CN107532179A - 产生pufa的材料和方法及含有pufa的组合物 - Google Patents

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Abstract

用于植物中表达靶基因的T‑DNA，其中T‑DNA包含左边界元件和右边界元件和至少一个包含与靶基因有效连接的启动子及其下游终止子的表达盒，其中从左边界元件至右边界元件测量并包含靶基因的T‑DNA的长度具有至少30000bp长度。

Description

产生PUFA的材料和方法及含有PUFA的组合物
发明领域
本申请要求2014年11月14日提交的美国临时专利申请序列号62/079622和2015年9月29日提交的美国临时专利申请序列号62/234373的优先权，所述文献通过引用方式完整并入本文。
借助专利版本3.5，将序列表(作为本公开的组成部分)作为文本文件与本说明书同时提交。序列表的主题通过引用的方式完整并入本文。
本发明总体上涉及制造脂肪酸、尤其大规模生产极长链多不饱和脂肪酸(VLC-PUFA，也称作多不饱和脂肪酸或PUFA，例如，二十碳五烯酸(EPA)、ω-3二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA))的领域。本发明特别地涉及在植物中产生VLC-PUFA并且因此尤其提供用于转化植物以使得这类转化的植物产生VLC-PUFA成为可能的核酸。为此目的，本发明还提供含有去饱和酶基因和延伸酶基因的转基因构建体和表达载体以及已经引入这些构建体和表达载体的宿主细胞。本发明还涉及用于制造油、含有脂肪酸或脂质的组合物的方法并这类油和脂质本身。此外，本发明涉及用于进一步改善植物中产生VLC-PUFA的方法。
发明背景
脂肪酸是具有在众多生物学过程中发挥基础作用的含有长链烃侧基团的羧酸。脂肪酸在自然界中罕以游离形式存在，相反，以酯化形式作为脂类的主要组分出现。因此，脂类/脂肪酸是能量的来源(例如，β-氧化)。此外，脂类/脂肪酸是细胞膜的不可分割部分，并且因此不可替代处理生物学或生物化学信息。
长链多不饱和脂肪酸((VLC-PUFA)如二十二碳六烯酸(DHA，22：6(4，7，10，13，16，19))是哺乳动物中多种组织和细胞器(神经、视网膜、脑和免疫细胞)的细胞膜的必需组分。临床研究已经显示，DHA对婴儿的脑生长与发育和成人正常脑功能的维持重要(Martinetz，M.(1992)J.Pediatr.120：S129 S138)。DHA还显著地影响参与信号转导过程的光受体功能、视紫红质激活和视杆与视锥发育(Giusto，N.M.等人(2000)Prog.Lipid Res.39：315-391)。此外，还发现DHA对疾病如高血压、关节炎、动脉粥样硬化、抑郁、血栓形成和癌症的某些积极影响(Horrocks，L.A.和Yeo，Y.K.(1999)Pharmacol.Res.40：211-215)。因此，脂肪酸的适宜膳食对人健康是重要的。因为此类脂肪酸不能由婴儿、幼儿和老年人有效合成，故从膳食中充分摄取这些脂肪酸对这些个体特别重要(Spector，A.A.(1999)Lipids 34：S1 S3)。
EPA(20：5n-35，8，11，14，17)并且另外ARA(花生四烯酸，20：4n-6(5，8，11，14))均是Δ5(d5)必需脂肪酸。它们形成人和动物的独特类型的食品组分和饲料组分。EPA属于酰基链中具有五个双键的n-3系列。EPA存在于海鲜中并且在来自北大西洋的油鱼类中丰富。ARA属于具有四个双键的n-6系列。与EPA中存在的那些性能相比，在ω-3位置内缺少双键赋予ARA不同的性能。从ARA(有时缩写为“AA”)产生的类花生酸类具有强烈的炎症特性和血小板聚集特性，而源自EPA的那些类花生酸类具有抗炎性能和抗血小板聚集特性。ARA可以从一些食物如肉、鱼和蛋类获得，但是其浓度低。
γ-亚麻酸(GLA，C18：3n-6(6，9，12))是哺乳动物中存在的另一种必需脂肪酸。GLA是极长链n-6脂肪酸和多种活性分子的代谢中间体。在哺乳动物中，长链多不饱和脂肪酸的形成受Δ-6去饱和作用限速。已经显示许多生理状况和病理状况如老化、应激、糖尿病、湿疹和一些感染抑制Δ-6去饱和步骤。此外，GLA因氧化和与某些疾病(例如癌症或炎症)相关的快速细胞分裂而轻易分解。因此，膳食补充GLA可以降低这些疾病的风险。临床研究已经显示，膳食补充GLA在治疗一些病理学疾病如异位性湿疹、经前综合征、糖尿病、高胆固醇血症和炎性疾病与心血管疾病方面是有效的。
已经显示DHA或EPA和DHA混合物的多种有益健康作用。
虽然生物技术为生产专一性脂肪酸提供有吸引力的途径，但是现有技术不能提供用于大规模生产不饱和脂肪酸的高效手段。因此，需要改进和高效的产生极长链多不饱和脂肪酸(VLC-PUFA)如EPA和DHA的方法。
EPA和DHA的当前商业来源是鱼油。但是，海洋储备因过度捕捞正在削减，并且需要EPA和DHA的备选可持续来源以满足日益增长的需求。已经做出许多努力以开发产生VLC-PUFA(包括EPA和DHA)的转基因油籽植物。参见，例如，WO 2004/071467、WO 2013/185184、WO2015/089587，Ruiz-Lopez等人，(2014)Plant J.77，198-208。但是，以商业意义的水平产生EPA和DHA的转基因油籽植物已经尚未商业化。
为了实现用多不饱和ω-3-脂肪酸强化食品和/或饲料，仍迫切需要用于产生、尤其在真核系统中产生前述每种长链多不饱和脂肪酸的简单价廉方法。
发明简述
本发明因此涉及提供轻易制造VLC-PUFA的可靠来源。为此目的，本发明还涉及提供可靠产生VLC-PUFA、优选地EPA和/或DHA的植物。本发明还涉及提供用于获得、改进和培育这类植物的手段和方法，并还涉及从类植物、尤其从其种子可获得的含有VLC-PUFA的油。另外，本发明提供这类植物和其部分的用途。
根据本发明，因此提供用于植物中表达靶基因的T-DNA。本发明有益地提供用于转化植物组织并产生重组植物的系统，其中重组植物因引入T-DNA不同于相应的亲本植物(出于本发明目的，亲本植物称作野生型植物，无论这类亲本植物本身是否在自然界中存在)。引入亲本植物的T-DNA有益地具有至少30000个核苷酸的长度。
本发明也提供具有下述基因型的植物，所述基因型赋予其一种或多种组织或组分中高种子油VLC-PUFA含量、优选地种子油中高EPA和/或DHA含量的可遗传表型。本发明还提供相对于其总含油量而言包含高VLC-PUFA含量，优选地高EPA和/或DHA含量的材料。另外，本发明提供芸苔属植物的示例性事件。最有益地，本发明提供包含高VLC-PUFA含量、优选地高EPA和/或DHA含量的油。
本发明也提供产生油的方法，其中油具有高VLC-PUFA含量、高EPA和/或DHA含量。在特别优选的方面，这些方法用于产生相应的植物油。因此，本发明还提供产生油的方法。
本发明也提供产生植物的方法，从而植物或其后代可以用作油来源，其中油具有高VLC-PUFA含量、高EPA和/或DHA含量。因此，本发明有益地还提供用于产生植物的方法，所述植物具有在其一种或多种组织或组分中高种子油VLC-PUFA含量、优选地种子油中高EPA和/或DHA含量的可遗传表型。
本发明还提供一种相对于对照植物增加植物中米德酸(20：3n-9)含量的方法，所述方法包括在植物中表达至少一个编码Δ-6-去饱和酶的多核苷酸、至少一个编码Δ-6-延伸酶的多核苷酸和至少一个编码Δ-5-去饱和酶的多核苷酸。
本发明也提供优化用于产生本发明植物的方法的手段。在这个方面，本发明提供用于分析酶特异性、尤其分析去饱和酶反应特异性和分析延伸酶特异性、优化代谢途径并确定目标去饱和酶的CoA依赖性的方法体系。
附图简述
图1：导致ARA、EPA和DHA产生的不同酶活性的示意图。
图2：计算途径步骤转化效率的公式。S：途径步骤的底物。P：途径步骤的产物。产物总是在这个途径步骤处转化的直接产物和经过这个途径步骤旨在形成的全部下游产物的总和。例如DHA(22：6n-3)的确拥有因油酸(18：1n-9)发生Δ-12-去饱和成为亚油酸(18：2n-6)所致的双键。
图3：用于逐步建立本发明植物表达质粒的策略。
图4：含有用于大肠杆菌(E.coli)/农杆菌(Agrobacteria)中复制质粒的ColE1/pVS1复制起点的双元植物表达质粒的稳定性。左小图：农杆菌细胞中的稳定性，通过在使用农杆菌培养物转化植物之前从农杆菌培养物分离质粒DNA，并且使质粒DNA经历限制性消化。一种意料之外的限制模式表明质粒在大肠杆菌中或在农杆菌中瓦解/不稳定。右小图：在来自LB至RB的至少一个完整T-DNA在转化过程期间整合入植物基因组的假设下，通过给定质粒转化所获得的大部分植物预计实现由质粒编码的所需性状(这里：在种子中产生新脂肪酸(FA))。这类‘功能性’植物的百分数下降显示了农杆菌(Agrobacteria)中或转移进入植物过程期间或基因组整合过程期间的不稳定性。如所见到的，当使用含有ColE1/pVS1的质粒时，对于大小超过25,000bp的质粒，无功能植物的比例急剧上升。
图5：显示表1中所列遗传元件的位置的VC-LJB2197-1qcz质粒图。
图6：显示表2中所列遗传元件的位置的VC-LJB2755-2qcz rc质粒图。
图7：显示表3中所列遗传元件的位置的VC-LLM306-1qcz rc质粒图。
图8：显示表4中所列遗传元件的位置的VC-LLM337-1qcz rc质粒图。
图9：显示表5中所列遗传元件的位置的VC-LLM338-3qcz rc质粒图。
图10：显示表6中所列遗传元件的位置的VC-LLM391-2qcz rc质粒图。
图11：显示表7中所列遗传元件的位置的VC-LTM217-1qcz rc质粒图。
图12：显示表8中所列遗传元件的位置的RTP10690-1qcz_F质粒图。
图13：显示表9中所列遗传元件的位置的RTP10691-2qcz质粒图。
图14：显示表10中所列遗传元件的位置的LTM595-1qcz rc质粒图。
图15：显示表11中所列遗传元件的位置的LTM593-1qcz rc质粒图。
图16：在四个不同构建体组合的单拷贝事件的种子发育期间受VfUSP启动子驱动的o3Des(Pi_GA2)的对比转录物分析。
图17：在四个不同构建体组合的单拷贝事件的种子发育期间o3Des(Pir_GA)的对比转录物分析。在VC-LJB2755-2qcz和VC-RTP10690-1qcz_F中，基因受LuCnl启动子驱动，而在VC-LLM337-1qcz rc中，基因受VfUSP启动子驱动并且按照比LuCnlo3Des(Pir_GA)组合更低的水平表达。
图18：在VC-RTP10690-1qcz_F的单拷贝事件的种子发育期间受BnSETL启动子驱动的o3Des(Pir_GA)的对比转录物分析。
图19：在来自VC-RTP10690-1qcz_F和VC-LTM217-1qcz rc的单拷贝事件的种子发育期间，受LuCnl启动子驱动的d4Des(Pl_GA)2的对比转录物分析，其与VC-LJB2755-1qcz一起存在。其他构建体缺少这种特定的d4Des。
图20：在四个不同构建体组合的单拷贝事件的种子发育期间受ARC5启动子驱动的d4Des(Tc_GA)的对比转录物分析。
图21：在以下两个不同构建体组合的单拷贝事件的种子发育期间受LuCnl启动子驱动的d4Des(Eg_GA)的对比转录物分析：VC-LJB2755-2qcz、VC-LLM391-2qcz rc以及VC-LJB2197-1qcz、VC-LLM337-1qcz rc。
图22：事件LANPMZ的分离性T1种子的半数谷粒分析。分析总计288株籽苗。发现这些籽苗中71株未产生显著量的VLC-PUFA(深灰色菱形)，同时含有＞49％的油酸和＜28％的亚油酸。71粒种子/288粒种子对应于分析的总计种子的24.65％。全部剩余种子均能够产生DHA，表明存在来自构建体VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM337-1qcz rc的两种T-DNA。在产生DHA的那些种子当中，可以区分一个显示中等VLC-PUFA水平的146粒种子组(空心菱形)和一个显示高VLC-PUFA水平的71粒种子组(浅灰色菱形)。这三个组的比率是71∶146∶71，其对应于传递某表型的全部基因(在这种情况下，两个T-DNA质粒VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM337-1qcz rc)整合入基因组中的一个基因座时对这种表型期望的孟德尔1∶2∶1比率(无效∶杂合∶纯合)。
图23：事件LBDIHN的分离性T1种子的半数谷粒分析。分析总计288株籽苗。该途径的第一底物脂肪酸的水平在x-轴上作图，两种途径产物(EPA+DHA)的总计水平在y-轴上作图。可以清楚地看到三个聚类，其中这三个聚类的种子数目比率是1∶2∶1(纯合∶杂合∶无效分离子)。根据孟德尔第一定律，表型的这种分离表明，构建体RTP10690-1qcz_F的T-DNA单基因座插入欧洲油菜栽培品种Kumily(B.napus cv Kumily)的基因组中。
图24：酵母中异源表达的去饱和酶酶活性的例子。将[14C]脂肪酸甲基酯(ME)从酶促反应分离，如对每种具体酶所述那样通过TLC解析并且使用瞬时(Instant)成像仪，通过电子放射自显影术检测。在小图A中，通过以下方式证明Δ-12去饱和酶(Ps)(c-d12Des(Ps_GA))活性：相对于从含有空载体(VC)的对照菌株分离的微粒体，比较从表达c-d12Des(Ps_GA)蛋白的菌株分离的酵母微粒体中存在的酶活性。在小图B中，通过以下方式证明ω-3去饱和酶活性(c-o3Des(Pir_GA)活性和c-o3Des(Pi_GA2))活性：比较源自从表达c-o3Des(Pir_GA)蛋白、c-o3Des(Pi_GA2)蛋白或空载体(VC)对照的菌株分离的酵母微粒体的酶活性。在小图C中，通过以下方式证明Δ-4去饱和酶(Tc)(c-d4Des(Tc_GA))活性：相对于从含有空载体(VC)的对照菌株分离的微粒体，比较源自从表达c-d4Des(Tc_GA)蛋白的菌株分离的酵母微粒体的酶活性。在小图D中，通过以下方式证明Δ-4去饱和酶(Pl)(c-d4Des(Pl_GA)2)活性：相对于从含有空载体(VC)的对照菌株分离的微粒体，比较源自从表达c-d4Des(Pl_GA)2蛋白的菌株分离的酵母微粒体的酶活性。
图25：转基因欧洲油菜中去饱和酶酶活性的例子。将[14C]脂肪酸甲基酯(ME)从酶促反应分离，如对每种具体酶所述那样通过TLC解析并且使用瞬时成像仪，通过电子放射自显影术检测。在小图A中，通过以下方式证明Δ-12去饱和酶(Ps)(c-d12Des(Ps_GA))活性：相对于从含有d12Des(Ps_GA2)基因的转基因欧洲油菜分离的微粒体，比较源自从表达c-d12Des(Ps_GA)蛋白的菌株分离的酵母微粒体的酶活性。在小图B中，通过以下方式证明Δ-4去饱和酶(Tc)活性、c-d4Des(Tc_GA)活性和Δ-4去饱和酶(Pl)活性：相对于从含有d4Des(Tc_GA3)基因和d4Des(Pl_GA)2基因的转基因欧洲油菜分离的微粒体，比较源自从表达c-d4Des(Tc_GA)蛋白的菌株分离的酵母微粒体的酶活性。
图26：显示酰基-脂质底物的特异性的去饱和酶酶反应例子。将[14C]脂肪酸甲基酯(ME)从酶促反应分离，如对每种具体酶所述那样通过TLC解析并且使用瞬时成像仪，通过电子放射自显影术检测，其中所述酶促反应含有从表达目的蛋白的酵母株获得的微粒体。在小图A中，Δ-12去饱和酶(Ps)(c-d12Des(Ps_GA))去饱和的酶产物仅在磷脂酰胆碱级分中检出，表明该酶对酰基-脂质底物特异。在小图B和小图C中，Δ-4去饱和酶(Tc)(c-d4Des(Tc_GA)去饱和的酶产物在磷脂酰胆碱级分中检出，表明该酶对酰基-脂质底物特异。在小图D中，时程证明了Δ-4去饱和酶(Tc)(c-d4Des(Tc_GA))的活性。
图27：显示酰基-CoA底物的特异性的去饱和酶酶反应例子。将[14C]脂肪酸甲基酯(ME)从酶促反应分离，如对每种具体酶所述那样通过TLC解析并且使用瞬时成像仪，通过电子放射自显影术检测，其中所述酶促反应含有从表达目的蛋白的酵母株获得的微粒体。在小图A中，根据确定脂质相关去饱和的方法，将PC用底物原位标记。在磷脂酰胆碱级分中Δ-9去饱和酶(Sc)(d9D(Sc))去饱和的酶产物很低，对照反应中例外(无PC原位标记)，表明该酶不能令酰基-脂质底物去饱和。在小图B和C中，根据确定酰基-CoA相关去饱和的方法进行孵育。在小图B中，当添加20：1-CoA至测定法时，酰基-CoA级分(MeOH/H2O-相，称作H2O中nmol16∶1)中放射性活度的量增加。这表明，添加的20：1-CoA与PC形成中的放射性底物和游离脂肪酸竞争。在小图C中，当添加20：1-CoA至测定法时，酰基-CoA级分中去饱和的酶产物的量增加，这表明这种去饱和是酰基-CoA相关联的。
图28：酵母中异源表达的延伸酶酶活性的例子。将[14C]脂肪酸甲基酯(ME)从酶促反应分离，如对每种具体酶所述那样通过TLC解析并且使用瞬时成像仪，通过电子放射自显影术检测。所示的全部FAME均具有与可靠标准品相似的Rf。在不存在[14C]丙二酸单酰-CoA的情况下，在任何的这些延伸酶反应中未观察到放射性脂肪酸。在小图A中，通过以下方式证明Δ-6延伸酶(Tp)(c-d6Elo(Tp_GA2))活性：相对于从含有空载体(VC)的对照菌株分离的微粒体，比较从表达c-d6Elo(Tp_GA2)蛋白的菌株分离的酵母微粒体中存在的酶活性。在小图B中，如小图A中所示，通过以下方式证明Δ-6延伸酶(Pp)(c-d6Elo(Pp_GA2))活性：相对于从含有空载体(VC)的对照菌株分离的微粒体，比较源自从表达c-d6Elo(Pp_GA2)蛋白的菌株分离的酵母微粒体的酶活性。在小图C中，通过以下方式证明Δ-5延伸酶(Ot)(c-d5Elo(Ot_GA3))活性：相对于从含有空载体(VC)的对照菌株分离的微粒体，比较从表达d5E(Ot)蛋白的菌株分离的酵母微粒体中存在的酶活性。
图29：转基因欧洲油菜中延伸酶活性的例子。将[14C]脂肪酸甲基酯(ME)从酶促反应分离，如对每种具体酶所述那样通过TLC解析并且使用瞬时成像仪，通过电子放射自显影术检测。在小图A中，通过以下方式证明Δ-6延伸酶活性：相对于从含有含有c-d6Elo(Pp_GA2)基因和c-d6Elo(Tp_GA2)基因的转基因欧洲油菜分离的微粒体，比较源自从表达d6E(Pp_GA2)蛋白的菌株分离的酵母微粒体的酶活性。在小图B中，通过以下方式证明Δ-5延伸酶(Ot)(d5Elo(Ot_GA3))活性：相对于从含有d5Elo(Ot_GA3)的转基因欧洲油菜和野生型欧洲油菜(对照)分离的微粒体，比较源自从表达c-d5Elo(Ot_GA3)蛋白的菌株分离的酵母微粒体的酶活性。
图30：时程优化。向表达c-d5Des(Tc_GA2)的酵母细胞输以0.25mM DHGLA并且通过GC测定ARA的产生。在输入后立即开始收集样品。在小图A-D中，去饱和表述为转化％对生长时间(小时)，并且产物水平和底物水平表述为总脂肪酸％对生长时间(小时)。小图A涉及诱导后立即供应DHGLA的样品。小图B是在输入之前诱导过夜(22小时)。小图C针对供应3X正常DHGLA水平的培养物。小图D针对每天供应正常程度的DHGLA(0.25mM)的培养物。
图31：全部去饱和酶和延伸酶的代表性时程曲线。向表达每种酶的酵母细胞供应0.25mM优选的脂肪酸底物，并且在所示的时间点通过GC获得脂肪酸特征。在小图A-J中，去饱和和延伸表述为转化％对生长时间(小时)，并且产物水平和底物水平表述为总脂肪酸％对生长时间(小时)。A.c-d5Des(Tc_GA2)+DHGLA；B.c-d6Des(Ot_febit)+ALA；C.c-d4Des(Pl_GA)2+DTA；D.c-d4Des(Tc_GA)+DTA；E.c-o3Des(Pir_GA)+ARA；F.c-o3Des(Pi_GA2)+ARA；G.c-d12Des(Ps_GA)+OA；H.c-d5Elo(Ot_GA3)+EPA；I.c-d6Elo(Tp_GA2)+GLA；J.c-d6Elo(Pp_GA2)+SDA。
图32：在转基因欧洲油菜的种子中和欧洲油菜野生型种子中Δ-12-去饱和的转化效率。显示了各个植物种群的平均转化效率，以及在具有最高EPA+DHA水平的事件LBFDAU的种子批次中观察到的转化效率，和在该种子批次的单个种子中观察到的那些效率，其中在全部95粒测量的单个种子当中，这粒单个种子具有最高的EPA+DHA水平。数据取自实施例10至实施例18。T0和T1指产生种子的植物世代(全部在温室中培育，二个LBFDAU数据点例外)
图33：在转基因欧洲油菜的种子中和欧洲油菜野生型种子中Δ-6-去饱和的转化效率。关于更多细节，参见图32中的说明文字。
图34：在转基因欧洲油菜的种子中和欧洲油菜野生型种子中Δ-6-伸长的转化效率。关于更多细节，参见图32中的说明文字。
图35：在转基因欧洲油菜的种子中和欧洲油菜野生型种子中Δ-5-去饱和的转化效率。关于更多细节，参见图32中的说明文字。
图36：在转基因欧洲油菜的种子中和欧洲油菜野生型种子中ω-3去饱和(不包括C18脂肪酸)的转化效率。关于更多细节，参见图32中的说明文字。
图37：在转基因欧洲油菜的种子中和欧洲油菜野生型种子中ω-3去饱和(包括C18脂肪酸)的转化效率。关于更多细节，参见图32中的说明文字。
图38：在转基因欧洲油菜的种子中和欧洲油菜野生型种子中Δ-5-伸长的转化效率。关于更多细节，参见图32中的说明文字。
图39：在转基因欧洲油菜的种子中和欧洲油菜野生型种子中Δ-4-去饱和的转化效率。关于更多细节，参见图32中的说明文字。
图40：全部途径脂肪酸的总量与种子含油量负相关。显示3个世代事件LANPMZ的数据。对于温室数据，一个标志物对应于一株植物的一个种子批，对于田间数据，一个标志物对应于代表一个小区的随机选择种子的分析。
图41：全部途径脂肪酸的总量与种子含油量负相关。显示4个世代事件LAODDN的数据。对于温室数据，一个标志物对应于一株植物的一个种子批次，对于田间数据，一个标志物对应于代表一个小区的随机选择种子的分析。
图42：全部途径脂肪酸的总量与种子含油量负相关。显示事件LBFGKN的2个世代的数据。对于温室数据，一个标记物对应于分析代表整装(bulk)50个T2种子批次或182个T3种子批次的种子的随机选择；对于田间数据，一个标记物对应于分析一株T1植物的一个T2种子批次，或分析代表小区(36个小区)或单一植物(60株植物)的T3种子的随机选择。
图43：全部途径脂肪酸的总量与种子含油量负相关。显示事件LBFLFK的2个世代的数据。对于温室数据，一个标记物对应于分析代表整装10个T2种子批次或195个T3种子批次的种子的随机选择；对于田间数据，一个标记物对应于分析一株T1植物的1个T2种子批次，或分析代表一个小区的T3种子的随机选择。
图44：Δ-12-去饱和酶的转化效率与种子含油量负相关。显示事件LANPMZ的3个世代的数据。对于温室数据，一个标志物对应于一株植物的一个种子批次，对于田间数据，一个标志物对应于代表一个小区的随机选择种子的分析。
图45：Δ-12-去饱和酶的转化效率与种子含油量负相关。显示事件LAODDN的4个世代的数据。对于温室数据，一个标志物对应于一株植物的一个种子批次，对于田间数据，一个标志物对应于代表一个小区的随机选择种子的分析。
图46：Δ-12-去饱和酶的转化效率与种子含油量负相关。显示事件LBFGKN的2个世代的数据。对于温室数据，一个标记物对应于分析代表整装50个T2种子批次或182个T3种子批次的种子的随机选择；对于田间数据，一个标记物对应于分析一株T1植物的一个T2种子批次，或分析代表小区(36个小区)或单一植物(60株植物)的T3种子的随机选择。
图47：Δ-12-去饱和酶的转化效率与种子含油量负相关。显示事件LBFLFK的2个世代的数据。对于温室数据，一个标记物对应于分析代表整装10个T2种子批次或195个T3种子批次的种子的随机选择；对于田间数据，一个标记物对应于分析一株T1植物的1个T2种子批次，或分析代表一个小区的T3种子的随机选择。
图48：Δ-6-去饱和酶的转化效率与种子含油量负相关。显示事件LANPMZ的3个世代的数据。对于温室数据，一个标志物对应于一株植物的一个种子批次，对于田间数据，一个标志物对应于代表一个小区的随机选择种子的分析。
图49：Δ-6-去饱和酶的转化效率与种子含油量负相关。显示事件LAODDN的4个世代的数据。对于温室数据，一个标志物对应于一株植物的一个种子批次，对于田间数据，一个标志物对应于针对代表一个小区的随机选择种子的分析。
图50：Δ-6-去饱和酶的转化效率与种子含油量负相关。显示事件LBFGKN的2个世代的数据。对于温室数据，一个标记物对应于分析代表整装50个T2种子批次或182个T3种子批次的种子的随机选择；对于田间数据，一个标记物对应于分析一株T1植物的一个T2种子批次，或分析代表小区(36个小区)或单一植物(60株植物)的T3种子的随机选择。
图51：Δ-6-去饱和酶的转化效率与种子含油量负相关。显示事件LBFLFK的2个世代的数据。对于温室数据，一个标记物对应于分析代表整装10个T2种子批次或195个T3种子批次的种子的随机选择；对于田间数据，一个标记物对应于分析一株T1植物的一个T2种子批次，或分析代表一个小区的T3种子的随机选择。
图52：Δ-6延伸酶的转化效率不与种子含油量负相关。显示事件LANPMZ的3个世代的数据。对于温室数据，一个标志物对应于一株植物的一个种子批次，对于田间数据，一个标志物对应于针对代表一个小区的随机选择种子的分析。
图53：Δ-6延伸酶的转化效率不与种子含油量负相关。显示事件LAODDN的4个世代的数据。对于温室数据，一个标志物对应于一株植物的一个种子批次，对于田间数据，一个标志物对应于针对代表一个小区的随机选择种子的分析。
图54：Δ-6延伸酶的转化效率不与种子含油量负相关。显示事件LBFGKN的2个世代的数据。对于温室数据，一个标记物对应于分析代表整装50个T2种子批次或182个T3种子批次的种子的随机选择；对于田间数据，一个标记物对应于分析一株T1植物的一个T2种子批次，或分析代表小区(36个小区)或单一植物(60株植物)的T3种子的随机选择。
图55：Δ-6延伸酶的转化效率不与种子含油量负相关。显示事件LBFLFK的2个世代的数据。对于温室数据，一个标记物对应于分析代表整装10个T2种子批次或195个T3种子批次的种子的随机选择；对于田间数据，一个标记物对应于分析一株T1植物的1个T2种子批次，或分析代表一个小区的T3种子的随机选择。
图56：Δ-5-去饱和酶的转化效率与种子含油量不相关。事件LANPMZ的显示3个世代的数据。对于温室数据，一个标志物对应于一株植物的一个种子批次，对于田间数据，一个标志物对应于针对代表一个小区的随机选择种子的分析。
图57：Δ-5-去饱和酶的转化效率与种子含油量不相关。显示事件LAODDN的4个世代的数据。对于温室数据，一个标志物对应于一株植物的一个种子批次，对于田间数据，一个标志物对应于针对代表一个小区的随机选择种子的分析。
图58：Δ-5-去饱和酶的转化效率与种子含油量不相关。显示事件LBFGKN的2个世代的数据。对于温室数据，一个标记物对应于分析代表整装50个T2种子批次或182个T3种子批次的种子的随机选择；对于田间数据，一个标记物对应于分析一株T1植物的一个T2种子批次，或分析代表小区(36个小区)或单一植物(60株植物)的T3种子的随机选择。
图59：Δ-5-去饱和酶的转化效率与种子含油量不相关。显示事件LBFLFK的2个世代的数据。对于温室数据，一个标记物对应于分析代表整装10个T2种子批次或195个T3种子批次的种子的随机选择；对于田间数据，一个标记物对应于分析一株T1植物的1个T2种子批次，或分析代表一个小区的T3种子的随机选择。
图60：ω-3-去饱和酶的转化效率与种子含油量不相关。显示事件LANPMZ的3个世代的数据。对于温室数据，一个标志物对应于一株植物的一个种子批次，对于田间数据，一个标志物对应于针对代表一个小区的随机选择种子的分析。
图61：ω-3-去饱和酶的转化效率与种子含油量不相关。显示4个世代的事件LAODDN的数据。对于温室数据，一个标志物对应于一株植物的一个种子批次，对于田间数据，一个标志物对应于针对代表一个小区的随机选择种子的分析。
图62：ω-3-去饱和酶的转化效率与种子含油量不相关。显示2个世代的事件LBFGKN的数据。对于温室数据，一个标记物对应于分析代表整装50个T2种子批次或182个T3种子批次的种子的随机选择；对于田间数据，一个标记物对应于分析一株T1植物的一个T2种子批次，或分析代表小区(36个小区)或单一植物(60株植物)的T3种子的随机选择。
