包含10bp侧翼基因组DNA和SEQ IDNO:21的bp 1-10(参见图4)。
SEQ ID NO:23是LBFDAU基因座1LB接头区域序列，包含SEQ ID NO:21的bp 43711-43720和10bp侧翼基因组DNA(参见图4)。
SEQ ID NO:24是LBFDAU基因座1中直至并包含T-DNA右边界的侧翼序列。核苷酸1-1017是基因组DNA(参见图4)。
SEQ ID NO:25是LBFDAU基因座1中直至并包含T-DNA左边界的侧翼序列。核苷酸637-1677是基因组DNA(参见图4)。
SEQ ID NO:26是适于鉴定LBFDAU事件基因座1的LBFDAU基因座1_正向引物。利用SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的组合的PCR扩增子对LBFDAU基因座1的存在为阳性。
SEQ ID NO:27是适于鉴定LBFDAU事件基因座1的LBFDAU基因座1_反向引物。利用SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的组合的PCR扩增子对LBFDAU基因座1的存在为阳性。
SEQ ID NO:28是LBFDAU基因座1_探针，该探针为FAMTM-标记的合成性寡核苷酸，在扩增反应中与SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27一起使用时，将在LBFDAU基因座1存在为阳性时释放荧光信号。
SEQ ID NO:29是从LBFDAU T-DNA基因座2的插入序列(SEQ ID NO:30)和SEQ IDNO:33和SEQ ID NO:34代表的侧翼序列装配的39620bp序列(参见图5)。
SEQ ID NO:30是事件LBFDAU基因座2中的T-DNA插入的序列，包含左边界序列和右边界序列(参见图5)。
SEQ ID NO:31是LBFDAU基因座2RB接头序列，包含10bp侧翼基因组DNA和SEQ IDNO:30的bp 1-10(参见图5)。
SEQ ID NO:32是LBFDAU基因座2LB接头区域序列，包含SEQ ID NO:30的bp 37478-37487和10bp侧翼基因组DNA(参见图5)。
SEQ ID NO:33是LBFDAU基因座2中直至并包含T-DNA右边界的侧翼序列。核苷酸1-1099是基因组DNA(参见图5)。
SEQ ID NO:34是LBFLFK基因座2中直至并包含T-DNA左边界的侧翼序列。核苷酸288-1321是基因组DNA(参见图5)。
SEQ ID NO:35是适于鉴定LBFDAU事件基因座2的LBFDAU基因座2_正向引物。利用SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的组合的PCR扩增子对LBFDAU基因座2的存在为阳性。
SEQ ID NO:36是适于鉴定LBFDAU事件基因座2的LBFDAU基因座2_反向引物。利用SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的组合的PCR扩增子对LBFDAU基因座2的存在为阳性。
SEQ ID NO:37是LBFDAU基因座2_探针，该探针为FAMTM-标记的合成性寡核苷酸，在扩增反应中与SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36一起使用时，将在LBFDAU基因座2存在为阳性时释放荧光信号。
SEQ ID NO:38是适于确定LBFLFK基因座1的接合性(zygosity)的引物。与SEQ IDNO:39组合使用时，约542bp PCR扩增子的产生对于LBFLFK基因座1处WT的存在而言为阳性。
SEQ ID NO:39是适于确定LBFLFK基因座1的接合性的引物。与SEQ ID NO:38组合使用时，约542bp PCR扩增子的产生对于LBFLFK基因座1处WT的存在而言为阳性。
SEQ ID NO:40是适于确定LBFLFK基因座2的接合性的引物。与SEQ ID NO:41组合使用时，约712bp PCR扩增子的产生对于LBFLFK基因座2处WT的存在而言为阳性。
SEQ ID NO:41是适于确定LBFLFK基因座2的接合性的引物。与SEQ ID NO:40组合使用时，约712bp PCR扩增子的产生对于LBFLFK基因座2处WT的存在而言为阳性。
SEQ ID NO:42是适于确定LBFDAU基因座1的接合性的引物。与SEQ ID NO:43组合使用时，约592bp PCR扩增子的产生对LBFDAU基因座1处WT的存在而言为阳性。
SEQ ID NO:43是适于确定LBFDAU基因座1的接合性的引物。与SEQ ID NO:42组合使用时，约592bp PCR扩增子的产生对LBFDAU基因座1处WT的存在而言为阳性。
SEQ ID NO:44是适于确定LBFDAU基因座2的接合性的引物。与SEQ ID NO:45组合时使用，约247bp PCR扩增子的产生对LBFDAU基因座2处WT的存在而言为阳性。
SEQ ID NO:45是适于确定LBFDAU基因座2的接合性的引物。与SEQ ID NO:44组合使用时，约247bp PCR扩增子的产生对LBFDAU基因座2处WT的存在而言为阳性。
发明详述
本发明涉及转基因芸苔属事件LBFLFK和LBFDAU，其能够产生包含VLC-PUFA(包括EPA和DHA)的油用作商业产品。已经通过插入实施例1中描述的双元T-质粒VC-LTM593-1qczrc(SEQ ID NO:1)修饰本发明的芸苔属植物，所述的双元T-质粒按顺序包含编码以下VLC-PUFA生物合成途径酶的多核苷酸：来自展叶剑叶藓的Δ-6延伸酶；来自破囊壶菌属物种ATCC21685的Δ-5去饱和酶；来自托瑞蚝球藻的Δ-6去饱和酶；来自假微型海链藻的Δ-6延伸酶；来自大豆疫霉的Δ-12去饱和酶；来自畸雌腐霉的Ω-3去饱和酶；来自致病疫霉的Ω-3-去饱和酶；来自破囊壶菌属物种ATCC21685的Δ-5去饱和酶；来自破囊壶菌属物种的Δ-4去饱和酶；来自畸雌腐霉的Ω-3去饱和酶；来自路氏巴夫藻的Δ-4去饱和酶；来自托瑞蚝球藻的Δ-5延伸酶。VC-LTM593-1qcz rc双元T-质粒(SEQ ID NO:1)还包含编码选择标记乙酰羟酸合酶的多核苷酸，所述多核苷酸赋予咪唑啉酮除草剂耐受性。
本发明还涉及:在芸苔属事件LBFLFK和LBFDAU的每一者中的T-DNA插入；存在于包含芸苔属事件LBFLFK的芸苔属植物或种子中的基因组DNA/转基因插入，即，基因座1和基因座2接头区域；存在于包含芸苔属事件LBFDAU的芸苔属植物或种子中的基因组DNA/转基因插入，即，基因座1和基因座2接头区域；对包含事件LBFLFK或事件LBFDAU的芸苔属植物或种子及其后代中相应基因组DNA/转基因插入(即，相应基因座1和基因座2接头区域)的检测。
如本文所用，术语“芸苔属(Brassica)”意指任何芸苔属植物并且包括可以用芸苔属植物繁殖的所有植物品种。如本文定义，芸苔属物种(Brassica sp.)包括欧洲油菜(B.napus)、芜青(B.rapa)、芥菜(B.juncea)、甘蓝(B.oleracea)、黑芥(B.nigra)和埃塞俄比亚芥(B.carinata)。优选地，LBFLFK事件和LBFDAU事件的物种和它们的后代是欧洲油菜。如本文中所用，术语“植物”包括植物细胞、植物器官、植物原生质体、从中可以再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块、以及在植物或植物部分(如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎秆、根、根尖、花药等)中完整的植物细胞。产生的成熟种子可以用于食物、饲料、燃料或其他商业或工业目的或用于培育或繁殖物种的目的。本发明的范围内还包括再生的植物的后代、变体和突变体，前提是这些部分包含LBFLFK或LBFDAU事件。
转基因“事件”通过以下方式产生：用包含核酸表达盒(其包含一个或多个目的转基因)的异源DNA构建体(一个或多个)转化植物细胞，从包含插入的转基因的各细胞再生一群植物，并且选择以插入特定基因组位置为特征的特定植物。事件在表型上由转基因的表达来表征。在遗传水平，事件是植物的遗传组成的部分。术语“事件”指包括异源DNA的原始转化体和转化体的后代。术语“事件”也指通过转化体和另一个品种之间有性远交产生的、包括异源DNA的后代。甚至与回归亲本反复回交后，来自转化亲本的插入DNA和侧翼DNA仍存在于杂交子代中相同的染色体位置处。术语“事件”还指来自原始转化体的、包含插入的DNA和与插入的DNA紧邻的侧翼序列的DNA，其中所述DNA预期可以通过包含插入DNA的一个亲本系(例如，原始转化体和自交产生的后代)与不含插入DNA的亲本系的有性杂交而转移至后代。根据本发明，芸苔属LBFLFK事件的后代可以包含LBFLFK基因座1或LBFLFK基因座2、或同时包含LBFLFK基因座1和LBFLFK基因座2。类似地，芸苔属LBFDAU事件的后代可以包含LBFDAU基因座1或LBFDAU基因座2、或同时包含LBFDAU基因座1和LBFDAU基因座2。
如本文所用，“插入DNA”指用来转化植物材料的表达盒中的异源DNA，而“侧翼DNA”可以包含生物如植物中天然存在的基因组DNA，或借助转化过程引入的、相对于原始插入DNA分子而言外部的、外来(异源)DNA，例如与转化事件相关的片段。如本文所用的“侧翼区”或“侧翼序列”指至少20、50、100、200、300、400、1000、1500、2000、2500或5000碱基对或更大的序列，所述序列位于原始的外来插入DNA分子紧上游并与之邻接，或位于其紧下游并与之邻接。LBFLFK事件的侧翼区的非限制性例子包括，对于基因座1，SEQ ID NO:6的核苷酸1至570、SEQ ID NO:7的核苷酸229至811，以及对于基因座2，SEQ ID NO:15的核苷酸1至2468、和/或SEQ ID NO:16的核苷酸242至1800，及其变体和片段。LBFDAU事件的侧翼区的非限制性例子包括，对于基因座1，SEQ ID NO:24的核苷酸1至1017、SEQ ID NO:25的核苷酸637至1677，以及对于基因座2，SEQ ID NO:33的核苷酸1至1099和/或SEQ ID NO:34的核苷酸288至1321，及其变体和片段。
