CN102448288B - 转基因水稻事件17314及其使用方法 - Google Patents

转基因水稻事件17314及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供转基因水稻事件17314及源自事件17314的植物、植物细胞、种子、植物部分和商品。本发明还提供对于事件17314特异性的多核苷酸及包含对于事件17314特异性的多核苷酸的植物、植物细胞、种子、植物部分和商品。本发明还提供与事件17314相关的方法。

Description

转基因水稻事件17314及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求享有于2009年3月30日提交的美国临时申请61/164,895的优先权，本文通过引用完整并入本申请中。
序列表的引入
序列表是本发明公开内容的一部分，包括计算机可读形式的15KB的文件，名称为“MONS245WO_ST25.txt”，包括本发明的核苷酸和/或氨基酸序列，通过EFS-Web提交。序列表的主题通过引用完整并入本申请中。
技术领域
本发明涉及转基因水稻事件17314。包含该事件的植物显示对于草甘膦除草剂的耐受性。本发明还涉及核酸分子、植物、植物部分、植物种子、植物细胞、农产品及涉及事件17314的方法。本发明提供该事件独特的核苷酸分子，且所述核苷酸分子是通过转基因DNA插入水稻基因组中而产生的。
背景技术
水稻是世界许多地区的一种重要的作物。生物技术方法已应用于水稻，以生产具有改良性状的水稻。一种这样的改良的性状是除草剂耐受性。除草剂耐受性转基因在植物中的表达可用于生产具有理想的除草剂耐受性的性状的植物。转基因在植物中的表达可能会受转基因的染色体位置影响，可能是由于染色质结构(如异染色质)或靠近整合位点的转录调控元件(如增强子)的接近性。基于这个原因，通常需要筛选大量的单个植物转化事件，以判断具有转基因的最佳表达的事件，进而判断特定的需要的特征。例如，在植物中已观察到：转基因的表达水平在事件之间差异很大。在表达的空间或时间模式上也有差异，例如，在不同植物组织中的相对转基因表达水平的差异，这可能不符合从引入的基因构建体中存在的转录调控元件预期的模式。基于这个原因，可能必须产生数百至数千个不同的转基因事件，并对这些事件进行筛选，以选择具有所需转基因表达水平和用于商业目的的模式的事件。这种具有理想的转基因表达水平或模式的事件然后可以用于使用植物育种方法通过有性杂交将转基因渗入其他遗传背景中。这种杂交的后代具有原转化体的转基因表达特征。这可以用来确保适当地适应当地特定生长条件的许多不同品种中的可靠的基因表达。
发明概述
本发明提供包含事件17314的转基因水稻，其显示商业上可接受的对于草甘膦除草剂的应用的耐受性，其代表性种子以保藏号PTA-9844保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。本发明还提供包含事件17314的水稻的种子、后代、植物部分、细胞和商品。本发明还提供与包含事件17314的水稻的基因组相关的新的DNA分子及使用这些分子的方法。本发明还提供使用转基因水稻事件17314和包含该事件的植物的方法及生产耐受草甘膦的水稻的方法。
本发明提供与水稻事件17314相关的DNA分子。这些DNA分子可以包含代表或衍生自以下的核苷酸序列：水稻事件17314的转基因插入与侧翼基因组DNA之间的连接点，和/或位于插入DNA侧翼的基因组DNA的区域，和/或位于插入位点侧翼的整合转基因DNA的区域，和/或整合转基因表达盒的区域，和/或任何这些区域的连续序列。本发明还提供用作判断水稻事件17314的引物和探针的DNA分子。本发明还公开包含这些分子的水稻、植物细胞、植物部分、商品、后代和种子。
本发明提供用于检测由水稻事件17314衍生的DNA的存在的方法、组合物和试剂盒。本发明提供一种检测事件17314的方法，该方法包括将包含DNA的样品与引物组接触，所述引物组在用于来自水稻事件17314的基因组DNA的核酸扩增反应时，产生能够判断水稻事件17314的扩增的DNA，进行核酸扩增反应，从而产生扩增的DNA，并检测扩增的DNA。本发明还提供一种检测事件17314的方法，该方法包括将包含DNA的样品与探针接触，所述探针在用于来自水稻事件17314的基因组DNA的杂交反应时，与水稻事件17314特异性的DNA分子杂交，进行杂交反应，并检测探针与DNA分子的杂交。本发明还提供包括本发明的方法和组合物的试剂盒，用于检测衍生自水稻事件17314的DNA的存在。
本发明提供包含事件17314的水稻、种子、植物细胞、后代植物、植物部分或衍生自水稻的植物、植物细胞或种子的商品。本发明还提供包含具有选自SEQ ID NO：1-6及其互补序列和片段的核苷酸序列的DNA分子或包含与SEQ ID NO：6至少90％序列一致的DNA分子的水稻、种子、植物细胞、后代植物、植物部分或商品。本发明还提供包含事件17314并且包含一种DNA分子的水稻、种子、植物细胞、后代植物、植物部分或衍生自该植物或种子的商品，所述DNA分子例如在DNA扩增方法中产生包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的扩增的DNA分子。
本发明提供用于在田地中控制杂草的方法，该方法是通过种植包含事件17314的水稻，然后应用有效剂量的能够控制杂草而不损害包含事件17314的植物的草甘膦除草剂。
本发明提供生产耐受草甘膦除草剂的应用的水稻和/或种子的方法，该方法是通过有性杂交包含事件17314或包含SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的水稻与第二水稻，从而产生种子，种植种子以产生后代植物，用草甘膦处理后代植物，并选择耐受草甘膦的后代植物。该方法也可以包括使选定的后代植物自交以产生多个第二代后代植物，并从其中选择耐受草甘膦的植物。该方法还可以包括有性杂交选定的后代植物与另一种水稻以产生种子，种植种子以产生第二代后代植物，用草甘膦处理第二代后代植物，并选择耐受草甘膦的第二代后代植物。本发明提供生产耐受草甘膦除草剂的应用的水稻和/或种子的方法，该方法是通过自交包含事件17314和包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的耐受草甘膦的植物，从而产生种子，种植种子以产生后代植物，用草甘膦处理后代植物，并选择耐受草甘膦的后代植物。
通过下面的详细描述，本发明的上述和其他方面将变得更加明显。
附图说明
图1为水稻事件17314的图解表示：[A]对应于5’连接区(提供为SEQ ID NO：1)的相对位置，这是水稻基因组和插入的转基因DNA的5’部分之间的连接区域；[B]对应于3’连接区(提供为SEQ ID NO：2)的相对位置，这是水稻基因组和插入的转基因DNA的3’部分之间的连接区域；[C]对应于插入的转基因DNA的5’侧翼区域和5’末端一部分(提供为SEQ ID NO：3)的相对位置，这包括位于事件17314的整合表达盒侧翼的5’水稻基因组序列和转基因DNA的5’端的区域；[D]对应于插入的转基因DNA的3’侧翼区域和3’末端一部分(提供为SEQ ID NO：4)的相对位置，这包括位于事件17314的整合表达盒侧翼的3’水稻基因组序列和转基因DNA的3’端的区域；[E]代表插入到事件17314的基因组中的转基因表达盒(提供为SEQ ID NO：5)；[F]代表包含如图中从左至右示出的SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：4的侧翼序列和转基因表达盒(提供为SEQ ID NO：6)的连续序列，其中，如上所示，包含有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，因为这些序列代表事件17314的连接序列。
序列简要说明
SEQ ID NO：1-代表水稻基因组DNA与整合的表达盒之间的5’连接序列的20个核苷酸的序列。该核苷酸序列对应于SEQ ID NO：3([C]，见图1)的283至302位和SEQ ID NO：6的283至302位。
SEQ ID NO：2-代表整合的表达盒与水稻基因组DNA之间的3’连接序列的20个核苷酸的序列。该核苷酸序列对应于SEQ ID NO：4([D]，见图1)的666至685位，SEQ ID NO：2的反向互补序列对应于SEQ ID NO：6的3397至3416位。
SEQ ID NO：3-位于事件17314的插入DNA侧翼的5’序列直至并包括转基因DNA的区域。SEQ ID NO：3的核苷酸283至302位对应于SEQ ID NO：1的核苷酸1至20位，SEQ ID NO：3的核苷酸293至302位对应于SEQ ID NO：5的核苷酸1至10位。
SEQ ID NO：4-位于事件17314的插入DNA侧翼的3’序列直至并包括转基因DNA插入的区域。SEQ ID NO：4的核苷酸666至685位对应于SEQ ID NO：2的核苷酸1至20位，SEQ ID NO：4的核苷酸666至685位的反向互补链对应于SEQ ID NO：5的核苷酸3105至3114位。
SEQ ID NO：5-赋予草甘膦除草剂耐受性的整合的表达盒的序列。SEQ ID NO：5对应于SEQ ID NO：6的核苷酸293至3046位。
