CN101302520A - 转基因水稻tt51-1转化事件外源载体整合位点全序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种转基因水稻TT51－1转化事件外源载体整合位点全序列及其应用，涉及生物工程技术领域中转基因水稻的安全评估和检测。本发明以转基因抗虫水稻品种TT51－1为材料，提取基因组DNA为模板，分四段扩增出包含旁侧水稻基因组序列的TT51－1事件全序列，如SEQ NO.1所示，由来源于水稻基因组的第1至673个碱基，来源于载体序列的第674至9364个碱基和来源于水稻基因组的第9365至10536个碱基共同组成；本发明适用于对转基因水稻TT51－1(包括亲本、杂种F1和后代)及其制品(包括植株、组织、稻谷、大米及其制品)实施检测、监测和安全管理。

Description

转基因水稻TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域中转基因水稻的安全评估和检测，具体地说，涉及一种转基因水稻TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列及其应用。

背景技术

近年来，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等转基因作物已在很多国家获准种植和生产，有的被加工成食品、饲料或用作食品添加剂。由于转基因产品的生态安全和食用安全一直备受争议，30多个国家和地区相继实施转基因产品标识制度。

转化事件包含的转化载体的序列、编码基因序列、重组方式、插入位点等序列信息是进行转基因安全评价的基础。根据这些信息，可以获得该转基因品系编码的蛋白的序列、完整性、编码蛋白的组织和时间特异性，并进一步分析其潜在的毒理特征、致敏性等安全性问题。同时，根据外源载体插入的位点，判断宿主基因组插入失活和缺失的情况，可以推测该转化事件对宿主的影响和导致的安全性问题。

同时，序列资料也是转基因产品身份验证和检测的基础。只有建立了有效的检测方法，才能对转基因产品的研究和生产进行有效的管理和监督。根据转基因产品中外源基因的序列信息，外源基因在转基因构建体上的组合方式，以及构建体在基因组上的整合位点，可以采用基因特异性、载体特异性和事件特异性的检测方法。

1、基因特异性检测方法

由于大量的转基因载体使用了相同的外源基因，因此基因特异性检测方法并不适合当前转基因产品不断涌现的现实。

2、载体特异性检测方法

载体特异性检测方法利用基因元件之间的边界序列特征，能够有效鉴定使用类似基因元件的不同构建体，而且存在序列信息容易获得的特点，因此被很多研究者所使用。但是，由同一构建体可能获得不止一个不同特性的转化株，甚至可能被转化到不同的物种中，而这些转化株未必全部经过了安全评估。因此载体特异性检测方法不能识别不同的转基因品系，也不能判别该转基因品系是否已经过安全评估。

3、事件特异性的检测方法

事件特异性检测的基础是转基因构建体在基因组DNA序列上的整合位点具有高度特异性，即使是相同的载体多次转化，整合的位置和整合位点特征也是不可重复的。因此，根据不可重复的整合位点特征序列，开发出了事件特异性的检测方法。与前两种方法相比，事件特异性检测具有最高的特异性，最适合做转基因产品的定性和定量检测。但转基因构建体的完整信息通常难以获得，而已知序列基因元件可能距边界有相当的距离，而且在整合的过程中，载体和基因组之间可能发生复杂的重组，因此，分离旁侧序列成为事件特异性检测的关键。2000年2月，欧盟为此资助了Qpcrgmofood European Project项目，该项目现已成功分离获得多个品种旁侧序列并用于建立事件特异性检测方法。当前，事件特异性检测方法已经被用于转基因Roundup Ready soybean，Mon810 maize等一系列转基因商品化品种的检测。

经对现有专利和其他文献的检索，尚未发现任何关于转基因水稻TT51-1事件外源插入载体全序列及两侧旁侧序列和利用此序列建立事件特异性定性、定量PCR(聚合酶链式反应)检测的报道。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术在转基因水稻TT51-1事件和转基因水稻TT51-1衍生品种安全评估和检测工作中存在的不足，提供一种转基因水稻TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列及其应用。