导致外来DNA随机整合的转化程序将产生含有不同侧翼区的转化体，所述侧翼区是每个转化体所特征性的和独有的。当通过传统杂交将重组DNA引入植物中时，其侧翼区通常不会被改变。转化体也将含有在一段异源插入DNA和基因组DNA之间或两段基因组DNA或两段异源DNA之间的独特接头。“接头点”是两个特定DNA片段相接合的点。例如，接头点存在于插入DNA与侧翼DNA接合的位置。接头点也可以存在于转化的生物中位于两个DNA片段以不同于天然生物中的修饰方式接合在一起的位置。如本文所用，“接头DNA”或“接头区域”指包含接头点的DNA。来自LBFLFK事件的接头DNA的非限制性例子包括，对于基因座1，SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5，以及对于基因座2，SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14，其互补序列或其变体及片段。来自LBFDAU事件的接头DNA的非限制性例子包括，对于基因座1，SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23，以及对于基因座2、SEQ ID NO:31和/SEQ ID NO:32，其互补序列或其变体及片段。
术语“种质”指代表基因型、品种、物种或培养物的个体、一组个体或克隆、或其遗传物质。
“系”或“株系”是具有相同家系(parentage)的一组个体，所述个体通常在一定程度上是近交的，并且通常是同基因的或近乎同基因的。近交系倾向于高度均一、纯合和可繁殖。许多分析方法可用于确定近交系的纯合性和表型稳定性。
短语“杂种植物”指由遗传上不同的个体之间杂交产生的植物。
术语“杂交的”或“杂交”在本发明中意指配子的融合，例如，在植物情况下通过授粉产生后代(即，细胞、种子或植物)。该术语涵盖有性杂交(一株植物由另一株植物授粉)，以及在植物的情况下，自交(自花授粉，即，此时花粉和胚珠来自同一株植物)。
术语“渐渗”指，基因座的所需等位基因从一个遗传背景传递至另一个遗传背景。在一种方法中，可以通过二个亲本之间的有性杂交来实现所需的等位基因的渐渗，其中至少一个亲本在其基因组中具有所需的等位基因。
根据本发明，术语“多核苷酸”指脱氧核糖核酸和/或核糖核酸。除非另外声明，否则本文中“多核苷酸”指单链DNA多核苷酸或指双链DNA多核苷酸。多核苷酸的长度根据本发明以指明的碱基对(“bp”)或核苷酸(“nt”)数目来表示。根据本发明，两种表示法可以互换用于单链核酸或双链核酸。另外，由于多核苷酸通过其相应的核苷酸序列来定义，术语核苷酸/多核苷酸和核苷酸序列/多核苷酸序列可以互换使用，因而对核酸序列的提及也意在定义包含如下核酸片段或由该核酸片段组成的核酸，其中所述核酸片段的序列与该核酸序列相同。
如本文所用，“分离的DNA分子”是对应于全部或部分的侧翼区、接头区域、转基因扩插入、增子、引物或探针的人工多核苷酸，其是芸苔属事件LBFLFK或芸苔属事件LBFDAU独有的，且不包含在芸苔属事件LBFLFK的基因组或芸苔属事件LBFDAU的基因组中。这类分离的DNA分子可以源自用来产生LBFLFK事件和LBFDAU事件的VC-LTM593-1qcz rc质粒、或源自芸苔属事件LBFLFK或芸苔属事件LBFDAU的基因组，或源自从芸苔属事件LBFLFK或芸苔属事件LBFDAU产生的组织、种子、后代、细胞、植物器官、生物样品或商业产品。这类分离的DNA分子可以提取自细胞、或组织、或植物或种子或植物器官的匀浆物；或可以作为扩增子从提取自细胞、或组织、或植物或种子或植物器官匀浆物的DNA或RNA产生，其中前述任一者源自芸苔属事件LBFLFK或芸苔属事件LBFDAU、或其后代、由其衍生的生物样品或商业产品。
“探针”是与常规的可检测标记物或报道分子(例如，放射性同位素、配体、化学发光物质或酶)连接的分离的核酸。探针与靶核酸的一条链互补，在本发明情况下，与来自芸苔属事件LBFLFK或芸苔属事件LBFDAU的基因组DNA的一条链互补，所述基因组DNA可以来自芸苔属植物或来自包含事件DNA的样品。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸还包括聚酰胺及其他探针材料，其可以与靶DNA序列特异性结合并且通过该结合可以检测靶DNA序列的存在。
“引物”是分离的核酸，其可以通过核酸杂交与互补靶DNA链特异性退火从而在引物和靶DNA链之间形成杂交分子，并且随后可以由聚合酶(例如，DNA聚合酶)沿着靶DNA链延长。本发明的引物对或引物组，是指(例如，通过聚合酶链反应(PCR)或其他常规核酸扩增方法)共同可用于扩增靶核酸序列的两种不同引物。
探针和引物的长度通常为11个核苷酸或更长，优选地18个核苷酸或更长，更优选地24个核苷酸或更长，并且最优选地30个核苷酸或更长。此类探针和引物在高严格性杂交条件下与靶序列特异性杂交。优选地，本发明的引物和探针与靶序列具有完全的序列相似性，但可以通过常规方法设计与靶序列不同并保持与靶序列杂交的能力的探针。可以通过核苷酸合成、克隆、扩增或产生多核苷酸分子的其他标准方法，产生引物、引物对或探针。根据本发明，可以使用本公开和本领域已知的方法，例如通过如Wojciech和Rhoads,NAR 17:8543-8551,1989中所述的计算机(in silico)分析，选择对事件LBFLFK基因座1、LBFLFK基因座2、LBFDAU基因座1和LBFDAU基因座2中的靶序列或其互补序列特异的一个或多个引物或探针序列。
术语“对(靶序列)特异的”表示探针或引物在严格杂交条件下仅与包含靶序列的样品中的靶序列杂交。
如本文所用，“扩增的DNA”或“扩增子”指靶核酸序列(作为核酸模板的组成部分)的核酸扩增产物。扩增子的长度和序列可以用于诊断事件。扩增子可以具有任何长度，并且可以在例如如下长度范围，例如，引物对加一个核苷酸碱基对的长度、或引物对加约五十个核苷酸碱基对的长度，或引物对加约二百个核苷酸碱基对的长度、引物对加约五百个核苷酸碱基对的长度、或引物对加约七百五十个核苷酸碱基对的长度等。引物对可以衍生自插入DNA两侧的侧翼序列，从而产生包含整个插入物核苷酸序列的扩增子。备选地，引物对可以衍生自插入物一侧的侧翼序列和插入物内部的序列。衍生自植物基因组序列的引物对成员可以位于距该插入DNA分子一定距离的位置，并且该距离可以从一个核苷酸碱基对直至约两万个核苷酸碱基对。术语“扩增子”的使用特别地排除可在DNA热扩增反应中形成的引物二聚体。
“商业产品”(commodity product)指由衍生自芸苔属植物的材料或芸苔属油组成并出售给消费者的任何产品。
如本文所用的术语“多不饱和脂肪酸(PUFA)”指包含至少2个、优选地3、4、5或6个双键的脂肪酸。另外，应当理解，此类脂肪酸在脂肪酸链中优选地包含18至24个碳原子。根据本发明，该术语涉及在脂肪酸链中具有20至24个碳原子的长链PUFA(VLC-PUFA)。表1中给出根据本发明使用的脂肪酸(包括多不饱和脂肪酸)的系统名称、其相应俗名和简化符号。
表1
优选地，由LBFLFK事件和LBFDAU事件及其后代产生的VLC-PUFA包括DHGLA、ARA、ETA、EPA、DPA、DHA。更优选地，由LBFLFK事件和LBFDAU事件及其后代产生的VLC-PUFA包括ARA、EPA和DHA。最优选地，由LBFLFK事件和LBFDAU事件及其后代产生的VLC-PUFA包括EPA和/或DHA。另外，LBFLFK事件和LBFDAU事件及其后代还产生在合成期间出现的VLC-PUFA中间体。这类中间体可以由本发明多肽的去饱和酶、酮酰基-CoA-合酶、酮酰基-CoA-还原酶、脱水酶和烯酰辅酶A还原酶活性从底物形成。优选地，这类底物可以包括LA、GLA、DHGLA、ARA、二十碳二烯酸、ETA和EPA。
在一个实施方案中，本发明的转基因芸苔属植物包含事件LBFLFK(ATCC命名PTA-121703)。该实施方案中还涵盖事件LBFLFK的种子和后代。在另一个实施方案中，本发明的转基因芸苔属植物包含事件LBFDAU(ATCC命名PTA-122340)。该实施方案中还涵盖事件LBFDAU的种子和后代。芸苔属事件LBFLFK(ATCC命名PTA-121703)和芸苔属事件LBFDAU(ATCC命名PTA-122340)的种子已经由申请人依据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条款，保藏在美国弗吉尼亚州马纳萨斯市美国典型培养物保藏中心。申请人无权放弃法律对生物材料转让或其商业运输所施加的任何限制。申请人不得免除侵犯如下权利的任何行为：依据本专利所授予的权利或根据植物品种保护法(7USC 2321及以下)适用于本保藏事件的权利，禁止未经授权的种子繁殖。种子可以根据国家法律监管。种子的保藏仅出于方便本领域技术人员而作出，不构成或隐含构成对下述的任何认可、承认、声明或声称：保藏的种子是充分描述本发明、充分公开本发明、或实施本发明或其任何部分或方面所必需的。
芸苔属植物LBFLFK和LBFDAU可以用来生产一般从芸苔属植物获取的商业产品。LBFLFK和LBFDAU的种子可以加工成粕或油以及作为动物饲料中的油源用于陆生和水生动物。来自事件LBFLFK和LBFDAU的含有VLC-PUFA的油可以例如用作食品添加剂以增加人类和动物中的ω-3脂肪酸摄入，或用在药物组合物中以增强其治疗作用，或用作化妆品组合物的组分等。