SEQ ID NO：6-代表位于事件17314的插入DNA侧翼的5’序列(SEQ ID NO：3)、整合的表达盒的序列(SEQ ID NO：5)和位于事件17314的插入DNA侧翼的3’序列(SEQ ID NO：4的反向互补序列)的叠连群的核苷酸序列。
SEQ ID NO：7-引物SQ4183，用来识别事件17314。引物SQ4183与位于插入表达盒的5’区域侧翼的基因组区域互补，接近右侧转基因DNA插入边界。使用引物SQ4183和SQ4191(SEQ ID NO：8)的组合产生的扩增子表明17314事件的存在。
SEQ ID NO：8-引物SQ4191，用来识别事件17314。引物SQ4191与插入表达盒的5’区域互补，接近转基因DNA插入边界。使用引物SQ4183(SEQ ID NO：7)和SQ4191的组合产生的扩增子表明17314事件的存在。
SEQ ID NO：9-PB1491探针，用来识别事件17314，且与5’连接序列的片段互补。该探针可以连接可检测的标签，如6FAMTM。使用引物(如SQ4183和SQ4191)在TAQMAN(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)检测中释放荧光信号，与探针(如6FAMTM标记的探针PB1491)组合，用于判断事件17314的存在。
SEQ ID NO：10-引物SQ1875，用来识别事件17314。引物SQ1875与插入表达盒的3’区域互补，接近转基因DNA插入边界。使用引物SQ1875和SQ3628(SEQ ID NO：11)的组合产生的扩增子表明17314事件的存在。
SEQ ID NO：11-引物SQ3628，用来识别事件17314。引物SQ3628与位于插入表达盒的3’末端侧翼的基因组区域互补，接近转基因DNA插入边界。使用引物SQ1875(SEQ ID NO：10)和SQ3628的组合产生的扩增子表明17314事件的存在。
SEQ ID NO：12-引物SQ1871，用来识别位于基因组DNA侧翼的事件17314。引物SQ1871与插入表达盒的5’区域互补，接近转基因DNA插入边界。
SEQ ID NO：13-引物SQ1869，用来识别位于基因组DNA侧翼的事件17314。引物SQ1869与插入表达盒的5’区域互补，接近转基因DNA插入边界。
SEQ ID NO：14-引物SQ1880，用来识别位于基因组DNA侧翼的事件17314。引物SQ1880与插入表达盒的3’区域互补，接近转基因DNA插入边界。
SEQ ID NO：15-引物SQ3629，用来识别位于基因组DNA侧翼的事件17314。引物SQ3626与位于插入表达盒的5’末端侧翼的基因组区域互补，接近转基因DNA插入边界。
SEQ ID NO：16-引物SQ3627，用来识别位于基因组DNA侧翼的事件17314。引物SQ3627与位于插入表达盒的3’末端侧翼的基因组区域互补，接近转基因DNA插入边界。
发明详述
提供下面的定义和方法以更好地定义本发明并指导本领域普通技术人员实施本发明。除非另有说明，应当根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解术语。
本文使用的术语“包括(包含)”指“包括但不限于”。
本发明提供事件17314和包含17314事件的转基因水稻，其显示商业上可接受的对于草甘膦除草剂应用的耐受性。该事件包括转基因DNA单插入到水稻种质的染色体/基因组内。包含事件的植物可以通过以下步骤产生：(i)用包括目标转基因的核酸构建体转化植物细胞；(ii)再生由向植物基因组中插入转基因而产生的植物群体；和(iii)选择以在植物基因组中的特定位置插入转基因为特征的特定植物。术语“事件”指目标基因向基因组中特定位置的特定的转基因插入。包含事件的植物可以指原始的转化体，其包括插入到植物基因组中的特定位置的转基因。包含事件的植物也可以指转化体的后代，该转化体包括插入到植物的基因组中的特定位置的转基因。这种后代可以通过该转化体或其后代与另一种植物之间的有性远交产生。这样的其他植物可以是包含相同或不同的转基因的转基因植物和/或非转基因植物，如不同的品种中的一种。即使经过与回交亲本的反复回交，来自转化的亲本的插入DNA和侧翼DNA仍然存在于杂交后代中的相同的基因组位置。
本文使用的术语“水稻”是指水稻(Oryza sativa)，包括所有可与水稻繁殖的植物品种，包括野生稻种以及那些属于稻属的允许物种间繁殖的植物。
术语“事件”也指来自包含插入DNA和紧邻插入DNA任一侧的侧翼水稻基因组DNA的原始转化体的DNA分子。这种DNA分子通过将转基因DNA插入水稻的基因组(即转化)来产生。因此，这种DNA分子包含对于事件为特异性的且对于已向其中插入转基因DNA的水稻基因组独特的核苷酸序列，因为这种核苷酸序列包含水稻基因组DNA和转基因DNA插入的特定区域的序列。插入DNA在水稻事件17314中相对于周围水稻基因组DNA的排列因此对于水稻事件17314是特异性且独特的。这种DNA分子也是包含事件17314的植物的水稻染色体的组成部分，因此在植物中是静态的，并且可以传递到该植物的后代。
事件17314赋予对应用于水稻的草甘膦除草剂的耐受性。“草甘膦”指N-磷酰基甲基甘氨酸及其盐。N-磷酰基甲基甘氨酸是一种对于广谱植物种类具有活性的除草剂。当施用到植物表面时，草甘膦可在整个植物中移动。由于它抑制可提供用于合成芳族氨基酸的前体的莽草酸途径，草甘膦具有植物毒性。
本文使用的术语“重组”指通常在自然界不被发现的DNA和/或蛋白质和/或有机体的形式，其是通过人工干预创造的。这种人工干预可以产生重组DNA分子和/或重组植物。本文使用的“重组DNA分子”是包含在自然界不会一起出现的DNA分子的组合的DNA分子，是人工干预的结果，例如，包括至少两个彼此异源的DNA分子的组合的DNA分子，和/或包含与在自然界通常存在的多核苷酸序列不同的多核苷酸序列的人工合成DNA分子，和/或包含人工掺入宿主细胞基因组DNA内的转基因和宿主细胞基因组的相关侧翼DNA的DNA分子。重组DNA分子的一个例子是本文所述的由转基因插入水稻基因组产生的DNA分子，这可能最终导致重组RNA和/或蛋白质分子在该生物体中的表达。本文使用的“重组植物”是一种植物，其通常不会存在于自然界，是人工干预的结果，并包含掺入其基因组中的转基因和/或异源DNA分子。由于这种基因组改变，重组植物与相关的野生型植物明显不同。重组植物的一个例子是本文所述的包含事件17314的水稻。
本文使用的术语“转基因”指人工掺入宿主细胞基因组的多核苷酸分子。这种转基因可以对于宿主细胞是异源的。术语“转基因植物”指包括这种转基因的植物。
本文使用的术语“异源的”指在自然界中通常不会与第二分子一同出现的第一分子。例如，分子可以来自第一物种，并插入到第二物种的基因组内。该分子因此对于宿主是异源的，且人工掺入宿主细胞的基因组内。
本文使用的术语“嵌合的”指通过将第一DNA分子与第二DNA分子融合产生的单个DNA分子，其中，第一DNA分子和第二DNA分子通常不会以该构型出现，即与另一个融合。因此嵌合DNA分子是通常不会在自然界中发现的新的DNA分子。
本发明提供DNA分子及其相应的核苷酸序列。本文使用的术语“DNA”、“DNA分子”、“多核苷酸分子”指基因组或合成来源的双链DNA分子，即，脱氧核糖核苷酸碱基的聚合物或多核苷酸分子，从5’(上游)末端向3’(下游)末端阅读。本文使用的术语“DNA序列”、“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”指DNA分子的核苷酸序列。本文使用的命名法是按照美国联邦法规§1.822第37条的规定和WIPO标准ST.25(1998)附录2的表1和3所要求的。本发明的公开只是关于插入转基因DNA位置处转基因事件17314的基因组中存在的两个核苷酸序列链中的一条链，特别是SEQ ID NOS：1-6。因此，通过隐含和推导，互补序列(在本领域中也被称为完整的互补序列或反向互补序列)也在本发明的范围之内，因此也意图在要求保护的主题的范围内。
对应于插入转基因DNA的完整核苷酸序列和位于插入转基因DNA任一端侧翼的水稻基因组DNA的大部分片段的核苷酸序列在此以SEQID NO：6提供。该序列的小部分为以SEQ ID NO：5提供的插入转基因DNA。通过磷酸二酯键物理连接至插入转基因DNA(SEQ ID NO：5)的5’末端因而位于其侧翼的水稻基因组DNA的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。通过磷酸二酯键物理连接至插入转基因DNA(SEQ ID NO：5)的3’末端因而位于其侧翼的水稻基因组DNA的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示。