本发明的目的是这样实现的：

一、转基因水稻TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列

本发明以转基因水稻品种TT51-1为材料，提取基因组DNA，并利用引物Frag1F：5’AAAAGTTGAATTTGGGAATAGTCAGCCA 3’和引物Frag1R：5’CTCACCCAGAAACGCTTTACGG 3’扩增出包含TT51-1事件5’端673bp水稻基因序列和部分TT51-1事件的全长3403bp的片段1；利用片段1内部引物Frag2F：5’AATATAAACCATGCTCACTCA 3’和引物Frag2R：5’CGGTTTCAATGCGTTCTCCACCAAGTA3’扩增出包含TT51-1事件的长2202bp的片段2；利用片段2内部引物Frag3F：5’AATCCCTCAGCATTGTTCATCG  3’和引物Frag3R：5’AGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGT 3’扩增出包含TT51-1事件的长3043bp的片段3；利用片段3内部引物Frag4F：5’AGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTAT 3’和引物Frag4R：5’ATCTATTTGTTAGATACGTATGTTTATAGATCAC 3’扩增出包含TT51-1事件的长2659bp的片段4；根据分离获得的4个片段，拼接出一种转基因水稻TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列(简称本序列)，该系列包含TT51-1事件及其两侧水稻基因组序列的长10536bp的全长序列，如SEQ NO.1。

转基因水稻TT51-1事件外源插入载体全序列及其两侧旁侧序列，其特征是：

1、碱基序列如SEQ NO.1所示，由来源于水稻基因组的第1至673个碱基，来源于载体序列的第674至9364个碱基和来源于水稻基因组的第9365至10536个碱基共同组成；

2、由来源于外源插入载体的第1至673个碱基和来源于油菜基因组序列的第674至9364个碱基共同组成的DNA序列，转基因水稻TT51-1事件外源插入载体5’端边界旁侧序列；

3、由来源于油菜基因组序列的第674至9364个碱基和来源于外源插入载体的第9365至10536个碱基共同组成的DNA序列，转基因水稻TT51-1事件外源插入载体3’端边界旁侧序列；

4、以上所述序列是转基因水稻TT51-1事件的特征序列，可以用于区分转基因水稻TT51-1和其他转基因和非转基因水稻，以及转基因水稻TT51-1的定性检测和定量分析。

二、转基因水稻TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列的应用

1、利用该序列特征设计的转基因水稻外源基因整合事件TT51-1的事件特异性定性PCR检测方法：

合成引物序列如下：TT511G：5’GCGTCCAGAAGGAAAAGGAATA 3’和TT511V：5’AGAGACTGGTGATTTCAGCGGG 3’；提取样品总DNA，分别利用TT511G/TT511V引物组合进行PCR扩增；PCR产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物，如存在扩增产物则说明样品中含有TT51-1来源的成分。

2、利用该序列特征设计的转基因水稻外源基因整合事件TT51-1的事件特异性定量PCR检测方法：

合成引物序列如下：TT511G：5’GCGTCCAGAAGGAAAAGGAATA 3’和TT511V：5’AGAGACTGGTGATTTCAGCGGG 3’；合成TaqMan探针序列如下：TT511P：5’FAM-ATCTGCCCCAGCACTCGTCCG-BHQ1 3’；提取样品总DNA，分别利用上述引物TT511G/TT511V和探针TT511P组合进行荧光定量PCR扩增；转基因水稻TT51-1基因组DNA被相同浓度非转基因水稻基因组DNA稀释至不同含量，以20ng的混和水稻基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR反应并建立标准曲线；以标准曲线为参照测定含有TT51-1基因组DNA的混和水稻基因组DNA样品中TT51-1基因组DNA的量。