LBFLFK或LBFDAU植物可以通过以下方式繁殖：首先令培育自转基因LBFLFK或LBFDAU芸苔属植物(或其后代)的第一亲本芸苔属植物和分别缺少LBFLFK或LBFDAU事件的EPA/DHA谱和咪唑啉酮耐受性的第二亲本芸苔属植物有性杂交，由此产生多个第一后代植物，并且随后选出显示所需咪唑啉酮耐受性的第一后代植物，自交第一后代植物以产生多个第二后代植物，随后选择显示所需咪唑啉酮耐受性和EPA/DHA谱的第二后代植物。这些步骤还可以包括将第一产生EPA/DHA的后代植物或第二产生EPA/DHA的后代植物与第二亲本芸苔属植物或第三亲本芸苔属植物回交，以产生显示出所需咪唑啉酮耐受性和EPA/DHA谱的芸苔属植物。进一步可以认识到，对后代表型进行分析并非必需的。如本文他处公开，多种方法和组合物可以用来检测和/或鉴定LBFLFK或LBFDAU事件。
两种不同的转基因植物也可以有性杂交以产生含有二个独立分离的外源基因的后代。适宜后代的自交可以产生对两个外源转基因插入物而言均纯合的植物。本发明还考虑，与亲本植物回交和与非转基因植物远缘杂交，以及营养繁殖。可以在几份参考文献之一中找到对常用于不同性状和作物的其他育种方法的描述，例如，Fehr,引自BreedingMethods for Cultivar Development,Wilcos编著,American Society of Agronomy,Madison Wis.(1987)，和Buzza,Plant Breeding,引自Brassica Oilseeds:Productionand Utilization.D.S.Kimber和D.I.McGregor编著Cab International,Wallingford,UK(1995)。
根据涉及芸苔属事件LBFLFK的本发明，LBFLFK基因座1基因组DNA/转基因接头区域和/或LBFLFK基因座2基因组DNA/转基因接头区域存在于芸苔属植物LBFLFK(ATCC保藏号PTA-121703)及其后代中。LBFLFK基因座1DNA/转基因右边界接头区域包含SEQ ID NO:4并且LBFLFK基因座1左边界接头区域包含SEQ ID NO:5，以及LBFLFK基因座2右边界接头区域包含SEQ ID NO:13并且LBFLFK左边界接头区域包含SEQ ID NO:14。提供这样的DNA序列及其互补序列，所述DNA序列包含事件LBFLFK的至少一个接头区域序列，所述接头区域序列选自SEQ ID NO:4(对应于SEQ ID NO:2的位置561至580，如图2中所示)；SEQ ID NO:5(对应于SEQ ID NO:2的位置44318至44337，如图2中所示)；SEQ ID NO:13(对应于SEQ ID NO:11的位置2459至2478，如图3中所示)；和SEQ ID NO:14(对应于SEQ ID NO:11的位置46232至46251，如图3中所示)；其中在含有芸苔属DNA的生物样品中检出这些序列可以诊断为芸苔属事件LBFLFK DNA存在于所述样品中。本发明的一个方面是包含这些DNA分子的芸苔属事件LBFLFK和芸苔属种子。
例如，为了确定有性杂交产生的芸苔属植物是否含有来自事件LBFLFK的转基因DNA，可以对从芸苔属植物组织样品提取的DNA进行核酸扩增，其中所述的核酸扩增方法使用(i)第一引物对，其包括：(a)从LBFLFK基因座1侧翼序列衍生的第一引物和(b)从LBFLFK基因座1插入的异源DNA衍生的第二引物，其中第一和第二引物的扩增产生可以诊断事件LBFLFK基因座1DNA存在的扩增子；和(ii)第二引物对，其包括(a)从LBFLFK基因座2侧翼序列衍生的第三引物和(b)从LBFLFK基因座2插入的异源DNA衍生的第四引物，其中第三和第四引物的扩增产生可以诊断事件LBFLFK基因座2DNA存在的扩增子。
对芸苔属事件LBFLFK中靶序列特异的引物DNA分子可以包含LBFLFK基因座1和基因座2的插入DNA、侧翼区和/或接头区域的任何部分的至少11个连续核苷酸。例如，LBFLFK基因座1引物DNA分子可以源自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的任一者或其互补序列，以检测LBFLFK基因座1。类似地，LBFLFK基因座2引物DNA分子可以源自SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:13、或SEQID NO:14、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:11的任一者或其互补序列，以检测LBFLFK基因座2。本领域技术人员可以使用这些引物来设计引物对，以使用已知的DNA扩增方法，产生LBFLFK基因座1扩增子和基因座2扩增子。在DNA扩增方法中使用这些DNA引物，当扩增产物含有包含LBFLFK基因座1接头区域SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或其互补序列的扩增子、和包含LBFLFK基因座2接头区域SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14或其互补序列的扩增子时，通过所产生的LBFLFK基因座1扩增子和基因座2扩增子可以诊断芸苔属事件LBFLFK。
本发明的一个方面是，通过与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:11的任何部分或其互补序列同源或互补的DNA引物产生的任何LBFLFK扩增子。本发明的一个方面是，包含SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14或其互补序列的任何扩增子。
根据本发明的另一个方面，提供在样品中检测与芸苔属事件LBFLFK相对应的DNA存在的方法。这类方法包括步骤：(a)使包含DNA的样品与LBFLFK基因座1引物对和LBFLFK基因座2引物对接触，其中所述引物对在具有来自芸苔属事件LBFLFK的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时，产生可以诊断芸苔属事件LBFLFK的基因座1扩增子和基因座2扩增子；(b)进行核酸扩增反应，由此产生基因座1扩增子和基因座2扩增子；和(c)检测扩增子，其中一个扩增子包含LBFLFK基因座1接头区域SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或其互补序列，一个扩增子包含LBFLFK基因座2接头区域SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14或其互补序列。
在样品中检测与芸苔属事件LBFLFK相对应的DNA存在的方法可以备选地包括步骤：(a)使包含DNA的样品与一个引物对接触，其中所述引物对在具有来自芸苔属事件LBFLFK的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时，产生诊断芸苔属事件LBFLFK的基因座1扩增子；(b)进行核酸扩增反应，由此产生扩增子；和(c)检测扩增子，其中该扩增子包含LBFLFK基因座1接头区域SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或其互补序列。SEQ ID NO:10的探针可以用来检测LBFLFK基因座1扩增子。
在样品中检测与芸苔属事件LBFLFK相对应的DNA存在的方法可以备选地包括步骤：(a)使包含DNA的样品与一个引物对接触，其中所述引物对在具有来自芸苔属事件LBFLFK的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时，产生诊断芸苔属事件LBFLFK的基因座2扩增子；(b)进行核酸扩增反应，由此产生扩增子；并且(c)检测扩增子，其中该扩增子包含LBFLFK基因座2接头区域SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14或其互补序列。SEQ ID NO:19的探针可以用来检测LBFLFK基因座2扩增子。
根据本发明的另一个方面，提供用于样品中检测与LBFLFK事件基因座1相对应的DNA存在的方法。在一个实施方案中，该方法包括步骤：(a)使包含DNA的样品与探针接触，其中所述探针在严格杂交条件下与来自芸苔属事件LBFLFK的基因座1的基因组DNA杂交并且在严格杂交条件下与来自对照芸苔属植物的基因组DNA不杂交；(b)将样品和探针置于严格杂交条件；和(c)检测探针与芸苔属事件LBFLFK DNA的杂交，其中所述探针特异于包含SEQID NO:2或其互补序列的11个连续核苷酸的靶序列。用于检测LBFLFK基因座1的一个示例性探针作为SEQ ID NO:10给出。
本发明还涵盖在样品中检测与LBFLFK事件基因座2相对应的DNA存在的方法。在这个实施方案中，该方法包括步骤：(a)使包含DNA的样品与探针接触，所述探针在严格杂交条件下与来自芸苔属事件LBFLFK的基因座2的基因组DNA杂交并且在严格杂交条件下与来自对照芸苔属植物的基因组DNA不杂交；(b)将样品和探针置于严格杂交条件；和(c)检测探针与芸苔属事件LBFLFK DNA的杂交，其中所述探针特异于包含SEQ ID NO:11或其互补序列的11个连续核苷酸的靶序列。用于检测LBFLFK基因座2的一个示例性探针作为SEQ ID NO:19示出。
用于检测芸苔属事件LBFLFK的方法还涵盖在单个测定中检测芸苔属事件LBFLFK基因座1和基因座2。在这个实施方案中，该方法包括步骤：(a)使包含DNA的样品与第一探针和第二探针接触，所述第一探针在严格杂交条件下与来自芸苔属事件LBFLFK基因座1的基因组DNA杂交并且在严格杂交条件下与来自对照芸苔属植物的基因组DNA不杂交，所述第二探针在严格杂交条件下与来自芸苔属事件LBFLFK基因座2的基因组DNA杂交并且在严格杂交条件下与来自对照芸苔属植物的基因组DNA不杂交；(b)将样品和探针置于严格杂交条件；和(c)检测探针与芸苔属事件LBFLFK基因座1DNA和基因座2DNA的杂交，其中所述第一探针特异于包含SEQ ID NO:2或其互补序列的11个连续核苷酸的靶序列，并且所述第二探针特异于包含SEQ ID NO:11或其互补序列的11个连续核苷酸的靶序列。