事件17314还包括两个多核苷酸序列，一个跨越5’位置，一个跨越3’位置，其中转基因DNA被插入到基因组DNA，在本文被称为连接序列。“连接序列”或“连接区域”指跨越插入转基因DNA和相邻的侧翼基因组DNA的DNA序列和/或相应的DNA分子。连接序列任意地由两个20核苷酸序列代表，提供为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，分别代表连接至插入DNA的10个核苷酸的紧邻侧翼基因组DNA的10个核苷酸。这些核苷酸通过磷酸二酯键连接。在水稻中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2不会在基因组中天然地出现，且对于转基因事件17314是特异的和独特的，在源自水稻的任何核苷酸序列中鉴定到这些序列或者这些序列中每一个的至少约11、至少约13、或至少约15个连续核苷酸可以确定该DNA是从水稻事件17314中获得的，并且判断样品中存在来自水稻事件17314的DNA。SEQ ID NO：1是跨越水稻基因组DNA和插入DNA的5’末端之间的连接区的20个核苷酸的序列。SEQ ID NO：2是跨越水稻基因组DNA和插入DNA的3’末端之间的连接区的20个核苷酸的序列。因此，本发明提供至少包含由SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2的任一个或两者所示的核苷酸序列的DNA分子。足以包括SEQID NO：1的至少约11、至少约13或至少约15个连续核苷酸的源自转基因水稻事件17314的DNA的任何片段在本发明的范围之内。足以包括SEQ ID NO：2的至少约11、至少约13或至少约15个连续核苷酸的源自转基因水稻事件17314的DNA的任何片段在本发明的范围之内。此外，包含与本段所述的任何序列互补的序列的任何多核苷酸在本发明的范围内。图1说明SEQ ID NO：1-5相对于SEQ ID NO：6从5’至3’排列的物理排列。本发明还提供包括SEQ ID NO：6的至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的核酸分子。
本发明提供可以作为引物或探针用于判断样品中源自事件17314的DNA的存在的示例DNA分子。这样的引物或探针对于靶核酸序列是特异性的，因而可用于通过本文所述的本发明的方法鉴定水稻事件17314。
“引物”通常是高度纯化的、分离的多核苷酸，其被设计用于包括热扩增的特定的退火或杂交方法。一对引物可以与模板DNA(如水稻基因组DNA的样品)用于热扩增，如聚合酶链反应(PCR)，以产生扩增子，其中，由这种反应所产生的扩增子具有对应于位于两个位点之间的模板DNA序列的DNA序列，在这两个位点处引物与模板杂交。本文使用的“扩增子”是已经使用扩增技术合成的DNA的一段或片段。在本发明的一个实施方式中，判断17314事件的扩增子包括不在水稻基因组中自然地存在的序列。本发明的扩增子包括至少约11个连续的核苷酸、至少约13个连续的核苷酸、或SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2的至少约11、至少约13或至少约15个连续核苷酸和/或其互补物。引物通常被设计为与互补靶DNA链杂交以形成引物和靶DNA链之间的杂种，引物的存在是聚合酶的识别点，以使用靶DNA链作为模板开始引物延伸(即，另外的核苷酸聚合成为加长多核苷酸分子)。用于本发明中的引物对意指使用两个结合双链核苷酸片段的相反链的引物，其目的是通常在热扩增反应或其他常规核酸扩增方法中，线性扩增位于将被引物对的各个成员所结合的位点之间的多核苷酸片段。用作引物的示例的DNA分子提供为SEQ ID NO：7-8和10-11。SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的引物对作为第一DNA分子和不同于第一DNA分子的第二DNA分子，且这两种分子的每一个具有SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的足够长度的连续核苷酸或其互补序列，以作为DNA引物发挥功能，当在热扩增反应中与源自水稻事件17314的模板DNA一起使用时，产生包括SEQ ID NO：1的至少约11个连续的核苷酸、至少约13个连续的核苷酸、或至少约11、至少约13或至少约15个连续核苷酸的扩增子。提供示例的DNA分子对，即SEQ ID NO：10和SEQID NO：11，作为第一DNA分子和不同于第一DNA分子的第二DNA分子，这两种分子的每一个具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQID NO：6的足够长度的连续核苷酸或其互补序列，以作为DNA引物发挥功能，当在热扩增反应中与源自水稻事件17314的模板DNA一起使用时，产生包括SEQ ID NO：2的至少约11个连续的核苷酸、至少约13个连续的核苷酸、或至少约11、至少约13或至少约15个连续核苷酸的扩增子。
“探针”是与靶核酸的链互补的分离的核酸。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且包括特异性地结合靶DNA序列的聚酰胺和其他探针材料，并且这种结合的检测可用于判断、区别、确定或确认特定样品中靶DNA序列的存在。探针可以附着至常规可检测的标记或报告分子，如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶。在本发明的一个实施方式中，用于判断事件17314的探针包括不在水稻基因组中自然存在的序列。用作探针的示例的DNA分子提供为SEQ IDNO：9。
本发明的探针和引物可以具有与靶序列的完全序列一致性，虽然可以通过常规方法设计不同于靶序列而保留优先与靶序列杂交的能力的引物和探针。为了使核酸分子用作引物或探针，只需要它们在序列上充分互补以能够在所采用的特定的溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。任何常规的核酸杂交或扩增方法可以用于鉴定样品中来自水稻事件17314的转基因DNA的存在。探针和引物的长度一般为至少约11个核苷酸，至少约18个核苷酸，至少约24个核苷酸，或至少约30个核苷酸或更长。这种探针和引物在严格杂交条件下特异性地与目标DNA序列杂交。Sambrook等人，1989和Haymes等人，In：Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach，IRL Press，Washington，DC(1985)描述了常规的严格性条件。如本文所用，如果两个核酸分子能够形成反平行双链核酸结构，那么这两个分子被认为能够特异性地彼此杂交。如果两个核酸分子表现出完全的互补性，则一核酸分子被认为是另一核酸分子的“互补物”。如本文所用，当一个分子的每个核苷酸都与另一分子的核苷酸互补时，这两个分子被认为显示出“完全的互补性”。如果两个分子能够以足够的稳定性互相杂交从而允许它们在至少常规的“低严格”条件下保持彼此退火，那么这两个分子被认为是“最低限度互补的”。类似地，如果分子能够以足够的稳定性互相杂交从而允许它们在常规的“高严格”条件下保持彼此退火，那么这两个分子被认为是“互补的”。因而偏离完全互补性是允许的，只要这种偏离没有完全消除该分子形成双链结构的能力。
本文使用的术语“分离的”指至少部分分离一种分子与在天然或自然状态下通常与其关联的其他分子。在一个实施方式中，术语“分离的”指与在天然或自然状态下通常位于DNA分子侧翼的核酸至少部分分离的DNA分子。因此，例如通过重组技术融合至与它们通常不相关的调控或编码序列的DNA分子在本文被认为是分离的。甚至在被整合到宿主细胞的染色体中或存在于具有其他DNA分子的核酸溶液中时，这种分子被认为是分离的。
本领域的技术人员公知的任何方法可以用来分离和操作本发明公开的DNA分子或其片段。例如，PCR(聚合酶链反应)技术可用于扩增特定的起始DNA分子和/或产生原始分子的变体。DNA分子或其片段也可以通过其他技术来获得，如通过化学方法直接合成片段，通常通过使用自动化的寡核苷酸合成仪来实现。
因此，本文提供的DNA分子和相应的核苷酸序列尤其可用于鉴定水稻事件17314，选择包含水稻事件17314的植物品种或杂种，检测样品中源自水稻事件17314的DNA的存在，和监测样品中水稻事件17314的存在和/或缺乏或包含水稻事件17314的植物和植物部分。
本发明提供水稻、后代、种子、植物细胞、植物部分(如花粉、胚珠、荚果、花、根或茎组织、纤维和叶)和商品。这些植物、后代、种子、植物细胞、植物部分和商品含有可检测量的本发明的多核苷酸，即，如具有至少一种如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列的多核苷酸。本发明的植物、后代、种子、植物细胞和植物部分也可以包含一种或多种另外的转基因。这种转基因可以是任何编码赋予理想性状的蛋白质或RNA分子的核苷酸序列，该理想性状包括但不限于：增强的抗虫性、提高的水利用效率、增加的产量表现、增强的抗旱性、提高的种子质量、改善的营养品质和/或增强的除草剂耐受性，其中相对于缺乏这种额外的转基因的水稻，测量该理想性状。
本发明提供水稻、后代、种子、植物细胞和源自包含事件17314的转基因水稻的植物部分，如花粉、胚珠、荚果、花、根或茎组织和叶。为了使本发明能够实施，包含事件17314的种子的代表性的样品已根据“布达佩斯条约”保藏。选择的接受保藏物的保藏机构是美国典型培养物保藏中心(ATCC)，地址为美国弗吉尼亚州马纳萨斯UniversityBoulevard 10801，邮编20110。ATCC保藏机构为事件17314种子分配的保藏号为PTA-9844。