与现有技术相比，本发明具有下列优点和积极效果：

1、本发明首次公布转基因水稻TT51-1转化事件全序列；

2、本发明首次公布转基因水稻TT51-1转化事件基因组插入位点的旁侧序列；

3、本发明首次确认转基因水稻TT51-1转化事件基因组插入位点的旁侧序列中不同碱基的来源，并确定外源插入载体序列和水稻基因组序列的接合位点；

4、利用本发明发现的序列特征，首次建立转基因水稻TT51-1事件特异性定性和定量PCR检测方法；

5、本发明适用于对转基因水稻TT51-1(包括亲本、杂种F1和后代)及其制品(包括植株、组织、稻谷、大米及其制品)实施检测、监测和安全管理。

附图说明

图1是转基因水稻TT51-1事件及其两侧旁侧序列结构图。

图2是转基因水稻TT51-1事件定性定量检测引物及其位置图。

图3是转基因水稻TT51-1事件特异性定性PCR扩增图；其中：

M：分子量Marker；

1-双蒸水模板；

2-非转基因水稻基因组DNA模板；

3-转SCK基因水稻基因组DNA模板；

4-转基因水稻TT51-1基因组DNA模板；

5-转基因大豆RBS基因组DNA模板；

6-转基因油菜RT73基因组DNA模板；

7-转基因油菜MS8RF3基因组DNA模板；

8-玉米基因组DNA模板；

9-棉花转基因组DNA模板。

图4是转基因水稻TT51-1事件特异性定量PCR扩增图。

具体实施方式

1、转基因水稻TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列的PCR扩增

先将20％SDS预热到65℃，取15ml SDS抽提buffer(0.1 TrisHCl，0.05MEDTA，1M NaCl pH8.0)加入到50ml离心管，再加入2.5μl β-巯基乙醇，混匀；液氮研磨3g左右的叶片，将粉末转至50ml含抽提buffer的50ml离心管中，在振荡器上振荡混匀，加入2ml预热的20％SDS，混匀，65℃水浴至少30分钟，其间要轻轻摇动试管；水浴后，迅速将离心管置于冰上，加入3ml 3M KAc，混匀，在冰上放置30分钟；4℃ 5000g离心5min；将上清转移到新的50ml离心管中，加入2/3体积的异丙醇，混匀，-20℃放置30min以上；6000g，4℃离心15min，倒掉上清，用75％乙醇洗一遍，真空干燥，用超纯水溶解DNA，溶解后，将溶液转移到15ml的离心管中；按DNA溶解体积的1％加蛋白酶K，55℃水浴30min；加入等体积苯酚，混匀，轻摇30min，8000g离心10min；转移上清至新的tube中，加等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，轻摇20min，8000g离心15min；转移上清至新的tube中，加等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)，轻摇20min，8000g离心15min；吸取上清，每管加入5μl RNase，混匀，37℃水浴1hr降解RNA；用等体积的苯酚抽提一次，轻摇20min，8000g离心15min；转移上清至新的离心管中，加等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)，轻摇20min，8000g离心15min；吸上清加入1/10体积3M NaAC，混匀，加入等体积异丙醇，-20℃放置30min，沉淀DNA；6000g，4℃离心15min，倒掉上清，用75％乙醇洗2遍，离心去掉75％乙醇，真空干燥；干燥后，用超纯水溶解DNA备用。

合成引物序列如下：Frag1F：5’AAAAGTTGAATTTGGGAATAGTCAGCCA 3’；Frag1R：5’CTCACCCAGAAACGCTTTACGG 3’；Frag2F：5’AATATAAACCATGCTCACTCA 3’；Frag2R：5’CGGTTTCAATGCGTTCTCCACCAAGTA 3’；Frag3F：5’AATCCCTCAGCATTGTTCATCG 3’；Frag3R：5’AGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGT  3’；Frag4F：5’AGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTAT  3’；Frag4R：5’ATCTATTTGTTAGATACGTATGTTTATAGATCAC 3’。

以提取的转基因水稻TT51-1基因组DNA为模板，利用PCR技术分4段扩增转基因水稻TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列。在50ul反应体系中，取Oxy-235基因组DNA 100ng，其他各组分终浓度为，KOD Plus Buffer 1x，dNTPs每种200uM，MgSO₄ 1mM，引物各100nM，KOD Plus酶1u。反应条件为，94℃ 2分钟预变性，94℃ 15秒，60℃ 30秒，68℃ 3分钟，循环35次，68℃保温7分钟。其中，利用引物Frag1F和引物Frag1R可以扩增出包含TT51-1事件5’端水稻基因序列和部分TT51-1事件的片段1。利用片段1内部引物Frag2F和引物Frag2R可以扩增出包含TT51-1事件的片段2。利用片段2内部引物Frag3F和引物Frag3R可以扩增出包含TT51-1事件的片段3。利用片段3内部引物Frag4F和引物Frag4R可以扩增出包含部分TT51-1事件和TT51-1事件3’端水稻基因组序列的片段4。分别进行PCR扩增后，琼脂糖电泳分离DNA，EB染色鉴定。