图63：ω-3-去饱和酶的转化效率与种子含油量不相关。显示2个世代的事件LBFLFK的数据。对于温室数据，一个标记物对应于分析代表整装10个T2种子批次或195个T3种子批次的种子的随机选择；对于田间数据，一个标记物对应于分析一株T1植物的1个T2种子批次，或分析代表一个小区的T3种子的随机选择。
图64：Δ-5-延伸酶的转化效率与种子含油量不相关。显示3个世代的事件LANPMZ的数据。对于温室数据，一个标志物对应于一株植物的一个种子批次，对于田间数据，一个标志物对应于针对代表一个小区的随机选择种子的分析。
图65：Δ-5-延伸酶的转化效率与种子含油量不相关。显示4个世代的事件LAODDN的数据。对于温室数据，一个标志物对应于一株植物的一个种子批次，对于田间数据，一个标志物对应于针对代表一个小区的随机选择种子的分析。
图66：Δ-5-延伸酶的转化效率与种子含油量不相关。显示2个世代的事件LBFGKN的数据。对于温室数据，一个标记物对应于分析代表整装50个T2种子批次或182个T3种子批次的种子的随机选择；对于田间数据，一个标记物对应于分析一株T1植物的一个T2种子批次，或分析代表小区(36个小区)或单一植物(60株植物)的T3种子的随机选择。
图67：Δ-5-延伸酶的转化效率与种子含油量不相关。显示2个世代的事件LBFLFK的数据。对于温室数据，一个标记物对应于分析代表整装10个T2种子批次或195个T3种子批次的种子的随机选择；对于田间数据，一个标记物对应于分析一株T1植物的一个T2种子批次，或分析代表一个小区的T3种子的随机选择。
图68：Δ-4-去饱和酶的转化效率与种子含油量负相关。显示3个世代的事件LANPMZ的数据。对于温室数据，一个标志物对应于一株植物的一个种子批次，对于田间数据，一个标志物对应于针对代表一个小区的随机选择种子的分析。
图69：Δ-4-去饱和酶的转化效率与种子含油量负相关。显示4个世代的事件LAODDN的数据。对于温室数据，一个标志物对应于一株植物的一个种子批次，对于田间数据，一个标志物对应于针对代表一个小区的随机选择种子的分析。
图70：Δ-4-去饱和酶的转化效率与种子含油量负相关。显示2个世代的事件LBFGKN的数据。对于温室数据，一个标记物对应于分析代表整装50个T2种子批次或182个T3种子批次的种子的随机选择；对于田间数据，一个标记物对应于分析一株T1植物的一个T2种子批次，或分析代表小区(36个小区)或单一植物(60株植物)的T3种子的随机选择。
图71：Δ-4-去饱和酶的转化效率与种子含油量负相关。显示2个世代的事件LBFLFK的数据。对于温室数据，一个标记物对应于分析代表整装10个T2种子批次或195个T3种子批次的种子的随机选择；对于田间数据，一个标记物对应于分析一株T1植物的1个T2种子批次，或分析代表一个小区的T3种子的随机选择。
图72：全部途径脂肪酸的总量与野生型卡诺拉油菜中的种子含油量不相关，但是在温室和田间之间差异。显示三个季节的数据。对于温室数据，一个标志物对应于一株植物的一个种子批次，对于田间数据，一个标志物对应于针对代表一个小区的随机选择种子的分析。
图73：与种子含油量相关的20：5n-3(EPA)的总脂肪酸百分数。显示3个世代的事件LANPMZ的数据。对于温室数据，一个标志物对应于一株植物的一个种子批次，对于田间数据，一个标志物对应于针对代表一个小区的随机选择种子的分析。
图74：与种子含油量相关的20：5n-3(EPA)的总脂肪酸百分数。显示4个世代的事件LAODDN的数据。对于温室数据，一个标志物对应于一株植物的一个种子批次，对于田间数据，一个标志物对应于针对代表一个小区的随机选择种子的分析。
图75：与种子含油量相关的20：5n-3(EPA)的总脂肪酸百分数。显示2个世代的事件LBFGKN的数据。对于温室数据，一个标记物对应于分析代表整装50个T2种子批次或182个T3种子批次的种子的随机选择；对于田间数据，一个标记物对应于分析一株T1植物的一个T2种子批次，或分析代表小区(36个小区)或单一植物(60株植物)的T3种子的随机选择。
图76：与种子含油量相关的20：5n-3(EPA)的总脂肪酸百分数。显示2个世代的事件LBFLFK的数据。对于温室数据，一个标记物对应于分析代表整装10个T2种子批次或195个T3种子批次的种子的随机选择；对于田间数据，一个标记物对应于分析一株T1植物的1个T2种子批次，或分析代表一个小区的T3种子的随机选择。
图77：与种子含油量相关的22：6n-3(DHA)的总脂肪酸百分数。显示3个世代的事件LANPMZ的数据。对于温室数据，一个标志物对应于一株植物的一个种子批次，对于田间数据，一个标志物对应于针对代表一个小区的随机选择种子的分析。
图78：与种子含油量相关的22：6n-3(DHA)的总脂肪酸百分数。显示4个世代的事件LAODDN的数据。对于温室数据，一个标志物对应于一株植物的一个种子批次，对于田间数据，一个标志物对应于针对代表一个小区的随机选择种子的分析。
图79：与种子含油量相关的22：6n-3(DHA)的总脂肪酸百分数。显示2个世代的事件LBFGKN的数据。对于温室数据，一个标记物对应于分析代表整装50个T2种子批次或182个T3种子批次的种子的随机选择；对于田间数据，一个标记物对应于分析一株T1植物的一个T2种子批次，或分析代表小区(36个小区)或单一植物(60株植物)的T3种子的随机选择。
图80：与种子含油量相关的22：6n-3(DHA)的总脂肪酸百分数。显示2个世代的事件LBFLFK的数据。对于温室数据，一个标记物对应于分析代表整装10个T2种子批次或195个T3种子批次的种子的随机选择；对于田间数据，一个标记物对应于分析一株T1植物的1个T2种子批次，或分析代表一个小区的T3种子的随机选择。
图81：与种子含油量相关的EPA+DHA(20：5n-3和22：6n-3)水平。显示纯合植物的数据(单一植物：大写G或F，小区：小写f，在温室中培育：G，在田间试验中培育：f和F)。在实施例12(事件LANBCH)和实施例14(全部其他事件)中更详细地描述数据。
图82：与种子含油量相关的ARA(20：4n-6)水平。显示纯合植物的数据(单一植物：大写G或F，小区：小写f，在温室中培育：G，在田间试验中培育：f和F)。在实施例12(事件LANBCH)和实施例14(全部其他事件)中更详细地描述数据。
图83：与种子含油量相关的EPA(20：5n-3)水平。显示纯合植物的数据(单一植物：大写G或F，小区：小写f，在温室中培育：G，在田间试验中培育：f和F)。在实施例12(事件LANBCH)和实施例14(全部其他事件)中更详细地描述数据。
图84：与种子含油量相关的DHA(22：6n-3)水平。显示纯合植物的数据(单一植物：大写G或F，小区：小写f，在温室中培育：G，在田间试验中培育：f和F)。在实施例12(事件LANBCH)和实施例14(全部其他事件)中更详细地描述数据。
图85：转基因欧洲油菜中去饱和酶酶活性的例子。将[14C]脂肪酸甲基酯(ME)从酶促反应分离，如对每种具体酶所述那样通过TLC解析并且使用瞬时成像仪，通过电子放射自显影术检测。在小图A-C中显示每种酶活性的重复反应。在小图A中，使用从转基因欧洲油菜分离的膜，通过[14C]18：3n-6 ME的存在，证明Δ-6去饱和酶(托瑞蚝球藻(Ostreococcustauri))活性。这种去饱和酶活性不存在于衍生自野生型(Kumily)欧洲油菜的膜中。在小图B中，使用从转基因欧洲油菜分离的膜，通过[14C]20：4n-6 ME的存在，证明Δ-5去饱和酶(破囊壶菌物种(Thraustochytrium ssp.))活性。这种去饱和酶活性不存在于衍生自野生型(Kumily)欧洲油菜的膜中。在小图C中，使用从转基因欧洲油菜分离的膜，通过[14C]20：5n-3ME的存在，证明ω-3去饱和酶活性。这种去饱和酶活性不存在于衍生自野生型(Kumily)欧洲油菜的膜中。
图86：Δ-12去饱和酶(大豆疫霉(Phytophthora sojae))，c-d12Des(Ps_GA)，底物偏好性。在酶促反应期间，分离以下脂质汇集物：磷脂酰胆碱(PC，■)、游离脂肪酸(FFA，·)和H2O(CoA，○)。在小图A中，使用分析条件以证明酰基-磷脂酰胆碱形式的脂肪酸底物(18：1(n-9))，显示c-d12Des(Ps_GA)酶活性。相对于游离脂肪酸(FFA)汇集物或H2O(CoA)汇集物，去饱和的酶促产物(18：2(n-6))优势地存在于磷脂酰胆碱(PC)汇集物中，这表明c-d12Des(Ps_GA)利用与磷脂酰胆碱连接的18：1(n-9)作为底物。在小图B中，使用分析条件以证明酰基-CoA形式的脂肪酸底物(18：1(n-9))，显示c-d12Des(Ps_GA)酶活性。相对于小图A，在磷脂酰胆碱(PC)汇集物、游离脂肪酸(FFA)汇集物或H2O(CoA)汇集物中不产生去饱和的酶促产物(18：2(n-6))，这表明c-d12Des(Ps_GA)不利用作为酰基-CoA酯结合的18：1(n-9)。
图87：Δ-9去饱和酶(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))，d9Des(Sc)底物偏好性。在酶促反应期间，分离以下脂质汇集物：磷脂酰胆碱(PC，■)、游离脂肪酸(FFA，·)和H2O(CoA，○)。在小图A中，使用分析条件以证明酰基-磷脂酰胆碱形式的脂肪酸底物(16：0)，显示d9Des(Sc)酶活性。相对于小图B，在磷脂酰胆碱(PC)汇集物、游离脂肪酸(FFA)汇集物或H2O(CoA)汇集物中不产生去饱和的酶促产物(16：1(n-7))，这表明d9Des(Sc)不利用与磷脂酰胆碱连接的18：0作为底物。在小图B中，使用分析条件以证明酰基-CoA形式的脂肪酸底物(16：0)，显示d9Des(Sc)酶活性。在游离脂肪酸(FFA)汇集物和H2O(CoA)汇集物中均分离到去饱和的酶促产物(16：1(n-7))，但是在磷脂酰胆碱(PC)汇集物中未分离到。另外，在H2O(CoA)汇集物中去饱和的酶促产物(16：1(n-7))的产生在测定法的前60分钟为线性，如通过散列线所示(r2＝0.99)。FFA汇集物中检出的高水平[14C]16：1(n-7)或许因膜制备物中存在的内源硫酯酶水解去饱和的酶促产物16：1(n-7)-CoA所致。
图88：2014年在田间培育的卡诺拉油菜植物的产率(kg种子/公顷)。植物未用2倍比率的咪唑啉酮除草剂处理(产率)或用2倍比率的咪唑啉酮除草剂处理(产率w/除草剂)。
图89：在除草剂(咪草啶酸(imazamox))处理或无除草剂处理(对照)情况下田间培育的植物的种子中的EPA+DHA含量。＊＊＊指除草剂处理和对照之间差异显著，如通过ANOVA计算，p＜0.05。
图90：在除草剂(咪草啶酸(imazamox))处理或无除草剂处理(对照)情况下田间培育的植物的种子中的含油量。＊＊＊指除草剂处理和对照之间差异显著，如通过ANOVA计算，p＜0.05。
图91：在除草剂(咪草啶酸(imazamox))处理或无除草剂处理(对照)情况下田间培育的植物的种子中的蛋白质含量。＊＊＊指除草剂处理和对照之间差异显著，如通过ANOVA计算，p＜0.05。
发明详述
下文更详细地描述本发明的多个方面。应当理解，详细描述不意在限制权利要求书的范围。
如本文所用的术语“多不饱和脂肪酸(PUFA)”指包含至少2个、优选地3、4、5或6个双键的脂肪酸。另外，应当理解此类脂肪酸在脂肪酸链中优选地包含18至24个碳原子。更优选地，该术语涉及在脂肪酸链中具有20至24个碳原子的长链PUFA(VLC-PUFA)。特别地，在本发明意义范围内的多不饱和脂肪酸是DHGLA 20：3(8，11，14)、ARA 20：4(5，8，11，14)、ETA20：4(8，11，14，17)、EPA 20：5(5，8，11，14，17)、DPA 22：5(4，7，10，13，16)、DPA n-3(7，10，13，16，19)、DHA 22：6(4，7，10，13，16，19)，更优选地，二十碳五烯酸(EPA)20：5(5，8，11，14，17)和二十二碳六烯酸(DHA)22：6(4，7，10，13，16，19)。因此，应当理解最优选地，本发明提供的方法涉及制造EPA和/或DHA。另外，还涵盖合成期间出现的VLC-PUFA的中间体。此类中间体优选地从底物由本发明的去饱和酶、酮酰基辅酶A-合酶、酮酰基辅酶A-还原酶、脱水酶和烯酰辅酶A还原酶多肽活性形成。优选地，底物涵盖LA 18：2(9，12)、GLA 18：3(6，9，12)、DHGLA 20：3(8，11，14)、ARA 20：4(5，8，11，14)，二十碳二烯酸20：2(11，14)、二十碳四烯酸20：4(8，11，14，17)、二十碳五烯酸20：5(5，8，11，14，17)。表18中(和表181中)给出根据本发明使用的脂肪酸(包括多不饱和脂肪酸)的系统名称、其相应俗名和简化符号。本发明的转基因植物产生在野生型芸苔属植物中非天然存在的众多VLC-PUFA和中间体。尽管这些VLC-PUFA和中间体可以在各种生物中出现，它们不出现在野生型芸苔属植物中。这些脂肪酸包括18：2n-9、GLA、SDA、20：2n-9、20：3n-9、20：3n-6、20：4n-6、22：2n-6、22：5n-6、22：4n-3、22：5n-3和22：6n-3。
如本文所用的术语“培育”指在允许细胞产生所述多不饱和脂肪酸(即上文所提及的PUFA和/或VLC-PUFA)的培养条件下维持和生长转基因植物。这暗含在转基因植物中表达本发明的多核苷酸，从而去饱和酶、延伸酶还如酮酰基辅酶A-合酶、酮酰基辅酶A-还原酶、脱水酶和烯酰辅酶A还原酶活性存在。在下文更详细地描述用于培育宿主细胞的合适培养条件。
如本文所用的术语“获得”包括提供本发明的细胞培养物(包括宿主细胞和培养基)或植物或植物部分、尤其种子，以及提供其纯化或部分纯化的制备物，所述制备物以游离形式或以辅酶A结合形式包含作为膜磷脂或作为三酰甘油酯的多不饱和脂肪酸，优选地，ARA、EPA、DHA。更优选地，PUFA和VLC-PUFA将作为甘油三酯形式(例如以油形式)获得。可以在本文其他地方找到关于纯化技术的更多细节。
根据本发明，术语“多核苷酸”指脱氧核糖核酸和/或核糖核酸。除非另外声明，否则本文中“多核苷酸”指单链DNA多核苷酸或指双链DNA多核苷酸。多核苷酸的长度根据本发明通过规定碱基对(“bp”)或核苷酸(“nt”)的数目指定。根据本发明，两种规定互换使用，无论相应的核酸是否为单链或双链核酸。另外，由于多核苷酸依据其相应的核苷酸序列确定，术语“核苷酸/多核苷酸”和“核苷酸序列/多核苷酸序列”互换使用，因此对核酸序列的提及还意在确定包含其序列与核酸序列相同的核酸片段或由该核酸片段组成的核酸。
尤其，如根据本发明使用的术语“多核苷酸”，只要它涉及去饱和酶或延伸酶基因，则涉及包含下述核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列编码具有去饱和酶或延伸酶活性的多肽。优选地，由本发明多核苷酸编码的一旦在植物中表达则具有去饱和酶或延伸酶活性的多肽应当能够增加例如种子油或整个植物或其部分中PUFA并且尤其VLC-PUFA的量。可以通过本领域熟知的统计检验(包括例如置信水平为至少90％、优选地至少95％和甚至更优选地至少98％的Student t-检验)，确定某种增加是否具有统计显著性。更优选地，增加是与野生型对照(优选地以重量计)相比，尤其与来自野生型对照的种子、种子油、提取的种子油、粗制油、或精制油相比，含有VLC-PUFA的甘油三酯的量增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％或至少30％。优选地，前文所指的VLC-PUFA是具有C20、C22或C24脂肪酸主体的多不饱和脂肪酸，更优选地是EPA或DHA。在后续实施例中显示油样品的脂质分析。
优选如实施例部分的表130中所示的编码具有去饱和酶或延伸酶活性的多肽的多核苷酸(在最后二列给出核酸序列和多肽序列的SEQ ID NO)。
在本发明的植物中、尤其在从本发明植物获得或可获得的油中，如与从对照植物获得或可获得的油相比，某些脂肪酸的含量应当降低或尤其增加。尤其，如与来自对照植物的种子、种子油、粗制油或精制油相比，降低或增加。选择合适的对照植物是实验设计的例行部分，并且可以包括相应的野生型植物或无编码如本文提到的去饱和酶和延伸酶的多核苷酸的相应植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同的品种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。失效合子(或失效对照植物)是因分离而丢失转基因的个体。另外，将对照植物在与本发明植物的培育条件相同或基本上相同的培育条件下培育，即在本发明植物附近并与之同时培育。如本文中所用的“对照植物”优选地不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。对照还可能是来自对照植物的油。
优选地，对照植物是同基因的对照植物。因此，例如，对照油或种子应当来自同基因的对照植物。
具有多不饱和C20-和/或C22-脂肪酸分子的脂肪酸酯可以从用于制备脂肪酸酯的生物，按油或脂质的形式分离，例如按包含具有至少2、3、4、5或6个双键、优选地5或6个双键的多不饱和脂肪酸的化合物如鞘脂、磷酸甘油酯、类脂、糖脂如糖鞘脂、磷脂如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或二磷脂酰甘油、单酰甘油酯、二酰甘油酯、三酰甘油酯或其他脂肪酸酯如酰基辅酶A酯的形式分离。优选地，它们按其二酰甘油酯、三酰甘油酯的形式和/或按磷脂酰胆碱的形式、特别优选地按三酰甘油酯的形式分离。除这些酯之外，多不饱和脂肪酸还在非人类转基因生物或宿主细胞、优选地在植物中作为游离脂肪酸存在或结合在其他化合物中。通常，各种上述化合物(脂肪酸酯和游离脂肪酸)在生物中按以下近似分布存在：按重量计80％至90％的甘油三酯、按重量计2％至5％的甘油二酯、按重量计5％至10％的甘油单酯、按重量计1％至5％的游离脂肪酸、按重量计2％至8％的磷脂，按重量计各种化合物总计占100％。在本发明的方法中，基于上文所提及的非人类转基因生物或宿主细胞中的总脂肪酸，已经产生的VLC-PUFA以下述的含量产生：对于DHA，至少按重量计5.5％、至少按重量计6％、至少按重量计7％、有利地按重量计至少8％、优选地按重量计至少9％、特别优选地按重量计至少10.5％、非常特别优选地按重量计至少20％；对于EPA，至少按重量计9.5％、按重量计至少10％、至少按重量计11％、有利地按重量计至少12％、优选地按重量计至少13％、特别优选地按重量计至少14.5％、非常特别优选地按重量计至少30％。脂肪酸优选地以结合形式产生。借助本发明的多核苷酸和多肽，这些不饱和脂肪酸有可能定位于优选待产生的甘油三酯的sn1、sn2和/或sn3位置处。
在本发明的方法或生产方法中，本发明的多核苷酸和多肽可以随至少一种其他编码脂肪酸或脂质生物合成的酶的多核苷酸一起使用。在这种情况下，优选的酶是如上文提到去饱和酶和延伸酶，但还有编码具有Δ-8-去饱和酶和/或Δ-9-延伸酶活性的酶的多核苷酸。全部这些酶反映了据此从起始化合物油酸(C18：1)、亚油酸(C18：2)或亚麻酸(C18：3)产生本发明方法的终产物(例如EPA或DHA)的各个步骤。通常，这些化合物不作为基本上纯的产物生成。相反，微小痕量的前体还可能存在于终产物中。例如，如果亚油酸和亚麻酸均存在于起始宿主细胞、生物或起始植物中，则终产物如EPA或DHA作为混合物存在。基于所讨论终末产物的量，前体应当有利地占到以重量计不多于20％，优选地以重量计不多于15％，更优选地以重量计不多于10％，最优选地以重量计不多于5％。备选地，例如，如果油酸、亚油酸和亚麻酸全部三者均适当地存在于起始宿主细胞、生物或起始植物中，则终产物如EPA或DHA作为混合物存在。基于所讨论终产物的量，前体应当有利地占到以重量计不多于60％，优选地以重量计不多于40％，更优选地以重量计不多于20％，最优选地以重量计不多于10％。有利地，在宿主细胞中，仅EPA或更优选地仅DHA(结合型或作为游离酸)作为本发明方法中的终产物产生。如果化合物EPA和DHA同时产生，则它们优选地按1∶2(DHA∶EPA)的比率产生，更优选地，该比率是至少1∶5并且最优选地是1∶8。通过本发明产生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物优选地包含6％至15％的棕榈酸、1％至6％的硬脂酸、7-85％的油酸、0.5％至8％的异油酸、0.1％至1％的花生酸、7％至25％的饱和脂肪酸、8％至85％的单不饱和脂肪酸以及60％至85％的多不饱和脂肪酸，在每种情况下均以100％为基础及以生物的总脂肪酸含量为基础。作为优选的长链多不饱和脂肪酸，DHA基于总脂肪酸含量以优选地至少0.1％；0.2％；0.3％；0.4％；0.5％；0.6％；0.7％；0.8％；0.9或1％的浓度存在于脂肪酸酯或脂肪酸混合物中。
也可以通过本文所述的方法合成化学纯的VLC-PUFA或脂肪酸组合物。为此目的，通过提取、蒸馏、结晶、色谱或这些方法的组合从相应样品分离脂肪酸或脂肪酸组合物。这些化学纯的脂肪酸或脂肪酸组合物有利于食品业领域、化妆品领域和特别地制药业领域的应用。
术语“去饱和酶”涵盖了催化长度和不饱和碳原子双键数不同的脂肪酸去饱和的全部酶活性和酶。具体而言，这包括催化第4和第5碳原子脱氢的Δ4(d4)-去饱和酶；催化第5和第6碳原子脱氢的Δ5(d5)-去饱和酶；催化第6和第7碳原子脱氢的Δ6(d6)-去饱和酶；催化第8和第9碳原子脱氢的Δ8(d8)-去饱和酶；催化第9和第10碳原子脱氢的Δ9(d9)-去饱和酶；催化第12和第13碳原子脱氢的Δ12(d12)-去饱和酶；催化第15和第16碳原子脱氢的Δ15(d15)-去饱和酶。ω3(o3)-去饱和酶优选地催化n-3和n-2碳原子脱氢。
术语“延伸酶”涵盖了催化长度和不饱和碳原子双键数不同的脂肪酸延伸的全部酶活性和酶。特别地，如本文所用的术语“延伸酶”指向脂肪酸碳链引入、优选地在脂肪酸的位置1、5、6、9、12和/或15中，尤其在脂肪酸的位置5、6、9、12和/或15引入双碳分子的延伸酶活性。
另外，如本文所用的术语“延伸酶”优选地指将双碳分子向饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的羧基末端(即位置1)引入的延伸酶活性。
在奠定本发明的研究中，已经提供了产生VLC-PUFA的优越去饱和酶和延伸酶催化活性的酶。
实施例部分中的表11和表130列出了优选的多核苷酸，所述多核苷酸编码待用于本发明中的优选的去饱和酶或延伸酶。因此，在表11和表130中显示了编码可以在本发明背景下使用的去饱和酶或延伸酶的多核苷酸。这些去饱和酶和延伸酶的SEQ ID NO在表130的最后两列中显示(核酸序列和氨基酸序列)。如本文中他处所述，还可以使用所述多核苷酸的变体。
已经在WO2001/059128、WO2004/087902和WO2005/012316中描述了编码显示出Δ-6-延伸酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件(描述来自球蒴藓的这种酶)完整并入本文。
已经在WO2002026946和WO2003/093482中描述了编码显示出Δ-5-去饱和酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件(描述来自破囊壶菌属物种(Thraustochytrium sp.)的这种酶)完整并入本文。
已经在WO2005/012316、WO2005/083093、WO2006/008099和WO2006/069710中描述了编码显示出Δ-6-去饱和酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件(描述来自托瑞蚝球藻的这种酶)完整并入本文。
在本发明的一个优选实施方案中，Δ-6-去饱和酶是CoA(辅酶A)依赖性Δ-6-去饱和酶。这类酶是本领域熟知的。例如，在实施例部分中使用的来自托瑞蚝球藻的Δ-6-去饱和酶是辅酶A依赖性Δ-6-去饱和酶。如与对照相比，CoA(辅酶A)依赖性Δ-6-去饱和酶与Δ-12-去饱和酶组合使用可以允许减少种子中、尤其种子油中18：1n-9的含量。如与磷脂依赖性Δ-6-去饱和酶与Δ-6-延伸酶组合使用相比，CoA依赖性Δ-6-去饱和酶与Δ-6-延伸酶组合使用可以允许减少种子中、尤其种子油中18：3n-6的含量。
已经在WO2005/012316、WO2005/007845和WO2006/069710中描述了编码显示出Δ-6-延伸酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件(描述来自假微型海链藻(Thalassiosirapseudonana)的这种酶)完整并入本文。
已经例如在WO2006100241中描述了编码显示出Δ-12-去饱和酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件(描述来自大豆疫霉的这种酶)完整并入本文。
已经例如在WO2004/090123中描述了编码显示出Δ-4-去饱和酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件(描述来自纤细裸藻(Euglena gracilis)的这种酶)完整并入本文。
已经在WO2005/012316和WO2007/096387中描述了编码显示出Δ-5-延伸酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件(描述来自托瑞蚝球藻的这种酶)完整并入本文。
已经例如在WO2008/022963中描述了编码显示出ω3-去饱和酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件(描述来自畸雌腐霉(Pythium irregulare)的这种酶)完整并入本文。
已经例如在WO2005012316和WO2005083053中描述了编码显示出ω3-去饱和酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件(描述来自致病疫霉(Phytophthora infestans)的这种酶)完整并入本文。
已经例如在WO2002026946中描述了编码显示出Δ-4-去饱和酶活性的多肽的多核苷酸，所述文件(描述来自破囊壶菌属物种的这种酶)完整并入本文。
WO2003078639和WO2005007845中描述了编码来自路氏巴夫藻(Pavlova lutheri)的Δ-4去饱和酶的多核苷酸。这些文件完整并入本文，尤其在这样的情况下，这些文件涉及Δ-4去饱和酶“PlDES 1”并分别涉及WO2003078639的图3a-图3d和WO2005007845的图3a、图3b。
本文中编码前述多肽的多核苷酸也称作“靶基因”或“目的核酸”。这些多核苷酸是本领域熟知的。所述多核苷酸的序列可以在实施例部分中公开的T-DNA的序列中找到(参见，例如，具有如SEQ ID NO：3中所示序列的VC-LTM593-1qcz的序列)。实施例部分的表130中还给出了优选的多核苷酸序列和多肽序列的SEQ ID No。
下文显示本文中与本发明联系而提到的去饱和酶和延伸酶的优选多核苷酸的序列。如本文中他处所述，还可以使用这些多核苷酸的变体。编码根据本发明待使用的去饱和酶和延伸酶的多核苷酸可以衍生自某些生物。优选地，衍生自某生物(例如，衍生自球蒴藓)的多核苷酸经密码子优化。特别地，多核苷酸应当为植物中表达而密码子优化。
术语“密码子优化”是技术人员充分理解的。优选地，密码子优化的多核苷酸是这样的多核苷酸，其中与该序列起源的生物中的核酸序列比较，所述多核苷酸受到修饰，因为它适应于一个或多个植物物种中的密码子选择。一般，通过将至少一个或多于一个密码子替换为一个或多个在给定的生物(尤其植物)的基因中更频繁使用的密码子，多核苷酸、尤其编码区适应于在该生物中(尤其在植物中)表达。根据本发明，“来自某生物”(或“衍生自某生物”)的特定多核苷酸的密码子优化变体优选地应当视为衍生自所述生物的多核苷酸。
优选地，密码子优化的多核苷酸应当编码与非密码子优化的多核苷酸(即野生型序列)编码的多肽具有相同序列的相同多肽。在奠定本发明的研究中，使用(去饱和酶)的密码子优化的多核苷酸。密码子优化的多核苷酸由具有如SEQ ID NO：3中所示序列的T-DNA载体组成(参见表130)。
优选地，根据本发明待使用的Δ-6-延伸酶衍生自球蒴藓(Physcomitrellapatens)。所述Δ-6-延伸酶的优选序列在SEQ ID NO：258中显示。优选地，所述Δ-6-延伸酶由衍生自球蒴藓的多核苷酸编码，尤其，所述Δ-6-延伸酶由其(即所述多核苷酸)密码子优化的变体编码。优选地，衍生自球蒴藓的编码Δ-6-延伸酶的多核苷酸是具有如SEQ ID NO：3的核苷酸1267至2139中所示序列的多核苷酸。这个多核苷酸的序列还在SEQ ID NO：257中显示。(因此，衍生球蒴藓的编码Δ-6-延伸酶的多核苷酸优选地具有如SEQ ID NO：257中所示的序列)