本发明提供一种包含具有存在于基因组中的SEQ ID NO：1和SEQID NO：2的DNA分子的微生物。这样的微生物的一个例子是转基因植物细胞。微生物如本发明的植物细胞用于许多工业应用，包括但不限于：(i)用作科学探究或工业研究的研究工具；(ii)在培养中用于生产内源性或重组碳水化合物、脂类、核酸或蛋白质产品或小分子，可用于后续的科研或作为工业产品；和(iii)利用现代植物组织培养技术生产转基因植物或植物组织培养物，然后可以用于农业研究或生产。微生物如转基因植物细胞的生产和使用利用现代微生物技术和人工干预，以产生人造的独特的微生物。在这种方法中，重组DNA被插入植物细胞的基因组，以产生与天然存在的植物细胞不同且独特的转基因植物细胞。然后可以利用现代微生物技术培养这种转基因植物细胞(非常类似于细菌和酵母细胞)，其可以以未分化的单细胞的状态存在。新的植物细胞的遗传组成和表型是通过将异源DNA整合到细胞的基因组中创建的技术效果。本发明的另一个方面是使用本发明的微生物的方法。使用本发明的微生物(如转基因植物细胞)的方法包括：(i)通过将重组DNA整合到细胞的基因组中产生转基因细胞，然后使用这种细胞衍生具有相同异源DNA的其他细胞的方法；(ii)利用现代微生物技术培养含有重组DNA的细胞的方法；(iii)由培养的细胞产生和纯化内源性或重组的碳水化合物、脂类、核酸或蛋白质产品的方法；和(iv)利用现代植物组织培养技术用转基因植物细胞生产转基因植物或转基因植物组织培养物的方法。
本发明的植物可以向后代传递事件DNA(包括转基因)。本文使用的“后代”包括任何包含源自祖先植物的事件DNA和/或具有SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示的至少一种序列的多核苷酸的植物、种子、植物细胞和/或可再生的植物部分。植物、后代和种子对于转基因而言可以是纯合的或杂合的。后代可以从由包含事件17314的水稻产生的种子长成和/或从用来自包含事件17314的水稻的花粉授粉的植物产生的种子长成。
后代植物可以自花授粉(又称“自交”)，以产生植物的纯育种系，即对于转基因而言纯合的植物。合适的后代的自交可以产生对于添加的外源基因而言纯合的植物。
另外，后代植物可以远交，例如，与另一种无关的植物繁殖，以产生变种或杂交种子或植物。其他无关的植物可以是转基因或非转基因的。本发明的变种或杂交种子或植物因此可以通过杂交缺乏水稻事件17314的特异和独特DNA的第一亲本与包含水稻事件17314的第二亲本而产生，产生包含水稻事件17314的特异和独特的DNA的杂种。只要杂交或繁殖产生本发明的植物或种子，即具有至少一个含有包含SEQID NO：1和SEQ ID NO：2的水稻事件17314的特异和独特DNA的等位基因的种子，每个亲本可以为杂种或自交系/变种。因此，两种不同的转基因植物可以杂交以产生包含两个独立分隔、添加的外源基因的杂种后代。例如，包含事件17314的耐受草甘膦的水稻可以与其他转基因水稻杂交以产生具有两个转基因亲本的特征的植物。这样的一个例子是包含事件17314的耐受草甘膦的水稻与具有额外的一种或多种性状的水稻的杂交，导致产生耐受草甘膦并且具有额外的一种或多种性状的后代植物或种子。例如，显示膦丝菌素或草丁膦除草剂耐受性的水稻可以与包含事件17314的水稻杂交以产生耐受草甘膦和膦丝菌素或草丁膦除草剂的后代植物或种子。用于本文公开的方法的植物和种子因此还可以包含一个或多个额外的转基因。这样的转基因可以是任何编码赋予理想性状的蛋白质或RNA分子的核苷酸序列，该理想性状包括但不限于：增强的抗虫性、提高的水利用效率、增加的产量表现、增强的抗旱性、提高的种子质量、改善的营养品质、改善的应激耐受性和/或增强的除草剂耐受性，其中相对于缺乏这种额外的转基因的水稻，测量该理想性状。
已经证明转基因植物对其耐受并且本发明的方法可以应用的除草剂包括但不限于：草甘膦、草丁膦、磺酰脲类、咪唑啉酮类、溴苯腈、茅草枯(delapon)、环己烯二酮、原卟啉原(protoporphyrionogen)氧化酶抑制剂和异噁氟草(isoxasflutole)除草剂。编码与除草剂耐受性有关的蛋白质的多核苷酸分子是本领域已知的，且包括但不仅限于编码以下的多核苷酸分子：草甘膦耐受性的5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS；参见，例如，美国专利5,627,061；5,633,435；6,040,497；5,094,945；5,804,425；6,248,876；7,183,110；RE39,247)；草甘膦氧化还原酶(GOX；参见，例如，美国专利5,776,760)；草甘膦-N-乙酰基转移酶(GAT)；耐受磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑嘧啶类、嘧啶氧苯甲酸酯类和/或杂芳基醚类的耐受除草剂的乙酰乳酸合酶(ALS，也称为乙酰羟酸合酶)；耐受芳氧基苯氧基丙酸酯(AOPP)(如吡氟氯禾灵(haloxyfop)、喹禾灵(quizalofop)、dichlorofop和禾草灵(diclofop))的耐受除草剂的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)或R-2，4-二氯苯氧丙酸酯双加氧酶(rdpA)；耐受合成生长素除草剂的解毒蛋白，如2，4-D双加氧酶(tfdA)、R-2，4-二氯苯氧丙酸酯双加氧酶(rdpA)、芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD)和/或S-2，4-滴丙酸双加氧酶(sdpA)；耐受溴苯腈的溴苯腈腈水解酶(Bxn)(参见，例如，美国专利号4,810,648)；耐受氟草敏(norflurazon)的八氢番茄红素去饱和酶(crtI)；耐受草丁膦和双丙胺磷(bialaphos)的双丙胺磷抗性(bar)或膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinothricin acetyltransferase)蛋白质(参见，例如，美国专利5,646,024和5,276,268)；和三酮类(硝磺草酮(mezotrione)、tembotrione、topromezone、异噁唑))除草剂耐受的蛋白质，如耐受性的4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)、解毒细胞色素P450或HPPD途径旁路如球形节杆菌(Artbrobacterglobiformis)HPP氧化酶(HPPO)和食酸假单胞菌(Pseudomonasacidovorans)4-HPA 1-羟化酶(HPAH)和NADH氧化还原酶(HPAC)。
编码用于转基因植物的其他蛋白质的多核苷酸分子是本领域已知的，包括但不限于编码以下的多核苷酸分子：大肠杆菌cspA(PCT公开WO2005/033318)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)cspB(PCT公开WO2005/033318)、玉米镁转运蛋白(美国公开20040034888、20070011783、20070294782)、玉米nfb2(又名hap3)(美国公开20050022266和20080104730、PCT公开WO2008/002480)、棉花csp-样(美国系列号11/980,758、美国公开20050097640、PCT公开WO2005/033318)、小麦csp样(美国专利7,214,786；美国公开20050097640)、G1988(美国系列号09/474,435、PCT公开WO04/031349)、G1073(美国专利6,717,034和美国公开20050097631)、G1274(美国公开20090265813)和CGPG 2117(美国公开20080090998)。编码用于转基因植物的蛋白质的其他多核苷酸分子是本领域已知的，该蛋白质包括那些用于病虫害控制的蛋白质，如杀线虫剂、杀真菌剂和杀虫剂。杀虫剂包括但不限于Bt毒素和/或来自致病杆菌属(Xenhorabdus)、光杆状菌属(Photorhabdus)、芽孢杆菌属(如侧孢芽孢杆菌属(Bacilluslaterosporous))、沙雷菌属(Serratia)、克雷白杆菌属(Klebsiella)、欧文氏菌属(Erwinia)等的毒素。Bt毒素包括但不限于VIP毒素类、Cry1’s、Cry2’s、Cry3’s、Cry4’s、Cry5’s、Cry7’s、Cry8’s、Cry9’s和二元杀虫毒素，如那些衍生自Bt的毒素等。
也考虑与亲本植物回交以及与非转基因植物远交，以及无性繁殖。常用于不同性状和作物的其他育种方法的描述可以在许多参考文献之一中找到，例如Fehr，in Breeding Methods for CultivarDevelopment，Wilcox J.ed.，American Society of Agronomy，MadisonWI(1987)。
本发明提供源自包含事件17314的水稻的植物部分。本文所用的“植物部分”指植物的任何部分，其包括源自包含事件17314的水稻的材料。植物部分包括但不限于花粉、胚珠、荚果、花、根或茎组织、纤维和叶。植物部分可以是能存活的、不能存活的、可再生的和/或不可再生的。
本发明提供源自包含事件17314的水稻的商品。本文使用的“商品”指任何包括源自包含事件17314的水稻、种子、植物细胞或植物部分的材料的组合物或产品。商品可以出售给消费者，且可以是能存活的或不能存活的。不能存活的商品包括但不限于不能存活的种子和谷粒；加工的种子、种子部分和植物部分；脱水的植物组织、冷冻的植物组织和加工的植物组织；加工的用于陆生和/或水生动物消耗的动物饲料的种子和植物部分、油、粗粉、面粉、薄片、麸皮、纤维、乳液、奶酪、纸、奶油、酒和任何供人类食用的其他食物；以及生物质和燃料产品。能存活的商品包括但不限种子和植物细胞。包含事件17314的水稻因此可以用于制造任何通常由水稻获得的商品。源自包含事件17314的植物的任何此类商品可以包含至少可检测量的对应于水稻事件17314的特异性和独特的DNA，特别可以包含可检测量的含有SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。可以使用任何核苷酸分子的标准检测方法，包括本文所公开的检测方法。如果商品中存在任何可检测量的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，则该商品在本发明的范围内。