本发明的另一个方面是确定芸苔属事件LBFLFK的后代的接合性的方法，所述方法包括实施以上用于检测LBFLFK基因座1和LBFLFK基因座2的步骤，以及实施以下额外的步骤：(d)使包含芸苔属DNA的样品与LBFLFK野生型引物对(包含LBFLFK基因座1转基因插入的芸苔属基因组区的至少11个核苷酸)和LBFLFK基因座2野生型引物对(包含LBFLFK基因座2转基因插入的芸苔属基因组区的至少11个连续核苷酸)接触，其中所述野生型引物对，在核酸扩增反应中与来自野生型芸苔属植物的与LBFLFK基因座2插入区域和/或LBFLFK基因座1转基因插入区域相对应的基因组DNA一起使用时，产生扩增子，通过所述扩增子可以诊断与LBFLFK基因座1和基因座2转基因插入的芸苔属基因组区同源的野生型芸苔属基因组DNA；(e)进行核酸扩增反应，产生第二扩增子；(f)检测野生型芸苔属扩增子；和(g)比较产生的LBFLFK扩增子和野生型扩增子，其中全部扩增子的存在表示样品为转基因插入杂合的。本发明的接合性检测方法可以利用上文描述的对事件LBFLFK基因座1和/或基因座2特异的任何引物和探针。检测LBFLFK基因座1插入位点处野生型芸苔属基因组DNA的示例性引物可以衍生自SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39，并且可以从通过SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39扩增产生的野生型芸苔属基因组序列设计合适的野生型基因座1探针。检测LBFLFK基因座2插入位点处野生型芸苔属基因组DNA的示例性引物可以衍生自SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41，并且可以从通过SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41扩增产生的野生型芸苔属基因组序列设计合适的野生型基因座2探针。
提供检测芸苔属事件LBFLFK的试剂盒，所述试剂盒使用从SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:11或其互补序列设计的引物。当使用所述试剂盒产生的扩增子(1)含有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列或其互补序列，和/或扩增子包含基因座2接头区域SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:14或其互补序列时，通过该扩增子可以诊断LBFLFK。
根据涉及芸苔属事件LBFDAU的本发明，LBFDAU基因座1基因组DNA/转基因接头区域和/或LBFDAU基因座2基因组DNA/转基因接头区域存在于芸苔属事件LBFDAU(ATCC保藏号PTA-122340)及其后代中。LBFDAU基因座1DNA/转基因右边界接头区域包含SEQ ID NO:22并且LBFDAU基因座1左边界接头区域包含SEQ ID NO:23；以及LBFDAU基因座2右边界接头区域包含SEQ ID NO:31并且LBFDAU左边界接头区域包含SEQ ID NO:32。提供这样的DNA序列及其互补序列，所述DNA序列包含事件LBFDAU的至少一个接头区域序列，所述接头区域序列选自SEQ ID NO:22(对应于SEQ ID NO:20的位置1008至1027，如图4中所示)；SEQ ID NO:23(对应于SEQ ID NO:20的位置44728至44747，如图4中所示)；SEQ ID NO:31(对应于SEQ IDNO:29的位置1090至1109，如图5中所示)；和SEQ ID NO:32(对应于SEQ ID NO:29的位置38577至38596，如图5中所示)；其中在含有芸苔属DNA的生物样品中检出这些序列，可以诊断芸苔属事件LBFDAU DNA存在于所述样品中。本发明的一个方面是包含这些DNA分子的芸苔属事件LBFDAU和芸苔属种子。
例如，为了确定有性杂交产生的芸苔属植物是否含有来自事件LBFDAU的转基因DNA，可以核酸扩增从芸苔属植物组织样品提取的DNA，所述的核酸扩增方法使用(i)第一引物对，其包括：(a)从LBFDAU基因座1侧翼序列衍生的第一引物和(b)从LBFDAU基因座1插入的异源DNA衍生的第二引物，其中第一和第二引物的扩增产生诊断事件LBFDAU基因座1DNA存在的扩增子；和/或(ii)第二引物对，其包括(a)从LBFDAU基因座2侧翼序列衍生的第三引物和(b)从LBFDAU基因座2插入的异源DNA衍生的第四引物，其中第三和第四引物的扩增产生诊断事件LBFDAU基因座2DNA存在的扩增子。
对芸苔属事件LBFDAU中靶序列特异的引物DNA分子可以包含LBFDAU基因座1和基因座2的插入DNA、侧翼区和/或接头区域的任何部分的11个或更多个连续核苷酸。例如，引物DNA分子可以衍生自SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、或SEQ ID：NO:23、SEQID NO:24或SEQ ID NO:25的任一者或其互补序列，以检测LBFDAU基因座1。类似地，引物DNA分子可以衍生自SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、或SEQ ID NO:32；SEQ IDNO:33、或SEQ ID NO:34的任一者或其互补序列，以检测LBFDAU基因座2。本领域技术人员可以使用这些引物来设计引物对，以使用已知的DNA扩增方法产生LBFDAU基因座1扩增子和基因座2扩增子。在DNA扩增方法中使用这些DNA引物，当扩增产物含有包含LBFDAU基因座1接头区域SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的扩增子和/或包含LBFDAU基因座2接头区域SEQ IDNO:31或SEQ ID NO:32的扩增子时，通过所产生的LBFDAU基因座1扩增子和基因座2扩增子可以诊断芸苔属事件LBFDAU。
本发明的一个方面是，通过与SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:29的任何部分或其互补序列同源或互补的DNA引物产生的任何LBFDAU扩增子。本发明的一个方面是，包含LBFDAU基因座1接头区域SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23或其互补序列的任何扩增子，和包含LBFDAU基因座2接头区域SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32或其互补序列的任何扩增子。
根据本发明的另一个方面，提供在样品中检测与芸苔属事件LBFDAU相对应的DNA存在的方法。这类方法包括：(a)使包含DNA的样品与LBFDAU基因座1引物对和LBFDAU基因座2引物对接触，其中所述引物对在具有来自芸苔属事件LBFDAU的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时，产生诊断芸苔属事件LBFDAU的基因座1扩增子和基因座2扩增子；(b)进行核酸扩增反应，产生这些扩增子；和(c)检测这些扩增子，其中一个扩增子包含LBFDAU基因座1接头区域SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23或其互补序列，一个扩增子包含LBFDAU基因座2接头区域SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32或其互补序列。
在样品中检测与芸苔属事件LBFDAU相对应的DNA存在的方法可以备选地包括步骤：(a)使包含DNA的样品与一个引物对接触，所述引物对在具有来自芸苔属事件LBFDAU的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时，产生诊断芸苔属事件LBFDAU的基因座1扩增子；(b)进行核酸扩增反应，由此产生该扩增子；和(c)检测该扩增子，其中该扩增子包含LBFDAU基因座1接头区域SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23或其互补序列。SEQ ID NO:28的探针可以用来检测LBFDAU基因座1扩增子。
在样品中检测与芸苔属事件LBFDAU相对应的DNA存在的方法可以备选地包括步骤：(a)使包含DNA的样品与一个引物对接触，所述引物对在具有来自芸苔属事件LBFDAU的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时，产生诊断芸苔属事件LBFDAU的基因座2扩增子；(b)进行核酸扩增反应，由此产生该扩增子；和(c)检测该扩增子，其中该扩增子包含LBFDAU基因座2接头区域SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32或其互补序列。SEQ ID NO:37的探针可以用来检测LBFDAU基因座2扩增子。
根据本发明的另一个方面，提供用于样品中检测与LBFDAU事件基因座1相对应的DNA存在的方法。在一个实施方案中，该方法包括步骤：(a)使包含DNA的样品与探针接触，所述探针在严格杂交条件下与来自芸苔属事件LBFDAU基因座1的基因组DNA杂交并且在严格杂交条件下与来自对照芸苔属植物的基因组DNA不杂交；(b)将样品和探针置于严格杂交条件；和(c)检测探针与芸苔属事件LBFDAU DNA的杂交，其中所述探针特异于包含SEQ ID NO:20或其互补序列的11个连续核苷酸的靶序列。用于检测LBFDAU基因座1的一个示例性探针作为SEQ ID NO:28示出。
本发明还提供在样品中检测与LBFDAU事件基因座2相对应的DNA存在的方法。在这个实施方案中，该方法包括步骤：(a)使包含DNA的样品与探针接触，所述探针在严格杂交条件下与来自芸苔属事件LBFDAU基因座2的基因组DNA杂交并且在严格杂交条件下与来自对照芸苔属植物的基因组DNA不杂交；(b)将样品和探针置于严格杂交条件；和(c)检测探针与芸苔属事件LBFDAU DNA的杂交，其中所述探针特异于包含SEQ ID NO:29或其互补序列的11个连续核苷酸的靶序列。用于检测LBFLFK基因座2的一个示例性探针作为SEQ ID NO:37示出。