优选地，根据本发明待使用的Δ-5-去饱和酶衍生自破囊壶菌属物种。在本发明的上下文中，破囊壶菌属物种优选地意指破囊壶菌属物种ATCC21685。所述Δ-5-去饱和酶的优选序列在SEQ ID NO：260中显示。优选地，所述Δ-5-去饱和酶由衍生自破囊壶菌属物种的多核苷酸编码；尤其，所述Δ-5-去饱和酶由所述多核苷酸的密码子优化变体编码。优选地，衍生自破囊壶菌属物种的编码Δ-5-去饱和酶的多核苷酸是具有如SEQ ID NO：3的核苷酸3892至5211中所示序列的多核苷酸。这个多核苷酸的序列还在SEQ ID NO：259中显示。根据本发明，构思了表达两个或更多个衍生自破囊壶菌属物种的编码Δ-5-去饱和酶的多核苷酸(即两个或更多个拷贝的多核苷酸)(优选地两个多核苷酸)。因此，本发明的T-DNA、构建体、植物、种子等应当包含两个(或更多个)拷贝的衍生自破囊壶菌属物种的编码Δ-5-去饱和酶的多核苷酸。
优选地，根据本发明待使用的Δ-6-去饱和酶衍生自托瑞蚝球藻。所述Δ-6-去饱和酶的优选序列在SEQ ID NO：262中显示。优选地，所述Δ-6-去饱和酶由衍生自托瑞蚝球藻的多核苷酸编码；尤其，所述Δ-6-去饱和酶由所述多核苷酸的密码子优化变体编码。优选地，衍生自托瑞蚝球藻的编码Δ-6-去饱和酶的多核苷酸是具有如SEQ ID NO：3的核苷酸7802至9172中所示序列的多核苷酸。这个多核苷酸的序列还在SEQ ID NO：261中显示。
优选地，根据本发明待使用的Δ-6-延伸酶衍生自假微型海链藻。所述Δ-6-延伸酶的优选序列在SEQ ID NO：264中显示。优选地，所述Δ-6-延伸酶由衍生自假微型海链藻的多核苷酸编码；尤其，所述Δ-6-延伸酶由所述多核苷酸的密码子优化变体编码。优选地，衍生自假微型海链藻的编码Δ-6-延伸酶的多核苷酸是具有如SEQ ID NO：3的核苷酸12099至12917中所示序列的多核苷酸。这个多核苷酸的序列还在SEQ ID NO：263中显示。
优选地，根据本发明待使用的Δ-12-延伸酶衍生自大豆疫霉。所述Δ-12-延伸酶的优选序列在SEQ ID NO：266中显示。优选地，所述Δ-12-延伸酶由衍生自大豆疫霉的多核苷酸编码；尤其，所述Δ-12-延伸酶由所述多核苷酸的密码子优化变体编码。优选地，衍生自大豆疫霉的编码Δ-12-延伸酶的多核苷酸是具有如SEQ ID NO：3的核苷酸14589至15785中所示序列的多核苷酸。这个多核苷酸的序列还在SEQ ID NO：265中显示。
优选地，根据本发明待使用的Δ-5-延伸酶衍生自托瑞蚝球藻。所述Δ-5-延伸酶的优选序列在SEQ ID NO：276中显示。优选地，所述Δ-5-延伸酶由衍生自托瑞蚝球藻的多核苷酸编码；尤其，所述Δ-5-延伸酶由所述多核苷酸的密码子优化变体编码。优选地，衍生自托瑞蚝球藻的编码Δ-5-延伸酶的多核苷酸是具有如SEQ ID NO：3的核苷酸38388至39290中所示序列的多核苷酸。这个多核苷酸的序列还在SEQ ID NO：275中显示。
优选地，根据本发明待使用的ω3-去饱和酶衍生自畸雌腐霉。所述ω3-去饱和酶的优选序列在SEQ ID NO：268中显示。优选地，所述ω3-去饱和酶由衍生自畸雌腐霉的多核苷酸编码；尤其，所述ω3-去饱和酶由所述多核苷酸的密码子优化变体编码。优选地，衍生自畸雌腐霉的编码ω3-去饱和酶的多核苷酸是具有如SEQ ID NO：3的核苷酸17690至18781中所示序列的多核苷酸。这个多核苷酸的序列还在SEQ ID NO：267中显示。根据本发明，构思了表达衍生自畸雌腐霉的两个或更多个编码ω3-去饱和酶的多核苷酸(即两个或更多个拷贝的多核苷酸)(优选地两个多核苷酸)。因此，本发明的T-DNA、构建体、植物、种子等应当包含衍生自畸雌腐霉的两个(或更多个)拷贝的编码ω3-去饱和酶的多核苷酸。
优选地，根据本发明待使用的ω3-去饱和酶衍生自致病疫霉。所述ω3-去饱和酶的优选序列在SEQ ID NO：270中显示。优选地，所述ω3-去饱和酶由衍生自致病疫霉的多核苷酸编码；尤其，所述ω3-去饱和酶由所述多核苷酸的密码子优化变体编码。优选地，衍生自致病疫霉的编码ω3-去饱和酶的多核苷酸是具有如SEQ ID NO：3的核苷酸20441至21526中所示序列的多核苷酸。这个多核苷酸的序列还在SEQ ID NO：269中显示。
根据本发明，尤其构思在植物中表达两个或更多个编码ω3-去饱和酶的多核苷酸。优选地，表达来自致病疫霉的至少一个编码ω3-去饱和酶的多核苷酸和来自畸雌腐霉的至少一个编码ω3-去饱和酶的多核苷酸(尤其两个多核苷酸，即二个拷贝的多核苷酸)。
优选地，根据本发明待使用的Δ-4-去饱和酶衍生自破囊壶菌属物种。所述Δ-4-去饱和酶的优选序列在SEQ ID NO：272中显示。优选地，所述Δ-4-去饱和酶由衍生自破囊壶菌属物种的多核苷酸编码；尤其，所述Δ-4-去饱和酶由所述多核苷酸的密码子优化变体编码。优选地，衍生自破囊壶菌属物种的编码Δ-4-去饱和酶的多核苷酸是具有如SEQ IDNO：3的核苷酸26384至27943中所示序列的多核苷酸。这个多核苷酸的序列还在SEQ ID NO：271中显示。
优选地，根据本发明待使用的Δ-4-去饱和酶衍生自路氏巴夫藻。所述Δ-4-去饱和酶的优选序列在SEQ ID NO：274中显示。优选地，所述Δ-4-去饱和酶由衍生自路氏巴夫藻的多核苷酸编码；尤其，所述Δ-4-去饱和酶由所述多核苷酸的密码子优化变体编码。优选地，衍生自路氏巴夫藻的编码Δ-4-去饱和酶的多核苷酸是具有如SEQ ID NO：3的核苷酸34360至35697中所示序列的多核苷酸。这个多核苷酸的序列还在SEQ ID NO：273中显示。
根据本发明，还构思在植物中表达优选地编码不相同的Δ-4-去饱和酶的两个不相同的多核苷酸。优选地，表达来自破囊壶菌属物种的至少一个编码Δ-4-去饱和酶的多核苷酸和来自路氏巴夫藻的至少一个编码Δ-4-去饱和酶的多核苷酸。
优选地，根据本发明待使用的Δ-15-去饱和酶衍生自异旋孢腔菌(Cochliobolusheterostrophus)。优选地，所述Δ-15-去饱和酶由衍生自异旋孢腔菌的多核苷酸编码；尤其，所述Δ-15-去饱和酶由所述多核苷酸的密码子优化变体编码。优选地，衍生自异旋孢腔菌的编码Δ-15-去饱和酶的多核苷酸是具有如SEQ ID NO：9的核苷酸2151至3654中所示序列的多核苷酸。
如上述的，编码Δ-6-延伸酶的多核苷酸可以衍生自球蒴藓。另外，编码Δ-6-延伸酶的多核苷酸可以衍生自假微型海链藻。特别地，在本发明背景下构思在植物中表达至少一个编码来自球蒴藓的Δ-6-延伸酶的多核苷酸和至少一个编码来自假微型海链藻的Δ-6-延伸酶的多核苷酸。因此，T-DNA、植物、种子等应当包含所述多核苷酸。
根据本发明，编码具有如上所述的去饱和酶或延伸酶活性的多肽的多核苷酸例如从下述属的生物可获得或获得自下述属的生物：蚝球藻属(Ostreococcus)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、裸藻属(Euglena)、海链藻(Thalassiosira)、疫霉属(Phytophthora)、腐霉属(Pythium)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、剑叶藓属(Physcomitrella)。然而，可以鉴定来自其他物种的直向同源物、旁系同源物或其他同源物。优选地，它们从植物如藻类例如等鞭金藻(Isochrysis)、Mantoniella、隐甲藻(Crypthecodinium)、藻类/硅藻如褐指藻(Phaeodactylum)、藓类如角齿藓(Ceratodon)或高等植物如报春花科(Primulaceae)植物如粉报春组(Aleuritia)植物、Calendulastellata、刺状骨籽菊(Osteospermum spinescens)或Osteospermum hyoseroides、微生物如真菌如曲霉(Aspergillus)、虫霉(Entomophthora)、毛霉(Mucor)或被孢霉(Mortierella)、细菌如希瓦氏菌(Shewanella)、酵母或动物获得。优选的动物是线虫如隐杆线虫(Caenorhabditis)、昆虫或脊椎动物。在脊椎动物当中，该核酸分子可以优选地源自真骨类(Euteleostomi)、辐鳍亚纲(Actinopterygii)；新鳍亚纲(Neopterygii)；真骨鱼次亚纲(Teleostei)；真骨鱼亚派(Euteleostei)、原棘鳍总目(Protacanthopterygii)、鲑形目(Salmoniformes)；鲑科(Salmonidae)或太平洋鲑属(Oncorhynchus)，更优选地来自鲑形目，最优选地，鲑科科，如鲑属(Salmo)，例如来自下述属和物种：虹鳟(Oncorhynchusmykiss)、澳鳟(Trutta trutta)或河鳟(Salmo trutta fario)。另外，核酸分子可以是从硅藻如海链藻属(Thalassiosira)或褐指藻属(Phaeodactylum)获得的。
因而，如根据本发明所用的术语“多核苷酸”还涵盖了代表本发明多核苷酸的直向同源物、旁系同源物或其他同源物的前述具体多核苷酸的变体或衍生物。另外，本发明多核苷酸的变体或衍生物还包括人工产生的突变蛋白。所述突变蛋白包括例如通过诱变技术产生并且显示出改进或改变的底物专一性的酶或是密码子优化的多核苷酸。
本发明的核酸变体或衍生物是与给定的参比多核苷酸差异至少一个核苷酸置换、添加和/或缺失的多核苷酸。如果参比多核苷酸编码蛋白质，则这种蛋白质的功能在多核苷酸的变体或衍生物中保守，从而变体核酸序列应当仍编码具有如上所述的去饱和酶或延伸酶活性的多肽。变体或衍生物还涵盖这样的多核苷酸，所述多核苷酸包含能够与前述具体核酸序列杂交、优选地在严格杂交条件下与之杂交的核酸序列。这些严格条件是本领域技术人员已知的并且可以在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。严格杂交条件的优选实例是在大约45℃于6x氯化钠/柠檬酸钠(＝SSC)中杂交，随后在50℃至65℃于0.2x SSC，0.1％SDS中的一个或多个洗涤步骤的条件。技术人员知道这些杂交条件取决于核酸的类型而不同，并且例如有机溶剂存在时在温度和缓冲液浓度方面不同。例如，在“标准杂交条件”下，温度范围根据核酸的类型在42℃和58℃之间在浓度0.1至5X SSC(pH 7.2)的含水缓冲液中不同。若上文提及的缓冲液中存在有机溶剂，例如50％甲酰胺，则标准条件下的温度是大约42℃。DNA的杂交条件：DNA杂交优选地是0.1X SSC和20℃至45℃，优选地在30℃和45℃之间。DNA：RNA杂交的杂交条件优选地是0.1X SSC和30℃至55℃，优选地在45℃和55℃之间。以上提及的杂交温度是例如在甲酰胺不存在下对长度大约100bp(＝碱基对)及G+C含量50％的核酸所确定的。通过参考教科书如上文提到的教材或以下教材：Sambrook等人，″Molecular Cloning″，Cold SpringHarbor Laboratory，1989；Hames和Higgins(编著)1985，″Nucleic Acids Hybridization：A Practical Approach″，IRL Press at Oxford University Press，Oxford；Brown(Ed.)1991，″Essential Molecular Biology：A Practical Approach″，IRL Pressat OxfordUniversity Press，Oxford，技术人员知道如何确定所要求的杂交条件。在一个实施方案中，严格杂交条件涵盖在65℃于1×SSC中或在42℃于1×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在65℃于0.2×SSC中洗涤。在另一个实施方案中，严格杂交条件涵盖在65℃于1×SSC中或在42℃于1×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在65℃于0.1×SSC中洗涤。
备选地，多核苷酸变体通过基于PCR的技术如基于混合寡核苷酸引物(即，使用针对本发明多肽保守结构域的简并引物)的DNA扩增法可获得。可以通过本发明多核苷酸的核酸序列或本发明多肽的氨基酸序列的序列比较鉴定本发明多肽的保守结构域。在后续实施例中描述合适作为PCR引物的寡核苷酸以及合适的PCR条件。作为模板，可以使用来自细菌、真菌植物或动物的DNA或cDNA。另外，变体包括了包含下述核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列与在实施例的相应表中所给出的任一个T-DNA序列中所示的核酸编码序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同。当然，变体必须保留相应酶的功能，例如，Δ-4-去饱和酶的变体应当具有Δ-4-去饱和酶活性。
优选地在整个氨基酸或核酸序列区域内计算同一性百分数值。对于技术人员，一系列基于多种算法的程序可用于比较不同的序列。在优选的实施方案中，使用已经并入EMBOSS软件包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice，P.，Longden，I.和Bleasby，A.，Trends in Genetics 16(6)，276-277，2000)的Needle程序中的Needleman和Wunsch算法(Needleman 1970，J.Mol.Biol.(48)：444-453)、BLOSUM62评分矩阵以及空位开口罚分10和空位延伸罚分0.5，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。可以在http：//emboss.sourceforge.net找到用于本地安装EMBOSS软件包以及与WEB-Services的链接的指南。使用needle程序用于比对两个氨基酸序列的参数的优选、非限制性实例是默认参数，包括EBLOSUM62评分矩阵、空位开口罚分10和空位延伸罚分0.5。在又一个优选的实施方案中，使用EMBOSS软件包(EMBOSS：The European Molecular BiologyOpen Software Suite，Rice，P.，Longden，I.和Bleasby，A.，Trends in Genetics 16(6)，276-277，2000)中的Needle程序，使用EDNAFULL评分矩阵和空位开口罚分10和空位延伸罚分0.5，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。待联合用于使用Needle程序比对两个核酸序列的参数的优选、非限制性例子是默认参数，包括EDNAFULL评分矩阵、空位开口罚分10和空位延伸罚分0.5。可以进一步使用本发明的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库进行检索，以例如鉴定其他家族成员或相关序列。可以使用Altschul等人的BLAST系列程序(2.2版)(Altschul 1990，J.Mol.Biol.215：403-10)执行此类检索。可以使用默认参数，以BLASTn、BLASTx或tBLASTx程序使用本发明的去饱和酶核酸序列及延伸酶核酸序列作为查询序列而执行的BLAST，以获得与本发明的去饱和酶序列和延伸酶序列同源的核苷酸序列(BLASTn、tBLASTx)或氨基酸序列(BLASTx)。可以使用默认参数，以BLASTp或tBLASTn程序执行使用本发明的去饱和酶蛋白质序列及延伸酶蛋白质序列作为查询序列的BLAST，以获得与本发明的去饱和酶序列和延伸酶序列同源的氨基酸序列(BLASTp)或核酸序列(tBLASTn)。为了出于比较目的获得空位比对结果，可以如Altschul等人(Altschul1997，Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402)中所述，利用具有默认参数的空位BLAST。
在一个实施方案中，编码如本文提到的去饱和酶或延伸酶的多核苷酸的变体优选地是包含选自以下的核酸序列的多核苷酸：
a)核酸序列，其与具有如SEQ ID NO：257、259、261、263、265、267、269、271、273或275中所示核苷酸序列的核酸序列至少70％、80％或90％相同，
b)编码多肽的核酸序列，所述多肽与具有如SEQ ID NO：258、260、262、264、266、268、270、272、274或276中所示氨基酸序列的多肽至少70％、80％或90％相同，和
c)核酸序列，其能够在严格条件下与i)具有如SEQ ID NO：257、259、261、263、265、267、269、271、273或275中所示核苷酸序列的核酸序列，或ii)编码具有如SEQ ID NO：258、260、262、264、266、268、270、272、274或276中所示氨基酸序列的多肽的核酸序列杂交。
如上述，由所述核酸编码的多肽必须保留相应酶的功能。例如，具有如SEQ ID NO：270中所示序列的多肽具有ω-3-去饱和酶活性。因此，这种多肽的变体也应当具有ω-3-去饱和酶活性。在实施例22中分析本发明去饱和酶和延伸酶的功能。
因此，编码如本文提到的去饱和酶或延伸酶的多核苷酸优选地是包含选自以下的核酸序列的多核苷酸：
a)核酸序列，其具有如SEQ ID NO：257、259、261、263、265、267、269、271、273或275中所示的核苷酸序列；
b)编码多肽的核酸序列，所述多肽具有如SEQ ID NO：258、260、262、264、266、268、270、272、274或276中所示的氨基酸序列，
c)核酸序列，其与具有如SEQ ID NO：257、259、261、263、265、267、269、271、273或275中所示核苷酸序列的核酸序列至少70％、80％或90％相同，
d)编码多肽的核酸序列，所述多肽与具有如SEQ ID NO：258、260、262、264、266、268、270、272、274或276中所示氨基酸序列的多肽至少70％、80％或90％相同，和
e)核酸序列，其能够在严格条件下与i)具有如SEQ ID NO：257、259、261、263、265、267、269、271、273或275中所示核苷酸序列的核酸序列，或ii)编码具有如SEQ ID NO：258、260、262、264、266、268、270、272、274或276中所示氨基酸序列的多肽的核酸序列杂交。
事件LBFLFK包含两个T-DNA插入，所述插入命名为LBFLFK基因座1和LBFLFK基因座2。通过用具有如SEQ ID NO：3中所示序列的T-DNA载体转化，产生包含这种插入的植物。对植物中存在的插入测序揭示，每个基因座在编码性序列中含有导致单个氨基酸交换的点突变。这些突变不影响基因的功能。基因座1在来自大豆疫霉的Δ-12去饱和酶(d12Des(Ps))的编码性序列中具有点突变。所产生的多核苷酸具有如SEQ ID NO：324中所示的序列。所述多核苷酸编码具有如SEQ ID NO：325中所示序列的多肽。基因座2在来自路氏巴夫藻的Δ-4去饱和酶(d4Des(Pl))的编码性序列中具有点突变。所产生的多核苷酸具有如SEQ ID NO：326中所示的序列。所述多核苷酸编码具有如SEQ ID NO：327中所示序列的多肽。前述多核苷酸被视为编码来自大豆疫霉的Δ-12去饱和酶的多核苷酸和编码来自路氏巴夫藻的Δ-4去饱和酶的多核苷酸的变体。这些多核苷酸被视为变体并且可以在本发明的上下文中使用。
还涵盖包含前述任何核酸的片段、尤其前述任何核酸序列的片段的多核苷酸作为本发明的多核苷酸。这些片段应当编码仍具有如上所述的去饱和酶或延伸酶活性的多肽。因而，所述多肽可以包含赋予所述生物学活性的本发明多肽的结构域或由其组成。如本文中所意指的片段优选地包含任一前述核酸序列的至少50个、至少100个、至少250个或至少500个连续核苷酸或编码这样的氨基酸序列，其包含任一前述氨基酸序列的至少20个、至少30个、至少50个、至少80个、至少100个或至少150个连续氨基酸。
上文所提及的变体多核苷酸或片段，优选地编码这样的多肽，所述多肽保留去饱和酶活性或延伸酶活性至明显的程度，优选地保留至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％由后续实施例中给出的任何T-DNA中所包含的任何多肽(尤其表11和表130中列出的去饱和酶或延伸酶)所显示的去饱和酶活性或延伸酶活性。
如实施例中详述的有益于本发明的其他酶例子是酰基转移酶和转酰基酶(参见WO2011161093 A1)。一组具有三种不同酶活性的酰基转移酶是“Kennedy途径”的酶，这些酶位于内质网(ER)膜系统的胞质侧面上。微粒体级分中的ER结合型酰基转移酶使用酰基-CoA作为脂肪酸的活化形式。甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)催化酰基在甘油-3-磷酸的sn-1位置掺入。1-酰基甘油-3-磷酸酰基转移酶，也称作溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)，催化酰基在溶血磷脂酸(LPA)的sn-2位置掺入。在磷脂酸由磷脂酸磷酸酶(PAP)去磷酸化后，二酰甘油酰基转移酶(DGAT)催化酰基在二酰甘油的sn-3位置掺入。除所述的Kennedy途径酶之外，直接涉及TAG生物合成的其他酶是磷脂二酰甘油酰基转移酶(PDAT)(一种将酰基从膜脂质的sn-2位置转移至二酰甘油的sn-3位置的酶)和二酰甘油二酰甘油转酰基酶(DDAT)(一种将酰基从一个二酰甘油分子的sn-2位置转移至另一个二酰甘油分子的sn-3位置的酶)。溶血磷脂酰基转移酶(LPLAT)表示一类能够将活化的酰基从酰基-CoA掺入膜脂质并且可能还催化逆反应的酰基转移酶。更具体地，LPLAT可以具有如溶血磷脂酰乙醇胺酰基转移酶(LPEAT)和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)那样的活性。其他酶如卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)也可能涉及将酰基从膜脂质转移入三酰甘油酯。文件WO 98/54302和WO 98/54303公开了人LPAAT和其治疗疾病、作为诊断药的潜在用途以及用于鉴定人LPAAT的调节物的方法。另外，已经在文件WO 98/55632、WO 98/55631、WO 94/13814、WO 96/24674、WO95/27791、WO 00/18889、WO 00/18889、WO 93/10241、Akermoun 2000，BiochemicalSociety Transactions 28：713-715；Tumaney 1999，Biochimica et Biophysica Acta1439：47-56；Fraser 2000，Biochemical Society Transactions 28：715-7718；Stymne1984，Biochem.J.223：305-314，Yamashita 2001，Journal of Biological Chemistry276：26745-26752和WO 00/18889中描述多种具有广泛类型酶促功能的酰基转移酶。
为了表达编码如与本发明所述相关的去饱和酶或延伸酶的多核苷酸，多核苷酸应当与表达控制序列有效连接。优选地，表达控制序列相对于与之有效连接的多核苷酸是异源的。应当理解每个多核苷酸与表达控制序列有效连接。
如本文所用的术语“表达控制序列”指能够掌控即启动并控制目的核酸序列(在本文情况下，上文提及的序列)转录的核酸序列。这种序列通常包含启动子或启动子与增强子序列的组合或由其组成。多核苷酸的表达包括核酸分子的转录，优选地，转录成可翻译的mRNA。额外的调节元件可以包括转录增强予以及翻译增强子。以下启动子和表达控制序列可以优选地在本发明的表达载体中使用。cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR或λ-PL启动子优选地在革兰氏阴性细菌中使用。对于革兰氏阳性细菌，可以使用启动子amy和SPO2。优选地使用来自酵母的启动子或真菌启动子ADC1、AOX1r、GAL1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH。对于动物性细胞或生物表达，优选地使用启动子CMV-、SV40-、RSV-启动子(罗氏肉瘤病毒)、CMV-增强子、SV40-增强子。来自植物的启动子CaMV/35S(Franck 1980，Cell 21：285-294]、PRP1(Ward 1993，Plant.Mol.Biol.22)、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos或遍在蛋白或菜豆蛋白启动子。另外，在这种情况下优选诱导型启动子，如EP 0388186 A1(即，苄氨磺酰诱导型)、Gatz1992，Plant J.2：397-404(即，四环素诱导型)、EP 0335528 A1(脱落酸诱导型)或WO 93/21334(即，乙醇诱导型或环己醇诱导型)中描述的启动子。其他合适的植物启动子是来自马铃薯的胞质FBP酶启动子或ST-LSI启动子(Stockhaus 1989，EMBO J.8，2445)、来自大豆(Glycine max)的磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶启动子(Genebank登录号U87999)或EP 0249676A1中所述的节特异性启动子。特别优选能够在参与脂肪酸生物合成的组织中引起表达的启动子。另外，根据实践，特别优选种子特异性启动子，如USP启动子，及其他启动子如LeB4、DC3、菜豆蛋白或油菜籽蛋白启动子。进一步特别优选的启动子是可以用于单子叶或双子叶植物并且在US 5,608,152(来自菜籽油菜的油菜籽蛋白启动子)、WO 98/45461(来自拟南芥属植物的油质蛋白启动子)、US 5,504,200(来自菜豆(Phaseolus vulgaris)的菜豆蛋白启动子)、WO 91/13980(来自芸苔属(Brassica)植物的Bce4启动子)中、由Baeumlein等人，Plant J.，2，2，1992：233-239(来自豆科植物的LeB4启动子)描述的种子特异性启动子，这些启动子适用于双子叶植物。以下启动子适用于单子叶植物：来自大麦的Ipt2-或Ipt1-启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)、来自大麦的大麦醇溶蛋白启动子和适用且在WO 99/16890中描述的其他启动子。原则上，可以将全部天然启动子连同它们的调节序列一起用于所述新方法。同样，额外或单独地使用合成性启动子是可能和有利的，尤其当它们介导种子特异性表达时，例如，如WO 99/16890中所述。优选地，编码如本文提到的去饱和酶和延伸酶的多核苷酸在植物的种子中表达。在一个具体实施方案中，使用种子特异性启动子来增强合乎需要的PUFA或VLC-PUFA的产生。在一个具体的优选实施方案中，编码去饱和酶或延伸酶的多核苷酸与实施例部分中用于表达相应去饱和酶和延伸酶的表达控制序列有效连接(参见，例如，VC-LTM593-1qcz rc中用于表达延伸酶和去饱和酶的启动子，表11)。SEQ IDNO：3中显示这个载体的序列。
术语“有效连接”意指将表达控制序列和目的核酸连接，从而所述目的核酸的表达可以由所述表达控制序列掌控，即，表达控制序列应当与所述待表达的核酸序列功能性连接。因而，所述表达控制序列和待表达的核酸序列可以彼此物理地连接，例如，通过将表达控制序列插在待表达核酸序列的5′末端。备选地，表达控制序列和待表达核酸可以是仅物理地接近，从而表达控制序列能够掌控至少一个目的核酸序列的表达。表达控制序列和待表达的核酸优选地相隔不多于500bp、300bp、100bp、80bp、60bp、40bp、20bp、10bp或5bp。
除启动子之外，本发明的优选多核苷酸还包含与目的核酸序列有效连接的终止子序列。
如本文所用的术语“终止子”指能够终止转录的核酸序列。这些序列将导致转录装置从待转录的核酸序列解离。优选地，终止子应当在植物中并且尤其在植物种子中有效。合适的终止子是本领域已知的，并且优选地包括在待表达核酸序列下游的多聚腺苷化信号如SV40多聚腺苷化位点或tk多聚腺苷化位点或在Loke等人(Loke 2005，Plant Physiol 138，第1457-1468页)中所示的植物特异性信号之一。