因此，本发明的植物、后代、种子、植物细胞、植物部分(如花粉、胚珠、荚果、花、根或茎组织和叶)和商品尤其可用于以产生用于农业的包含事件17314的种子和/或植物部分为目的种植植物，生产包含事件17314的后代用于植物育种和研究目的，使用微生物技术用于工业和研究应用，和出售给消费者。
本发明提供控制杂草的方法和使用草甘膦除草剂产生植物和包含事件17314的植物的方法。本发明提供在田地中控制杂草的一种方法，且该方法包括在田地中种植包含事件17314的变种或杂种植物，和以控制田地中的杂草而不损害包含事件17314的植物为目的向田地应用除草有效剂量的草甘膦。草甘膦除草剂的这种应用可以在出苗前(即种植包含事件17314的种子之后和包含事件17314的植物出苗之前的任何时间)或出苗后(即包含事件17314的植物出苗后的任何时间)。本发明还提供在田地中控制杂草的另一种方法，且该方法包括应用有效剂量的草甘膦除草剂以控制田地中的杂草，然后在田地中种植包含事件17314的水稻。草甘膦除草剂的这种应用在种植前(即种植包含事件17314的种子之前)，且可以在种植前的任何时间(包括但不限于种植前约14天至种植前约1天)进行。用于田地中的除草有效剂量的草甘膦应包括一个生长季节每英亩约0.5磅草甘膦至多达每英亩约4.5磅草甘膦。一个生长季节可以多次应用草甘膦，例如，两次应用(如种植前的应用和出苗后的应用，或出苗前的应用和出苗后的应用)或三次应用(如种植前的应用、出苗前的应用和出苗后的应用)。
本发明提供生产包含对于本发明转基因事件17314特异性和独特的DNA序列的抗除草剂耐受性水稻的方法。用于这些方法的转基因植物对于转基因可以为纯合的或杂合的。通过这些方法所产生的后代植物可以是变种或杂种植物；可以从由植物产生的种子长成和/或从通过用来自包含事件17314的水稻的花粉授粉的植物产生的包含事件17314的种子长成；且对于转基因可以是纯合的或杂合的。后代植物可以随后自花授粉以产生植物纯育种系(即，对于转基因为纯合的植物)，或者可以远交，例如，与另一无关的植物杂交，以产生变种或杂交种子或植物。
通过包含具有序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的多核苷酸分子、包含事件17314的植物与另一种水稻有性杂交从而产生种子，可以产生耐受草甘膦除草剂的应用的水稻，其然后生长为后代植物。这些后代植物然后可以用草甘膦除草剂处理来选择耐受草甘膦除草剂的后代植物。或者，这些后代植物可以经使用判断方法分析以选择包含事件17314DNA的后代植物。用于杂交的其他植物可能耐受或可能不耐受草甘膦除草剂，可能是或可能不是转基因的。产生的后代植物和/或种子可以是变种或杂种种子。
在实行这种方法中，一种植物与另一种植物有性杂交(即异花授粉)的步骤可以通过人工干预完成或协助，例如：手工收集一种植物的花粉，将此花粉与第二植物的花柱或柱头接触；手工和/或用动作除去、破坏或覆盖植物的雄蕊或花药(例如，通过去雄或应用化学杀配子剂)使得自然的自花授粉被阻止，且为了授粉，必需进行异花授粉；在“定向授粉”的位置人工放置传粉昆虫(例如，在果园或田地放置蜂箱或将传粉昆虫放于植物周围)；人工打开或除去花的部分，以使得外源性花粉放置于或接触花柱或柱头(例如，在天然具有妨碍或阻止异花授粉的花的水稻中，使其自然地发生自花授粉，无需人工干预)；选择性放置植物(例如，有意授粉靠近地种植植物)；和/或应用化学物质以促成开花或促进(柱头对于花粉的)可接受性。
通过包含具有序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的多核苷酸分子、包含事件17314的植物自交从而产生种子，可以产生耐受草甘膦除草剂的应用的水稻，其然后生长为后代植物。这些后代植物然后可以用草甘膦除草剂处理来选择耐受草甘膦除草剂的后代植物。或者，这些后代植物可以经使用判断方法分析以选择包含事件17314DNA的后代植物。在实行这种方法中，一种植物与自身有性杂交(即自花授粉或自交)的步骤可以通过人工干预完成或协助，例如：手工收集植物的花粉，将此花粉与同一植物的花柱或柱头接触，然后任选地防止该植物的进一步的授粉；手工和/或通过动作除去、破坏或覆盖其他附近植物的雄蕊或花药(例如，通过去雄或应用化学杀配子剂)使得自然的异花授粉被阻止，且为了授粉，必需进行自花授粉；在“定向授粉”的位置人工放置传粉昆虫(例如，将传粉昆虫放于单独的植物周围)；人工处理花或其部分，以允许自花授粉；选择性放置植物(例如，有意种植植物远离授粉距离)；和/或应用化学物质以促成开花或促进(柱头对于花粉的)可接受性。
这些方法所包含的以及使用这些方法产生的后代水稻和种子有别于其他水稻，例如，因为后代水稻和种子：是重组的，因而是通过人工干预产生的；耐受草甘膦除草剂；包含至少一个由本发明的转基因DNA组成的等位基因；和/或包含可检出量的选自SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2的多核苷酸序列。只要种子包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，该种子可以选自单个后代植物，这在本发明的范围内。
在实行本发明中，两种不同的转基因植物可以杂交以产生包含两个独立分离的异源基因的杂种后代。适当后代的自交能够产生对于这两个基因均为纯合的植物。也考虑与亲本植物回交和与非转基因植物远交，以及无性繁殖。常用于不同性状和作物的其他育种方法的描述可以在许多参考文献之一中找到，例如Fehr，in Breeding Methods forCultivar Development，Wilcox J.ed.，American Society of Agronomy，Madison WI(1987)。
用于本文公开的方法的植物和种子也可以包含一种或多种另外的转基因。这种转基因可以是任何编码赋予理想性状的蛋白质或RNA分子的核苷酸序列，该理想性状包括但不限于：增强的抗虫性、提高的水利用效率、增加的产量表现、增强的抗旱性、提高的种子质量、改善的营养品质和/或增强的除草剂耐受性，其中相对于缺乏这种额外的转基因的水稻，测量所述理想性状。
因此，本发明的方法尤其可以用于控制田地中的杂草同时生长植物以产生包含事件17314的种子和/或植物部分用于农业或研究目的，选择包含事件17314的后代用于植物育种或研究目的，和产生包含事件17314的后代植物和种子。
可以对本发明的植物、后代、种子、植物细胞、植物部分(如花粉、胚珠、荚果、花、根或茎组织和叶)和商品评估DNA组成、基因的表达和/或蛋白质的表达。这种评估可以通过以下方法来进行：使用标准方法，如PCR、northern印迹、southern印迹、免疫印迹、免疫沉淀和ELISA；或使用本文提供的检测方法和/或检测试剂盒。
本发明提供检测样品中水稻事件17314特异性材料的存在的方法。一种方法包括检测特异于和源自包含水稻事件17314的水稻细胞、组织或植物的DNA的存在。该方法提供待与引物对接触的模板DNA样品，所述引物对在经受适于热扩增的条件时能够从事件17314DNA产生扩增子，尤其是包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的至少15个连续核苷酸或其互补序列的扩增子。只要模板DNA分子包含如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的特异性和独特的核苷酸序列，扩增子由源自水稻事件17314的模板DNA分子产生。根据用于产生扩增子所选定的聚合酶，扩增子可以是单链或双链DNA或RNA。该方法提供检测在任何这样的热扩增反应中产生的扩增子分子，并确定对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或其互补序列的核苷酸在扩增子序列中的存在。在扩增子中检测到对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或其互补序列的核苷酸能够确定和/或判断样品中存在事件17314特异性DNA，因而存在包含事件17314的生物材料。
本发明提供另一种方法，用于检测由源自水稻或水稻组织的材料组成的样品中对应于SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的DNA分子的存在。该方法包括：(i)从水稻或一组不同的水稻中提取DNA样品；(ii)将该DNA样品与显示SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的至少15个连续核苷酸的DNA探针分子接触；(iii)允许探针和DNA样品在严格的杂交条件下杂交；然后(iv)检测探针和靶DNA样品之间的杂交事件。检测到杂合组成可判断DNA样品中存在SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：4，视具体情况而定。没有杂交可判断样品中没有转基因事件。或者，确定特定的水稻中包含一个或两个对应于SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的序列或其互补序列可以确定该水稻包含至少一个对应于事件17314的等位基因。