用于检测芸苔属事件LBFDAU的方法还涵盖在单个测定中检测芸苔属事件LBFDAU基因座1和基因座2。在这个实施方案中，该方法包括步骤：(a)使包含DNA的样品与第一探针和第二探针接触，所述第一探针在严格杂交条件下与来自芸苔属事件LBFDAU基因座1的基因组DNA杂交并且在严格杂交条件下与来自对照芸苔属植物的基因组DNA不杂交，所述第二探针在严格杂交条件下与来自芸苔属事件LBFDAU基因座2的基因组DNA杂交并且在严格杂交条件下与来自对照芸苔属植物的基因组DNA不杂交；(b)将样品和探针置于严格杂交条件；和(c)检测探针与芸苔属事件LBFDAU基因座1DNA和基因座2DNA的杂交，其中所述第一探针特异于包含SEQ ID NO:20或其互补序列的11个连续核苷酸的靶序列；所述第二探针特异于包含SEQ ID NO:29或其互补序列的11个连续核苷酸的靶序列。
本发明的另一个方面是确定芸苔属事件LBFDAU的后代的接合性的方法，所述方法包括实施以上用于检测LBFDAU基因座1和LBFDAU基因座2的步骤，以及实施以下额外的步骤：(d)使包含芸苔属DNA的样品与包含LBFDAU基因座1转基因插入的芸苔属基因组区的至少11个连续核苷酸的LBFDAU基因座1野生型引物对和包含LBFDAU基因座2转基因插入的芸苔属基因组区的至少11个连续核苷酸的LBFDAU基因座2野生型引物对接触，其中所述野生型引物对，在核酸扩增反应中与来自野生型芸苔属植物的基因组DNA一起使用时，产生与LBFDAU基因座1和/或LBFDAU基因座2转基因插入区域相对应的第二扩增子；(e)进行核酸扩增反应，由此产生第二扩增子，(f)检测芸苔属野生型扩增子；和(g)比较产生的LBFDAU扩增子和野生型扩增子，其中全部扩增子的存在表示样品为转基因插入杂合的。本发明的接合性检测方法可以利用上文描述的对事件LBFDAU基因座1和/或基因座2特异的任何引物和探针。检测LBFDAU基因座1插入位点处野生型芸苔属基因组DNA的示例性引物可以衍生自SEQID NO:42和SEQ ID NO:43或其互补序列，并且可以从通过SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43扩增产生的野生型芸苔属基因组序列设计合适的野生型基因座1探针。检测LBFDAU基因座2插入位点处野生型芸苔属基因组DNA的示例性引物可以衍生自SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45，并且可以从通过SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45扩增产生的野生型芸苔属基因组序列设计合适的野生型基因座2探针。
提供检测芸苔属事件LBFDAU的试剂盒，所述试剂盒使用从SEQ ID NO:20和SEQ IDNO:29或其互补序列设计的引物。使用所述试剂盒，当产生的扩增子(1)含有SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列或其互补序列，以及扩增子包含基因座2接头区域SEQID NO:31或SEQ ID NO:32或其互补序列时，可以通过该扩增子，诊断LBFDAU。
用于制备和使用探针和引物的方法描述在例如以下文献中：Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,第1-3卷,Sambrook等人编著,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989(下文，"Sambrook等人,1989")；Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等人编著,Greene Publishing andWiley-Interscience,New York,1992(随附定期更新)(下文，"Ausubel等人,1992")；和Innis等人,PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press:San Diego,1990。PCR-引物对可以从已知的序列衍生，例如，通过使用旨在用于此目的计算机程序如Primer(0.5版,COPYRGT.1991,Whitehead Institute for BiomedicalResearch,Cambridge,Mass.)来产生。
基于本文公开的侧翼DNA和插入序列的引物和探针可以，通过常规方法(例如，通过再克隆和测序这些序列)，用来验证(并且，如果需要，校正)这些公开的序列。
本发明的核酸探针和引物在严格条件下与靶DNA序列杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法均可以用来鉴定样品中来自转基因事件的DNA的存在。核酸分子或其片段能够在某些情况下与其他核酸分子特异性杂交。如本文所用，如果两个核酸分子能够形成反平行、双链核酸结构，则将两个分子称作能够彼此特异性杂交。如果两个核酸分子显示完全互补性，则称一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。如本文所用，当一个分子的每个核苷酸与另一个分子的核苷酸互补时，则称所述分子显示出“完全互补性”。如果两个分子可以彼此以足够稳定性杂交从而允许其在至少常规的“低严格性条件”下保持彼此退火，则称它们是“最低互补的”。类似地，如果两个分子可以彼此以足够稳定性杂交以允许其在常规的“高严格性条件”保持彼此退火，则称它们是“互补的”。常规的严格性条件由Sambrook等人,1989和Haymes等人,In:Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach,IRLPress,Washington,D.C.(1985)描述。因此容许自完全互补性的一定偏离，只要这类偏离不彻底排除分子形成双链结构的能力即可。为了使核酸分子充当引物或探针，仅要求它在序列上足够互补以能够在所用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。
关于使用特定扩增引物对(例如，通过PCR)扩增靶核酸序列，“严格条件”是仅允许引物对与靶核酸序列(所述靶核酸序列将与具有相应野生型序列(或其互补序列)的引物结合)杂交并且优选地在DNA热扩增反应中产生独特扩增产物(扩增子)的条件。
核酸扩增可以通过本领域已知的多种核酸扩增方法(包括聚合酶链反应(PCR))中的任一者完成。多种扩增方法是本领域已知的并且尤其描述在美国专利号4,683,195和4,683,202中及PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Innis等人编著,Academic Press,San Diego,1990中。已经开发了扩增多达22kb基因组DNA和多达42kb噬菌体DNA的PCR扩增方法(Cheng等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:5695-5699,1994)。这些方法以及本领域已知的其他DNA扩增方法可以用于本发明的实施。可以通过使用源自本文提供的序列的引物从事件扩增这些序列，随后对PCR扩增子或克隆的DNA进行标准DNA测序，验证(并如果需要，校正)来自包含芸苔属事件LBFLFK或芸苔属事件LBFDAU的植物或种子组织的异源DNA插入物序列或侧翼序列。
可以使用多个技术检测通过这些方法产生的扩增子。这样一种方法是遗传Bit分析(例如，Nikiforov等人,Nucleic Acid Res.22:4167-4175,1994)，其中设计与相邻侧翼基因组DNA序列和插入的DNA序列两者重叠的DNA寡核苷酸。将该寡核苷酸固定于微孔平板的孔中。在PCR目的区域(使用在插入序列中的一个引物和在相邻侧翼基因组序列中的一个引物)后，单链PCR产物可以与该固定的寡核苷酸杂交，并充当模板，使用DNA聚合酶和特异于预期的下一个碱基的标记ddNTP进行单碱基延伸反应。读出可以是荧光或基于ELISA的。信号指示因成功的扩增、杂交和单碱基延伸而存在的插入物/侧翼序列。
另一种方法是如Winge所描述的焦磷酸测序技术(Innov.Pharma.Tech.00:18-24,2000)。在这种方法中，设计与相邻基因组DNA和插入物DNA接头重叠的寡核苷酸。寡核苷酸与来自目的区域的单链PCR产物(一个引物在插入序列中，一个在侧翼基因组序列中)杂交，在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、萤光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶、腺苷5'磷酰硫酸和萤光素存在下温育。单独添加dNTP，掺入导致可以被测量的光信号。光信号指示，因成功的扩增、杂交和单碱基或多碱基延伸而存在的转基因插入物/侧翼序列。
如Chen等人描述的荧光偏振法(Genome Res.9:492-498,1999)是可以用来检测本发明扩增子的方法。使用这种方法时，设计与基因组侧翼和插入DNA接头重叠的寡核苷酸。寡核苷酸与来自目的区域的单链PCR产物(一个引物在插入的DNA中，一个在侧翼基因组DNA序列中)杂交，在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP存在下温育。单碱基延伸导致掺入ddNTP。使用荧光计，掺入可以测量为偏振性的变化。偏振性的变化指示，因成功的扩增、杂交和多碱基延伸而存在的转基因插入物/侧翼序列。