本发明另外涉及重组核酸分子，所述重组核酸分子包含至少一个编码具有去饱和酶和/或延伸酶活性的多肽的核酸序列，所述核酸序列与该序列起源的生物中的核酸序列相比，受到修饰，因为它适应于一个或多个植物物种中的密码子选择。
出于本发明的目的，例如就核酸序列、表达盒(＝基因构建体)或包含本发明方法中所用核酸的载体或经本发明方法中所用核酸序列、表达盒或载体转化的宿主细胞而言，“重组”意指通过重组方法产生的全部那些结构，其中核酸序列或与该核酸序列有效连接的遗传控制序列(例如启动子)不位于其天然遗传环境或已经通过重组方法修饰。
优选地，本发明的植物细胞(或植物)是油料作物植物细胞(或油料作物植物)。更优选地，所述油料作物选自亚麻(亚麻属物种(Linum sp.))、油菜(芸苔属物种(Brassicasp.))、大豆(大豆属(Glycine)和野大豆亚属物种(Soja sp.))、向日葵(向日葵属物种(Helianthus sp.))、棉花(棉属物种(Gossypium sp.))、玉米(玉蜀黍)、橄榄(木犀榄属物种(Olea sp.))、红花(红花属物种(Carthamus sp.))、可可(可可树(Theobroma cacoa))、花生(花生属物种(Arachis sp.))、大麻、亚麻荠属植物、两节荠属植物、油棕榈、椰子、落花生、芝麻、蓖麻、雷斯克勒(lesquerella)、乌桕、牛油树、油桐、木棉果、罂粟籽、霍霍巴籽和紫苏。待用于引入本发明多核苷酸或T-DNA的优选植物是能够合成脂肪酸的植物，如全部双子叶或单子叶植物、藻类或藓类。应当理解，源自植物的宿主细胞也可以用于产生本发明的植物。优选的植物选自以下植物科：Adelotheciaceae、漆树科(Anacardiaceae)、棕榈科(Arecaceae)、菊科(Asteraceae)、伞形科(Apiaceae)、桦木科(Betulaceae)、紫草科(Boraginaceae)、十字花科(Brassicaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、番木瓜科(Caricaceae)、大麻科(Cannabaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、菊科(Compositae)Crypthecodiniaceae、十字花科(Cruciferae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、牛毛藓科(Ditrichaceae)、胡颓子科(Elaeagnaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、牻牛儿苗科(Geraniaceae)、禾本科(Gramineae)、胡桃科(Juglandaceae)、樟科(Lauraceae)、豆科(Leguminosae)、亚麻科(Linaceae)、锦葵科(Malvaceae)、辣木科(Moringaceae)、地钱科(Marchantiaceae)、柳叶菜科(Onagraceae)，铁青树科(Olacaceae)、木犀科(Oleaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、胡椒科(Piperaceae)、胡麻科(Pedaliaceae)、禾本科(Poaceae)、茄科(Solanaceae)、绿枝藻纲(Prasinophyceae)、蔬菜植物和观赏植物如万寿菊(Tagetes)。可以提到的例子是选自以下的植物：Adelotheciaceae如剑叶藓属(Physcomitrella)，如展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)，漆树科(Anacadiaceae)如黄连木属(Pistacia)，芒果属(Mangifera)，腰果属(Anacardium)，例如阿月浑子(Pistacia vera)[阿月浑子]，Mangiferindica[芒果]或腰果(Anacardium occidentale)[腰果]，菊科(Asteraceae)，如金盏花(Calendula)，红蓝花属(Carthamus)，矢车菊属(Centaurea)，菊苣属(Cichorium)，菜蓟属(Cynara)，向日葵属(Helianthus)，莴苣属(Lactuca)，新缬草属(Locusta)，万寿菊属(Tagetes)，缬草属(Valeriana)，例如金盏花[普通万寿菊(common marigold)]，红花[红花]，矢车菊[矢车菊]，菊苣(Cichorium intybus)[菊苣]，洋蓟(Cynara scolymus)[球蓟(artichoke)]，向日葵(Helianthus annus)[向日葵]，莴苣(Lactuca sativa)，皱叶莴苣(Lactuca crispa)，Lactuca esculenta，毒莴苣栽培种(Lactuca scariolaL.ssp.sativa)，Lactuca scariola L.var.integrata，毒莴苣全缘叶变种(Lactucascariola L.var.integrifolia)，生菜(Lactuca sativa subsp.romana)，Locustacommunis，莴苣缬草(Valeriana locusta)[沙拉蔬菜]，香叶万寿菊(Tagetes lucida)，万寿菊(Tagetes erecta)或细叶万寿菊(Tagetes tenuifolia)[非洲或法国万寿菊]，伞形科(Apiaceae)，如胡萝卜属(Daucus)，例如胡萝卜(Daucus carota)[胡萝卜]，桦木科(Betulaceae)，如榛属(Corylus)，例如以下属和物种：欧洲榛(Corylus avellana)或土耳其榛(Corylus colurna)[榛]，紫草科(Boraginaceae)，如玻璃苣属(Borago)，例如以下属和物种：玻璃苣(Borago officinalis)[玻璃苣]，十字花科，如芸苔属(Brassica)，黑芥属(Melanosinapis)，白芥属(Sinapis)，拟南芥属(Arabidopsis)，例如以下属和物种：欧洲油菜(Brassica napus)，芜青某些物种(Brassica rapa ssp.)[菜籽油菜]，野欧白芥(Sinapis arvensis)芥菜(Brassica juncea)，芥菜原变种(Brassica junceavar.juncea)，皱叶芥菜(Brassica juncea var.crispifolia)，大叶芥菜(Brassicajuncea var.foliosa)，黑芥，黑芥(Brassica sinapioides)，黑芥(Melanosinapiscommunis)[芥菜]，甘蓝(Brassica oleracea)[饲用甜菜(fodder beet)]或拟南芥(Arabidopsis thaliana)，凤梨科(Bromeliaceae)，如凤梨属(Anana)，Bromelia(菠萝)，例如凤梨(Anana comosus)，Ananas ananas或Bromelia comosa[菠萝]，番木瓜科(Caricaceae)，如Carica，如番木瓜(Carica papaya)[番木瓜]，大麻科(Cannabaceae)，如大麻属(Cannabis)，如大麻(Cannabis sativa)[大麻]，旋花科(Convolvulaceae)，如番薯属(Ipomea)，旋花属(Convolvulus)，例如甘薯(Ipomoea batatus)，提琴叶牵牛花(Ipomoeapandurata)，Convolvulus batatas，Convolvulus tiliaceus，甘薯(lpomoeafastigiata)，lpomoea tiliacea，Ipomoea triloba或旋花属(Convolvulus panduratus)[甘薯(sweet potato)，甘薯]，藜科(Chenopodiaceae)，如甜菜属Beta，如甜菜(Betavulgaris)，甜萝卜(Beta vulgaris var.altissima)，甜菜原变种(Beta vulgarisvar.Vulgaris)，沿海甜菜(Beta maritima)，Beta vulgaris var.perennis，红甜菜(Betavulgaris var.conditiva)或Beta vulgaris var.esculenta[糖用甜菜(sugarbeet)]，Crypthecodiniaceae，如隐甲藻属(Crypthecodinium)，例如寇氏隐甲藻(Cryptecodiniumcohnii)，葫芦科(Cucurbitaceae)，如南瓜属(Cucurbita)，例如笋瓜(Cucurbita maxima)，灰籽南瓜(Cucurbita mixta)，西葫芦(Cucurbita pepo)或南瓜(Cucurbita moschata)[南瓜/南瓜]，桥弯藻目(Cymbellaceae)如双眉藻属(Amphora)，桥弯藻属(Cymbella)，Okedenia，褐指藻属(Phaeodactylum)，瑞氏藻属(Reimeria)，例如以下属和物种：三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)；牛毛藓科(Ditrichaceae)，如牛毛藓科、高地藓属(Astomiopsis)、角齿藓属(Ceratodon)、Chrysoblastella、牛毛藓属(Ditrichum)、牛毛藓属、Eccremidium、Lophidion、泽藓属(Philibertiella)、丛毛藓属(Pleuridium)，石缝藓属(Saelania)、毛齿藓属(Trichodon)、Skottsbergia，例如以下属和物种：Ceratodonantarcticus、Ceratodon columbiae、Ceratodon heterophyllus、角齿藓(Ceratodonpurpureus)、角齿藓、Ceratodon purpureus ssp.convolutus、Ceratodon、purpureusspp.stenocarpus、圆叶角齿藓(Ceratodon purpureus var.rotundifolius)、Ceratodonratodon、疣蒴角齿藓(Ceratodon stenocarpus)、Chrysoblastella chilensis、Ditrichumambiguum、短齿牛毛藓(Ditrichum brevisetum)、扭叶牛毛藓(Ditrichumcrispatissimum)、卷叶牛毛藓(Ditrichum difficile)、Ditrichum falcifolium、细牛毛藓(Ditrichum flexicaule)、Ditrichum giganteum、牛毛藓(Ditrichum heteromallum)、Ditrichum lineare、Ditrichum lineare、Ditrichum montanum、Ditrichum montanum、黄牛毛藓(Ditrichum pallidum)、Ditrichum punctulatum、细叶牛毛藓(Ditrichumpusillum)、Ditrichum pusillum var.tortile、Ditrichum rhynchostegium、Ditrichumschimperi、Ditrichum tortile、对叶藓(Distichium capillaceum)、小对叶藓(Distichium hagenii)、斜蒴对叶藓(Distichium inclinatum)、Distichium macounii、Eccremidium floridanum、Eccremidium whiteleggei、Lophidion strictus、尖叶丛毛藓(Pleuridium acuminatum)、Pleuridium alternifolium、Pleuridium holdridgei、Pleuridium mexicanum、Pleuridium ravenelii、丛毛藓(Pleuridium subulatum)、石缝藓(Saelania glaucescens)、Trichodon borealis、Trichodon cylindricus或Trichodoncylindricus var.oblongus；胡颓子科(Elaeagnaceae)，如胡颓子属(Elaeagnus)，例如以下属和物种：油橄榄(Olea europaea)[橄榄]；杜鹃花科(Ericaceae)，如山月桂属(Kalmia)，例如以下属和物种：宽叶山月桂(Kalmia latifolia)、窄叶山月桂(Kalmiaangustifolia)、小叶山月桂(Kalmia microphylla)、沼泽山月桂(Kalmia polifolia)、Kalmia occidentalis、Cistus chamaerhodendros或Kalmia lucida[山月桂(mountainlaurel)]；大戟科(Euphorbiaceae)，如木薯属(Manihot)、Janipha、麻疯树属(Jatropha)、蓖麻属(Ricinus)，例如以下属和物种：苦木薯(Manihot utilissima)、Janipha manihot、Jatropha manihot、Manihot aipil、manihot dulcis、Manihot manihot、Manihotmelanobasis、甜木薯(Manihot esculenta)[manihot]或蓖麻[蓖麻]；豆科(Fabaceae)，如豌豆属(Pisum)、合欢属(Albizia)、Cathormion、Feuillea、因加属(Inga)、围涎树属(Pithecolobium)、金合欢属(Acacia)、含羞草属(Mimosa)、苜蓿属(Medicago)、大豆属(Glycine)、扁豆属(Dolichos)、菜豆属(Phaseolus)、野大豆亚属(Soja)，例如以下属和物种：豌豆(Pisum sativum)、饲料豌豆(Pisum arvense)、早生矮豌豆(Pisum humile)[豌豆]、Albizia berteriana、合欢(Albizia j ulibrissin)、大叶合欢(Albizia lebbeck)、Acacia berteriana、Acacia littoralis、Albizia berteriana、Albizzia berteriana、Cathormion berteriana、Feuillea berteriana、Ingafragrans、Pithecellobiumberterianum、Pithecellobium fragrans、Pithecolobium berterianum、Pseudalbizziaberteriana、Acacia julibrissin、Acacia nemu、Albizia nemu、Feuilleea julibrissin、Mimosa julibrissin、Mimosa speciosa、Sericanrda j ulibrissin、Acacia lebbeck、Acacia macrohylla、Albizia lebbek、Feuilleea lebbeck、Mimosa lebbeck、Mimosaspeciosa[丝绸树]、紫花苜蓿(Medicago sativa)、野苜蓿(Medicago falcata)、杂交苜蓿(Medicago varia)[苜蓿]、大豆(Glycine max)、Dolichos soja、宽叶蔓豆(Glycinegracilis)、Glycine hispida、Phaseolus max、Soja hispida或Soja max[大豆]；葫芦藓科(Funariaceae)，如以下属：Aphanorrhegma、尖叶梨蒴藓属(Entosthodon)、葫芦藓属(Funaria)、剑叶藓属(Physcomitrella)、立碗藓属(Physcomitrium)，例如以下属和物种：Aphanorrhegma serratum、Entosthodon attenuatus、Entosthodon bolanderi、Entosthodon bonplandii、Entosthodon californicus、Entosthodon drummondii、Entosthodon j amesonii、Entosthodon leibergii、Entosthodon neoscoticus、Entosthodon rubrisetus、Entosthodon spathulifolius、Entosthodon tucsoni、Funariaamericana、Funaria bolanderi、齿叶葫芦藓(Funaria calcarea)、Funaria californica、Funaria calvescens、Funaria convoluta、Funaria flavicans、Funaria groutiana、葫芦藓(Funaria hygrometrica)、Funaria hygrometrica var.arctica、Funariahygrometrica var.calvescens、Funaria hygrometrica var.convoluta、Funariahygrometrica var.muralis、Funaria hygrometrica var.utahensis、Funariamicrostoma、Funaria microstoma var.obtusifolia、刺边葫芦藓(Funariamuhlenbergii)、Funaria orcuttii、Funaria plano-convexa、Funaria polaris、Funariaravenelii、Funaria rubriseta、Funaria serrata、Funaria sonorae、Funariasublimbatus、Funaria tucsoni、小立碗藓加利福尼亚亚种(Physcomitrellacalifornica)、展叶剑叶藓、Physcomitrella readeri、Physcomitrium australe、Physcomitrium californicum、Physcomitrium collenchymatum，Physcomitriumcoloradense，Physcomitrium cupuliferum，Physcomitrium drummondii，Physcomitriumeurystomum，Physcomitrium flexifolium，Physcomitrium hookeri，Physcomitriumhookeri var.serratum，Physcomitrium immersum，Physcomitrium kellermanii，Physcomitrium megalocarpum，Physcomitrium pyriforme，Physcomitrium pyriformevar.serratum，Physcomitrium rufipes，Physcomitrium sandbergii，Physcomitriumsubsphaericum，Physcomitrium washingtoniense，牻牛儿苗科，如天竺葵属(Pelargonium)、椰子属(Cocos)、Oleum，例如以下属和物种：椰子(Cocos nucifera)、椰香天竺葵(Pelargonium grossularioides)或Oleum cocois[椰子]；禾本科(Gramineae)，如例如以下属：甘蔗属(Saccharum)，例如以下属和物种：甘蔗(Saccharum officinarum)；核桃科(Juglandaceae)，如核桃属(Juglans)、Wallia，例如以下属和物种：核桃(Juglansregia)、Juglans ailanthifolia、山核桃(Juglans sieboldiana)、灰核桃(Juglanscinerea)、Wallia cinerea、Juglans bixbyi、加州黑核桃(Juglans californica)、印度黑核桃(Juglans hindsii)、Juglans intermedia、Juglans j amaicensis、大核桃(Juglansmajor)、Juglans microcarpa、黑核桃(Juglans nigra)或Wallia nigra[walnut]；樟科(Lauraceae)，如鳄梨属(Persea)、月桂属(Laurus)，例如下述属例如下述属和物种：月桂(Laurus nobilis)[bay]、鳄梨(Persea americana、Persea gratissima或Persea persea)[鳄梨(avocado)]；豆科(Leguminosae)，如落花生属(Arachis)，例如下述属和物种：落花生(Arachis hypogaea)[花生]；亚麻科(Linaceae)，如亚麻属(Linum)、Adenolinum，例如下述属和物种：亚麻(linum usitatissimum)、linum humile、奥地利亚麻(linum austriacum)、linum bienne、窄叶亚麻(linum angustifolium)、泻亚麻(linum catharticum)、金黄亚麻(linum flavum)、大花亚麻(linum grandiflorum、Adenolinum grandiflorum)、刘易斯亚麻(linum lewisii)、那旁亚麻(linum narbonense)、宿根亚麻(linum perenne)、刘易斯宿根亚麻(linum perenne var.lewisii)、linum pratense、linum trigynum[亚麻]；千屈菜科(Lythrarieae)，如石榴属(Punica)，例如下述属和物种：石榴(Punica granatum)[pomegranate]；锦葵科(Malvaceae)，如棉属(Gossypium)，例如下述属和物种：陆地棉(Gossypium hirsutum)、树棉(Gossypium arboreum)、海岛棉(Gossypium barbadense)、草棉(Gossypium herbaceum)或瑟伯氏棉(Gossypium thurberi)[棉花]；地钱科(Marchantiaceae)，如地钱属(Marchantia)，例如下述属和物种：Marchantia berteroana、Marchantia foliacea、Marchantia macropora；芭蕉科(Musaceae)，如芭蕉属(Musa)，例如下述属和物种：香蕉(Musa nana)、小果野蕉(Musa acuminata)、大蕉(Musa acuminata)、芭蕉属某些物种(Musa spp.)[香蕉]；柳叶菜科(Onagraceae)，如Camissonia、月见草属(Oenothera)，例如下述属和物种：月见草(Oenothera biennis或C amissonia brevipes)[晚樱草(evening primose)]；棕榈科(Palmae)，如油棕属(Elacis)，例如下述属和物种：油棕(Elaeis guineensis)[油棕榈]；罂粟科(Papaveraceae)，如罂粟属(Papaver)，例如下述属和物种：东方罂粟(Papaver orientale)、虞美人(Papaver rhoeas)、长果罂粟(Papaverdubium)[罂粟]；胡麻科(Pedaliaceae)，如胡麻属(Sesamum)，例如下述属和物种：芝麻(Sesamum indicum)[芝麻]；胡椒科(Piperaceae)，如胡椒属(Piper)、Artanthe、草胡椒属(Peperomia)、Steffensia，例如下述属和物种：树胡椒(Piper aduncum)、Piper amalago、狭叶胡椒(Piper angustifolium)、Piper auritum、萎叶(Piper betel)、毕澄茄(Pipercubeba)、荜菝(Piper longum)、胡椒(Piper nigrum)、假荜菝(Piper retrofractum)、Artanthe adunca、Artanthe elongata、Peperomia elongata、Piper elongatum、Steffensia elongata[Cayenne pepper]；禾本科(Poaceae)，如大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、燕麦属(Avena)、高粱属(Sorghum)、须芒草属(Andropogon)、绒毛草属(Holcus)、黍属(Panicum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)，例如下述属和物种：大麦(Hordeum vulgare)、芒颖大麦草(Hordeum jubatum)、鼠大麦(Hordeum murinum)、黑麦状大麦草(Hordeum secalinum)、栽培二棱大麦(Hordeum distichon)、三叉大麦(Hordeumaegiceras)、栽培六棱大麦(Hordeum hexastichon)、栽培六棱大麦(Hordeumhexastichum)、不规则型大麦(Hordeum irregulare)、大麦(Hordeum sativum)、黑麦状大麦草(Hordeum secalinum)[大麦]、黑麦(Secale cereale)[rye]、燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、野燕麦原变种(Avena fatuavar.sativa)、杂种野燕麦(Avena hybrida)[燕麦]、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、石茅高粱(Sorghum halepense)、甜高粱(Sorghum saccharatum)、高粱(Sorghum vulgare)、Andropogon drummondii、Holcus bicolor、Holcus sorghum、Sorghum aethiopicum、Sorghum arundinaceum、卡佛尔高粱(Sorghum caffrorum)、垂穗高粱草(Sorghumcernuum)、甜高粱(Sorghum dochna)、Sorghum drummondii、硬高粱草(Sorghum durra)、Sorghum guineense、Sorghum lanceolatum、多脉高粱草(Sorghum nervosum)、甜高粱(Sorghum saccharatum)、Sorghum subglabrescens、Sorghum verticilliflorum、高粱(Sorghum vulgare)、石茅高粱(Holcus halepensis)、黍(Sorghum miliaceum)、稷(Panicum militaceum)[谷子(millet)]、稻(Oryza sativa)、阅叶野生稻(Oryzalatifolia)[稻]、玉蜀黍(Zea mays)[玉米]、普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(riticum macha)、普通小麦(Triticum sativum或Triticum vulgare)[小麦]；紫球藻科(Porphyridiaceae)，如色盒藻属(Chroothece)、Flintiella、Petrovanella、紫球藻属(Porphyridium)、小红藻属(Rhodella)、红孢囊藻属(Rhodosorus)、Vanhoeffenia，例如下述属和物种：紫球藻(Porphyridium cruentum)；山龙眼科(Proteaceae)，如澳洲坚果属(Macadamia)，例如下述属和物种：全缘叶澳洲坚果(Macadamia intergrifolia)[macadamia]；绿色鞭毛藻纲(Prasinophyceae)，如肾藻属(Nephroselmis)、Prasinococcus、Scherffelia、扁藻属(Tetraselmis)、Mantoniella、Ostreococcus，例如下述属和物种：梨形肾藻(Nephroselmis olivacea)、Prasinococcus capsulatus、Scherffelia dubia、周氏扁藻(Tetraselmis chui)、亚心形扁藻(Tetraselmis suecica)、Mantoniella squamata、Ostreococcus tauri；茜草科(Rubiaceae)，如例如下述属和物种：咖啡属某些物种(Cofea spp.)