以QIAGEN公司QIAquick PCR Purification Kit纯化PCR产物。

将PCR产物与EcoRV酶切的pZero2(Invitrogen)载体连接。连接体系：DNA mixture 22μl；2.5μl 10×T4 DNA Ligase Buffer with 1mM ATP；0.5μlT4 DNA Ligase(NEB)。22℃连接至少1hr。

根据《分子克隆实验指南》提供的方法制备大肠杆菌TOP10(Invitrogen)感受态细胞，并以连接产物转化。挑取单克隆，以突变位点特异引物进行菌落PCR检测重组子。将筛选出的克隆扩大培养，小量制备质粒，酶切验证。

将筛选出的克隆送测序公司测序。将获得的序列信息，利用NCBI提供的Blastn软件，分析不同部分序列的来源，从而判断基因组和载体的结合位点。

2、应用方法

1)利用本发明中所提供的序列进行转基因水稻TT51-1事件及其衍生品种的安全性分析

利用NCBI提供的Blastn软件，分析不同部分序列的来源，可以发现TT51-1事件中包含了氨苄青霉素和潮霉素抗性基因片段。在包含的2个抗虫基因中，有1个因为启动子的断裂导致其可能无法正常表达。同时，根据两侧旁侧序列，可以发现TT51-1事件中外源基因的整合导致水稻宿主基因组片段的缺失和插入失活，可能会影响到宿主的正常发育。

2)利用本发明中所提供序列设计转基因水稻TT51-1事件及其衍生品种的事件特异性定性PCR检测方法

合成引物序列如下：TT511G：5’GCGTCCAGAAGGAAAAGGAATA 3’和TT511V：5’AGAGACTGGTGATTTCAGCGGG 3’。

分别取非转基因水稻基因组DNA模板，转SCK基因水稻基因组DNA模板，转基因水稻TT51-1基因组DNA模板，转基因大豆RBS基因组DNA模板，转基因油菜RT73基因组DNA模板，转基因油菜MS8RF3基因组DNA模板，玉米基因组DNA模板，棉花转基因组DNA模板，分别利用TT511LG/TT511LV引物组合进行PCR扩增。在25ul反应体系中，以100ng不同来源基因组DNA为模板，其他各组分终浓度为，PCR Buffer 1x(含10mM Tris·HCl pH8.3，KCl 50mM)，dNTPs每种200uM，MgCl₂ 2.5mM，引物各250nM，Hot Start Taq酶1u。反应条件为，94℃ 2分钟预变性，94℃ 15秒，60℃ 30秒，72℃ 30秒，循环35次，72℃保温2分钟。PCR产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物。

3)利用本发明中所提供序列设计转基因水稻TT51-1事件及其衍生品种的事件特异性定量PCR检测方法

合成TaqMan探针序列如下：TT511P：5’FAM-ATCTGCCCCAGCACTCGTCCG-BHQ13’。

针对转基因水稻TT51-1事件外源插入载体3’端旁侧序列的引物、探针组合被用于荧光定量PCR分析。荧光定量PCR分析在一台MJR DNA Engine Opticon2 Continuous Fluorescence Detector上进行，检测及分析软件为OpticonMonitor 2 Version 2.02。

TT51-1事件定量检测反应体积25ul，含模板DNA 20ng，其他组分含量为：1x TaqMan Universal Master，引物TT511G和TT511V 800uM，探针TT511P400uM。

TaqMan反应条件为：50℃ 2分钟和95℃ 10分钟预变性以后，进行50次PCR循环：95℃ 15秒变性，60℃ 1分钟退火及延伸，收集荧光信号。

转基因水稻TT51-1基因组DNA被相同浓度非转基因水稻DNA稀释至不同含量，以20ng的混和水稻基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR反应。不同稀释倍数，分别含20，4.7，0.47，0.047，0.0047ng TT51-1基因组DNA的混和DNA样品被用于建立标准曲线。所有的荧光定量反应都重复4次。