TaqMan.RTM.(PE Applied Biosystems,Foster City,Calif.)被描述为一种检测并定量DNA序列存在的方法，在生产商提供的说明书中有充分说明。简而言之，设计与基因组侧翼和插入DNA接头重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针和PCR引物(一个引物在插入的DNA序列中，一个引物在侧翼基因组序列中)在热稳定性聚合酶和dNTP存在下循环。FRET探针的杂交导致荧光部分自FRET探针的淬灭部分上断裂和释放。荧光信号指示，因成功的扩增和杂交而存在的侧翼/转基因插入物序列。
分子信标已经描述用于序列检测，如Tyangi等人(Nature Biotech.14:303-308,1996)中所述。简而言之，设计与基因组侧翼和插入DNA接头重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针的独特结构导致它含有保持荧光部分和淬灭部分紧邻的二级结构。FRET探针和PCR引物(一个引物在插入的DNA序列中，一个引物在侧翼基因组序列中)在热稳定性聚合酶和dNTP存在下循环。在PCR扩增成功后，FRET探针与靶序列的杂交导致探针二级结构的移除及荧光部分和淬灭部分的空间分离，从而导致荧光信号产生。荧光信号指示，因成功的扩增和杂交而存在的侧翼/转基因插入序列。
描述的其他方法如微流体法(美国专利公开2006068398、美国专利号6,544,734)提供了分离和扩增DNA样品的方法和装置。光学染料用来检测并定量特定DNA分子(WO/05017181)。纳米管装置(WO/06024023)包含用于检测DNA分子的电子传感器或结合特定DNA分子并可以随后检出的纳米珠。
本发明的一个方面是从芸苔属事件LBFLFK或芸苔属事件LBFDAU衍生的供销售、供种植或供生产商业产品的种子。这类商业产品包括含有VLC-PUFA(包括但不限于EPA和DHA)的卡诺拉油或粕。从芸苔属事件LBFLFK衍生的商业产品包含可检测量的包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14的DNA分子。从芸苔属事件LBFDAU衍生的商业产品包含可检测量的包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31和/或SEQ ID NO:32的DNA分子。从事件LBFLFK和LBFDAU衍生的示例性商业产品包括但不限于烹调油、沙拉油、起酥油、营养强化食品、动物饲料、药物组合物、化妆品组合物、毛发护理产品等。
包括以下实施例以展示本发明的某些优选实施方案的例子。本领域技术人员应当理解，以下的实施例中公开的技术代表了发明人发现的在实施本发明时发挥良好作用的方法，并且因此可以视为构成其实施的优选模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应当理解，可以在公开的具体实施方案中产生许多变化并且仍获得类似或相似的结果而不偏离本发明的精神和范围。
实施例1：BiBAC T-质粒VC-LTM593-1qcz rc的构建
为了在欧洲油菜事件LBFLFK和LBFDAU的种子中合成VLC-PUFA，将编码VLC-PUFA代谢途径蛋白质的该组基因与表达元件(启动子、终止子和内含子)组合在单个双元T-质粒(命名为VC-LTM593-1qcz rc)上(图1)。美国专利号5,733,744和5,977,439中描述了适于向植物中转化庞大T-DNA的双元BAC(BiBAC)载体。在构建质粒VC-LTM593-1qcz rc中，由LifeTechnologies使用WO2013049227中描述的技术执行合成。质粒VC-LTM593-1qcz rc(SEQ ID NO:1)具有约61,000bp的总尺寸，并且表2中给出其结构，其中列出了元件的名称、在SEQ ID NO:1中的位置(注：对于由VC-LTM593-1qcz rc的互补链编码的元件，起始位置大于终止位置)、元件的功能和来源。转化过程期间整合至植物基因组中的T-DNA在侧翼具有右边界(VC-LTM593-1qcz rc的核苷酸59895至148)和左边界(VC-LTM593-1qcz rc的核苷酸43830至43695)。该区域外部的元件(＝载体主链)是在大肠杆菌和/或农杆菌中克隆和稳定维持所必需的。
表2中列出了VC-LTM593-1qcz rc的遗传元件和每种元件的功能。出于方便，表3列出在携带VC-LTM593-1qcz rc的T-DNA的植物种子中表达的、合成EPA和DHA所必需的全部酶。
表2：质粒VC-LTM593-1qcz rc的遗传元件
表3：由质粒VC-LTM593-1qcz rc的T-DNA携带的EPA和DHA合成必需的基因列表。
实施例2：产生和选择欧洲油菜事件LBFLFK和LBFDAU
使用根据DeBlock等人1989,Plant Physiology,91:694-701)的改良方案，产生LBFLFK事件和LBFDAU事件。将双元载体VC-LTM593-1qcz rc(SEQ ID NO:1)转化入发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)SHA001(WO2006024509)，并且与芸苔属品种Kumily外植体共培育。从转化的组织再生咪唑啉酮耐受性植物。
获得大约1543个半合子T0转化事件，其中68％含有AHAS咪唑啉酮抗性选择标记。在T0世代中，通过qPCR筛选335个事件的转基因拷贝数和EPA/DHA特征。这些T0事件当中，275个事件含有单拷贝VC-LTM593-1qcz rc，49个含有双拷贝，并且11个含有三拷贝载体。
在T1世代中，筛选57个事件的拷贝数和EPA/DHA特征。针对T-DNA上三个位置处的拷贝数，破坏性分析来自每个事件的大约250粒种子。拷贝数分离样式用来确定每个事件的T-DNA基因座数目。确定LBFLDK和LBFDAU均具有两个独立的T-DNA基因座。对每个事件的额外植物进行更广泛分析，其中分析T-DNA中每个基因的拷贝数。拷贝数结果提示，来自LBFDAU的一个T-DNA丢失基因c-AHAS和j-i-Atss1_c-d5Elo(Ot_GA3)。事件LBFLFK具有两个完整拷贝的T-DNA。来自T1世代的结果与T0世代的拷贝数结果比较，以鉴定每个事件的纯合植物。来自全部事件的纯合T1植物均在温室栽培并且记录表型观察结果，包括至首次开花的天数、变形花评级、变形叶评级、变形植株评级、变形果荚评级、花颜色、叶齿状突(leafdentation)、叶颜色、能育性、叶裂数目、植物高度。从自花授粉的植物采集T2种子并测量千粒籽重、种子品质、含油量、蛋白质含量和EPA及DHA含量(图6和图7)。与WT Kumily对照相比，事件LBFLFK和LBFDAU在T1植物的地上部分表型方面没有任何显著差异，对T2种子中对总油或蛋白质积累没有显著影响。LBFDAU和LBFLFK均能够在它们的种子中合成EPA和DHA(图6和图7)，如通过气相色谱分析脂肪酸甲酯所确定。
在2013年冬季期间在USDA生长区带11的田间试验中栽培了在温室中具有较高水平EPA和DHA的某些事件(包括LBFLFK和LBFDAU)，并且检查了T1世代中的脂肪酸特征、地上部分表型(如有)和拷贝数。对LBFLFK和LBFDAU未观察到表型异常或拷贝数异常。T2种子中的EPA和DHA含量大约等于温室中的EPA和DHA产生量(图6和图7)。对来自单个植物事件LBFDAU的数个T2种子单个地进行了脂肪酸分析。结果表明，在单株植物的种子中存在宽范围的EPA/DHA含量，但是全部种子均含有至少一些EPA和DHA，并且一些单种子含有超过在整批种子中所见两倍的EPA/DHA(图8)。
在T2世代中，温室中筛选十个事件。对于每个事件，选择两株纯合T1植物的T2种子批供播种。对每株T2植物进行拷贝数分析并且结果证实T2种子的确是纯合的。在温室中观察T2植物，并且与T1植物一样，不存在因插入T-DNA的存在而引起的对LBFLFK和LBFDAU T2植物表型的明显影响。对温室中培育的T2植物进行额外的分子表征。qPCR和Southern印迹分析用来确认载体主链的缺失。发现LBFLFK和LBFDAU不含载体主链。从温室培育的植物采集T3种子并测量EPA和DHA含量(图6和图7)。
还在2014年夏季期间在USDA生长区带3a-4b和5a的田间试验中栽培某些T2事件。记录表型评级如直立数(stand count)、出苗生长势、至首次开花的天数、至最后开花的天数、至种子成熟的天数、植物高度、倒伏和荚果掉落。事件LBFLFK的一些植物比WT Kumily的生长势略弱并且开花较之晚两天，但其它无区别。还筛选田间培育的事件的咪唑啉酮耐受性。表4显示因喷洒过咪唑啉酮除草剂的植物招致的损伤。第一列中显示事件。IMI损伤：根据表5中详述的量表的损伤(DAT＝处理后天数)。除草剂甲氧咪草烟(imazamox)按70g甲氧咪草烟/公顷的2倍率施加。作为否则相对于该事件为同基因的非转基因对比品系，欧洲油菜栽培品种Kumily被评定为6至7级，从统计分析中移除。使用软件JMP11.0实施ANOVA。使用Tukey检验在95％置信度水平实施分析。表4中各事件之间的共同字母表示除草剂耐受性无显著差异。从田间收获T3种子并用于脂肪酸分析。图6和图7显示田间产生的分别来自LBFLFK和LBFDAU的T3种子能够合成EPA和DHA至与针对GH产生的T3种子观测的相同水平。
在夏季期间在USDA生长区带3a-4b和5a的田间试验中栽培选出的事件。播种纯合的T4种子并且收获所产生的T5种子并进行脂肪酸分析。LBFLFK和LBFDAU的T5种子维持产生EPA和DHA的能力(图6和图7)。基于EPA/DHA特征和咪唑啉酮耐受性，选择事件LBFLFK和LBFDAU。
表4：在USDA生长区3a-4b和5a田间试验中栽培的LBFLFK和LBFDAU T2植物的除草剂耐受性
表5：除草剂用卡诺拉油菜评级量表
实施例3：从转基因事件分离基因组侧翼序列