、小果咖啡(Coffea arabica)、中果咖啡(Coffeacanephora)或大果咖啡(Coffea liberica)[咖啡]；玄参科(Scrophulariaceae)，如毛蕊花属(Verbascum)，例如下述属和物种：毛瓣毛蕊花(Verbascum blattaria)、南欧毛蕊花(Verbascum chaixii)、密花毛蕊花(Verbascum densiflorum)、Verbascum lagurus、长叶毛蕊花(Verbascum longifolium)、Verbascum lychnitis、黑毛蕊花(Verbascum nigrum)、奥林匹克毛蕊花(Verbascum olympicum)、抱茎毛蕊花(Verbascum phlomoides)、紫花毛蕊花(Verbascum phoenicum)、Verbascum pulverulentum或毛蕊花(Verbascum thapsus)[mullein]；茄科(Solanaceae)，如辣椒属(Capsicum)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、番茄属(Lycopersicon)，例如下述属和物种：红辣椒(Capsicum annuum)、朝天椒(Capsicum annuum var.glabriusculum)、小米椒(Capsicum frutescens)[辣椒]；辣椒[红辣椒(paprika)]；普通烟草(Nicotiana tabacum)、花烟草(Nicotiana alata)、渐狭叶烟草(Nicotiana attenuate)、光烟草(Nicotiana glauca)、郎氏烟草(Nicotianalangsdorffii)、Nicotiana obtusifolia、裂叶烟草(Nicotiana quadrivalvis)、浅波烟草(Nicotiana repanda)、黄花烟草(Nicotiana rustica)、林烟草(Nicotiana sylvestris)[烟草]；马铃薯(Solanum tuberosum)[马铃薯]；茄子(Solanum melongena)[茄子]；番茄(Lycopersicon esculentum)、番茄(Lycopersicon lycopersicum)、梨形番茄(Lycopersicon pyriforme)、红茄(Solanum integrifolium)或番茄(Solanumlycopersicum)[番茄]；梧桐科(Sterculiaceae)，如可可属(Theobroma)，例如下述属和物种：可可树(Theobroma cacao)[可可]或山茶科(Theaceae)，如山茶属(Camellia)，例如下述属和物种：大叶茶(Camellia sinensis)[茶]。特别地，待用作本发明转基因植物的优选植物是包含大量脂类化合物的油料作物，如花生、菜籽油菜、卡诺拉油菜、向日葵、红花、罂粟、芥菜、大麻、蓖麻、橄榄、芝麻、金盏花(Calendula)、石榴(Punica)、月见草、毛蕊花、蓟、野玫瑰、榛、扁桃、澳洲坚果、鳄梨、月桂属植物、南瓜、亚麻、大豆、阿月浑子、玻璃苣、树(油棕榈、椰子、胡桃树)或作物如玉米、小麦、黑麦、燕麦、小黑麦、稻、大麦、棉属植物、木薯、辣椒、万寿菊、茄科植物如马铃薯、烟草、茄子和番茄、蚕豆属物种、豌豆、苜蓿或灌丛植物(咖啡、可可、茶)、柳属物种和多年生牧草和饲用作物。本发明的优选植物是油料作物植物如花生、菜籽油菜、卡诺拉油菜、向日葵、红花、罂粟、芥菜、大麻、蓖麻、橄榄、金盏花、石榴、月见草、南瓜、亚麻、大豆、玻璃苣、树(油棕榈、椰子)。特别优选的是向日葵、红花、烟草、毛蕊花、芝麻、棉属植物、南瓜、罂粟、月见草、胡桃、亚麻、大麻、蓟或红花。极特别优选的植物是植物如红花、向日葵、罂粟、月见草、胡桃、亚麻或大麻，或最优选地，十字花科植物。。
本发明还涉及提供在植物或其部分中、特别地在植物油中实现高含量VLC-PUFA的构建体。
因而，本发明提供一种用于植物中表达靶基因的T-DNA，其中T-DNA包含左边界元件和右边界元件和至少一个包含与靶基因有效连接的启动子及其下游终止子的表达盒，其中T-DNA的长度，优选地从左边界元件至右边界元件测量并包含靶基因，具有至少30000bp长度。在一个实施方案中，表达盒借助至少500bp长度的分隔区与T-DNA的最近边界分隔。在另一个实施方案中，表达盒借助至少100bp长度的分隔区与T-DNA的最近边界分隔。在另一个实施方案中，表达盒借助至少200bp长度的分隔区与T-DNA的最近边界分隔。
另外，本发明涉及构建体，所述构建体包含如本文他处以更多细节描述的多种去饱和酶基因和延伸酶基因的表达盒。
如本文他处描述，本发明的T-DNA或构建体可以包含编码各种即多种蛋白质的多个表达盒。在一个实施方案中，本发明的T-DNA或构建体可以在编码上文所提及的去饱和酶或延伸酶的表达盒之间包含分隔区。在一个实施方案中，表达盒彼此借助至少100碱基对的分隔区分隔，它们优选地由100-200碱基对的分隔区分隔。因此，每个表达盒之间存在分隔区。
本发明因此提供核酸，即多核苷酸。本发明的多核苷酸是或包含本发明的T-DNA。因此，本发明的T-DNA是多核苷酸，优选地是DNA，并且最优选地是双链DNA。本发明的“T-DNA”是能够最终整合入植物遗传物质(基因组)的核酸。本领域普通技术人员理解对于这类整合，要求转化相应的植物材料，本文中描述了优选的转化方法和植物生成方法。
根据本发明，还提供了包含如根据本发明定义的T-DNA或构建体的核酸。例如，本发明的T-DNA或构建体可以包含于环状核酸(例如，质粒)中，从而额外的核酸部分存在于左边界元件和右边界元件之间，即存在于本发明表达盒的“对面”。例如使用任意起点，这种环状核酸可以标定成线性形式，从而定义“左边界元件-表达盒-右边界元件-表达盒对面的额外核酸部分”将相同的环状核酸限定为定义“表达盒-右边界元件-表达盒对面的额外核酸部分-左边界元件”。额外的核酸部分优选地包含在一种或多种宿主微生物中、优选地在埃希氏菌属(Escherichia)微生物、优选地大肠杆菌和/或农杆菌中复制总核酸的一个或多个遗传元件，即核酸分子包含T-DNA和额外的核酸部分。下文以更多细节描述优选的宿主微生物。包含本发明T-DNA的这类环状核酸特别可用作转化载体；下文以更多细节描述这类载体。
如本文提到的多核苷酸优选地在其引入植物后在植物中表达。因此，本发明的方法还可以包括将多核苷酸引入植物的步骤。优选地，通过转化，尤其通过农杆菌介导的转化法，将多核苷酸引入植物。在一个实施方案中，植物用包含如与本发明所述相关的多核苷酸和/或表达盒(如表11中所示的编码去饱和酶和延伸酶的表达盒)的构建体或T-DNA转化。因此，构思植物(已经)用本发明的T-DNA或构建体转化。用于引入的构建体或T-DNA优选地包含待表达的全部多核苷酸。因此，单个构建体或T-DNA应当用于转化，换而言之，编码去饱和酶和延伸酶的多核苷酸应当包含在相同的T-DNA中。然而，应当理解植物可以包含多于一个拷贝的T-DNA。
T-DNA长度优选地巨大，即它具有至少30000bp、优选地多于30000bp、更优选地至少40000bp、甚至更优选地至少50000bp和最优选地至少60000bp的最小长度。优选地，T-DNA的长度处于任何前述最小长度至120000bp的范围内，更优选地处于任何前述最小长度至100000bp的范围内，甚至更优选地处于任何前述最小长度至90000bp的范围内，甚至更优选地处于任何前述最小长度至80000bp的范围内。在这类最小长度情况下，可以按表达盒形式引入多个基因，从而每个独立基因与至少一个启动子和至少一个终止子有效链接。如下文实施例部分中显示，本发明利用这类最小长度的T-DNA在植物例如油种子植物、优选地芸苔属植物中引入产生VLC-PUFA的代谢途径所需的基因。另外，T-DNA的长度优选地如前文描述那样限制以允许容易操作。
另外，本发明的构建体可以具有至少30000bp、优选地多于30000bp、更优选地至少40000bp、甚至更优选地至少50000bp和最优选地至少60000bp的最小长度。
在一个实施方案中，在T-DNA左边界元件的3′方向或在T-DNA右边界元件的5′方向，存在设定除包含靶基因的表达盒之外的相应边界元件的分隔区。在T-DNA左边界元件3′方向的分隔区不必然地具有与T-DNA右边界元件5′方向的分隔区相同的长度和/或序列，只要两个分隔区满足下文给出的其他要求即可。
在另一个实施方案中，表达盒彼此借助至少100碱基对的分隔区、优选地100至200碱基对的分隔区分隔。因此，在表达盒之间存在分隔区。
分隔区或间隔区是优势地由其长度限定的DNA部分。其功能是将靶基因分别与T-DNA的左边界或右边界分隔。如将在实施例中显示，引入分隔区有效地将目的基因与T-DNA插入基因组DNA后相邻基因组位置产生的重大影响分隔。例如，通常认为并非全部基因组位点同等地适于靶基因的表达，并且处于相同启动子和终止子控制下的相同基因可能在植物中以不同强度表达，这取决于靶基因(和其相应启动子和终止子)在植物基因组中整合的区域。通常认为，转录因子和/或聚合酶以不同的难易程度接近植物基因组的不同区域，例如归因于这些区域紧密缠绕在组蛋白周围和/或连接至染色体主链(参见，例如Deal等人，Curr Opin Plant Biol.Apr 2011；14(2)：116-122)或其他支架物质(参见，例如，FukudaY.，Plant Mol Biol.1999Mar；39(5)：1051-62)。不易理解通过本发明的T-DNA实现上文所提到益处的机制，因此便利地是，将间隔区视为物理上提供缓冲的手段以抵消因相邻组蛋白或染色体主链或其他支架接合的区域缠绕DNA所形成的应变。作为模型，可以认为，为了转录靶基因，DNA不得不部分解开。如果靶基因的相邻区域抵抗这种解开，例如因为它们紧密缠绕在组蛋白周围或否则接合至支架或主链，从而核酸链的转动有限，则间隔区允许在较长的核酸片段上分散尝试解开所产生的应变，因而减少在靶基因解开所需要的力。
在一个实施方案中，分隔区具有至少500bp的长度。因此，分隔区可以长于500bp，并且优选地长至少800bp，更优选地至少1000bp。较长的间隔区允许靶基因和最近的基因组侧翼区之间甚至更充分的物理分隔。
在另一个实施方案中，间隔区具有至少100bp的长度。优选地，间隔区具有100至200碱基对的长度。
分隔区优选地具有缺少基质接合信号或支架接合信号的序列。优选地，分隔区或间隔区对500bp长度而言不包含多于一个、优选地对1000bp长度而言不包含多于一个在下文实施例中描述的间隔区中出现20次或更多次的5元组，总结在实施例中给出的全部间隔区。这些元组按递增频率处于实施例中给出的间隔区内：AGCCT，CGTAA，CTAAC，CTAGG，GTGAC，TAGGC，TAGGT，AAAAA，AACGC，TTAGC，ACGCT，GCTGA，ACGTT，AGGCT，CGTAG，CTACG，GACGT，GCTTA，AGCTT，CGCTA，TGACG，ACGTG，AGCTG，CACGT，CGTGA，CGTTA，AGCGT，TCACG，CAGCT，CGTCA，CTAGC，GCGTC，TTACG，GTAGC，TAGCG，TCAGC，TAGCT，AGCTA，GCTAG，ACGTA，TACGT。与如实施例中给出的分隔区或间隔区相比，通过降低一种或多种前文所列元组的出现频率，可以实现T-DNA中靶基因的表达进一步增加。
分隔区可以含有选择标记。选择标记是在不必等待植物发芽或完全长成的情况下可以优选地在种子中验证其存在的核酸部分。优选地，选择标记向种子或向正在生长的植物传递表型特性，例如除草剂耐受性、着色、种子表面特性(例如，起皱)、发光蛋白或荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白或萤光素酶。如果需要标记基因的表达以显示表型特征，则分隔区相应地包含标记基因作为选择标记，优选地以表达盒形式包含。分隔区中包含选择标记是特别有利的，因为该标记允许便利地抛弃非转化的植物材料。另外，在下述的这种意料之外情况下，即T-DNA整合于其中间隔区的长度和/或核碱基组成不足以克服因相邻基因组DNA所致基因沉默效应的植物基因组位置中，则选择标记允许便利地抛弃这类不巧表现不佳的特殊转化体。因此，分隔区优选地包含表达除草剂耐受性基因的表达盒。这种分隔区大大减少不得不栽培下述转化体的几率，在所述转化体中沉默效应如此之强，甚至选择标记基因的表达大大减少或完全被抑制。根据本发明，分隔区优选地不包含去饱和酶基因或延伸酶基因，并且还优选地不包含与去饱和酶基因或延伸酶基因有效连接的启动子。因此在优选的实施方案中，本发明的T-DNA可用于将对于产生VLC-PUFA必需的去饱和酶基因和延伸酶基因与因相邻植物基因组DNA所致的效应的任何影响有效分隔。
将T-DNA与相邻基因组位置产生的重大影响隔离的另一种方法是使T-DNA插入物与相邻基因的距离最大化。此外，破坏相邻基因可能对宿主植物导致意料之外的影响。可以用本领域技术人员已知的多种方法，如衔接头连接介导的PCR确定T-DNA的基因组插入位点，如O’Malley等人，2007Nature Protocols 2(11)：2910-2917中所述。这类方法允许选择其中已经以远离内源基因的所需距离插入T-DNA的转基因植物。优选鉴定其中T-DNA远离相邻编码性序列超过1000bp的转基因事件。更优选地，T-DNA远离最近的编码性序列2500bp，并且最优选地，T-DNA远离其5000bp或更远。
在一个实施方案中，本发明植物包含的T-DNA或多个T-DNA因此不破坏内源编码性序列。优选地，T-DNA(多个T-DNA)远离相邻编码性序列超过1000bp。更优选地，T-DNA(多个T-DNA)远离最近的编码性序列2500bp，并且最优选地，T-DNA(多个T-DNA)远离其5000bp或更远。
为了在植物中产生VLC-PUFA，本发明还提供T-DNA或构建体，所述T-DNA或构建体包含实施例中所给出的表的任何单基因的编码性序列(尤其去饱和酶和延伸酶的编码性序列)，优选地包含实施例中所给出的表的任何单个编码性序列和启动子、更优选地实施例中所给出的表的任何单个编码性序列和启动子及终止子，以及最优选地实施例的表的任何单个表达盒。
在一个实施方案中，本发明还提供构建体或T-DNA，所述的构建体或T-DNA包含如实施例的表11和表130中给出的编码性序列(尤其去饱和酶和延伸酶的编码性序列)，优选地包含如实施例的表11中给出的编码性序列(尤其去饱和酶和延伸酶的编码性序列)和启动子，更优选地包含如实施例的表11中给出的编码性序列(尤其去饱和酶和延伸酶的编码性序列)和启动子及终止子，并且最优选地包含如本发明方法背景下提到的如存在于VC-LTM593-1qcz rc中的去饱和酶表达盒和延伸酶表达盒(参见实施例部分，SEQ ID NO：3)。
另外，本发明提供一种用于植物中产生VLC-PUFA的T-DNA，其中T-DNA包含左边界元件和右边界元件和在其之间的一个或多个表达盒，其中T-DNA的长度，从左边界元件至右边界元件测量并包含一个或多个表达盒，具有至少30000bp长度。在一个实施方案中，分别最靠近左边界元件或右边界元件的表达盒借助至少500bp长度的分隔区与T-DNA的所述最近边界元件分隔。应当理解一个或多个表达盒各自包含与靶基因有效连接的启动子及其下游的终止子，其中相应表达盒的靶基因是如产生VLC-PUFA所要求的饱和酶基因或延伸酶基因。优选地至少一个和最优选地全部靶基因编码如实施例部分的任何表给出的去饱和酶或延伸酶，并且还优选地，至少一个和最优选地全部表达盒由如下任何实施例中给出的启动子、去饱和酶/延伸酶基因和终止子的组合组成。在一个实施方案中，本发明的植物包含本发明的一个或多个T-DNA，所述T-DNA包含一个或多个编码一种或多种d6Des(Δ6去饱和酶)、一种或多种d6Elo(Δ6延伸酶)、一种或多种d5Des(Δ5去饱和酶)、一种或多种o3Des(ω3去饱和酶)、一种或多种d5Elo(Δ5延伸酶)和一种或多种D4Des(Δ4去饱和酶)、优选地至少一种CoA依赖性D4Des和一种磷脂依赖性d4Des的表达盒。在一个实施方案中，T-DNA还编码一种或多种d12Des(Δ12去饱和酶)。在一个实施方案中，去饱和酶和延伸酶衍生自上文公开的生物。在一个实施方案中，本发明的植物因此包含本发明的一个或多个T-DNA，所述T-DNA包含至少一个编码Δ-6-去饱和酶(优选地CoA依赖性Δ-6-去饱和酶)的多核苷酸、至少两个编码Δ-6-延伸酶的多核苷酸、至少两个编码Δ-5-去饱和酶的多核苷酸、至少一个编码Δ-12-去饱和酶的多核苷酸、至少三个编码ω-3-去饱和酶的多核苷酸和至少一个编码Δ-5-延伸酶多核苷酸和至少两个编码Δ-4-去饱和酶的多核苷酸(优选地至少一个编码CoA依赖性D4Des的多核苷酸和至少一个编码磷脂依赖性d4Des的多核苷酸)。
本文他处公开了编码上文所提及的去饱和酶和延伸酶的优选的多核苷酸序列(还参见表130中的SEQ ID NO)。
在一个具体的优选实施方案中，去饱和酶和延伸酶是来自上文公开的生物。在一个实施方案中，本发明的植物因此包含本发明的一个或多个T-DNA，所述T-DNA包含至少一个编码Δ-6-去饱和酶的多核苷酸、至少两个编码Δ-6-延伸酶的多核苷酸、至少两个编码Δ-5-去饱和酶的多核苷酸、至少一个编码Δ-12-去饱和酶的多核苷酸、至少三个编码ω-3-去饱和酶的多核苷酸和至少一个编码Δ-5-延伸酶多核苷酸和至少两个编码Δ-4-去饱和酶的多核苷酸(优选地编码至少一种CoA依赖性D4Des和至少一种磷脂依赖性d4Des的多核苷酸)。
在本发明的又一个优选的实施方案中，本发明的植物包含本发明的一个或多个T-DNA，所述T-DNA包含一个来自球蒴藓的Δ-6延伸酶的表达盒、一个来自假微型海链藻的Δ-6延伸酶的表达盒、两个来自破囊壶菌属物种(尤其来自破囊壶菌属物种ATCC21685)的Δ-5去饱和酶的表达盒、来自畸雌腐霉的ω-3去饱和酶的二个表达盒、一个来自致病疫霉的ω-3-去饱和酶的表达盒、一个来自托瑞蚝球藻的Δ-5延伸酶的表达盒、一个来自破囊壶菌属物种的Δ-4去饱和酶的表达盒和一个来自路氏巴夫藻的Δ-4去饱和酶的表达盒。编码去饱和酶或延伸酶的多核苷酸的序列可以在T-DNA载体VC-LTM593-1qcz的(SEQ ID NO：3)中找到。关于更多信息，还参见表11。在一个甚至进一步优选的实施方案中，本发明的植物包含一个或多个T-DNA，其中T-DNA包含VC-LTM593-1qcz的去饱和酶和延伸酶的表达盒(参见，例如，表11)。另外，构思本发明的植物包含本发明的一个或多个T-DNA，其中T-DNA具有载体VC-LTM593-1qcz的T-DNA的序列。表11中显示载体中T-DNA的位置。该载体具有SEQ ID NO：3中所示的序列。
在一个优选实施方案中，本发明的T-DNA、构建体或植物包含、尤其按以下顺序包含编码以下去饱和酶和延伸酶的多核苷酸：来自球蒴藓的Δ-6延伸酶；来自破囊壶菌(尤其来自破囊壶菌属物种ATCC21685)的Δ-5去饱和酶；来自托瑞蚝球藻的Δ-6去饱和酶；来自假微型海链藻的Δ-6延伸酶；来自大豆疫霉的Δ-12去饱和酶；来自畸雌腐霉的ω-3去饱和酶；来自致病疫霉的ω-3-去饱和酶；来自破囊壶菌(尤其来自破囊壶菌属物种ATCC21685)的Δ-5去饱和酶；来自破囊壶菌属物种的Δ-4去饱和酶；来自畸雌腐霉的ω-3去饱和酶；来自路氏巴夫藻的Δ-4去饱和酶；来自托瑞蚝球藻的Δ-5延伸酶。因此，本发明的T-DNA、构建体或植物包含二拷贝的来自破囊壶菌的Δ-5去饱和酶和二拷贝的来自破囊壶菌的Δ-5去饱和酶。还涵盖其变体。
如本文中他处所述，T-DNA优选地应当具有至少30000bp的长度。
在一个实施方案中，如本文所述的本发明植物或其部份包含本发明的一个或多个T-DNA，所述T-DNA编码至少两种d6Des、至少两种d6Elo和/或、至少两种o3Des。在一个实施方案中，本发明的植物或其部份包含T-DNA，所述T-DNA包含一个或者多个编码至少一种CoA依赖性4Des和至少一种磷脂依赖性d4Des的表达盒。在一个实施方案中，由本发明植物或其部份中一个或多个T-DNA编码的酶的活性由具有表19第1列中所示活性的多肽编码和表达。在一个实施方案中，本发明的植物包含如表13中第1至9列所显示的至少一个T-DNA。在一个实施方案中，本发明的一个T-DNA包含一个或多个编码表13中列出的活性或酶的基因表达盒。
在一个实施方案中，至少一个T-DNA还包含编码至少一种d12Des的表达盒。在一个实施方案中，该T-DNA或多个T-DNA包含的一个或多个编码一种或多种d5Des(Tc_GA)、o3Des(Pir_GA)、d6Elo(Tp_GA)和/或d6Elo(Pp_GA)的表达盒。已经显示本发明的这类植物历经三个或更多世代及在不同生长条件具有特别高的VLC-PUFA量和浓度。
在一个实施方案中，本发明的T-DNA编码如表19中公开的第1列的活性、优选地表13中公开的基因组合的活性、甚至更优选地如表13中所述的启动子-基因组合的活性。
难以评估来自T-DNA中存在的每个去饱和酶基因和延伸酶基因对VLC-PUFA量的贡献，但是可以计算每个途径步骤的转化效率，例如通过使用图2中显示的公式。这些计算基于所讨论组织或油的脂肪酸组成并且显示从特定酶的底物形成的产物脂肪酸(和下游产物)的量。转化效率有时称作“表观”转化效率，因为对于这些计算中的某些，认可计算不考虑可能影响反应的全部因素。然而，转化效率值可以用来评估每个去饱和酶反应或延伸酶反应对VLC-PUFA总体生产的贡献。通过比较转化效率、可以在不同个体种子、植物、整装种子批次、事件、芸苔属种质或转基因构建体之间比较给定酶促步骤的相对有效性。
在本发明的一个实施方案中，植物是欧洲油菜植物。优选地，植物包含本发明的至少一个-DNA(并且因此包含一个或多个T-DNA)。T-DNA应当具有至少10,000个碱基对、尤其至少30,000bp的长度。
如本文中他处所述，本发明包含的T-DNA应当包含去饱和酶和延伸酶的表达盒。在一个实施方案中，T-DNA包含一个或多个(优选地一个)Δ-5去饱和酶表达盒、一个或多个(优选地三个)ω-3去饱和酶表达盒、一个或多个(优选地一个)Δ12去饱和酶表达盒、一个或多个Δ4去饱和酶表达盒(优选地一个CoA依赖性d4des表达盒和一个磷脂依赖性d4des表达盒)、一个或多个(优选地一个)Δ-5延伸酶表达盒、一个或多个(优选地一个)Δ-6去饱和酶表达盒、和一个或多个(优选地两个)Δ-6延伸酶表达盒。优选地，T-DNA包含两个来自破囊壶菌属物种的Δ-5去饱和酶的表达盒、两个来自致病疫霉的ω-3-去饱和酶的表达盒、一个来自畸雌腐霉的ω-3-去饱和酶的表达盒、一个来自大豆疫霉的Δ-12去饱和酶的表达盒、一个来自路氏巴夫藻的Δ-4去饱和酶的表达盒、一个来自破囊壶菌属物种的Δ-4去饱和酶的表达盒、一个来自托瑞蚝球藻的Δ-6去饱和酶的表达盒、一个来自球蒴藓的Δ-6延伸酶的表达盒和一个来自假微型海链藻的Δ-6延伸酶的表达盒。表130中给出SEQ ID No。另外，构思可以使用前述酶的变体的表达盒。
植物应当产生如本文他处以更多细节描述的油：
本发明构思了植物具有以下一个或多个特征：
(i)整批次种子中Δ6去饱和酶转化效率大于约28％、或大于约34％、或大于约40％，
(ii)单个种子中大于约40％的Δ6去饱和酶转化效率，
(iii)整批次种子中Δ6延伸酶转化效率大于约75％、或大于约82％、或大于约89％，
(iv)单个种子中大于约86％的Δ6延伸酶转化效率，
(v)T-DNA插入或多个T-DNA插入不破坏内源编码性序列(如本文他处描述)，
(vi)在任何插入的T-DNA序列和最近内源性基因之间的距离是约1000、或约2000、或约5000碱基对、
(vii)T-DNA插入物或多个插入物不造成插入位置周围的任何DNA重排，
(viii)没有不完整T-DNA插入(因此，全长T-DNA应当整合在基因组中)，
(ix)T-DNA插入物或多个插入物仅出现在芸苔属C基因组中，
(x)全部插入的转基因均完整发挥作用(因此，由这些基因编码的酶应当保留其功能)。
如何计算Δ-6-去饱和酶、Δ6-延伸酶的转化效率是本领域熟知的。在一个实施方案中，通过使用图2中所示的公式计算转化效率。另外，构思如实施例19至22中描述那样计算转化效率。
如实施例中就产生VLC-PUFA而言详述，三个去饱和酶基因特别地易受基因剂量效应(也称作“拷贝数效应”)影响，从而相比增加其他基因的表达盒数目，增加包含这些相应基因的表达盒数目导致植物油中更强的VLC-PUFA水平增长。这些基因是编码Δ-12-去饱和酶活性、Δ-6-去饱和酶活性和ω-3-去饱和酶活性的基因。因此，根据本发明，包含编码Δ-12-去饱和酶、Δ-6-去饱和酶或ω-3-去饱和酶的基因的每个表达盒由分隔区和任选地一个或多个表达盒与相应的最近左边界元件或右边界元件分隔。应当理解在本发明的T-DNA包含多于一个包含相同功能的基因的表达盒情况下，这些基因就其核酸序列或由其编码的多肽序列而言不需要是相同的，但应当是功能性同源物。因此，例如，为了利用本文所述的基因剂量效应，任选地除编码Δ-6-去饱和酶和/或ω-3-去饱和酶的多重基因之外，本发明的T-DNA还可以包含二、三、四个或更多个表达盒，所述表达盒各自包含编码Δ-12-去饱和酶的基因，其中由相应基因编码的Δ-12-去饱和酶多肽在其氨基酸序列上相异。同样地，任选地除编码Δ-12-去饱和酶和/或ω-3-去饱和酶的多重基因之外，本发明的T-DNA还可以包含二、三、四或更多个表达盒，所述表达盒各自包含编码Δ-6-去饱和酶的基因，其中由相应基因编码的Δ-6-去饱和酶多肽在其氨基酸序列上相异，或任选地除编码Δ-12-去饱和酶和/或Δ-6-去饱和酶的多重基因之外，本发明的T-DNA还可以包含二、三、四或更多个表达盒，所述表达盒各自包含编码ω-3-去饱和酶的基因，其中由相应基因编码的ω-3-去饱和酶多肽在其氨基酸序列上相异。
根据本发明，代之一个或多个前述编码性序列，T-DNA、构建体或植物还可以包含其功能性同源物。编码性序列的功能性同源物是编码与替换的编码性序列所编码的多肽具有相同代谢功能的多肽的序列。例如，Δ-5-去饱和酶的功能性同源物将是另一种Δ-5-去饱和酶，并且Δ-5-延伸酶的功能性同源物将是另一种Δ-5-延伸酶。编码性序列的功能性同源物优选地编码这样的多肽，所述多肽与实施例的相应表中给出的相应编码性序列编码的多肽具有至少40％序列同一性，更优选地至少41％、更优选地至少46％、更优选地至少48％、更优选地至少56％、更优选地至少58％、更优选地至少59％、更优选地至少62％、更优选地至少66％、更优选地至少69％、更优选地至少73％、更优选地至少75％、更优选地至少77％、更优选地至少81％、更优选地至少84％、更优选地至少87％、更优选地至少90％、更优选地至少92％、更优选地至少95％、更优选地至少96％、更优选地至少97％、更优选地至少98％和甚至更优选地至少99％序列同一性。同样地，启动子的功能性同源物是启动下述编码性序列转录的序列，对于近端启动子，所述编码性序列位于距离最靠近该编码性序列的启动子TATA框的500bp范围内，或对于远端启动子，位于其3000bp范围内。再次，植物种子特异性启动子的功能性同源物是另一种植物种子特异性启动子。相应地，终止子的功能性同源物是终结核酸序列转录的序列。
实施例描述了特别优选的T-DNA序列。如上所述，本领域普通技术人员理解，本文中所述的编码性序列、启动子和终止子可以由其功能性同源物替换。但是，实施例还描述了根据本发明，启动子和编码性序列的某些组合，或驱动其相应编码性序列表达的各启动子的某些组合，或某些编码性序列或其组合是特别有利的；根据本发明，这类组合或独立的编码性序列不应当由相应元件(此处：编码性序列或启动子)的功能性同源物替换。
本发明的T-DNA或构建体优选地包含易受基因剂量效应影响的两个或更多个基因，优选地全部基因。如本文所述，为了实现某些酶活性(例如，Δ-12-去饱和酶、Δ-6-去饱和酶和/或ω-3-去饱和酶活性)的高转化效率，向植物细胞中引入多于一个编码具有所需活性的酶的基因是有利的。当T-DNA引入植物细胞时，例如，如本文所述，通常采用涉及植物细胞暴露于微生物的转化方法。由于每个微生物可以包含多于一个包含本发明T-DNA的核酸，频繁地获得包含两个或更多个独立整合入细胞遗传物质的本发明T-DNA的重组植物细胞。因此，在一个转化用构建体上组合易受基因剂量效应影响的基因，允许轻易利用转化的独立性来实现更高频率的这类T-DNA多重插入。这可用于下述转化方法，所述转化方法依赖共转化以保持每个待转化构建体的尺寸。