根据标准曲线优化的结果，利用与建立标准曲线相同的PCR反应条件，以标准曲线为参照测定含有TT51-1基因组DNA的混和水稻基因组DNA样品中TT51-1基因组DNA的量。取20ng基因组DNA为模板，利用不同含量标准样品做标准曲线，根据获得的标准曲线和转基因样品的Ct值，计算TT51-1基因组DNA的质量，从而计算出TT51-1在样品中的含量。所有荧光定量反应都重复4次。

3.实验结果

1)转基因水稻TT51-1事件外源插入载体全序列及其两侧旁侧序列的PCR扩增和测序分析

利用引物Frag1F和引物Frag1R扩增出3403bp的片段1，测序和序列比对分析结果表明其中包含TT51-1事件5’端673bp水稻基因序列和部分TT51-1事件。

利用片段1内部引物Frag2F和引物Frag2R扩增出包含TT51-1事件的长2202bp的片段2。

利用片段2内部引物Frag3F和引物Frag3R扩增出包含TT51-1事件的长3043bp的片段3。

利用片段3内部引物Frag4F和引物Frag4R扩增出长2659bp的片段4，测序和序列比对结果表明其中包含部分TT51-1事件和TT51-1事件3’端1172bp水稻基因组序列。

拼接以上片段，可以获得转基因水稻TT51-1事件全序列及其两侧旁侧序列。

根据以上分析，本发明分离获得的序列包含转基因水稻TT51-1事件外源插入序列全序列及其两侧旁侧序列，其特征如图1所示。

2)利用本发明中所提供序列设计转基因水稻TT51-1事件及其衍生品种的事件特异性定性PCR检测方法

以不同来源转基因和非转基因作物基因组DNA为模板，利用TT51-1事件外源插入载体3’端旁侧序列特异性引物组合TT511G/TT511V(图2)，进行PCR扩增，结果如图3。只有TT51-1基因组DNA可以扩增出特异的PCR产物，而其他转基因和非转基因水稻基因组DNA做模板时都没有扩增产物可观察到。同时以其他非水稻转基因和非转基因植物基因组DNA为模板，也没有可见的PCR扩增产物。因此，我们认为，该引物组合具有良好的特异性，适合用于事件特异性的检测。

3)利用本发明中所提供序列设计转基因水稻TT51-1事件及其衍生品种的事件特异性定量PCR检测方法

利用如图2所示的引物探针组合，进行TT51-1事件特异性的荧光定量PCR反应。根据梯度稀释模板，4次重复获得的荧光曲线信息，针对TT51-1事件的特异性荧光定量PCR反应标准曲线被建立起来，如图4所示，其R²值为0.997，表明外源基因的拷贝数与荧光强度都具有良好的对应关系，适合用于外源基因的精确定量。

为了验证本研究中建立的定量方法的精确性，我们使用了从标准转基因水稻TT51-1产品中提取的基因组DNA用非转基因水稻基因组DNA稀释至一定含量，并以不含转基因水稻TT51-1基因组DNA的相同量基因组DNA做对照，作为实时荧光定量PCR反应的模板，并根据相同条件下获得的标准曲线，计算不同样品中转基因水稻基因组DNA的含量。

以不含转基因水稻TT51-1的非转基因水稻基因组DNA为模板，没有扩增产物被检测到。对于混和实验样品，用本研究中建立TT51-1事件特异性荧光定量检测方法来检测，都和理论值非常接近，误差小于15％。

以上结果可以看出，本发明为转基因水稻TT51-1事件及其衍生品种的定量检测分析提供了基于简单、可靠的测定方法，可以用于不同来源、不同含量的混和产品中转基因油菜Oxy-235事件以及转基因油菜品种Oxy-235的定量。本发明为转基因标识提供了一种有用的参考，对转基因产品的控制提供了必要的手段。

序列表

<110>中国农业科学院油料作物研究所

<120>转基因水稻TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列及其应用

<160>1

<210>1

<211>10536

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa cv.TT51-1)