测定在事件LBFLFK和LBFDAU中每个T-DNA插入物侧翼的基因组DNA序列。从事件LBFLFK和LBFDAU的温室培育植物收获叶样品并冷冻。研磨叶组织并且使用植物基因组DNA提取标准方案，提取基因组DNA。随后通过衔接头连接介导的PCR，将来自每个事件的一个等分量的基因组DNA用来分离侧翼序列，如O’Malley等人2007Nature Protocols 2(11):2910-2917中所述。使用这项技术，生成含有T-DNA边界和相邻基因组DNA的序列的PCR产物。对于每个事件，获得与每个T-DNA基因座的左边界和右边界相对应的四种不同PCR产物。将各个PCR产物分离并使用标准DNA测序方案测序，以确定侧翼区的序列。侧翼序列用以从事件LBFLFK和LBFDAU的每个基因座分离完整的T-DNA插入物并对其测序。为此目的，使用本领域技术人员已知的方法(如长距离PCR和Sanger测序法)的组合。图2-5显示在事件LBFLFK和LBFDAU的各基因座处的T-DNA结构。
事件LBFLFK中基因座1处延伸入T-DNA右边界的侧翼序列是SEQ ID NO:6，其中核苷酸1-570是基因组DNA(图2)。事件LBFLFK中基因座1处延伸入T-DNA左边界的侧翼序列是SEQ ID NO:7，其中核苷酸229-811是基因组DNA(图2)。通过将这些侧翼序列与事件LBFLFK基因座1处完整T-DNA插入物的序列对齐，产生一个44910bp重叠群(SEQ ID NO:2)。
事件LBFLFK中基因座2处延伸入T-DNA右边界的侧翼序列是SEQ ID NO:15，其中核苷酸1-2468是基因组DNA(图3)。事件LBFLFK中基因座2处延伸入T-DNA左边界的侧翼序列是SEQ ID NO:16，其中核苷酸242-1800是基因组DNA(图3)。通过将这些侧翼序列与事件LBFLFK基因座2处完整T-DNA插入物的序列(SEQ ID NO:12)对齐，产生一个47800bp重叠群(SEQ ID NO:11)。
事件LBFDAU中基因座1处延伸入T-DNA右边界的侧翼序列是SEQ ID NO:24，其中核苷酸1-1017是基因组DNA(图4)。事件LBFDAU中基因座1处延伸入T-DNA左边界的侧翼序列是SEQ ID NO:25，其中核苷酸637-1677是基因组DNA(图4)。通过将这些侧翼序列与事件LBFDAU的基因座1处完整T-DNA插入物的序列(SEQ ID NO:21)对齐，产生一个45777bp重叠群(SEQ ID NO:21)。
事件LBFDAU中基因座2处延伸入T-DNA右边界的侧翼序列是SEQ ID NO:33，其中核苷酸1-1099是基因组DNA(图5)。事件LBFDAU中基因座2处延伸入T-DNA左边界的侧翼序列是SEQ ID NO:34，其中核苷酸288-1321是基因组DNA(图5)。通过将这些侧翼序列与事件LBFDAU的基因座2处完整T-DNA插入物的序列(SEQ ID NO:30)对齐，产生一个39620bp重叠群(SEQ ID NO:29)。
来自事件LBFLFK和LBFDAU的每个侧翼序列包含T-DNA边界与相邻基因组DNA的实际接头。这些接头区域可以用20bp DNA序列描述，其中10bp DNA对应于右边界或左边界，而另10bp对应于相邻基因组DNA(表6)。
表6：LBFLFK和LBDFAU的T-DNA基因座的20bp接头区域序列。
实施例4：事件特异性检测和接合性分析试验
实施例3中分离的侧翼序列(对于LBFLFK基因座1，SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7；对于LBFLFK基因座2，SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；对于LBFDAU基因座1，SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；对于LBFDAU基因座2，SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34)用于设计事件特异性检测试验，以检验事件LBFLFK和LBFDAU的存在。在本实施例中提供了特异性引物对，但是公开的侧翼序列可以用来设计不同引物对以产生针对每个事件的每个基因座具有诊断性的扩增子。可以用来产生下述扩增子的任何引物对均可以用于检测事件LBFLFK或LBFDAU并且涵盖在本发明的范围内，其中所述扩增子包含由以下序列代表的接头序列的至少11个连续bp：对于LBFLFK基因座1，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；对于LBFLFK基因座2，SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；对于LBFDAU基因座1，SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；对于LBFDAU基因座2，SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32。
开发了检测基因座的终点Taqman qPCR分析试验并在本实施例中描述。其他方法可以是已知的并可以由本领域技术人员用于检测事件LBFLFK和LBFDAU。表7中列出用于这些试验的寡核苷酸引物，表8和表9中提供终点Taqman qPCR试验条件。检测来自LBFDAU和LBFLFK的每个基因座需要使用正向引物、反向引物和探针的特定组合。用FAM/BHQ1标记针对目的靶的TaqMan探针。在此描述的方法针对来自Life Technologies的QuantstudioTM12KFlex实时PCR系统进行优化，但通过本领域技术人员已知的少量改良，多种方法可以适应于其他系统。用JumpStart TaqReadyMix(Sigma,P2893)在384孔平板(Life technologies，目录号4309849)中以10微升/孔的总体积实施终点Taqman qPCR分析。根据下表8，在每个反应中，2μl模板DNA与8微升qPCR反应混合物混合。用光学胶粘膜(LifeTechnologies，目录号4311971)密封平板。使用表9中描述的循环参数实施反应。
表7：在终点Taqman qPCR分析试验中用于事件特异性检测的引物和探针。
表8：用于事件特异性终点Taqman qPCR分析试验的反应组分。
表9.终点Taqman qPCR循环参数
LBFLFK基因座1的示例性诊断扩增子含有SEQ ID NO:5所示的接头序列。LBFLFK基因座2的示例性诊断扩增子含有SEQ ID NO:14所示的接头序列。LBFDAU基因座1的示例性诊断扩增子含有SEQ ID NO:23所示的接头序列。LBFDAU基因座2的示例性诊断扩增子含有SEQID NO:32所示的接头序列。在终点Taqman qPCR分析中，通过探针与靶扩增子杂交导致荧光信号释放，来检测扩增子。这项分析的对照应当包括来自已知含有事件LBFLFK或事件LBFDAU DNA的一个或多个基因座的植物的阳性对照、来自非转基因植物的阴性对照和不含有模板DNA的阴性对照。
可以通过与下述PCR反应同时进行上文描述的终点Taqman qPCR分析，确定转基因植物的接合性，所述PCR反应扩增与事件LBFLFK和LBFDAU的各基因座相对应的非转基因基因组插入位点。表10中列出寡核苷酸引物连同聚合酶的名称和应当用于每个引物对的循环条件。表11、表12和表13中列出了PCR反应组分和循环参数。优化反应，以使用KOD热启动聚合酶(EMD Millipore 71086)或Phusion热启动DNA聚合酶(New England Biolabs M0535)实施。反应体积是50μL并根据表11和表12建立。表13中描述所使用的循环参数。表10中列出用于每个引物对的循环条件的名称。可以通过多种本领域技术人员已知的方法，如琼脂糖凝胶电泳，可视化PCR产物。LBFDAU基因座1的预计扩增子大小是约592bp。LBFDAU基因座2的预计扩增子大小是约247bp。LBFLFK基因座1的预计扩增子大小是约542bp。LBFLFK基因座2的预计扩增子大小是约712bp。
表10：使用PCR用于接合性检验的引物。
表11：用于KOD聚合酶反应的PCR反应组分
表12.用于Phusion聚合酶反应的PCR反应组分
表13.用于确定接合性的PCR热循环方案
对于给定的基因座，通过比较使用表7中引物的终点Taqman qPCR反应结果与使用表10中对应于相同基因座的引物的PCR反应结果，确定接合性。对于给定的基因座，终点Taqman qPCR分析的阳性结果组合该PCR的阴性结果，指示纯合转基因植物。终点TaqmanqPCR分析的阳性结果组合该PCR的阳性结果，指示对于该特定基因座，植物为半合子。终点Taqman qPCR分析的阴性结果组合该PCR的阳性结果，指示植物在该基因座处是非转基因的。使用这些方法，可以独立地确定任何植物中事件LBFLFK和LBFDAU的每个T-DNA基因座的接合性。
仅供受理局使用
仅供国际局使用

Claims (30)

1.芸苔属植物，其包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14。
2.芸苔属种子，其包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14。
3.包含事件LBFLFK的芸苔属植物或种子，其中包含转化事件LBFLFK的种子样品已经以ATCC保藏号PTA-121703保藏。
4.根据权利要求3所述的芸苔属植物的后代，其中后代包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14。
5.人工DNA分子，其包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的序列。
6.在包含DNA的样品中检测与芸苔属事件LBFLFK相对应的DNA存在的方法，所述方法包括步骤：
(a)使样品与LBFLFK基因座1引物对和LBFLFK基因座2引物对接触，其中所述引物对在具有来自芸苔属事件LBFLFK的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时，产生诊断芸苔属事件LBFLFK的基因座1扩增子和基因座2扩增子；