本发明因此还提供包含本发明T-DNA的构建体，其中构建体优选地是通过微生物介导的转化法、优选地通过农杆菌介导的转化法转化植物细胞的载体。相应地，本发明还提供转化用微生物，所述微生物包含本发明的一个T-DNA，优选地作为包含所述T-DNA的构建体。优选地，微生物是农杆菌属微生物，优选地是其卸甲菌株，并且优选地是物种根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或，甚至更优选地，是物种发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)。例如在WO06024509A2中描述了相应菌株，并且例如在WO13014585A1中描述使用这类微生物转化植物的方法。这些WO出版物完整并入本文，因为它们含有关于产生、选择和使用这类微生物的有价值信息。
术语“载体”优选地包括噬菌体、质粒、病毒载体以及人工染色体，如细菌或酵母人工染色体。另外，该术语还涉及允许导引构建体随机或位点定向整合入基因组DNA的导引构建体。此类定向构建体优选地包含足够长度的用于如下文详述的同源或异源重组的DNA。包含本发明多核苷酸的载体优选地还包含用于宿主中增殖和/或选择的选择标记。载体可以通过本领域熟知的多项技术并入宿主细胞中。如果被导入宿主细胞中，载体可以停留在细胞质中或可以并入基因组中。在后一种情况下，可以理解载体可以进一步包含允许同源重组或异源插入的核酸序列。载体可以通过常规转化或转染技术引入原核或真核细胞中。如本上下文中所用，术语“转化”和“转染”、接合和转导，意图包括用于将外来核酸(例如DNA)引入宿主细胞的多种现有技术方法，包括磷酸钙、氯化铷或氯化钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖介导转染法、脂质体转染法、天然感受态法、碳基团簇法(carbon-based cluster)、化学介导转移法、电穿孔法或粒子轰击法。可以在Sambrook等人(Molecular Cloning：ALaboratory Manual.，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)和其他实验室手册如Methods inMolecular Biology，1995，第44卷，Agrobacterium protocols，编者Gartland和Davey，Humana Press，Totowa，New Jersey中找到用于转化或转染宿主细胞(包括植物细胞)的合适方法。备选地，可以通过热休克或电穿孔技术导入质粒载体。如果载体是病毒，则在施加至宿主细胞之前，可以使用适宜包装细胞系在体外包装该载体。
优选地，本文提到的载体适合用作克隆载体，即，在微生物系统中可复制。此类载体确保在细菌并且优选地在酵母或真菌中高效克隆，并且使得植物的稳定转化成为可能。那些必须提到的载体尤其是多种双元和共整合载体系统，它们适用于T DNA介导的转化。通常，此类载体系统的特征在于，它们至少含有为农杆菌介导转化所需要的vir基因和界定T-DNA的序列(T-DNA边界)。这些载体系统优选地也包含其他顺式调节区如启动子和终止子和/或可以借以鉴定适宜的已转化宿主细胞或生物的选择标记。共整合载体系统使得vir基因和T-DNA序列安置在同一个载体上，而双元系统基于至少两个载体，其中之一携带vir基因，但无T-DNA，同时第二个载体携带T-DNA，但无vir基因。因而，最后提到的载体相对小，易于操作并且可以在大肠杆菌和农杆菌中均复制。这些双元载体包括来自pBIB-HYG、pPZP、pBecks、pGreen系列的载体。根据本发明，优选地使用Bin19、pBI101、pBinAR、pGPTV和pCAMBIA。可以在Hellens等人，Trends in Plant Science(2000)5，446-451中找到对双元载体及其用途的综述。另外，可以通过使用适宜的克隆载体，将所述多核苷酸引入宿主细胞或生物(如植物或动物)，并且因而可以用于转化植物，如Plant Molecular Biology andBiotechnology(CRC Press，Boca Raton，Florida)，第6/7章，第71-119页(1993)；F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；引自：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Kung和R.Wu编著，Academic Press，1993，15-38；B.Jenes等人，Techniques for Gene Transfer，引自：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Kung和R.Wu编著，Academic Press(1993)，128-143；Potrykus 1991，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.42，205-225中发表和引用的那些载体。
更优选地，本发明的载体是表达载体。在这种表达载体中，即，包含本发明多核苷酸的载体具有核酸序列，所述核酸序列与允许在原核植物细胞或其分离的级分中表达的表达控制序列(还称作“表达盒”)有效连接。
最重要的，本发明还提供植物或其种子，所述植物或其种子包含在其基因组中整合的本发明T-DNA或构建体。
因此，构建体或T-DNA应当稳定整合入植物或植物细胞的基因组。在一个实施方案中，植物对T-DNA纯合。在另一个实施方案中，植物对T-DNA为半合子性。如果植物在一个基因座对一个T-DNA纯合，则本文中将此视为单拷贝，即视为一个拷贝。如本文所用，双拷贝指其中两个T-DNA已经在一个或两个基因座插入并处于半合子态或纯合态的植物。
可以通过确定某转基因事件的两个或更多个后续世代中T-DNA的存在，评估T-DNA的稳定性。可以通过DNA印迹分析、PCR、DNA测序或适于检测特定DNA序列的其他方法确定T-DNA的存在。T-DNA的稳定性应当还包括含有多于一个拷贝T-DNA的转基因事件的拷贝数量值。在这种种情况下，可能无法通过选择性状(即VLC-PUFA含量)检测单拷贝T-DNA的不稳定性，因为一个稳定T-DNA拷贝的存在可以掩蔽另一者的不稳定性。当采用至少30000bp长度的巨大T-DNA和采用多重拷贝的某些序列(例如二个拷贝的相同启动子)工作时，特别重要的是确认T-DNA内部多个位置处的存在和拷贝数。长T-DNA的边界具有增加的连锁平衡可能性，并且重复序列增加同源重组的可能性。处于连锁平衡和潜在同源重组的影响意味着，T-DNA的转基因可能历经多个世代遭破坏或丢失。因此，优选在T-DNA上多于三个位置(包括在右边界和左边界的区域以及T-DNA内部区域)处检查巨大T-DNA(至少30000bp)的存在和拷贝数。更优选检查T-DNA上多于5个区域的存在和拷贝数并且最优选地检查T-DNA上至少7个区域的存在和拷贝数。
这类T-DNA或构建体优选地允许下述全部基因表达，所述全部基因是在植物中和尤其在其种子中、尤其在油籽植物中和最有益地在十字花科、优选地芸苔属和最优选地下述物种的植物或种子中产生VLC-PUFA所要求的，所述物种包含甘蓝(Brassica oleracea)、黑芥(Brassica nigra)和芜青(Brassica rapa)物种，因此优选地欧洲油菜(Brassicanapus)、埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)、芥菜(Brassica juncea)、甘蓝、黑芥或芜青物种中一个或两个成员的基因组。根据本发明特别优选欧洲油菜和埃塞俄比亚芥物种的植物和种子。
本发明的植物必然地是转基因的，即它们包含在相应野生型植物中不存在或在相应野生型植物中布置不同(例如遗传元件数目不同)的遗传物质。例如，本发明的植物包含还存在于野生型植物中的启动子，但是，本发明的植物包含与编码性序列有效连接的这类启动子，从而启动子和编码性序列的这种组合不存在于相应的野生型植物中。因此，编码去饱和酶或延伸酶的多核苷酸应当是重组多核苷酸。
本发明的植物和种子就其产生VLC-PUFA而言在多个有利特征方面不同于迄今产生的植物，所述有利特征在实施例中详细描述。特别地，本发明的T-DNA允许产生具有下述特征的转化体植物(也称作“重组植物”)及其种子：转化频率高、T-DNA插入历经自体受精植物的多个世代而稳定性高、VLC-PUFA生产之外的表型特征和农艺学特征未改变或未受损、在这类转化的植物及其相应后代的群体的油中VLC-PUFA、尤其EPA和/或DHA数量及浓度高。
每种种子的VLC-PUFA数量的种子间变异性和植物间变异性高，甚至对于相同温室条件下并排栽培的相同克隆也是如此。另外，现在发现并且在下文实施例中报告，欧洲油菜中VLC-PUFA的含量与种子含油量负相关。单纯以植物油的全部脂肪酸的％(w/w)提到VLC-PUFA浓度不表示通过农业(即大规模)培育相应克隆可实现该VLC-PUFA量。VLC-PUFA量或浓度取决于哪些基因、启动子、基因-启动子组合、基因-基因组合等有益于油籽植物中的VLC-PUFA合成。基于用来产生该组的种子，不同种类的种子分组是：(i)“单粒种子”或“单一种子”指来自一株植物的一粒种子；(ii)衍生自“独立植物”的种子指在没有尝试基于种子间变异性选择的情况下，单株植物上长出的全部种子；(iii)“批次种子”或“种子批次”指在没有基于植物间或种子间变异性选择的情况下，从特定数目的植物采集的全部种子。批次中提到的具体植物数目可以是任何数目，一或更大，其中可以理解，一个植物的批次等同于独立植物。(iv)“整装种子”指在没有尝试基于植物间或种子间变异性选择种子的情况下，从多株植物(等于或大于100株)收集的全部种子。
另外，重要的是要注意，可以实际上通过增加功能上相同的基因的表达盒的数目，增加VLC-PUFA量或浓度。而且重要的是要注意，尽管许多现有技术文献声称包含适用的技术教导，例如，声称组合多种具有特定特性(例如，CoA依赖性)的去饱和酶，但是却不知道如何将这类声称的技术教导落实到实践，特别地因为这类文献仅教导要求(即功能性权利要求特征)，但未教导这些要求的解决方案(即结构性特征)。例如，这类现有技术文献频繁地仅包含一个单基因例子并且指导读者启动研究计划以找到满足其中所给出的功能性定义的其他酶，条件是存在满足这些功能要求的任何其他酶。
除非另外声明，否则包含本发明T-DNA或构建体的本发明植物也可以是包含本发明T-DNA或构建体之部分的植物，其中这种部分足以产生与相应完整的本发明T-DNA或构建体编码的去饱和酶和/或延伸酶相同的去饱和酶和/或延伸酶。除了如前句中所限定的本发明T-DNA之部分以外，这类植物最优选地还包含至少一个完整的本发明T-DNA或构建体。这类植物以下也称作“不完整双拷贝”植物。事件LBFDAU是包含本发明T-DNA之部分并且仍属本发明植物的植物的例子。在一个实施方案中，T_DNA是完整T-DNA。
优选的本发明植物包含一个或多个包含表达盒的本发明T-DNA或构建体，所述表达盒包含编码一种或多种d5Des、一种或多种d6Elo、一种或多种d6Des、一种或多种o3Des、一种或多种d5Elo和一种或多种D4Des的一个或多个基因，优选地编码至少一种CoA依赖性D4Des和一个磷脂依赖性d4Des。在一个实施方案中，至少一个T-DNA还包含编码至少一种d12Des的表达盒。在一个实施方案中，该T-DNA或多个T-DNA还包含一个或多个编码一种或多种d5Des(Tc_GA)、o3Des(Pir_GA)、d6Elo(Tp_GA)和/或d6Elo(Pp_GA)的表达盒，括号中缩写的解释例如给出在表130中，例如，d6Elo(Tp_GA)是来自假微型海链藻的Δ-6延伸酶，d6Elo(Pp_GA)是来自球蒴藓的Δ-6延伸酶。已经显示本发明的这类植物历经三个或更多世代及在不同生长条件具有特别高的VLC-PUFA量和浓度。
优选的本发明植物是油料作物植物。
最优选地，本发明的植物是“禹氏三角”中存在的植物，即芸苔属植物：欧洲油菜(AA CC基因组；n＝19)是双二倍体芸苔属植物，但认为其因芜青(AA基因组；n＝10)与甘蓝(CC基因组；n＝9)杂交而产生。芥菜(AA BB基因组；n＝18)是双二倍体芸苔属植物，通常认为该植物因芜青与黑芥(BB基因组；n＝8)杂交而产生。在某些生长条件下，芥菜可以相对于欧洲油菜具有某些优越性状。这些优越性状可以包括更高的产量、更好的耐旱及耐热性和更好的抗病性。埃塞俄比亚芥(BB CC基因组；n＝17)是双二倍体芸苔属植物，但认为其因黑芥与甘蓝杂交而产生。在某些生长条件下，埃塞俄比亚芥可以相对于欧洲油菜具有优越的性状。特别地，当用相同T-DNA转化时，与欧洲油菜(B.napus)相比，埃塞俄比亚芥允许VLC-PUFA浓度增加至少20％。
本发明的植物优选地是“卡诺拉油菜”植物。卡诺拉油菜是由加拿大植物育种者针对其油特性及粗粉特性、特别是其低饱和脂肪水平而专门开发的遗传性变异油菜。卡诺拉油菜在本文中通常指具有种子油中以重量计小于2％芥酸(Δ13-22：1)和小于30微摩尔芥子油苷/克无油粗粉的芸苔属植物物种。通常卡诺拉油菜油可以包含称作棕榈酸和硬脂酸的饱和脂肪酸、称作油酸的单不饱和脂肪酸及称作亚油酸和亚麻酸的多不饱和脂肪酸。卡诺拉油菜油可以含有小于约7％(w/w)的总饱和脂肪酸(大部分是棕榈酸和硬脂酸)和大于40％(w/w)的油酸(作为总脂肪酸的百分数)。传统上，卡诺拉油菜作物包括欧洲油菜和芜青的变种。本发明的优选植物是卡诺拉春油菜(欧洲油菜油用亚种一年生变种(Brassicanapus subsp.oleifera var.annua))和卡诺拉冬油菜(欧洲油菜油用亚种二年生变种(Brassica napus subsp.oleifera var.biennis))。另外，具有与其他卡诺拉油菜类型相似的油质量和粗粉质量的卡诺拉品质芥菜品种已经加入卡诺拉油菜作物家族(2001年10月16日授予Potts等人的美国专利号6,303,849；Yao等人的美国专利号7,423,198；Potts和Males，1999；全部文献均通过引用方式并入本文)。同样地，可以通过卡诺拉品质欧洲油菜变体与黑芥杂交并且适当地选择其后代，任选地与埃塞俄比亚芥、欧洲油菜和/或黑芥进一步回交后，建立卡诺拉品质埃塞俄比亚芥变种。
本发明也提供具有下述基因型的十字花科植物或其种子、优选地芸苔属植物或其种子，所述基因型向种子油VLC-PUFA含量赋予可遗传表型，所述植物或其种子从通过包括下述步骤的方法制备的后代系可获得或获得：
i)将十字花科植物、优选地芸苔属植物、最优选地欧洲油菜、甘蓝、黑芥或埃塞俄比亚芥植物，所述植物包含了本发明的T-DNA或构建体和/或这种T-DNA的部分，与十字花科亲本植物、优选地芸苔属亲本植物、最优选地欧洲油菜、甘蓝、黑芥或埃塞俄比亚芥亲本植物(所述亲本植物不包含所述T-DNA和/或其部份)杂交，以产生F1杂种，
ii)自交F1杂种至少一个世代，并且
iii)鉴定包含本发明T-DNA的步骤(ii)的后代，所述后代能够产生包含VLC-PUFA的种子。
优选地，后代能够产生包含如本文他处描述的油(尤其，参见对本发明油的定义)的种子。更优选地，后代应当能够产生这样的种子，所述种子包含VLC-PUFA，从而在40％含油量(w/w)时，18：1n-9下游的全部VLC-PUFA的含量是总种子脂肪酸含量的至少40％(w/w)，或者优选地在40％含油量(w/w)时，EPA的含量是总种子脂肪酸含量的至少12％(w/w)和/或DHA的含量是总种子脂肪酸含量的至少2％(w/w)。还优选地，在40％含油量(w/w)时，18：1n-9下游的全部VLC-PUFA的含量是总种子脂肪酸含量的至少40％(w/w)，或者优选地在40％含油量(w/w)时，EPA的含量是总种子脂肪酸含量的至少5％、尤其至少8％(w/w)和/或DHA的含量是总种子脂肪酸含量的至少1％(w/w)、尤其1.5％(w/w)。
这种方法允许将十字花科、优选地芸苔属的其他成员的遗传物质有效并入包含本发明T-DNA或构建体的植物的基因组。该方法特别可用于将本发明的T-DNA或构建体与负责十字花科其他成员中所证明的有益性状的遗传物质组合。本文中示例地描述了十字花科其他成员的有益性状，可以在其他地方描述涉及有益性状表现的其他有益性状或基因和/或调节元件。
不包含本发明T-DNA或构建体或其部份的亲本植物优选地是农艺学优良的亲本。特别地，本发明教授了源自本发明植物或种子的异源物质转移至不同的基因组背景，例如不同的品种或物种。
特别地，本发明教授了转移T-DNA或其部份(后者对本发明的那些植物特别有意义，其中除了完整的本发明T-DNA之外，所述植物还包含本发明T-DNA的部分，所述部分优选地包含至少一个表达盒，所述表达盒优选地包含编码去饱和酶或延伸酶、优选地Δ-12-去饱和酶，Δ-6-去饱和酶和/或ω-3-去饱和酶的基因)或构建体至埃塞俄比亚芥物种中，或教授了将源自埃塞俄比亚芥或黑芥的遗传物质引入包含本发明T-DNA和/或其一个部分或两个或更多个部分的本发明植物。根据本发明，替换其在欧洲油菜中存在的同源物或除欧洲油菜中存在的同源物之外所附加的黑芥基因特别地有益于进一步增加植物种子及其油中VLC-PUFA的量。
另外，本发明教授了包含本发明的T-DNA和/或其部份的新植物变种。通过选择适宜的交配配偶，这类变种可以特别地适应于例如选定的气候生长条件、除草剂耐受性、胁迫抗性、真菌抗性、草食动物抗性、增加或降低的含油量或其他有益特征。如本文实施例中显示，特别有益的是提供这样的本发明植物，其中收获时其含油量低于相同品种的相应野生型植物，从而改善所述本发明植物的油中的VLC-PUFA量和/或所述油中的VLC-PUFA浓度。
另外，本发明提供一种用于产生植物的方法，所述植物具有向种子油VLC-PUFA含量赋予可遗传表型的基因型，从通过包括下述步骤的方法制备的后代系可获得或获得
i)将本发明的转基因植物与不包含本发明T-DNA或其部份的亲本植物杂交，所述亲本植物属于十字花科、优选地属于芸苔属、最优选地属于欧洲油菜、甘蓝、黑芥或埃塞俄比亚芥，以产生F1杂种，
ii)自交F1杂种至少一个世代，并且
iii)鉴定包含本发明T-DNA的步骤(ii)的后代，所述后代能够产生包含VLC-PUFA的种子。
优选地，后代能够产生包含如本文他处描述的油(尤其，本发明的油)的种子。更优选地，后代应当能够产生这样的种子，所述种子包含VLC-PUFA，从而在40％含油量(w/w)时，18：1n-9下游的全部VLC-PUFA的含量是总种子脂肪酸含量的至少40％(w/w)，或者优选地在30％(w/w)的含油量、优选地在35％(w/w)的含油量和更优选地在40％(w/w)的含油量时，EPA的含量是总种子脂肪酸含量的至少8％(w/w)和/或DHA的含量是总种子脂肪酸含量的至少1％(w/w)。
该方法允许产生本发明植物的新变体和转基因物种及其种子。这类植物和种子显示出本发明的前述益处。优选地，按重量计，EPA的含量是油的总脂质含量的至少5％、更优选地至少8％、甚至更优选地至少10％、最优选地至少13％(w/w)。还优选地，按重量计，DHA的含量是油的总脂质含量的至少1.0％、更优选地至少1.5％、甚至更优选地至少2％(w/w)。本发明首次允许在农艺学条件下可靠地在种子中实现这类高水平的VLC-PUFA，即代表了从栽种本发明植物的至少1公顷商品田的种子中获得的真实产量，其中所述植物具有确定拷贝数的基因，以在所述植物中执行产生EPA和/或DHA的途径，并且拷贝数低，即单拷贝或不完整双拷贝。
本发明的植物还包括通过回交(杂交入非转基因的、同基因亲本系)和通过与其他禹氏三角种质杂交可获得或获得的植物。因此，本发明提供一种用于产生植物的方法，所述植物具有向种子油VLC-PUFA含量赋予可遗传表型的基因型，从通过包括下述步骤的方法制备的后代系可获得或获得
i)将本发明的转基因植物(也称作“非回归亲本”)与不表达在本发明T-DNA中所含的基因的亲本植物杂交，所述亲本植物属于十字花科、优选地属于芸苔属、最优选地属于欧洲油菜、甘蓝、黑芥或埃塞俄比亚芥，以产生杂交后代，
ii)将杂交后代再次与亲本杂交以获得另一个杂交后代，
iii)任选地重复步骤ii)并且
iv)选择包含本发明T-DNA的杂交后代。
例如，如上文所述的回交方法可以与本发明一起使用以改善某特征或将其引入包含本发明T-DNA的植物株系。在步骤iv)中选择的这种杂交后代满足预定参数。本发明的回交方法因而有益地促进采用来自非回归亲本的目的基因或优选地本发明T-DNA改良回归亲本的遗传物质，同时基本上保留回归亲本的全部其他所需遗传物质，并且因此基本上保留亲本系的所需生理学和形态学构成。选择的杂交后代随后优选地繁殖并构成如本文所述的株系。可以通过使用基因组标记进一步促进选择有用后代供重复步骤ii)。例如，选择这类后代供重复步骤ii)，其中与先前杂交步骤中获得的其他后代目比，所述后代包含在亲本中也存在的最多标记和/或在非回归亲本也存在的最少标记，所需的本发明T-DNA或其部分例外。
优选地，选择这样的杂交后代，所述杂交后代包含本发明的T-DNA，并且例如，通过将本发明T-DNA的额外部分并入杂交植物的遗传物质，甚至更优选地还包含来自本发明非回归亲本的至少一个其他表达盒。
进一步优选地，获得这样的杂交后代，其中除了来自非回归亲本的遗传物质之外，转化的植物中亲本的基本上全部所需形态特征和生理特征恢复，如相同环境条件下培育时在5％显著性水平测定。
进一步优选地，选择产生下述种子的杂交后代，所述种子包含如本文他处描述的油(即，本发明的油)。特别地，选择产生下述种子的杂交后代，所述种子包含VLC-PUFA，从而在40％含油量(w/w)时，18：1n-9下游的全部VLC-PUFA的含量是总种子脂肪酸含量的至少40％(w/w)，或者优选地在30％(w/w)的含油量、优选地在35％(w/w)的含油量和更优选地在40％(w/w)的含油量时，EPA的含量是总种子脂肪酸含量的至少8％(w/w)和/或DHA的含量是总种子脂肪酸含量的至少1％(w/w)。
应当理解，这个种子VLC-PUFA含量不从单个种子或从单株植物的种子测量，而指至少100株植物、甚至更优选地至少200株植物、甚至更优选地其半数已经在田间试验在不同年份培育的至少200株植物的种子VLC-PUFA含量的数字均值，尤其指至少100株植物、甚至更优选地至少200株植物、甚至更优选地其半数已经在田间试验在不同年份培育的至少200株植物的整装种子VLC-PUFA含量的数字均值。
特定非回归亲本的选择将取决于回交目的。主要目的之一是向株系增加某些合乎商业需要的农艺学重要性状。
术语“株系”指在共享这个命名的个体之间显示非常小的总体变异的植物群体。“株系”通常指对于至少一个性状显示个体间微小遗传性变异或不显示遗传性变异的植物群体。如本申请中所用的“DH(双单倍体)系”指通过以下方式产生的植物群体：培养单倍体组织并且随后在不伴以细胞分裂的情况下令染色体含量加倍，以产生具有二倍体数目染色体的植物，其中每个染色体对由二个重复的染色体组成。因此，DH系通常情况下对于诸性状显示个体间微小变异或不显示变异。包含一个或多个在非回归亲本中最初含于本发明T-DNA中的基因的株系也构成本发明的植物。
本发明还涉及一种产生植物油的方法，所述方法包括步骤
i)培育本发明的植物，从而获得其含油种子，
ii)收获所述种子，并且
iii)从步骤ii中收获的所述种子提取油
优选地，油是如下文以更多细节所述的油(即，本发明的油)。更优选地，油具有基于总脂质含量以重量计至少1％的DHA含量和/或基于总脂质含量以重量计至少8％的EPA含量。还优选地、油具有基于总脂肪酸含量以重量计至少1％的DHA含量和/或基于总脂肪酸含量以重量计至少8％的EPA含量。
还优选地，按重量计，EPA的含量是油的总脂质含量的至少10％(w/w)、甚至更优选地至少13％(w/w)。还优选地，按重量计，DHA的含量是油的总脂质含量的至少1.5％(w/w)、甚至更优选地至少2％(w/w)。如本文所述，本发明的植物包含，出于产生植物油的这种方法的目的，优选地包含本发明的T-DNA(或构建体)和任选地还包含其一个或多个额外部分，其中所述部分或多个部分分别地包含本发明T-DNA的至少一个表达盒。
本发明是还涉及本发明植物的部分。术语“植物的部分”包括衍生自本发明植物的任何物，包括植物部分如细胞、组织、根、茎、叶、非活着的收获材料、青贮料、种子、种子粕和花粉。优选地，这类植物部分包含本发明的T-DNA和/或包含按重量计总脂质含量的至少8％(w/w)、更优选地至少10％(w/w)、甚至更优选地至少13％(w/w)的EPA含量。还优选地，按重量计，DHA的含量是植物部分的总脂质含量的至少1.0％、更优选地至少1.5％、甚至更优选地至少2％(w/w)。与野生型相比植物，本发明的植物部分包含含量升高的EPA和/或DHA，或本发明的油或脂质还特别出于饲料目的使用，例如，用于水产养殖饲料，例如，如AU2011289381A和其专利家族成员中所述。
本发明的植物并非必然地必须包含完整的本发明T-DNA。如前所述，通过杂交(或回交)方法，可以将一个株系的任意遗传物质转移至另一个株系。因此，通过应用这类杂交或回交，可以将一个或多个、甚至全部包含于本发明植物(这种植物包含本发明的T-DNA)中的表达盒转移至另一个植物株系，因而丢失例如左边界元件或右边界元件(或二者)和/或间隔区。
因此，本发明还提供植物，所述植物包含与如实施例24中给出的引物杂交的遗传物质。
另外，本发明提供植物，所述植物包含在其遗传物质中插入的异源核酸区段。根据本发明，插入处于下文列出的侧翼区之一中或在一对侧翼区之间。归因于植物间变异性，每个侧翼区可以在至少100nt的连续片段范围内计算时与下文所示的侧翼区差异最多10％，优选地在与100nt具有至少-按渐增同一性百分数更优选-90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98或99％、优选100％同一性的连续片段范围内计算时差异最多5％。甚至更优选地，对于与如下文所给出侧翼区的片段相同的50个连续核苷酸，侧翼区包含至少-按渐增同一性百分数更优选-90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98或99％，优选100％同一性，甚至更多优选，连续相同核苷酸的长度是至少100。
实施例24概述了对该表中所列出每个事件获得的全部基因座的全部侧翼序列。此外，在表176中公开用于特异性检测事件的事件特异性引物和探针。实施例24中描述了使用这些引物和探针的方法。
如实施例中所示，现在已经证明这些侧翼区中的插入导致种子中产生高得令人惊讶的VLC-PUFA，其中这类产生历经多个世代并且在不同生长条件下稳定。因此，与植物基因组的其他位置处的插入相比，在这些插入位置插入其他遗传物质也导致稳定的插入基因高表达。
本发明还涉及建立和优化高效代谢性VLC-PUFA合成途径。为此目的，本发明提供一种用于分析去饱和酶反应特异性的方法，所述方法包括步骤
i)向去饱和酶提供可检测标记的分子，所述分子包含脂肪酸部分和头部基团，
ii)允许去饱和酶在标记的分子上反应，并且
iii)检测去饱和产物。
标记分子优选地是脂肪酸-辅酶A或脂肪酸-磷脂，后者优选地是溶血磷脂酰胆碱结合的脂肪酸。该方法有利地允许通过检测辅酶A结合的脂肪酸是否去饱和和/或磷脂结合的脂肪酸是否去饱和，确定去饱和酶头部基团偏好性或甚至头部基团特异性。
优选地，将去饱和酶作为生物的、优选酵母的微粒体部分提供。表达所讨论的去饱和酶的转基因酵母易于制备和操作，并且可以在没有重大负担的情况下，可靠地和重现地制备包含有功能去饱和酶的微粒体部分。微粒体部分、尤其酵母的、最优选地酿酒酵母的微粒体部分，还允许通过使用酵母的天然LPCAT，将脂肪酸-辅酶A分子转化成与其他头部基团结合的脂肪酸。同样地，微粒体部分可以从其他细胞和生物制备。
优选地，通过包括放射性同位素而不是非放射性同位素，可检测地标记分子。同位素优选地是[14C]。这种标记物易于检测，在生物化学反应中不起到干扰作用并且可以掺入实际上任何含碳的分子中，因而允许灵敏地检测及表征任何去饱和产物。
脂肪酸部分优选地是PUFA部分，更优选地是VLC-PUFA部分并且最优选地是VLC-PUFA部分。以这种方式，可以在不必求助于易错和繁琐的活生物或活细胞饲喂过程情况下确定经济上重要的去饱和酶的头部基团偏好性或特异性。
允许去饱和酶在标记的分子上反应。如果去饱和酶可以接受标记的分子作为底物，则进行去饱和反应。优选地，通过包含已经证实其为去饱和酶之底物的标记分子作为阳性对照，重复该方法。