因此，可以通过任何公知的核酸检测方法(如聚合酶链反应(PCR)或使用核酸探针的DNA杂交)检测本发明的核酸分子的存在。例如，Taverniers等人(J.Agric.Food Chem.，53：3041-3052，2005)讨论了事件特异性的PCR分析方法，其中证明了用于转基因玉米株系Bt11、Bt176和GA21及用于油菜(canola)事件RT73的事件特异性追踪系统。在这项研究中，事件特异性的引物和探针基于各事件的基因组/转基因连接区的序列进行设计。转基因植物事件特异性的DNA检测方法也已在美国专利6,893,826、6,825,400、6,740,488、6,733,974、6,689,880、6,900,014和6,818,807中描述。
本发明提供DNA检测试剂盒。其中一类试剂盒包含至少一种具有足够长度的与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6相似或互补的连续核苷酸的DNA分子，其作为特异性DNA引物或探针用于检测样品中源自转基因水稻事件17314的DNA的存在。用该试剂盒检测的DNA分子包含SEQ ID NO：1所示的至少15个连续核苷酸或其互补序列。或者，该试剂盒可以包含至少一种具有足够长度的与SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6相似或互补的连续核苷酸的DNA分子，其作为特异性DNA引物或探针用于检测生物样品中源自转基因水稻事件17314的DNA的存在。用该试剂盒检测的DNA分子包含SEQ ID NO：2所示的至少15个连续核苷酸或其互补序列。
可选择的试剂盒采用以下方法：其中用上文所述的引物对接触靶DNA样品，然后进行足以产生包含SEQ ID NO：2所示的至少15个连续核苷酸或其互补序列的扩增子的核酸扩增反应。检测到扩增子以及确定扩增子序列内存在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的不少于15个连续核苷酸或其互补序列可以确定，或者说，能够判断靶DNA样品中存在17314事件特异性的DNA。
本发明提供足以用作DNA探针的DNA分子，所述DNA探针用于确定、检测或判断样品中存在或甚至不存在事件17314DNA特异性和独特的DNA。DNA分子含有SEQ ID NO：1的至少15个连续核苷酸或其互补序列，或SEQ ID NO：2的至少15个连续核苷酸或其互补序列。
可以通过本领域已知的各种核酸扩增方法中的任何一种(包括热扩增方法)实现核酸扩增。可以通过使用源自本发明提供的序列的引物扩增来自所述事件的这种序列，接着对扩增子或克隆的DNA进行标准DNA测序，来验证(如果必要，校正)来自水稻事件17314(包含事件17314的代表性的种子样品已经作为ATCC PTA-9844保藏)的异源DNA插入序列、连接序列或侧翼序列。
可以通过多种技术检测由这些方法产生的扩增子。一种这样的方法是遗传位分析(Genetic Bit Analysis)(Nikiforov等人，NucleicAcid Res.22：4167-4175，1994)，其中设计了与相邻的侧翼基因组DNA序列和插入的DNA序列重叠的DNA寡核苷酸。将该寡核苷酸固定在微孔板的孔中。继目标区域的热扩增(对插入序列使用一个引物，对相邻的侧翼基因组序列使用另一个引物)之后，可以将单链的扩增子(热扩增产物)与固定的寡核苷酸杂交，并用作单碱基延伸反应的模板，该反应使用DNA聚合酶和对于预期的下一碱基特异性的标记ddNTP。读数可以是荧光或基于ELISA的。检测到荧光或其他信号表明由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸而存在插入/侧翼序列。
另一种方法是Winge(Innov.Pharma.Tech.00：18-24，2000)所描述的焦磷酸测序技术(Pyrosequencing technique)。在该方法中，寡核苷酸设计为与相邻的基因组DNA和插入DNA连接区重叠。将寡核苷酸与来自目标区域的单链热扩增产物(单链扩增子)(插入序列使用一个引物，侧翼基因组序列使用另一个引物)杂交，并在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶(sulfurylase)、萤光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶(apyrase)、腺苷5’磷酰硫酸(adenosine 5’phosphosulfate)和萤光素的存在下孵育。单个地加入ddNTP，掺入产生光信号，对产生的光信号进行测量。光信号表明由于成功的扩增、杂交和单-或多-碱基延伸而存在转基因插入/侧翼序列。
如Chen等人(Genome Res.9：492-498，1999)所述的荧光偏振是一种可用于检测扩增子的方法。使用此方法，设计与基因组侧翼DNA和插入DNA连接区重叠的寡核苷酸。将该寡核苷酸与目标区域的单链扩增产物(插入DNA使用一个引物，侧翼基因组序列使用另一个引物)杂交，并在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP的存在下孵育。单碱基延伸导致ddNTP的掺入。可以使用荧光计作为偏振的变化而测定掺入。偏振的改变表明由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸而存在转基因插入/侧翼序列。
也可以根据制造商提供的说明书，利用TAQMAN(PE AppliedBiosystems，Foster City，CA)检测和定量DNA序列的存在。简单地说，设计与基因组侧翼和插入DNA连接区重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针和扩增引物(插入DNA序列使用一个引物，侧翼基因组序列使用另一个引物)在热稳定聚合酶和dNTP的存在下循环。FRET探针的杂交导致荧光部分从FRET探针上的猝灭部分裂解和释放。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交而存在侧翼/转基因插入序列。
如Tyangi等人(Nature Biotech.14：303-308，1996)所述，已描述分子信标用于序列检测。简单地说，设计与侧翼基因组和插入DNA连接区重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针的独特结构导致它含有保持荧光部分和猝灭部分紧密接近的二级结构。FRET探针和扩增引物(插入DNA序列使用一个引物，侧翼基因组序列使用另一个引物)在热稳定聚合酶和dNTP的存在下循环。继成功进行扩增之后，FRET探针与靶序列的杂交导致探针二级结构丧失及荧光和猝灭部分的空间分离，导致荧光信号的产生。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交而存在侧翼/转基因插入序列。本领域已知的其他方法可以用于实行本发明的方法：如微流体技术(参见，例如，美国专利公开2006068398和美国专利6,544,734)，其提供分离和扩增DNA样品的方法和设备；检测和测量特定的DNA分子的光染料(参见，例如，WO/05017181)；包含用于检测DNA分子的电子传感器的纳米管装置(参见，例如，WO/06024023)；和/或结合特定的DNA分子然后可以检测该DNA分子的纳米珠。
可以使用本文公开的组合物和DNA检测领域已知的方法开发DNA检测试剂盒。该试剂盒用于鉴定样品中的事件17314，且可以应用于培育含有适当的事件DNA的水稻植物的方法。试剂盒可以包含与SEQ ID NO：1-6或其片段类似或互补的DNA引物或探针。因此，本发明的试剂盒和检测方法尤其可用于鉴定水稻17314事件，选择包含事件17314的植物变种或杂种，检测样品中源自水稻事件17314的DNA的存在，和对样品监测水稻事件17314的存在和/或不存在或包含水稻事件17314的植物、植物部分或商品。
本文包括下面的实施例来证明本发明的某些优选实施方案的实施例。本领域的技术人员应该理解，下面的实施例中公开的技术代表了本发明人发现在实施本发明中运用良好的技术，因此可以被认为是构成实施本发明的优选方式的实施例。然而，本领域的技术人员根据本公开内容应该理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对公开的具体实施方案进行许多改变，而且仍然获得相同或类似的结果。
实施例
实施例1：水稻的转化和事件选择
本实施例说明如何产生转基因水稻的事件和如何选择事件17314。通过用如图1所示的转基因DNA片段(其序列如SEQ ID NO：5所示)对水稻细胞进行粒子枪介导的转化，产生转基因的耐受草甘膦的事件17314。转基因DNA片段包括包含源自花椰菜花叶病毒的启动子(P-CaMV.e35S)分子、包含复制的增强子的表达盒，该表达盒可操作地连接至源自水稻肌动蛋白1基因的内含子分子(I-Os.Act1)，可操作地连接至编码叶绿体转运肽(CTP2，拟南芥EPSPS)的DNA分子，可操作地连接至编码草甘膦抗性EPSPS(AGRtu.EPSPS CP4)的DNA分子，可操作地连接至源自根癌土壤杆菌胭脂碱合成酶基因的3’转录终止区DNA分子(T-AGRtu.nos)。