<400>

aaaagttgaa tttgggaata gtcagccaag gttttgtagc tactttggaa gctaaaccta   60

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ttgaaagtgc caatgctttt acatcttcac tcggtaacat cgtgggtgtt agaaacttta  2820

gtgggactgc tggagtgatt atcgacagat tcgagttcat tccagttact gcaacactcg  2880

aggctgaata agtcgaggta ccgagctcga atttccccga tcgttcaaac atttggcaat  2940

aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt  3000

tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg  3060

tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc  3120

gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat cgggaattca  3180

tcgatgatat cagatctgcc ggtctcccta tagtgagtcg tattaatttc gataagccag  3240

cacatctaag cctgacgaag cagcagaaat atataaaaat ataaaccatg ctcactcaaa  3300

ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa  3360

aggccagcaa aaggccagga accgtaaagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa  3420

aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt  3480

tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa  3540

tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct  3600

gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg  3660

ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg  3720

gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg  3780

tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta  3840

ctgagagtgc accatatgga catattgtcg ttagaacgcg gctacaatta atacataacc  3900

ttatgtatca tacacatacg atttaggtga cactatagaa ctcgagcagc tgaagcttgc  3960

atgcctgcag gtcgaggtca ttcatatgct tgagaagaga gtcgggatag tccaaaataa  4020

aacaaaggta agattacctg gtcaaaagtg aaaacatcag ttaaaaggtg gtataaagta  4080

aaatatcggt aataaaaggt ggcccaaagt gaaatttact cttttctact attataaaaa  4140

ttgaggatgt ttttgtcggt actttgatac gtcatttttg tatgaattgg tttttaagtt  4200

tattcgcttt tggaaatgca tatctgtatt tgagtcgggt tttaagttcg tttgcttttg  4260

taaatacaga gggatttgta taagaaatat ctttaaaaaa acccatatgc taatttgaca  4320

taatttttga gaaaaatata tattcaggcg aattctcaca atgaacaata ataagattaa  4380

aatagctttc ccccgttgca gcgcatgggt attttttcta gtaaaaataa aagataaact  4440

tagactcaaa acatttacaa aaacaacccc taaagttcct aaagcccaaa gtgctatcca  4500

cgatccatag caagcccagc ccaacccaac ccaacccaac ccaccccagt ccagccaact  4560

ggacaatagt ctccacaccc ccccactatc accgtgagtt gtccgcacgc accgcacgtc  4620

tcgcagccaa aaaaaaaaaa agaaagaaaa aaaagaaaaa gaaaaaacag caggtgggtc  4680

cgggtcgtgg gggccggaaa cgcgaggagg atcgcgagcc agcgacgagg ccggccctcc  4740

ctccgcttcc aaagaaacgc cccccatcgc cactatatac ataccccccc ctctcctccc  4800

atccccccaa ccctaccacc accaccacca ccacctccac ctcctccccc ctcgctgccg  4860

gacgacgagc tcctcccccc tccccctccg ccgccgccgc gccggtaacc accccgcccc  4920

tctcctcttt ctttctccgt tttttttttc cgtctcggtc tcgatctttg gccttggtag  4980

tttgggtggg cgagaggcgg cttcgtgcgc gcccagatcg gtgcgcggga ggggcgggat  5040

ctcgcggctg gggctctcgc cggcgtggat ccggcccgga tctcgcgggg aatggggctc  5100

tcggatgtag atctgcgatc cgccgttgtt gggggagatg atggggggtt taaaatttcc  5160