检测优选地使用色谱法、最优选地薄层色谱法完成。这项技术是技术人员熟知的、轻易可获得的、非常灵敏并允许甚至区分非常相似的分子。因此，即便阳性对照分子类似于目的分子，仍可能明确检测去饱和产物(如果出现分子的去饱和)。
上文方法允许针对每种去饱和酶、微粒体部分类型(例如，来自酵母、植物细胞等)、脂肪酸部分和头部基团编制一组特异性数据。因此，该方法可以用来为给定的需求选择去饱和酶，例如，旨在植物细胞中接受CoA结合型脂肪酸以便进一步呈递给延伸酶。该方法还允许在目的生物或器官(例如，酵母、植物叶细胞或植物种子细胞)中确立去饱和酶的底物特异性。
本发明也提供一种用于分析延伸酶反应特异性的方法，所述方法包括步骤
i)向延伸酶提供可检测标记的延伸底物和待延长的分子，
ii)使用标记的延伸底物，允许延伸酶延长待延长的分子，并且
iii)检测延伸产物。
除非另外声明，否则进行分析延伸酶反应特异性的方法，该方法对应于因相应理由分析去饱和酶反应特异性的方法。延伸底物优选地是丙二酸单酰-CoA。延伸底物优选地经放射性标记，最优选地是[14C]丙二酸单酰-CoA。放射性标记物允许容易和灵敏地检测延伸产物。另外，对延伸底物而非待延长分子的标记，允许呈递待延长分子的混合物至延伸酶，并且仅延伸产物本身将掺入明显量的标记物以令其轻易可检出。因此，在单个反应容器中，可以分析多种潜在的待延长分子以确定这些分子中哪些的确被延长及延伸酶对相应分子的相对亲和力。
通过组合这两种方法，可以甚至分析去饱和反应和延伸反应的复杂序列。本发明因此还提供一种用于途径优化的方法，所述方法包括步骤
i)提供代谢途径的酶和由所述途径的第一酶或酶类使用的一种或多种底物。
ii)使酶和底物反应以产生产物，所述产物转而还作为潜在底物暴露于途径的酶，并且
iii)确定产物的累积。
该方法特别地允许提供去饱和酶和延伸酶以形成某个途径。这可用于确定该途径的产物的产率和任何不想要的副产物的产率。另外，通过提供执行相同代谢功能(例如，特定去饱和步骤，例如，Δ-5去饱和)的两种或更多种不同酶，可以分析多于一个类型的酶存在是否影响产物形成，尤其影响产物形成速率。为了这类分析，将比较采用至少两种酶中仅一种酶进行的方法情况下的结果。因此，如果添加执行相同代谢功能的酶导致产率或产物形成速率增加，则这个代谢步骤受基因剂量效应影响。为了在生物中优化该途径，将相应地尽力使用如需要的两种或更多种酶执行该途径步骤。
另外，该方法有利地允许确定所讨论酶的作用模式。为此目的，提供辅助酶以产生目标酶的底物。辅助酶的作用模式是已知的。随后向辅助酶提供底物，其将转变成产物，所述产物可以用作目标酶的底物。确定产物由目标酶产生，优选地通过测量单位时间的产物量或产物最终量除以辅助酶转化的底物量来确定。随后，使用作用模式不同的辅助酶重复该方法，并且也确定由目标酶产生的产物。通过比较每种作用模式的目标酶的产物产生，将目标酶的作用模式确定为如此辅助酶的作用模式，其导致目标酶最强烈地产生产物。
例如，为了确定目标去饱和酶的作用模式，提供一种辅助延伸酶，其中已知辅助延伸酶利用酰基CoA底物并且产生酰基-CoA产物。随后，测量目标去饱和酶的产物生成。在另一个步骤中，提供辅助去饱和酶，其中已经确定所述辅助去饱和酶产生磷脂酰胆碱结合型脂肪酸。再次，测量目标去饱和酶的产物生成。当比较目标去饱和酶的产物产生时，如果在其中CoA结合型脂肪酸由辅助酶提供的条件下目标去饱和酶的产物产生比其中磷脂酰胆碱结合型脂肪酸由辅助酶提供的条件下更强烈(例如，更高转化效率)，则可以确定目标去饱和酶为CoA依赖性去饱和酶。
因此，本发明还提供一种用于确定目标去饱和酶的CoA依赖性的方法，所述方法包括步骤
i)提供延伸酶以产生目标去饱和酶的底物，并确定目标去饱和酶的转化效率，并且
i)提供非CoA依赖性去饱和酶以产生目标去饱和酶的底物，并确定目标去饱和酶的转化效率，并且
iii)比较步骤i)和ii)的目标去饱和酶转化效率。
如果目标去饱和酶的转化效率在步骤i)中比步骤ii)中更大，则目标去饱和酶是CoA依赖的。当然，两个步骤必须在可比较条件下进行；尤其必须避免目标去饱和酶的底物限制作用。
也可以通过提供使用目标去饱和酶的底物的延伸酶，进行该方法。因此，本发明提供一种用于确定目标去饱和酶的CoA依赖性的方法，所述方法包括步骤
i)提供延伸酶以延长目标去饱和酶的产物，并确定延伸酶的转化效率，
i)提供延伸酶以延长已知为非CoA依赖性的对比去饱和酶的产物，并确定延伸酶的转化效率，
iii)比较步骤i)和ii)的延伸酶转化效率。
如果延伸酶转化效率在步骤i)中比步骤ii)中更高，则目标去饱和酶是CoA依赖的。在不受任何具体理论约束的情况下，目前预计在这种情况下，去饱和产物并非不得不转化成可延长的CoA结合型脂肪酸，因此，去饱和的产物可以由延伸酶立即利用，无累积。当然，两个步骤必须在可比较条件下进行；尤其必须避免延伸酶的底物限制作用。
本发明还涉及包含通过前述方法可获得的多不饱和脂肪酸的油。此外，本发明还涉及包含通过前述方法可获得的多不饱和脂肪酸的脂质或脂肪酸组合物。
术语“油”指包含了酯化成甘油三酯的不饱和/或饱和脂肪酸的脂肪酸混合物。优选地，本发明油中的甘油三酯包含如上文所提及的PUFA部分或VLC-PUFA部分。酯化的PUFA和/或VLC-PUFA的量优选地是大约30％，更优选50％的含量，甚至更优选60％、70％、80％或更多的含量。油还可以包含游离脂肪酸，优选地，上文所提及的PUFA和VLC-PUFA。为了分析，可以通过转酯反应将脂肪酸转化成甲基酯后，例如通过GC分析测定脂肪酸含量。油或脂肪中多种脂肪酸的含量可以变动，尤其根据来源变动。然而，所述油应当在PUFA和/或VLC-PUFA组成和含量方面具有非天然存在的组成。已知植物油中的大部分脂肪酸酯化为三酰甘油酯。因此，在本发明的油中，PUFA和VLC-PUFA优选地还以酯化形式在三酰甘油酯中出现。应当理解，在所述油的甘油三酯中PUFA和VLC-PUFA的这种独特油组成和独特酯化模式仅应当通过采用上文所述的本发明方法才可获得。另外，本发明的油也可以包含其他分子种类。具体而言，它可以包含本发明多核苷酸或载体的少量杂质(并且因此微量)。然而，这仅可以通过高度灵敏的技术如PCR检出。
如上所述，这些油、脂质或脂肪酸组合物优选地包含4至15％的棕榈酸(在一个实施方案中6至15％的棕榈酸)、1％至6％的硬脂酸、7-85％的油酸、0.5％至8％的异油酸、0.1％至1％的花生酸、7％至25％的饱和脂肪酸、8％至85％的单不饱和脂肪酸以及60％至85％的多不饱和脂肪酸，在每种情况下均基于100％和基于生物的总脂肪酸含量(优选地以重量计)。基于总脂肪酸含量(优选地以重量计)，脂肪酸酯或脂肪酸混合物中存在的优选VLC-PUFA优选地是至少5.5％至20％的DHA和/或9.5％至30％的EPA。
基于生产宿主细胞、生物、有利地植物、尤其油料作物如大豆、油菜、椰子、油棕榈、红花、亚麻、大麻、蓖麻、金盏花、花生、可可豆、向日葵或上述其他单子叶或双子叶油料作物的总脂肪酸含量，本发明的油、脂质或脂肪酸优选地包含至少1％、1.5％、2％、3％、4％、5.5％、6％、7％或7.5％、更优选地至少8％、9％、10％、11％或12％并且最优选地至少13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的DHA(优选地以重量计)，或至少5％、8％、9.5％、10％、11％或12％、更优选地至少13％、14％、14.5％、15％或16％并且最优选地至少17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％的EPA(优选地以重量计)。基于生产宿主细胞、生物、有利地植物、尤其油料作物如大豆、油菜、椰子、油棕榈、红花、亚麻、大麻、蓖麻、金盏花、花生、可可豆、向日葵或上述其他单子叶或双子叶油料作物的总脂肪酸含量，本发明的油、脂质或脂肪酸优选地包含至少1％的DHA，和/或至少8％的EPA。
优选地，本发明的油、脂类或脂肪酸组合物是植物油、植物脂质或植物脂肪酸组合物。优选地，从植物，更优选地从一株植物或多株植物(尤其本发明的一株植物或多株植物)的种子提取、获得、可获得或产生油或脂质。油或脂质因此可以通过本发明的方法获得。特别地，植物油或植物脂质是提取的植物油或脂质。还优选地，从植物、更优选地从一株植物或多株植物(尤其本发明的一株植物或多株植物)的批次种子或整装种子提取、获得、可获得或产生所述油或脂质。
优选地，与油或脂质相关的术语“提取”指油或脂质已经从植物，尤其从一株植物或多株植物的种子提取。更优选地，与油或脂质相关的术语“提取”指油或脂质已经从植物，尤其从一株植物或多株植物的批次种子或整装种子提取。这种油或脂质可以是粗制组合物。但是，它还可以是其中例如已经移除水的纯化油或脂质。在一个实施方案中，油或脂质不与来自其他来源的脂肪酸掺合。
本发明的油或脂质还可以是植物种子中的油或脂质。优选地，所述植物是转基因植物。更优选地，所述植物是本发明的植物。在一个具体的优选实施方案中，植物是芸苔属植物。
本发明的油或脂质应当包含脂肪酸。特别地，油或脂质应当包含酯化形式的脂肪酸。因此，脂肪酸应当酯化。优选地，本发明的油或脂质包含一种或多种以下脂肪酸(处于酯化形式)：油酸(OA)、亚油酸(LA)、γ-亚麻酸(GLA)、α-亚麻酸(ALA)、硬脂艾杜糖酸(SDA)、20：2n-9((Z，Z)-8，11-二十碳二烯酸)、米德酸(20：3n-9)、二高-γ-亚麻酸(DHGLA)、二十碳五烯酸(花生五烯酸，EPA，20：5n-3)、鰶鱼酸(DPA n-3)和DHA((Z，Z，Z，Z，Z，Z)-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸)。更优选地，油或脂质包含EPA、DHA和米德酸。甚至更优选地，油或脂质包含EPA、DHA、米德酸、DPA n-3和DHGLA。最优选地，油或脂质包含这个段落中提到的脂肪酸。
尤其构思本发明的油或脂质包含EPA和DHA。本文他处给出EPA和DHA的优选含量。
另外，构思油或脂质包含EPA、DHA和DPA n-3。在一个实施方案中，油或脂质还包含米德酸。
另外，构思油或脂质包含EPA、DHA和DHGLA。在一个实施方案中，油或脂质还包含米德酸。
此外，油或脂质可以包含EPA、DHA、DPA n-3和DHGLA。在一个实施方案中，油或脂质还包含米德酸。
因此，与对照植物相比，本发明的表达盒、构建体或T-DNA可以用于调节、尤其增加植物中、种子中和/或植物的种子油中一种或多种前述脂肪酸的含量。
下文进一步描述前述脂肪酸在本发明脂质或油的总脂肪酸含量中的优选含量。在下文，给出含量的范围。脂肪酸的含量(水平)表述为全部脂肪酸的总重量的百分数(特定脂肪酸的重量的百分数)、尤其油或脂质中存在的全部脂肪酸的总重量的百分数。因此，含量优选地作为油或脂质中存在的总脂肪酸的重量百分数给出(％w/w))。因此，“％”优选地意指“与脂肪酸的总重量相比某脂肪酸(或脂肪酸组合)的％(w/w)”。
优选地，脂肪酸以酯化形式存在。因此，脂肪酸应当是酯化的脂肪酸。
优选地，油或脂质包含油酸(OA)。优选地，油酸(OA)的含量在总脂肪酸含量的10％和45％之间、更优选地在20％和38％之间、最优选地在26％和32％之间。
优选地，油或脂质包含亚油酸(LA)。优选地，亚油酸(LA)的含量在总脂肪酸含量的5％和40％之间、更优选地在10％和40％之间、最优选地在20％和35％之间。
优选地，油或脂质包含γ-亚麻酸(GLA)。优选地，γ-亚麻酸(GLA)含量在总脂肪酸含量的0.1％和6％之间、更优选地在0.1％和3％之间、最优选地在0.5％和2％之间。
优选地，油或脂质包含α-亚麻酸(ALA)。优选地，α-亚麻酸(ALA)的含量在总脂肪酸含量的2％和20％之间、更优选地在4％和10％之间、最优选地在4％和7％之间。
优选地，油或脂质包含硬脂艾杜糖酸(SDA)。优选地，硬脂艾杜糖酸(SDA)的含量在总脂肪酸含量的0.1％和10％之间、更优选地在0.1％和5％之间、最优选地在0.1％和1％之间。
SDA的含量令人惊讶地低。在一个实施方案中，SDA的含量低于2％、尤其低于1％。
优选地，油或脂质包含20：2n-9。优选地，20：2n-9((Z，Z)-8，11-二十碳二烯酸)的含量在总脂肪酸含量的0.1％和3％之间、更优选地在0.1％和2％之间、最优选地在0.1％和1％之间。
优选地，油或脂质包含米德酸(20：3n-9)。优选地，米德酸(20：3n-9)的含量在总脂肪酸含量的0.1％和2％之间、更优选地在0.1％和1％之间、最优选地在0.1％和0.5％之间。在另一个实施方案中，米德酸(20：3n-9)的含量在总脂肪酸含量0.1％和0.3％之间
优选地，油或脂质包含二高-γ-亚麻酸(DHGLA)。优选地，二高-γ-亚麻酸(DHGLA)的含量在总脂肪酸含量的0.1％和10％之间、更优选地在1％和6％之间、最优选地在1％和5％之间、尤其在2％和4％之间。这种中间体的累积并非必然预期。
优选地，油或脂质包含EPA(20：5n-3)。优选地，二十碳五烯酸(二十碳五烯酸(timnodonic acid)，EPA，20：5n-3)的含量在总脂肪酸含量的0.1％和20％之间、更优选地2％和15％之间、最优选地5％和10％之间。
另外，构思EPA的含量在总脂肪酸含量的5％和15％之间。
优选地，油或脂质包含鰶鱼酸(DPA n-3)。优选地，鰶鱼酸(DPA n-3)的含量在总脂肪酸含量的0.1％和10％之间、更优选地在1％和6％之间、最优选地在2％和4％之间。此外，DPA n-3的含量可以是总脂肪酸的至少2％。
优选地，油或脂质包含DHA。优选地，DHA的含量在总脂肪酸含量的1％和10％之间、更优选地在1％和4％之间、最优选地在1％和2％之间。
另外，构思DHA的含量在总脂肪酸含量的1％和3％之间。
在一个优选实施方案中，本发明的油或脂质具有在总脂肪酸含量的1％和4％之间的DHA含量和在2％和15％之间的EPA含量。在另一个优选实施方案中，本发明的油或脂质具有在总脂肪酸含量的1％和3％之间的DHA含量和在5％和15％之间的EPA含量。
在另一个优选实施方案中，本发明的油或脂质具有在总脂肪酸含量的1％和2％之间的DHA含量和在5％和10％之间的EPA含量。
本发明的油或脂质还可以包含饱和脂肪酸如16：0(棕榈酸)和/或18：0(硬脂酸)。如与野生型植物相比，16：0和18：0的含量有利地低。从健康的角度看，低级饱和脂肪是有利特征。
因此，油或脂质可以包含16：0。优选地，16：0的含量是低于总脂肪酸含量的6％。更优选地，16：0的含量在总脂肪酸含量的3％和6％之间。
因此，油或脂质可以包含18：0。优选地，18：0的含量小于总脂肪酸含量的4％、尤其小于3％。更优选地，18：0的含量在总脂肪酸含量的1.5％和4％之间、尤其在2％和3％之间。
在本发明油或脂质的一个实施方案中，EPA、DHA和DPA n-3的总含量优选地多于油或脂质中存在的全部脂肪酸的6％并且SDA的含量低于其2％。更优选地，EPA、DHA、和DPA n-3的含量在油或脂质中存在的全部脂肪酸的7％和14％之间并且SDA的含量低于其1％。
在本发明油或脂质的另一个优选实施方案中，DPA n-3的含量优选地是总脂肪酸含量的至少2％，并且EPA和DHA的总含量是总脂肪酸含量的至少3％。更优选地，DPA n-3的含量在油或脂质中存在的全部脂肪酸的2％和5％之间，并且EPA和DHA的总含量在其6％和12％之间。
在本发明油或脂质的另一个优选实施方案中，16：0的含量优选地低于总脂肪酸含量的6％，并且EPA和DHA的总含量是总脂肪酸含量的至少3％。更优选地，16：0的含量在油或脂质中存在的全部脂肪酸的2％和6％之间，并且EPA和DHA的总含量在其6％和12％之间。
在本发明油或脂质的另一个优选实施方案中，16：0的含量优选地低于总脂肪酸含量的5％，并且EPA、DHA、DPA n-3的总含量是总脂肪酸含量的至少6％。更优选地，16：0的含量在油或脂质中存在的全部脂肪酸的2％和5％之间，并且EPA、DHA和DPA的总含量在其8％和14％之间。
有意义地，种子中、尤其种子油中总脂肪酸的EPA含量大于DHA含量。这并非总是如此；参见例如US2015/0299676A1和WO 2015/089587。因此，尤其构思本发明的油和脂质包含比DHA更多的EPA。因此，EPA的含量应当大于DHA的含量。优选地，总脂肪酸酸含量中EPA含量是总脂肪酸含量中DHA含量的3至7倍。更优选地，总脂肪酸酸含量中EPA含量是总脂肪酸含量中DHA含量的4至5倍。
优选地，全部ω-3多不饱和[n-3(C18-C22)]脂肪酸的总含量在总脂肪酸含量的1％和40％之间、更优选地在10％和30％之间、最优选地在15％和22％之间。
还优选地，全部ω-6多不饱和[n-6(C18-C22)]脂肪酸的总含量在总脂肪酸含量的0.1％和50％之间、更优选地在20％和50％之间、最优选地在37％和42％之间。
本发明的油或脂质可以包含这样的脂肪酸，所述脂肪酸在野生型对照欧洲油菜脂质或油中非天然存在、优选地大于总脂肪酸含量的10％、更优选地在12％和25.2％之间并且最优选地在16％和25.0％之间。优选地，非天然存在的脂肪酸是18：2n-9、GLA、SDA、20：2n-9、20：3n-9、20：3n-6、20：4n-6、22：2n-6、22：5n-6、22：4n-3、22：5n-3和22：6n-3。因此，这些脂肪酸在本发明油或脂质中的总含量优选地大于总脂肪酸含量的10％、更优选地在12％和25.2％之间并且最优选地在16％和25.0％之间
在实施例32中，显示在本发明植物的种子中(尤其从本发明植物提取的种子油中)，某些TAG(三酰甘油酯)种类减少并且某些TAG种类增加。
野生型Kumilly植物中五种最丰富的TAG(三酰甘油酯)种类是TAG(18：1 18：1 18：3)、TAG(18：1 18：2 18：3)、TAG(18：1 18：1 18：2)、TAG(18：1 18：1 18：1)和(TAG 18：1 18：2 18：2)。总计，这些种类占(在野生型植物油中)全部TAG种类的64.5％。这些种类在本发明的植物中特异性减少(参见实施例32、表192)。转基因卡诺拉油菜样品中二种最丰富的含有DHA的TAG种类是TAG(18：1 18：2 22：6)和TAG(18：2 18：2 22：6)。有意义地，发现EPA和DHA连同18：1和18：2最频繁与TAG酯化。这种组成可能比含有多种PUFA的TAG种类在氧化上更稳定(参见Wijesundra 2008，Lipid Technology 20(9)：199-202)。关于更多细节，参见实施例32和表192。
本发明的油或脂质因此可以包含某些TAG种类。优选地，油或脂质包含以下一个或多个TAG种类：TAG(18：1 18：2 20：5)、TAG(18：1 18：1 20：5)、TAG(18：2 18：2 20：5)、TAG(18：1 18：2 22：6)和TAG(18：2 18：2 22：6)。更优选地，本发明的油或脂质包含全部前述的TAG种类。备选地或额外地，本发明的油或脂质可以包含TAG(18：1 18：1 22：6)。
本文所用的三酰甘油酯命名是本领域熟知的并且由技术人员充分理解。三酰甘油酯TAG(x1：y1 x2：y2 x3：y3)优选地代表意指包含三个脂肪酸酯残基的三酰甘油酯，其中一个脂肪酸酯残基是x1：y1，其意指这个残基包含x1碳原子和y1双键，其中一个脂肪酸酯残基是x2：y2，其意指这个残基包含x2碳原子和y2双键，并且其中一个脂肪酸酯残基是x3：y3，其意指这个残基包含x3碳原子和y3双键。优选地，任何的这些脂肪酸酯残基可以接合至甘油的任何前羟基(former hydroxyl groups)。
下文进一步描述本发明脂质或油的总TAG含量中前述TAG种类的优选含量。在下文，给出含量的范围。TAG含量(水平)表述为(油或脂质中存在的)总TAG(全部TAG)的总重量的百分数(特定TAG或TAG组合物的重量)。因此，含量优选地作为重量百分数给出(％(w/w))。因此，“％”优选地意指“与TAG的总重量相比某TAG(或TAG组合)的％(w/w)”。
优选地，油或脂质包含TAG(18：1 18：2 20：5)。优选地，TAG(18：1 18：2 20：5)的含量在总TAG含量的0.1％和20％之间、更优选地在5％和15％之间、最优选地在7％和12％之间。
如上述，油或脂质优选地包含TAG(18：1 18：1 20：5)。优选地，TAG(18：1 18：1 20：5)的含量在总TAG含量的1.5％和15％之间、更优选地在2％和10％之间、最优选地在4％和7.6％之间。
如上述，油或脂质优选地包含TAG(18：2 18：2 20：5)。优选地，TAG(18：2 18：2 20：5)的含量在总TAG含量的3％和20％之间、更优选地在3％和15％之间、最优选地在3.5％和9％之间。
还优选地，TAG(18：1 18：2 20：5)、TAG(18：1 18：1 20：5)和TAG(18：2 18：2 20：5)的含量总和，即这三个TAG种类的合并含量，在总TAG含量的5％和55％之间、更优选地在10％和45％之间、最优选地在20％和26％之间。
因此，最丰富的TAG种类是含有酯化EPA的那些。出于某些健康理由，EPA比DHA更好。
如上述，油或脂质优选地包含TAG(18：1 18：2 22：6)。优选地，TAG(18：1 18：2 22：6)的含量在总TAG含量的0.1％和15％之间、更优选地在0.1％和10％之间、最优选地在0.5％和3％之间。
如上述，油或脂质优选地包含TAG(18：2 18：2 22：6)。优选地，TAG(18：2 18：2 22：6)的含量在总TAG含量的0.1％和15％之间、更优选地在0.1％和10％之间、最优选地在0.5％和2％之间。
如上述，油或脂质优选地包含TAG(18：1 18：1 22：6)。优选地，TAG(18：1 18：1 22：6)的含量在总TAG含量的0.1％和15％之间、更优选地在0.1％和10％之间、最优选地在0.3％和1％之间。
还优选地，TAG(18：1 18：2 22：6)、TAG(18：2 18：2 22：6)和TAG(18：1 18：1 22：6)的含量总和，即这三个TAG种类的合并含量，在总TAG含量的0.3％和45％之间、更优选地在1％和30％之间、最优选地在1％和5％之间。
本发明的油或脂质还可以包含TAG(18：3 18：3 20：5)和/或TAG(18：3 18：3 22：6)。如可以从例子见到，观察到这些TAG种类的低丰度(参见表192)。低丰度可以具有氧化稳定性益处。
优选地，TAG(18：3 18：3 20：5)的含量在总TAG含量的0.1％和2％之间、更优选地在0.1％和1％之间、最优选地在0.1％和0.5％之间。
优选地，TAG(18：3 18：3 22：6)的含量在总TAG含量的0.03％和2％之间、更优选地在0.03％和1％之间、最优选地在0.03％和0.5％之间。另外，构思了TAG(18：3 18：3 22：6)的含量在总TAG含量的0.03％和0.2％之间。
如上述，野生型Kumily植物中最丰富的TAG种类是TAG(18：1 18：1 18：3)、TAG(18：1 18：2 18：3)、TAG(18：1 18：1 18：2)、TAG(18：1 18：1 18：1)和(TAG 18：1 18：2 18：2)。如与野生型油相比，来自转基因芸薹属植物的种子油中这些种类的含量有利地减少。油中未检出这些种类之一TAG(18：1 18：1 18：3)。
因此，本发明的油或脂质还可以具有以下一个或多个特征：
如上述，油或脂质优选地包含TAG(18：1 18：1 18：3)。优选地，TAG(18：1 18：1 18：3)的含量在总TAG含量的0％和10％之间、更优选地在0％和5％之间、最优选地在0％和3％之间。
还优选地，总TAG含量的TAG(18：1 18：1 18：3)的含量可以低于3％、尤其低于1％。
如上述，油或脂质优选地包含TAG(18：1 18：2 18：3)。优选地，TAG(18：1 18：2 18：3)的含量在总TAG含量的3％和19％之间、更优选地在4％和18％之间、最优选地在4％和7％之间。
还优选地，总TAG含量的TAG(18：1 18：2 18：3)的含量可以低于7％。
如上述，油或脂质优选地包含TAG(18：1 18：1 18：2)。优选地，TAG(18：1 18：1 18：2)的含量在总TAG含量的1％和10％之间、更优选地在2％和10％之间、最优选地在2％和5％之间。
还优选地，总TAG含量的TAG(18：1 18：1 18：2)的含量可以低于5％。
如上述，油或脂质优选地包含TAG(18：1 18：1 18：1)。优选地，TAG(18：1 18：1 18：1)的含量在总TAG含量的0.1％和8％之间、更优选地在0.5％和5％之间、最优选地在1％和3％之间。
还优选地，总TAG含量的TAG(18：1 18：1 18：1)的含量可以低于3％。
如上述，油或脂质优选地包含TAG(18：1 18：2 18：2)。优选地，TAG(18：1 18：2 18：2)的含量在总TAG含量的0.1％和13％之间、更优选地在3％和11％之间、最优选地在4％和10％之间。
还优选地，总TAG含量的TAG(18：1 18：2 18：2)的含量可以低于10％。
还优选地，TAG(18：1 18：1 18：3)、TAG(18：1 18：2 18：3)、TAG(18：1 18：1 18：2)和TAG(18：1 18：1 18：1)、TAG(18：1 18：2 18：2)的总含量并且因此其含量总和在总TAG含量的5％和50％之间、更优选地在10％和30％之间、最优选地在14％和22％之间。在一个实施方案中，总TAG含量中前述TAG种类的总含量低于总TAG含量的21.2％。
如可以从实施例32导出，发现EPA和DHA连同18：1和/或18：2最频繁与TAG酯化。这些脂肪酸组合是有利的，因为它们比具有多于一个PUFA的TAG种类在氧化上更稳定。在本发明油或脂质的一个优选实施方案中，油或脂质中包含的总TAG种类中少于21％含有多于一个EPA、DPA、和DHA n-3残基。
本发明的油或脂质包含TAG(三酰甘油酯)、DAG(二酰甘油酯)和DAG(二酰甘油酯)。如所述，在本发明植物的种子中(尤其本发明植物的种子油中)某些TAG(三酰甘油酯)种类减少并且某些TAG种类增加。此外，在本发明植物的种子中(尤其本发明植物的种子油中)某些MAG和DAG种类减少并且某些MAG和DAG种类增加。
例如，实施例显示，DAG中比MAG中存在更多的酯化EPA和DHA。因此，构思DAG中的酯化EPA和DHA含量(相对于DAG中总酯化脂肪酸含量)大于MAG中的酯化EPA和DHA含量(相对于MAG中总酯化脂肪酸含量)。优选地，DAG中的酯化EPA和DHA含量(相对于DAG中总酯化脂肪酸含量)对MAG中的酯化EPA和DHA含量(相对于MAG中总酯化脂肪酸含量)的比率是约1.5。
另外，实施例显示DHA在磷脂酰胆碱(PC)部分中积累。认为这通过表达磷脂依赖性和CoA依赖性d4Des实现。它可能是有利的，原因是认为磷脂中的DHA更轻易可消化。
优选地，本发明油或脂质的磷脂酰胆碱(PC)部分中的DHA含量在PC部分的总脂肪酸含量的2％和12％之间、更优选地在2％和10％之间、最优选地在5％和9％之间(优选地％(w/w)。
另外，构思本发明油或脂质的PC部分中DHA含量对TAG部分中含量的比率大于1。
此外，奠定本发明的研究显示，PC和PE(磷脂酰乙醇胺)部分中DHA对DPA n-3的比率比中性脂质部分(MAG、DAG和TAG)中更高，参见实施例30。这令PC部分和PE部分可能更有价值。在本发明油或脂质的一个实施方案中，PC和PE部分中全部脂肪酸的DHA含量对PC和PE部分中全部脂肪酸的DPA n-3含量的比率大于MAG、DAG和/或TAG部分中全部脂肪酸的DHA含量对MAG、DAG和/或TAG部分中全部脂肪酸的DPA n-3含量的比率。
另外，构思本发明油或脂质中磷脂部分中的DHA量大于磷脂部分中的EPA量。另外，构思本发明油或脂质中TAG部分中的EPA量应当大于TAG级分中的DHA量。这个段落中“量”优选地意指绝对量。
实施例31显示含有EPA或DHA的丰富PC(磷脂酰胆碱)种类是PC(18：2 22：6)和PC(18：2 20：5)。这种PUFA的大部分与18：2组合，这比它们与18：3或另一种PUFA组合时更稳定。
因此，本发明的油或脂质优选地包含PC(18：2 22：6)、PC(18：2 20：5)或二者。下文给出本发明油或脂质中各种类的优选含量。种类的含量(水平)表述为(油或脂质中存在的)总PC(即，全部PC)的总重量的百分数(特定种类的重量)。因此，含量优选地作为重量百分数给出(％(w/w))。因此，“％”优选地意指“与PC的总重量相比某PC(或PC组合)的％(w/w)”。
优选地，PC(18：2 20：5)的含量在总磷脂酰胆碱含量的2.5％和15％之间、更优选地在2.5％和12％之间、最优选地在3％和10％之间。还优选地，这个种类的含量是至少3％。