首先，使用粒子枪方法，用4个表达盒中的一个转化来自水稻品种M-202的外植体。然后在含有草甘膦的培养基上选择转化的细胞，并将存活细胞再生为植物。转化过程产生928株R0植物，每株R0植物为单独的、个别的事件。在R0阶段通过PCR和Southern分析筛选这928个事件，以消除多拷贝和/或分子复杂事件。对于PCR分析，最初对提取的DNA进行端点TAQMAN检测。基于PCR筛选，选出565个R0事件。然后通过Southern分析筛选这565个R0事件。对于Southern分析，从水稻组织提取DNA，用NcoI和EcoRI或SSPI消化，并利用Southern印迹杂交分析技术与互补于CaMV 35S启动子和EPSPS编码序列的放射性DNA探针进行杂交。这些数据被用于确定插入水稻基因组中的转基因盒拷贝数，并选择240个具有单一插入的R0事件。
这240个选定的事件然后被转到生长室用于表型和能育性分析，以确定非型植物。从生长室的表型和能育性筛选中选出170个事件进行下一步。然后在生长室中，对这170个R1事件筛选草甘膦耐受性。也通过次级Southern分析，对这些植物分析完整的转基因插入。使用从这些分析收集的数据，选出19个事件进行下一步。随后，选出其中13个事件的R2植物用于田间试验。对于这13个事件中的每一个在一个生长季节，对于这些事件中的5个在两个生长季节，收集植物的多个特征的田间试验数据。在第一年的田间试验中，在多重复田间试验设计中的最少3个地点，测试这13个事件的草甘膦耐受性和农艺学等效性。结果列于表1中。
表1：第一季田间试验程序的田间试验结果
然后利用这些数据选择5个先导事件，进行第二年田间试验。在第二年田间试验中，在多重复田间试验设计中的最少6个地点，测试5个先导事件的草甘膦耐受性和农艺学等效性。结果列于表2中。
表2：第二季田间试验程序的田间试验结果
在两个季节的功效试验中，在生长的4-6叶阶段，用每英亩3磅酸当量(lb ae/ac)的量的草甘膦处理植物，这是通常商业用量的两倍；或4.5lb ae/ac量的草甘膦，这是通常商业用量的三倍。营养草甘膦耐受性测量为营养损伤，生殖草甘膦耐受性测量为产量和能育百分比(％)。使用这些试验的数据，选择事件17314。事件17314表明在3lb ae/ac或4.5lb ae/ac时没有营养损伤，且在用草甘膦处理后没有产量损失(以吨/英亩(T/ac)的稻谷测量)。
实施例2：邻近插入DNA的水稻染色体序列的分离
使用快速高pH/高盐溶解方案，分离用于所有PCR反应的水稻基因组DNA。对于这个方案，大约0.1g的冻干磨碎叶组织与600μl(微升)裂解缓冲液(100mM Tris，1M KCl，10mM EDTA，pH 9.5)振荡混合，接着在65℃下孵育45-60分钟。接下来，再次振荡试管，并加入200μl沉淀缓冲液(5M醋酸钾，pH 7.0)，再次振荡，离心。将DNA溶液的600μl等分部分转移到清洁试管，并加入500μl冰冷的异丙醇，以沉淀DNA。离心后，用70％乙醇洗涤DNA沉淀块，风干，并将DNA重悬浮于250μl水中。
使用基本上如Liu等人(Plant Journal 8：457-463，1995)所述的TAIL-PCR方案，对于17314事件获得邻近转基因插入的水稻基因组DNA的延伸。为了确定侧翼基因组DNA，在侧翼连接区附近设计两组各两个嵌套基因组步移引物。一组设计为从整合表达盒的5’末端向外步移，另一组设计为从整合表达盒的3’末端向外步移。5’TAIL-PCR的引物是用于第1轮的引物SQ1871(SEQ ID NO：12)和用于第2轮的引物SQ1869(SEQ ID NO：13)。3’TAIL-PCR的引物是用于第1轮的引物SQ1875(SEQ ID NO：10)和用于第2轮的引物SQ1880(SEQ ID NO：14)。
为了识别每个侧翼区，两个嵌套引物用于连续PCR反应中，该反应使用较短的任意简并(AD)引物，如Liu等人(Plant Journal 8：457-463，1995)所述。对于第一轮PCR，对于5’和3’侧翼序列，如表3所述设置分别的PCR反应。使用如表4所示的循环参数以及默认的变温速度设置，在MJ Engine热循环仪中进行这些反应。
表3：水稻事件17314第一轮TAIL-PCR反应
表4：第一轮TAIL-PCR的热循环条件
第一轮的TAIL-PCR的一等分部分用于如表5所详述的第二轮TAIL-PCR。使用如表6所示的循环参数、默认的变温速度设置，在MJEngine热循环仪中进行这些反应。
表5：第二轮TAIL-PCR反应
表6：第二轮TAIL-PCR的热循环条件
为了显现TAIL-PCR扩增子，第二轮反应液的等分部分在2.0％琼脂糖凝胶上电泳，并用溴化乙锭染色。此外，第二轮TAIL-PCR的等分部分被送到盂山都基因组测序中心测序。用孟山都专有的侧翼序列应用序列分析软件进行序列分析。设计PCR引物，以确认在第二轮TAIL-PCR反应的测序结果中观察到的基因组侧翼序列。对于17314事件，通过使用引物对SQ3629(SEQ ID NO：15)和SQ1869(SEQ ID NO：13)的PCR反应证实5’基因组侧翼序列。对于17314事件，通过使用引物对SQ3627(SEQ ID NO：16)和SQ1875(SEQ ID NO：10)的PCR反应证实3’基因组侧翼序列。
实施例3：事件特异性的端点TAQMAN分析。
本实施例说明为了确定样品中的事件17314而开发的事件特异性的端点TAQMAN热扩增方法。表7和表8描述了这种方法可用的条件的例子。用于本方法中的DNA分子是，例如，引物SQ4183(SEQ ID NO：7)和SQ4191(SEQ ID NO：8)及6FAMTM-标记的寡核苷酸探针PB1491(SEQ ID NO：9)。基于本文提供的转基因插入的序列和/或侧翼序列，可以设计其他探针和引物。当在这些反应方法中与PB1491(SEQ IDNO：9)使用时，SQ4183(SEQ ID NO：7)和SQ4191(SEQ ID NO：8)产生可判断事件17314DNA的DNA扩增子。用于此分析的对照包括来自包含事件17314DNA的水稻的阳性对照、来自非转基因水稻的阴性对照和不包含模板DNA的阴性对照。
优化这些分析方法以用于Applied Biosystems GeneAmp PCRSystem 9700或Stratagene Robocycler、MJ Engine、Perkin-Elmer 9700或Eppendorf Mastercycler Gradient热循环仪。本领域技术人员已知用于产生鉴定生物样品中的事件17314 DNA的扩增子的其他方法和仪器。分析样品时，可以使用表7和表8所述的循环参数。当在EppendorfMastercycler Gradient或MJ Engine中进行热扩增时，热循环仪应该以计算的模式运行。当在Perkin-Elmer 9700中进行热扩增时，热循环仪应设定为最大的变温速度。
表7：水稻事件17314特异性的端点TAQMAN
表8：端点TAQMAN热循环仪条件
实施例4：育种活动中17314事件的鉴定
本实施例说明对于使用包含事件17314的水稻的任何育种活动，如何鉴定后代中的事件17314。使用DNA事件引物对产生可判断事件17314的扩增子。可判断事件17314的扩增子包含至少一个连接序列：本文表示为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2(分别如图1所示的[A]和[B])。SEQ ID NO：1(图1的[A])是对应于侧翼序列与转基因插入的5’末端的连接的核苷酸序列(SEQ ID NO：3[C]的283至302位，参见图1)。SEQ ID NO：2([B]，参见图1)是对应于侧翼序列与转基因插入的3’末端的连接的核苷酸序列(SEQ ID NO：4[D]的666至685位，参见图1)。
将产生事件17314的判断性扩增子的事件引物对包括使用侧翼序列(SEQ ID NO：3和4)和插入的转基因DNA序列(SEQ ID NO：5)设计的引物对。为了获得其中发现有SEQ ID NO：1的至少11个核苷酸的判断性扩增子，设计基于SEQ ID NO：3的碱基1至292的正向引物分子和基于插入表达盒DNA序列SEQ ID NO：5的1至3114位的反向引物分子，其中，引物分子具有足够长度的连续核苷酸，以特异性地与SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5杂交。为了获得其中发现有SEQ ID NO：2的至少11个核苷酸的判断性扩增子，设计基于插入表达盒SEQ ID NO：5的1至3114位的正向引物分子和基于3’侧翼序列SEQ ID NO：4的1至675位的反向引物分子，其中，引物分子具有足够长度的连续核苷酸，以特异性地与SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：5杂交。为了实践目的，应设计能够产生大小范围有限的、例如100至1000个碱基的扩增子的引物。较小(较短的多核苷酸长度)大小的扩增子一般可以在PCR反应中更可靠地产生，允许更短的循环时间，并且可以容易地在琼脂糖凝胶上分离和显示或适用于端点TAQMAN样的分析中。通过DNA扩增子检测领域已知的方法可以产生和检测较小的扩增子。此外，使用引物对产生的扩增子可以被克隆到载体中，增殖，分离并测序，或者可以用本领域确立的方法直接测序。源自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的组合或SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的组合的、可用于DNA扩增方法以产生可判断事件17314或其后代的扩增子的任何引物对是本发明的方面。任何用于DNA扩增方法中以产生可判断包含事件17314的植物或其后代的扩增子的、包含SEQ ID NO：3至少11个连续核苷酸或其互补序列的单个分离的DNA多核苷酸引物分子是本发明的方面。任何用于DNA扩增方法中以产生可判断包含事件17314的植物或其后代的扩增子的、包含SEQ ID NO：4至少11个连续核苷酸或其互补序列的单个分离的DNA多核苷酸引物分子是本发明的方面。任何用于DNA扩增方法中以产生可判断包含事件17314的植物或其后代的扩增子的、包含SEQ ID NO：5至少11个连续核苷酸或其互补序列的单个分离的DNA多核苷酸引物分子是发明的方面。