(b)进行核酸扩增反应，由此产生基因座1扩增子和基因座2扩增子；和
(c)检测扩增子，其中一个扩增子包含LBFLFK基因座1接头区域SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5或其互补序列，一个扩增子包含LBFLFK基因座2接头区域SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14或其互补序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其中：
(a)LBFLFK基因座1引物对包含：
(i)第一引物，其选自SEQ ID NO:6的至少11个连续核苷酸、SEQ ID NO:6的互补序列的至少11个连续核苷酸、SEQ ID NO:7的至少11个连续核苷酸和SEQ ID NO:7的互补序列的至少11个连续核苷酸；和
(ii)第二引物，其选自SEQ ID NO:3的至少11个连续核苷酸和SEQ ID NO:3的互补序列的至少11个连续核苷酸，和
(b)LBFLFK基因座2引物对包含：
(i)第三引物，其选自SEQ ID NO:15的至少11个连续核苷酸、SEQ ID NO:15的互补序列的至少11个连续核苷酸、SEQ ID NO:16的至少11个连续核苷酸和SEQ ID NO:16的互补序列的至少11个连续核苷酸；和
(ii)第四引物，其选自SEQ ID NO:12的至少11个连续核苷酸和SEQ ID NO:12的互补序列的至少11个连续核苷酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其中第一引物包含SEQ ID NO:8，第二引物包含SEQ IDNO:9，第三引物包含SEQ ID NO:17，并且第四引物包含SEQ ID NO:18。
9.根据权利要求6所述的方法，还包括步骤：
d)使样品与LBFLFK基因座1野生型引物对和LBFLFK基因座2野生型引物对接触，其中所述LBFLFK基因座1野生型引物对包含LBFLFK基因座1转基因插入的芸苔属基因组区域的至少11个连续核苷酸，所述LBFLFK基因座2野生型引物对包含LBFLFK基因座2转基因插入的芸苔属基因组区域的至少11个连续核苷酸；
e)进行核酸扩增反应，由此产生与LBFLFK基因座1和LBFLFK基因座2插入相对应的同源野生型芸苔属基因组区域的扩增子；
f)检测该野生型芸苔属扩增子；
g)比较步骤c)中产生的扩增子与步骤f)中产生的扩增子，其中两种扩增子的存在表明，就LBFLFK基因座1和基因座2转基因插入而言，样品是杂合的。
10.用于检测生物样品中芸苔属事件LBFLFK的试剂盒，其中试剂盒利用包括以下步骤的方法：
(a)使样品与LBFLFK基因座1特异性DNA引物对和LBFLFK基因座2特异性DNA引物对接触；
(b)进行核酸扩增反应，由此产生两种扩增子；和
(c)检测扩增子，其中LBFLFK基因座1扩增子包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5，并且LBFLFK基因座2扩增子包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14。
11.油或粕，其衍生自芸苔属事件LBFLFK种子或其后代。
12.根据权利要求11所述的油或粕，其中油或粕包含可检测量的诊断芸苔属事件LBFLFK的核苷酸序列，其中所述序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13和SEQID NO:14。
13.包含可检测量的芸苔属事件LBFLFK DNA序列的商业产品，其中所述序列选自SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14。
14.用于产生包含改变的VLC-PUFA含量的芸苔属植物的方法，所述方法包括步骤：将包含芸苔属事件LBFLFK的植物与缺少事件LBFLFK的芸苔属植物杂交以获得包含芸苔属事件LBFLFK和改变的VLC-PUFA含量的植物，其中事件LBFLFK的样品已经以ATCC保藏号PTA-121703保藏。
15.用于产生包含芸苔属事件LBFLFK的芸苔属品种的方法，包括步骤：将包含芸苔属事件LBFLFK的植物与第二芸苔属植物杂交，其中事件LBFLFK的样品已经以ATCC保藏号PTA-121703保藏。
16.芸苔属植物，其包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31和/或SEQ ID NO:32。
17.芸苔属种子，其包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31和/或SEQ ID NO:32。
18.包含事件LBFDAU的芸苔属植物或种子，其中包含转化事件LBFDAU的种子样品已经以ATCC保藏号PTA-122340保藏。
19.根据权利要求18所述的芸苔属植物的后代，其中后代包含SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32。
20.人工DNA分子，其包含选自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:32的序列。
21.在包含DNA的样品中检测与芸苔属事件LBFDAU相对应的DNA存在的方法，所述方法包括步骤：
(a)使样品与LBFDAU基因座1引物对和LBFDAU基因座2引物对接触，其中所述引物对在具有来自芸苔属事件LBFDAU的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时，产生诊断芸苔属事件LBFLFK的基因座1扩增子和基因座2扩增子；
(b)进行核酸扩增反应，由此产生基因座1扩增子和基因座2扩增子；和
(c)检测扩增子，其中一个扩增子包含LBFDAU基因座1接头区域SEQ ID NO:22或SEQ IDNO:23，一个扩增子包含LBFLFK基因座2接头区域SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32。
22.根据权利要求21所述的方法，其中：
(a)LBFLFK基因座1引物对包含：
(i)第一引物，其选自SEQ ID NO:24的至少11个连续核苷酸、SEQ ID NO:24的互补序列的至少11个连续核苷酸、SEQ ID NO:25的至少11个连续核苷酸和SEQ ID NO:25的互补序列的至少11个连续核苷酸；和
(ii)第二引物，其选自SEQ ID NO:21的至少11个连续核苷酸和SEQ ID NO:21的互补序列的至少11个连续核苷酸，和
(b)LBFLFK基因座2引物对包含：
(i)第三引物，其选自SEQ ID NO:33的至少11个连续核苷酸、SEQ ID NO:33的互补序列的至少11个连续核苷酸、SEQ ID NO:34的至少11个连续核苷酸和SEQ ID NO:34的互补序列的至少11个连续核苷酸；和
(ii)第四引物，其选自SEQ ID NO:30的至少11个连续核苷酸和SEQ ID NO:30的互补序列的至少11个连续核苷酸。
23.根据权利要求22所述的方法，其中第一引物包含SEQ ID NO:26，第二引物包含SEQID NO:27，第三引物包含SEQ ID NO:35，并且第四引物包含SEQ ID NO:36。
24.根据权利要求21所述的方法，还包括步骤：
d)使样品与LBFDAU基因座1野生型引物对和LBFDAU基因座2野生型引物对接触，其中所述LBFDAU基因座1野生型引物对包含LBFDAU基因座1转基因插入的芸苔属基因组区域的至少11个连续核苷酸，所述LBFDAU基因座2野生型引物对包含LBFDAU基因座2转基因插入的芸苔属基因组区域的至少11个连续核苷酸；
e)进行核酸扩增反应，由此产生与LBFDAU基因座1插入和LBFDAU基因座2插入相对应的同源野生型芸苔属基因组区域的扩增子；
f)检测该野生型芸苔属扩增子；
g)比较步骤c)中产生的扩增子与步骤f)中产生的扩增子，其中两种扩增子的存在表明，就LBFDAU基因座1和基因座2转基因插入而言。样品是杂合的。
25.用于检测生物样品中芸苔属事件LBFDAU的试剂盒，其中试剂盒利用包括以下步骤的方法：
使样品与LBFDAU基因座1特异性DNA引物对和LBFDAU基因座2特异性DNA引物对接触；
进行核酸扩增反应，由此产生两种扩增子；和
检测扩增子，其中LBFDAU基因座1扩增子包含SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23，并且LBFDAU基因座2扩增子包含SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32。
26.油或粕，其衍生自芸苔属事件LBFDAU种子或其后代。
27.根据权利要求26所述的油或粕，其中油或粕包含可检测量的诊断芸苔属事件LBFDAU的核苷酸序列，其中所述序列选自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32。
28.包含可检测量的芸苔属事件LBFDAU核苷酸序列的商业产品，其中所述序列选自SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32。
29.用于产生包含改变的VLC-PUFA含量的芸苔属植物的方法，所述方法包括步骤：将包含芸苔属事件LBFDAU的植物与缺少事件LBFDAU的芸苔属植物杂交以获得包含芸苔属事件LBFDAU和改变的VLC-PUFA含量的植物，其中事件LBFDAU的样品已经以ATCC保藏号PTA-122340保藏。
30.用于产生包含芸苔属事件LBFDAU的芸苔属品种的方法，包括步骤：将包含芸苔属事件LBFDAU的植物与第二芸苔属植物杂交，其中事件LBFDAU的样品已经以ATCC保藏号PTA-122340保藏。
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