gccatgctaa acaagatcag gaagagggga aaagggcact atggtttata tttttatata  5220

tttctgctgc ttcgtcaggc ttagatgtgc tagatctttc tttcttcttt ttgtgggtag  5280

aatttgaatc cctcagcatt gttcatcggt agtttttctt ttcatgattt gtgacaaatg  5340

cagcctcgtg cggagctttt ttgtaggtag acgataagct tgatatcgaa ttcctgcagc  5400

cccatggaca actgcaggcc atacaactgc ttgagtaacc cagaagttga agtacttggt  5460

ggagaacgca ttgaaaccgg ttacactccc atcgacatct ccttgtcctt gacacagttt  5520

ctgctcagcg agttcgtgcc aggtgctggg ttcgttctcg gactagttga catcatctgg  5580

ggtatctttg gtccatctca atgggatgca ttcctggtgc aaattgagca gttgatcaac  5640

cagaggatcg aagagttcgc caggaaccag gccatctcta ggttggaagg attgagcaat  5700

ctctaccaaa tctatgcaga gagcttcaga gagtgggaag ccgatcctac taacccagct  5760

ctccgcgagg aaatgcgtat tcaattcaac gacatgaaca gcgccttgac cacagctatc  5820

ccattgttcg cagtccagaa ctaccaagtt cctctcttgt ccgtgtacgt tcaagcagct  5880

aatcttcacc tcagcgtgct tcgagacgtt agcgtgtttg ggcaaaggtg gggattcgat  5940

gctgcaacca tcaatagccg ttacaacgac cttactaggc tgattggaaa ctacaccgac  6000

cacgctgttc gttggtacaa cactggcttg gagcgtgtct ggggtcctga ttctagagat  6060

tggattagat acaaccagtt caggagagaa ttgaccctca cagttttgga cattgtgtct  6120

ctcttcccga actatgactc cagaacctac cctatccgta cagtgtccca acttaccaga  6180

gaaatctata ctaacccagt tcttgagaac ttcgacggta gcttccgtgg ttctgcccaa  6240

ggtatcgaag gctccatcag gagcccacac ttgatggaca tcttgaacag cataactatc  6300

tacaccgatg ctcacagagg agagtattac tggtctggac accagatcat ggcctctcca  6360

gttggattca gcgggcccga attcaccttt cctctctatg gaactatggg aaacgccgct  6420

ccacaacaac gtatcgttgc tcaactaggt cagggtgtct acagaacctt gtcttccacc  6480

ttgtacagaa gacccttcaa tatcggtatc aacaaccagc aactttccgt tcttgacgga  6540

acagagttcg cctatggaac ctcttctaac ttgccatccg ctgtttacag aaagagcgga  6600

accgttgatt ccttggacga aatcccacca cagaacaaca atgtgccacc caggcaagga  6660

ttctcccaca ggttgagcca cgtgtccatg ttccgttccg gattcagcaa cagttccgtg  6720

agcatcatca gggctcctat gttctcttgg atacaccgta gtgctgagtt caacaacatc  6780

atcgcatccg atagtattac tcaaatccct gcagtgaagg gaaactttct cttcaacggt  6840

tctgtcattt caggaccagg attcactggt ggagacctcg ttagactcaa cagcagtgga  6900

aacaacattc agaatagagg gtatattgaa gttccaattc acttcccatc cacatctacc  6960

agatatagag ttcgtgtgag gtatgcttct gtgaccccta ttcacctcaa cgttaattgg  7020

ggtaattcat ccatcttctc caatacagtt ccagctacag ctacctcctt ggataatctc  7080

caatccagcg atttcggtta ctttgaaagt gccaatgctt ttacatcttc actcggtaac  7140

atcgtgggtg ttagaaactt tagtgggact gctggagtga ttatcgacag attcgagttc  7200

attccagtta ctgcaacact cgaggctgaa taagtcgagg taccgagctc gaatttcccc  7260

gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg  7320

atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc  7380

atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac  7440

gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct  7500

atgttactag atcgggaatt catcgatgat atcagatctg ccggtctccc tatagtgagt  7560

cgtattaatt tcgataagcc aggttaacct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag  7620

aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt  7680

cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga  7740

atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg  7800

taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa  7860

aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt  7920

tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct  7980

gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct  8040

cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc  8100

cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt  8160

atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc  8220

tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat  8280

ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa  8340

acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa  8400

aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga  8460

aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct  8520

tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga  8580

cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc  8640

catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg  8700

ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat  8760

aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat  8820

ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg  8880

caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc  8940

attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa  9000

agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc  9060

actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt  9120

ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag  9180

ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaacccc  9240

cgaacatcgc ctcgctccag tcaatgaccg ctgttatgcg gccattgatt tgtagagaga  9300

gactggtgat ttcagcgggc atgcctgcag gtcgactcta gaggatcccg gacgagtgct  9360

ggggcagata agcagtagtg gtggggctac gaacatattc cttttccttc tggacgctac  9420

cactcatatg ttccaaaatt acaaatttgt cctttgtatt tgttgcaatt ttcatgtaag  9480

aaatccaacg aggctctgtt tttttttatt ggccttgttt ggatcctcag agctattaaa  9540

tagccctgca gaatcttact atttaggagt attaaacgta gattaccgac aaaaccgatt  9600

ccataaccct aggctatttt gcaagacaaa tctaatgatg tatattaatc catgattagc  9660

gactgattac tgtagcatca ctgtagcaaa tcatggatta atatacctcg ttagattcgt  9720

ctcgtaaaat agcctatggg ttttgtcatt aatctacgtt taatacttct aaatagcaag  9780

attccggagg gctatttaat agccctccgg atccaaacag agccattgat catgtcgacg  9840

gaactctaac ttctcaattt aacttacttt acactttcta tcactttcta ttttcttggt  9900

gtcctaagaa aaccctacat ctttctgggt atatcataat acaagtggat tttctttttc  9960

cttttttggc aacgctaccc ctgtaaactc agcatagcca tgctgcattt gtgcatgttg 10020

gtatatacac catcatccat gtcagagtac tgtattgcaa aacacatcta ttatctatct 10080

attataatac tacaagtcca ttaaatttcc tacaaacact tctaagctgc cacttggcgc 10140

tctaataaat tagagaaatc aaagaaattc taaggaaaaa gcatatattc taacactttg 10200

catgctacca acaatcgtga aatattatag aacaatttaa tatgttgatt atgctaccat 10260

acatttattc catcctaaaa tataaacata tttagaaaag tgctaagtca aacattttaa 10320

ctttaattat ttatagtgaa aataaataaa agatcaatca tataaaaatg atattaaata 10380

caatgtcact cttctatcta gaacaattta ttttttataa atataaatat tattagtcaa 10440

agtagtatcc taaagaccgt tccaaaataa aacaaacgta tatttttagg acagaatgtg 10500

gagtgatcta taaacatacg tatctaacaa atagat                           10536

Claims (3)

1、一种转基因水稻TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列，其特征是：

碱基序列如SEQ NO.1所示，由来源于水稻基因组的第1至673个碱基，来源于载体序列的第674至9364个碱基和来源于水稻基因组的第9365至10536个碱基共同组成；

由来源于外源插入载体的第1至673个碱基和来源于油菜基因组序列的第674至9364个碱基共同组成的DNA序列，转基因水稻TT51-1事件外源插入载体5’端边界旁侧序列；

由来源于油菜基因组序列的第674至9364个碱基和来源于外源插入载体的第9365至10536个碱基共同组成的DNA序列，转基因水稻TT51-1事件外源插入载体3’端边界旁侧序列；

以上所述序列是转基因水稻TT51-1事件的特征序列，可以用于区分转基因水稻TT51-1和其他转基因和非转基因水稻，以及转基因水稻TT51-1的定性检测和定量分析。

2、按权利要求1所述的转基因水稻TT51-1事件外源插入载体旁侧序列的应用，其特征是利用该序列特征设计的转基因水稻外源基因整合事件TT51-1的事件特异性定性PCR检测方法：

合成引物序列如下：TT511G：5’GCGTCCAGAAGGAAAAGGAATA 3’和TT511V：5’AGAGACTGGTGATTTCAGCGGG 3’；提取样品总DNA，分别利用TT511G/TT511V引物组合进行PCR扩增；PCR产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物，如存在扩增产物则说明样品中含有TT51-1来源的成分。

3、按权利要求1所述的转基因水稻TT51-1事件外源插入载体旁侧序列的应用，其特征是利用该序列特征设计的转基因水稻外源基因整合事件TT51-1的事件特异性定量PCR检测方法：

合成引物序列如下：TT511G：5’GCGTCCAGAAGGAAAAGGAATA 3’和TT511V：5’AGAGACTGGTGATTTCAGCGGG 3’；合成TaqMan探针序列如下：TT511P：5’FAM-ATCTGCCCCAGCACTCGTCCG-BHQ13’；提取样品总DNA，分别利用上述引物TT511G/TT511V和探针TT511P组合进行荧光定量PCR扩增；转基因水稻TT51-1基因组DNA被相同浓度非转基因水稻基因组DNA稀释至不同含量，以20ng的混和水稻基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR反应并建立标准曲线；以标准曲线为参照测定含有TT51-1基因组DNA的混和水稻基因组DNA样品中TT51-1基因组DNA的量。

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