表7和表8显示了用于这种分析的扩增条件的例子。然而，对于这些方法的任何改变或产生可判断事件17314的扩增子的、与SEQID NO：3或SEQ ID NO：4或事件17314转基因插入片段(SEQ ID NO：5)的DNA序列同源或互补的DNA引物的应用都属于本领域的范围。判断性扩增子包含与至少一个转基因/基因组连接DNA(SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2)或其实质部分同源或互补的DNA分子。
对样品中的事件17314的分析可以包括来自事件17314的阳性对照、来自不是事件17314的水稻植物(例如但不限于M-202)的阴性对照和/或不包含水稻基因组DNA的阴性对照。扩增内源性水稻DNA分子的引物对可以用作DNA扩增条件的内部控制。选自SEQID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所述序列的序列的任何片段可以作为用于通过表7和表8所示的方法产生扩增子的DNA扩增引物，且当使用事件17314作为这样的判断性扩增反应的模板时，这样的扩增子可以用于判断事件17314。在表7和表8的方法中应用改良的这些DNA引物序列在本发明的范围内。由源自SEQ ID NO：3、SEQID NO：4或SEQ ID NO：5的至少一个DNA引物序列产生的可判断事件17314的扩增子是本发明的一方面。
因此，可以设计DNA检测试剂盒，且其是本发明的一方面，所述DNA检测试剂盒包含至少一个源自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的具有足够长度的连续核苷酸的DNA引物，且当该DNA引物在DNA扩增方法中使用时，产生对于包含事件17314的植物或其后代的判断性扩增子。在DNA扩增法中检测时产生可判断事件17314的扩增子的水稻植物部分或种子或商品是本发明的方面。可以通过使用Applied Biosystems GeneAmpPCR System 9700、或Stratagene RoboCycler或MJ Engine、或Perkin-Elmer 9700、或Eppendorf MastercyclerGradient热循环仪或任何其他能够用来如表8所示产生判断事件17314的扩增子的扩增系统，对事件17314扩增子进行分析。
以上公开的并且在权利要求书中引用的、包含水稻事件17314的种子的代表性样品已经按照布达佩斯条约的规定在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，VA.20110进行了保藏。保藏日为2009年2月18日。ATCC保藏号为PTA-9844。该保藏物将在该保藏机构保存30年或最后请求后的5年或专利的有效期间，以较长者为准，并且在此期间必要时将进行更换。
上面已经说明并描述了本发明的原理，本领域技术人员应当明白，可以在不背离这种原理的情况下在配置和细节方面对本发明进行修改。我们要求保护在所附的权利要求的精神和范围内的所有修改。

Claims (15)

1.DNA分子，包括
(a)序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：4所示的多核苷酸分子，
所述DNA分子还包含编码草甘膦耐受性的5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的序列，其中SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4分别位于所述编码EPSPS的序列的5’端和3’端侧翼；或
(b)(a)的互补序列。
2.根据权利要求1所述的DNA分子，包含SEQ ID NO：6的核苷酸序列。
3.根据权利要求1的DNA分子，其中，所述DNA分子源自事件17314，包含事件17314的种子的代表性的样品已经以ATCC保藏号PTA-9844保藏。
4.根据权利要求1的DNA分子，其中，所述DNA分子包含在水稻、植物细胞、种子、后代植物、植物部分或商品中。
5.根据权利要求3的DNA分子，其中，所述DNA分子是由事件17314的模板分子产生的扩增子。
6.用于判断事件17314的存在的多核苷酸探针，其中，所述探针具有至少15个核苷酸的长度以结合选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的至少15个连续核苷酸的序列或其互补序列，其中包含事件17314的种子的代表性的样品已经以ATCC保藏号PTA-9844保藏，且其中所述探针包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列。
7.由第一DNA分子和不同于第一DNA分子的第二DNA分子组成的DNA分子对，其中，所述这些DNA分子具有SEQ ID NO：6的至少11个连续核苷酸的核苷酸序列或其互补序列，从而在与来自水稻事件17314的模板一起在扩增反应中使用时，作为DNA引物发挥功能，以产生用于判断样品中的水稻事件17314的扩增子，所述扩增子包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2及其互补序列的核苷酸序列，其中包含事件17314的种子的代表性的样品已经以ATCC保藏号PTA-9844保藏。
8.一种检测来自水稻事件17314的DNA分子的存在的检测方法，包括：
(a)使DNA样品接触权利要求7所述的DNA分子对；
(b)进行扩增反应，该扩增反应足以产生一种扩增子，该扩增子包含具有选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸分子或其互补序列；和
(c)检测所述DNA扩增子，
其中，检测到所述DNA扩增子则判断在所述DNA样品中存在所述来自水稻事件17314的DNA分子，包含事件17314的种子的代表性的样品已经以ATCC保藏号PTA-9844保藏。
9.一种在样品中检测包含选自SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的核苷酸序列的DNA分子的存在的方法，包括：
(a)使样品接触权利要求6的DNA探针，其中，所述DNA探针在高严格杂交条件下与包含选自SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的核苷酸序列的DNA分子杂交，且在该高严格杂交条件下不与不包含选自SEQID NO：3或SEQ ID NO：4的核苷酸序列的DNA分子杂交；
(b)使所述样品和所述DNA探针经受该高严格杂交条件；和
(c)检测所述DNA探针与包含选自SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的核苷酸序列的所述DNA分子的杂交。
10.DNA检测试剂盒，包含(a)根据权利要求7的DNA分子对，或(b)根据权利要求6的多核苷酸探针。
11.根据权利要求10的DNA检测试剂盒，其中，所述试剂盒采用的方法包括：
(a)使样品接触权利要求7所述的DNA分子对；
(b)进行核酸扩增反应，该核酸扩增反应足以产生包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或其互补序列的扩增子；和
(c)检测所述扩增子。
12.一种产生耐受草甘膦除草剂的水稻的方法，包括
(a)杂交包含事件17314的第一水稻与缺乏事件17314的第二水稻以产生后代植物；和
(b)选择包含所述事件17314且耐受草甘膦的至少第一代后代植物，包含所述事件17314的代表性的种子已经以ATCC保藏号PTA-9844保藏。
13.根据权利要求12所述的方法，还包括自交所述第一代后代植物以产生第二代后代植物，并选择所述事件17314为纯合的至少第一代植物。
14.一种用于控制包括包含事件17314的水稻的田地中杂草生长的方法，所述方法包括用有效控制杂草生长的量的草甘膦处理田地，其中所述水稻显示草甘膦耐受性，其中包含事件17314的种子的代表性的样品已经以ATCC保藏号PTA-9844保藏。
15.根据权利要求14的方法，其中，所述草甘膦的有效量为每英亩约0.5磅至约4.5磅。
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