优选地，PC(18：2 22：6)的含量在总磷脂酰胆碱含量的0.5％和10％之间、更优选地在1％和7％之间、最优选地在1％和6％之间。还优选地，这个种类的含量是至少1.4％。
本发明还涉及包含种子的植物，所述种子包含本发明的油。另外，本发明涉及包含本发明油的种子。上文描述了优选的植物物种。优选地，植物和种子包含如本发明内容中所述的一个或多个多核苷酸、表达盒、T-DNA和/或构建体。
本发明还涉及本发明植物的种子、尤其涉及整装种子。种子应当含有本发明的油或脂质。
此外，如实施例中所示，确定来自事件LBFGKN的整装种子具有25.7mg EPA+DHA/g种子并且确定来自事件LBFDAU的整装种子有47.4mg EPA+DHA/g种子。因此，本发明涉及种子、尤其芸苔属植物种子，其中1g种子包含至少10mg、尤其至少20mg的EPA和DHA合并含量。另外，构思1g本发明的种子包含优选地15至75mg、更优选地20至60mg和最优选地25至50mg的EPA和DHA合并含量。
优选地，本发明的种子包含至少一个本发明T-DNA。因此，构思所述种子均是转基因的。
本发明还涉及从本发明种子、尤其从本发明的整装种子产生的种子粗粉和种子饼粕。
有意义地，在奠定本发明的研究背景下产生的种子具有比预期更高的产率和更大的种子油含量(参见，例如，实施例18，表152和表153中的EPA/DHA和表154中的油)。转基因种子油中不饱和延伸的程度相对于对照增加。为了实现这些增加，引入的去饱和酶和延伸酶与对照相比消耗额外的ATP和NADH。因此，我们引入的去饱和酶和延伸酶与从头脂肪酸和油合成直接竞争，后者也需要ATP和NADH(每次伸长需要二个NADH和一个ATP，并且每次去饱和需要一个NADH)。另外，提供丙二酸单酰-CoA以延长脂肪酸导致CO2形式的碳损耗(参见Schwender等人2004Nature 432：779-782)。因此，我们预计产率或含油量因NADH、ATP消耗增加和CO2损耗增加而较低。但是，我们产生了含有高含量EPA和DHA的种子，所述种子相对于对照在产率或含油量方面没有差异(参见实施例18和表154)。例如，产生了含有EPA/DHA和多于38.2％油的种子。这是未预计的，原因是观察到油和PUFA含量之间的负相关(参见实施例)。因此，本发明的种子和本发明植物的种子优选地具有至少38％的种子含油量、更优选地，这些种子具有38％至42％、尤其38％至40％的种子含油量。优选地，种子含油量表述为种子总重量的油重量百分数。还优选地，在下述植物中产生种子油，所述植物具有田间栽培时与对照植物并无不同的种子产量。
本发明的植物、优选地是转基因欧洲油菜植物。如本文他处描述，植物应当同时产生EPA和DHA。构思来自整装种子的油含有多于12％非天然存在的PUFA。因此，非天然存在的脂肪酸的含量应当多于总脂肪酸含量的12％。在另一个实施方案中，来自整装种子的油含有多于16％非天然存在的PUFA。在另一个实施方案中，来自整装种子的油含有多于18％非天然存在的PUFA。表达“非天然存在的”优选地指在野生型芸苔属植物中不天然存在的PUFA。优选地，所述非天然存在的PUFA是18：2n-9、GLA、SDA、20：2n-9、20：3n-9、20：3n-6、20：4n-6、22：2n-6、22：5n-6、22：4n-3、22：5n-3和22：6n-3。尽管这些PUFA不天然地出现在芸苔属植物中，然而它们可以出现在其他的非转基因生物中。
在本发明植物的一个实施方案中，转基因植物的每个T-DNA拷贝历经多个世代稳定，如通过T-DNA上三个或更多个位置处的拷贝数分析所确定。在本发明植物的一个实施方案中，插入欧洲油菜植物中的转基因构建体具有拷贝数1或2。因此，本发明T-DNA的一个或两个拷贝应当存在于植物中。在本发明植物的一个优选实施方案中，插入欧洲油菜植物中的转基因构建体具有拷贝数1。优选地，全部插入的转基因均完整发挥作用(因此，由这些基因编码的酶应当保留其功能)。优选地，遗传性插入远离任何内源性基因＞5000碱基对存在。在一个实施方案中，该距离从左边界和右边界的末端度量。
优选地，本发明的植物、尤其所描述的在使用方法中使用的植物产生含有EPA和DHA的油。油已经在本文他处详细描述。在一个实施方案中，油包含如上文所述的非天然存在的PUFA。
产生油的方法可以包括如下步骤：培育本发明的植物，从而获得其含油种子，收获所述种子并从所述种子提取油。
本发明进一步构思一种油，所述油含有由上文描述的植物产生的EPA和DHA。
本发明的又一个实施方案是油、脂质、脂肪酸和/或脂肪酸组合物在饲料原料、食品原料、膳食供应、化妆品或药物组合物中如下文详述的用途。本发明的油、脂质、脂肪酸或脂肪酸混合物可以用于与动物源的其他油、脂质、脂肪酸或脂肪酸混合物(例如，鱼油)混合。
本发明因此构思饲料原料、食品原料和膳食供应。在一个实施方案中，饲料原料、食品原料和饮食供应包含本发明的植物、本发明植物的部分、尤其种子或种子、和/或本发明的油或脂质。
在一个实施方案中，饲料原料、食品原料和饮食供应包含从本发明植物、尤其从本发明植物的种子产生的种子饼粕(seedcake)或种子粕(seedmeal)。因此，本发明还涉及从本发明植物、尤其从本发明植物的种子产生的种子饼粕或种子粕。在一个实施方案中，种子粕或种子饼粕包含至少一个本发明T-DNA。
饲料原料、食品原料和饮食供应可以包含从本发明植物(或从其部份、尤其从种子)产生的脂肪酸酯或脂肪酸。
本发明的饲料原料可以用于水产养殖。使用该饲料原料将允许增加鱼类中VLC-PUFA的含量。在一个实施方案中，鱼是鲑鱼。
术语“组合物”指以固体、液体或气体形式配制的任何组合物。所述组合物包含例如本发明的化合物，任选地连同合适的辅助化合物如稀释剂或载体或其他成分。在这种语境下，对于本发明，在辅助化合物(即当施加组合物用于其所需目的时并不有助于本发明化合物所产生的作用的化合物)和其他成分(即有助于本发明化合物的又一种作用或调节其作用的化合物)之间可区分。合适的稀释剂和/或载体取决于组合物待使用的目的和其它成分。本领域技术人员可以在不过度费力的情况下确定这类合适的稀释剂和/或载体。合适的载体和/或稀释剂的例子是本领域熟知的并且包括盐水溶液，如缓冲剂、水、乳液如油/水乳液，各种类型润湿剂等。
在含油、含脂肪酸或含脂质的组合物的一个更优选的实施方案中，所述组合物进一步配制为药物组合物、化妆品组合物、食品原料、饲料原料、优选地鱼饲料或膳食供应。
如本文所用的术语“药物组合物”包含本发明的化合物和任选地一种或多种可药用载体。本发明的化合物可以配制为可药用盐。可接受的盐包括乙酸盐、甲酯、Hel、硫酸盐、氯化物等。药物组合物优选地局部或全身施用。常规用于药物施用的合适施用途径是口服、静脉内或肠胃外施用以及吸入。但是，取决于化合物的性质和作用模式，药物组合物也可以通过其他途径施用。例如，多核苷酸化合物可以在基因治疗方法中通过使用病毒载体或病毒或脂质体施用。
另外，化合物可以在常见的药物组合物中或作为分立的药物组合物与其他药物组合施用，其中所述分立的药物组合物可以按组分试剂盒形式提供。优选地在常规剂型中施用化合物，所述常规剂型通过将药物与标准药用载体根据常规程序组合而制备。(如果适宜)所需制品的这些程序可以涉及混合、造粒和压制或溶解这些成分。将可以理解，可药用载体或稀释剂的形式和特征由与它待组合的有效成分的量、施用途径和其他熟知变量决定。载体必须在兼容于制剂的其他成分的意义上是可接受的并且无损于其接受者。使用的药用载体可以例如是固体、凝胶或液体。示例性固态载体是乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、阿位伯树胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。液态载体的示例是磷酸盐缓冲盐水溶液、糖浆、油如花生油和橄榄油、水、乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。类似地，载体或稀释剂可以包括本领域熟知的延时材料，如单独或连同蜡一起的甘油基单硬脂酸酯或二硬脂酸甘油酯。所述合适的载体包括上文提到的那些和本领域熟知的其他，参见，例如，Remington＇s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania。稀释剂如此选择，从而不影响组合的生物学活性。这类稀释剂的例子是蒸馏水、生理盐水、林格液、右旋糖溶液和Hank溶液。此外，药物组合物或制剂还可以包含其他载体、辅助剂或无毒、无治疗性、无免疫原性稳定剂等。治疗有效剂量指在本发明药物组合物中待使用的化合物的量，所述量预防、改善或治疗本说明书中提到的疾病或病状的症状。可以在细胞培养物或实验动物中通过标准药学方法确定这类化合物的治疗功效和毒性，例如，ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)和LD50(对群体的50％致死的剂量)。治疗作用和毒性作用之间的剂量比是治疗指数并且它可以表述为LD50/ED50比。剂量方案将由主治医生和其他临床因素决定；优选地根据任一个上述方法决定。如医学领域中熟知，针对任一位患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体格大小、身体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、总体健康状况和正在共同施用的其他药物。可以通过定期评定监测进展。常见的剂量可以例如在1至1000μg范围内；然而，构思低于或高于这个示例性范围的剂量，尤其考虑前述因素情况下。但是，取决于受试者和施用模式，施用的物质的量可以在宽范围内变动。施用本文中提及的药物组合物和制剂至少一次，以治疗或改善或预防本说明书中所述的疾病或病状。但是，可以施用所述药物组合物多于一次，例如从每日1次至4次直至不限制的天数。特定药物组合物以制药领域熟知的方式配制并且包含在混合物中或否则与可药用载体或稀释剂结合的上文提到的至少一种活性化合物。为了产生这些特定药物组合物，通常将活性化合物与载体或稀释剂混合，或在胶囊、小袋、扁囊剂、纸或其他合适的容器或溶媒中封闭或包囊化。所产生的制剂将是适应于施用模式，即处于片剂、胶囊剂、栓剂、溶液剂、混悬剂形式等。剂量推荐应当在处方者或使用者说明中指示，旨在根据考虑的受者预计剂量调整。
术语“化妆品组合物”指如对上文药物组合物描述那样配制的组合物。同样地，对于化妆品组合物，构思本发明的化合物还优选地以基本上纯的形式使用。然而相比较于药物组合物，杂质可能相对较不重要。化妆品组合物优选地待局部施加。
可以将包含本发明化合物的优选的化妆品组合物配制为护发组合物、生发组合物、洗发剂、粉剂、胶浆剂(jelly)、发淋洗剂、软膏剂、发洗剂、糊剂、发乳膏剂、发胶和/或发用气溶胶。
下文实施例部分中详述的三个事件的种子已经依据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条款保藏在ATCC，即事件“LBFLFK”＝ATCC名称“PTA-121703”的种子、事件“LBFDHG”＝ATCC命名“PTA-121704”的种子和事件“LBFDAU”＝ATCC名称“PTA-122340”的种子。申请人无权放弃法律对生物材料转让或其商业运输所施加的任何限制。申请人不放弃任何侵犯其以下权利之行为的起诉：根据本专利授予的权利或根据植物品种保护法(7 USC 2321 et seq.)适用于已保藏事件的权利，禁止未授权的种子繁殖。这种种子可以根据国家法律监管。种子的保藏仅出于方便本领域技术人员而进行并且不构成或暗示以下的任何供认、承认、声明或断言：要求保藏的种子以充分描述本发明、以充分能够实现本发明或实施本发明或其任何部分或方面。另外，种子的保藏不构成或暗示将本发明任何方法的应用限于该种子的应用或该种子中所含任何材料(例如，核酸、蛋白质或这种核酸或蛋白质的任何片段)的应用的任何建议。
保藏的种子衍生自经具有如SEQ ID NO：3中所示序列的T-DNA载体转化的植物。
本文中更详细地描述事件LBFLFK和LBFDAU。在一个实施方案中，本发明的植物包含由LBFLFK和LBFDAU组成的T-DNA、优选地在基因组的该位置处包含(如在植物中命名为LBFLFK和LBFDA)。
在一个实施方案中，本发明因此提供包含作为ATCC名称“PTA-121703”保藏的转基因芸苔属事件LBFLFK的芸苔属植物。芸苔属事件LBFLFK含有双元T-质粒VC-LTM593-1qczrc的T-DNA的两个插入，所述插入命名为LBFLFK基因座1和LBFLFK基因座2。这个实施方案的芸苔属植物包括与芸苔属事件LBFLFK不可区分(至这样的程度，从而这种后代还含有至少一个与LBKLFK基因座1和/或LBFLFK基因座2相对应的等位基因)的后代。这个实施方案的芸苔属植物包含相对于每种LBFLFK插入的独特基因组DNA/转基因接头点和因此独特的接头区域：LBFLFK基因座1的接头区域具有至少SEQ ID NO：282的多核苷酸序列或至少SEQ IDNO：283的多核苷酸序列，并且LBFLFK基因座2的接头区域具有至少SEQ ID NO：291的多核苷酸序列或至少SEQ ID NO：292的多核苷酸序列。在这个实施方案中还包括从芸苔属事件LBFLFK及其后代衍生的种子、植物部分、植物细胞和植物产物。在另一个实施方案中，本发明提供从芸苔属事件LBFLFK和/或其后代产生的商品产物，包括卡诺拉油菜油和粗粉。
在另一个实施方案中，本发明提供包含作为ATCC名称“PTA-122340”保藏的转基因芸苔属事件LBFDAU的芸苔属植物。芸苔属事件LBFDAU含有双元T-质粒VC-LTM593-1qcz rc的T-DNA的两个插入，这些插入命名为LBFDAU基因座1和/或LBFDAU基因座2。这个实施方案的芸苔属植物包括其与芸苔属事件LBFDAU不可区分(至这样的程度，从而这种后代还含有至少一个与插入的转基因DNA相对应的等位基因)的后代。这个实施方案的芸苔属植物包含相对于每种LBFDAU插入的独特基因组DNA/转基因接头点和因此两个独特的接头区域：LBFDAU基因座1的接头区域具有至少SEQ ID NO：300的多核苷酸序列或至少SEQ ID NO：301的多核苷酸序列，并且LBFDAU基因座2的接头区域具有至少SEQ ID NO：309的多核苷酸序列或至少SEQ ID NO：310的多核苷酸序列。在这个实施方案中还包括从芸苔属事件LBFDAU及其后代衍生的种子、植物部分、植物细胞和植物产物。在另一个实施方案中，本发明提供从芸苔属事件LBFDAU和/或其后代产生的商品产物，包括卡诺拉油菜油和粗粉。
前述的本发明植物可以用于本发明的方法情境中。例如，本发明的油、脂肪酸、或脂质可从植物获得(并且可以提取)。
本发明的植物已经借助实施例部分中描述的转化用双元T-质粒VC-LTM593-1qczrc(SEQ ID NO：3)修饰。这种载体的T-DNA(其是本发明的T-DNA)包含(优选地按以下顺序)编码以下VLC-PUFA生物合成途径酶的多核苷酸：来自球蒴藓的Δ-6延伸酶；来自破囊壶菌属物种ATCC21685的Δ-5去饱和酶；来自托瑞蚝球藻的Δ-6去饱和酶；来自假微型海链藻的Δ-6延伸酶；来自大豆疫霉的Δ-12去饱和酶；来自畸雌腐霉的ω-3去饱和酶；来自致病疫霉的ω-3-去饱和酶；来自破囊壶菌属物种ATCC21685的Δ-5去饱和酶；来自破囊壶菌属物种的Δ-4去饱和酶；来自畸雌腐霉的ω-3去饱和酶；来自路氏巴夫藻的Δ-4去饱和酶；来自托瑞蚝球藻的Δ-5延伸酶。因此，本发明的前述T-DNA包含二拷贝的编码来自破囊壶菌物种ATCC21685的Δ-5去饱和酶的多核苷酸和二拷贝的编码来自畸雌腐霉的ω-3去饱和酶的多核苷酸。
VC-LTM593-1qcz(SEQ ID NO：3)的T-DNA还包含编码选择标记乙酰羟酸合酶的多核苷酸，所述多核苷酸赋予咪唑啉酮除草剂耐受性。
本发明还涉及在芸苔属事件LBFLFK和LBFDAU的每一者中插入的T-DNA，并且涉及基因组DNA/转基因插入，即，存在于包含芸苔属事件LBFLFK的芸苔属植物或种子中的基因座1和基因座2接头区域，涉及基因组DNA/转基因插入，即，存在于包含芸苔属事件LBFDAU的芸苔属植物或种子中的基因座1和基因座2接头区域，并涉及对相应基因组DNA/转基因插入(即，在包含事件LBFLFK或事件LBFDAU的芸苔属植物或种子及其后代中的相应基因座1和基因座2接头区域)的检测。
本发明的范围内还包括再生植物的子代、变体和突变体，前体是后代、变体和突变体包含LBFLFK事件或LBFDAU事件。优选地，后代、变体和突变体含有双元T-质粒VC-LTM593-1qcz rc的T-DNA的两个插入，所述插入命名为LBFLFK基因座1和LBFLFK基因座2，前提是这些后代、变体和突变体含有双元T-质粒VC-LTM593-1qcz rc的T-DNA的两个插入，所述插入命名为LBFDAU基因座1和LBFDAU基因座2。
转基因“事件”优选地通过以下方式产生：用包含核酸表达盒(其包含一个或多个目的转基因)的异源DNA构建体转化植物细胞、从各自包含插入的转基因的细胞再生植物种群并且选择以插入特定基因组位置为特征的特定植物。某事件在表型上由转基因的表达表征。在遗传水平，某事件是植物的遗传组成的部分。术语“事件”指包括异源DNA的原始转化体和转化体的后代。术语“事件”也指通过转化体和另一个品种之间有性远交产生的包括异源DNA的后代。甚至与回归亲本反复回交后，来自已转化亲本的插入的DNA和侧翼DNA存在于杂交子代中相同的染色体位置处。术语“事件”还指来自原始转化体(其包含插入的DNA和与插入的DNA紧邻的侧翼序列)的DNA，其中所述DNA将预计因一个包含插入的DNA的亲本系(例如，原始转化体和因自交产生的后代)与不含有插入的DNA的亲本系有性杂交而转移至后代。根据本发明，芸苔属LBFLFK事件的后代优选地包含LBFLFK基因座1或LBFLFK基因座2、或同时包含LBFLFK基因座1和LBFLFK基因座2。类似地，芸苔属LBFDAU事件的后代优选地包含LBFDAU基因座1或LBFDAU基因座2、或同时包含LBFDAU基因座1和LBFDAU基因座2。
如本文所用的“侧翼区”或“侧翼序列”优选地指至少20、50、100、200、300、400、1000、1500、2000、2500或5000碱基对或更大的序列，所述序列紧邻原始的外来插入DNA分子上游和与之邻接存在，或紧邻其下游并与之邻接存在。对于基因座1，LBFLFK事件的侧翼区的非限制性例子包括SEQ ID NO：284的核苷酸1至570、SEQ ID NO：285的核苷酸229至811，并且对于基因座2，包括SEQ ID NO：293的核苷酸1至2468、和/或SEQ ID NO：294的核苷酸242至1800，及其变体及片段。对于基因座1，LBFDAU事件的侧翼区的非限制性例子包括SEQID NO：302的核苷酸1至1017、SEQ ID NO：303的核苷酸637至1677，并且对于基因座2，包括SEQ ID NO：311的核苷酸1至1099、和/或SEQ ID NO：312的核苷酸288至1321，及其变体及片段。
对于基因座1，来自LBFLFK事件的接头DNA的非限制性例子包括SEQ ID NO：282、SEQ ID NO：283，并且对于基因座2、包括SEQ ID NO：291和/SEQ ID NO：292，其互补序列或其变体及片段。对于基因座1，来自LBFDAU事件的接头DNA的非限制性例子包括SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：301，并且对于基因座2、包括SEQ ID NO：309和/SEQ ID NO：310，其互补序列或其变体及片段。
本发明前述植物的油优选地是如本文中他处所述的油。
在一个实施方案中，本发明的转基因芸苔属植物包含事件LBFLFK(ATCC命名PTA-121703)。这个实施方案中还涵盖事件LBFLFK的种子和后代。在另一个实施方案中，本发明的转基因芸苔属植物包含事件LBFDAU(ATCC命名PTA-122340)。这个实施方案中还涵盖事件LBFDAU的种子和后代。
芸苔属植物LBFLFK和LBFDAU可以用来生产一般从芸苔属植物获得的商品。LBFLFK和LBFDAU的种子可以加工成粗粉或油以及作为动物饲料中的油源用于陆生和水生动物。
根据芸苔属事件LBFLFK中所体现的本发明，LBFLFK基因座1基因组DNA/转基因接头区域和/或LBFLFK基因座2基因组DNA/转基因接头区域存在于芸苔属植物LBFLFK(ATCC登录号PTA-121703)及其后代中。LBFLFK基因座1DNA/转基因右边界接头区域包含SEQ ID NO：282并且LBFLFK基因座1左边界接头区域包含SEQ ID NO：283，以及LBFLFK基因座2右边界接头区域包含SEQ ID NO：291并且LBFLFK左边界接头区域包含SEQ ID NO：292。提供这样的DNA序列及其互补序列，所述DNA序列包含事件LBFLFK的至少一个接头区域序列，所述接头区域序列选自SEQ ID NO：282(对应于SEQ ID NO：280的位置561至580)；SEQ ID NO：283(对应于SEQ ID NO：280的位置44318至44337)；SEQ ID NO：291(对应于SEQ ID NO：289的位置2459至2478)；和SEQ ID NO：292(对应于SEQ ID NO：289的位置46232至46251)；其中在含有芸苔属DNA的生物样品中检出这些序列判定芸苔属事件LBFLFK DNA存在于所述样品中。本发明的一个方面是包含这些DNA分子的芸苔属事件LBFLFK和芸苔属种子。
例如，为了确定因有性杂交产生的芸苔属植物是否含有来自事件LBFLFK的转基因DNA，从芸苔属植物组织样品提取的DNA可以接受核酸扩增方法作用，所述的核酸扩增方法使用(i)第一引物对，其包括：(a)从LBFLFK基因座1侧翼序列衍生的第一引物和(b)从LBFLFK基因座1插入的异源DNA衍生的第二引物，其中第一和第二引物的扩增产生了判定存在事件LBFLFK基因座1DNA的扩增子；和(ii)第二引物对，其包括(a)从LBFLFK基因座2侧翼序列衍生的第三引物和(b)从LBFLFK基因座2插入的异源DNA衍生的第四引物，其中第三和第四引物的扩增产生了判定事件LBFLFK基因座2DNA存在的扩增子。
对芸苔属事件LBFLFK中靶序列特异的引物DNA分子包含LBFLFK基因座1和基因座2的已插入DNA、侧翼区和/或接头区域的任何部分的至少11个连续核苷酸。例如，LBFLFK基因座1的引物DNA分子可以从SEQ ID NO：280、SEQ ID NO：281、SEQ ID NO：282、或SEQ ID NO：283；SEQ ID NO：284或SEQ ID NO：285的任一者或其互补序列衍生，以检测LBFLFK基因座1。类似地，LBFLFK基因座2的引物DNA分子可以从SEQ ID NO：293、SEQ ID NO：294、SEQ ID NO：291、或SEQ ID NO：292；SEQ ID NO：290或SEQ ID NO：289的任一者或其互补序列衍生，以检测LBFLFK基因座2。本领域技术人员可以使用这些引物来设计引物对，以使用已知的DNA扩增方法，产生LBFLFK基因座1扩增子和基因座2扩增子。当扩增产物含有包含LBFLFK基因座1接头区域SEQ ID NO：282或SEQ ID NO：283或其互补序列的扩增子、和包含LBFLFK基因座2接头区域SEQ ID NO：291、或SEQ ID NO：292、或其互补序列的扩增子时，在DNA扩增方法中使用这些DNA引物所产生的LBFLFK基因座1扩增子和基因座2扩增子判断存在芸苔属事件LBFLFK。
根据芸苔属事件LBFDAU中所体现的本发明，LBFDAU基因座1基因组DNA/转基因接头区域和/或LBFDAU基因座2基因组DNA/转基因接头区域存在于芸苔属事件LBFDAU(ATCC登录号PTA-122340)及其后代中。LBFDAU基因座1DNA/转基因右边界接头区域包含SEQ ID NO：300并且LBFDAU基因座1左边界接头区域包含SEQ ID NO：301，以及LBFDAU基因座2右边界接头区域包含SEQ ID NO：309并且LBFDAU左边界接头区域包含SEQ ID NO：310。提供这样的DNA序列及其互补序列，所述DNA序列包含事件LBFDAU的至少一个接头区域序列，所述接头区域序列选自SEQ ID NO：300(对应于SEQ ID NO：298的位置1008至1027，如图4中所示)；SEQ ID NO：301(对应于SEQ ID NO：298的位置44728至44747，如图4中所示)；SEQ ID NO：309(对应于SEQ ID NO：307的位置1090至1109，如图5中所示)；和SEQ ID NO：310(对应于SEQ ID NO：307的位置38577至38596，如图5中所示)；其中在含有芸苔属DNA的生物样品中检出这些序列判定芸苔属事件LBFDAU DNA存在于所述样品中。本发明的一个方面是包含这些DNA分子的芸苔属事件LBFDAU和芸苔属种子。
例如，为了确定因有性杂交产生的芸苔属植物是否含有来自事件LBFDAU的转基因DNA，从芸苔属植物组织样品提取的DNA可以接受核酸扩增方法作用，所述的核酸扩增方法使用(i)第一引物对，其包括：(a)从LBFDAU基因座1侧翼序列衍生的第一引物和(b)从LBFDAU基因座1插入的异源DNA衍生的第二引物，其中第一和第二引物的扩增产生了判定存在事件LBFDAU基因座1DNA的扩增子；和/或(ii)第二引物对，其包括(a)从LBFDAU基因座2侧翼序列衍生的第三引物和(b)从LBFDAU基因座2插入的异源DNA衍生的第四引物，其中第三和第四引物的扩增产生了判定事件LBFDAU基因座2DNA存在的扩增子。
本发明的一个方面是从芸苔属事件LBFLFK或芸苔属事件LBFDAU衍生的供销售、供种植或供生产商品产物的种子。这类商品产物包括含有VLC-PUFA(包括但不限于EPA和DHA)的卡诺拉油菜油或粗粉。从芸苔属事件LBFLFK衍生的商品产物包含可检测量的包含SEQ IDNO：282、SEQ ID NO：283、SEQ ID NO：291和/或SEQ ID NO：292的DNA分子。从芸苔属事件LBFDAU衍生的商品产物包含可检测量的包含SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：301、SEQ ID NO：309和/或SEQ ID NO：310的DNA分子。从事件LBFLFK和LBFDAU衍生的示例性商品产物包括但不限于烹调油、沙拉油、起酥油、营养强化食品、动物饲料、药物组合物、化妆品组合物、毛发护理产物等。
本发明也提供有商业意义的植物材料来源、优选地种子来源。因而，本发明提供至少5kg、优选地至少10kg、更优选地至少50kg、甚至更优选地至少100kg、甚至更优选地至少500kg、甚至更优选地至少1吨、甚至更优选地至少2吨、甚至更优选地至少5吨的大量植物材料，其中植物材料包含如本发明所述的VLC-PUFA。如本文所述，本发明的优点是首次提供农艺学可靠的VLC-PUFA植物油来源，并且为此目的，提供这类大量的植物材料。植物材料优选地是植物种子、甚至更优选地产生VLC-PUFA的种子，从而在40％含油量(w/w)时，18：1n-9下游的全部VLC-PUFA的含量是总种子脂肪酸含量的至少40％(w/w)，或者优选地在30％含油量(w/w)时，EPA的含量是总种子脂肪酸含量的至少10％(w/w)和/或DHA的含量是总种子脂肪酸含量的至少1％(w/w)，或这种植物种子的粗粉。因而，本发明提供一种容器，所述容器以至少5kg、优选地至少10kg、更优选地至少50kg、甚至更优选地至少100kg、甚至更优选地至少500kg、甚至更优选地至少1吨、甚至更优选地至少2吨、甚至更优选地至少5吨的量包含这种植物种子。本发明因此表明，本发明已经完全超越实验室规模含VLC-PUFA的植物的传闻结果，并且相反已经满足在植物油和植物材料中大规模提供可靠VLC-PUFA源及尤其可靠EPA源和/或DHA源的额外要求。
本发明允许产生包含修改的脂肪酸组成(如与对照植物相比)的植物。因此，如本文中公开的T-DNA、表达盒、载体、多核苷酸(尤其多核苷酸的组合)和多肽(尤其多肽的组合)可以用于修改植物的脂肪酸组成。在一个实施方案中，修改(如与对照植物的种子油中的含量相比，增加或减少)种子油中至少一种在表18或表181中公开的脂肪酸的含量。在另一个实施方案中，修改(如与对照植物的种子油的含量相比，增加或减少)种子油的单酰甘油(MAG)部分、二酰甘油(DAG)部分、三酰甘油(TAG)部分、磷脂酰胆碱(PC)部分和/或磷脂酰乙醇胺(PE)部分中至少一种在表18或表181中公开的脂肪酸的含量。在另一个实施方案中，修改(如与对照植物的种子油中的含量相比，增加或减少)种子油中至少一种在表189中所示的溶血磷脂酰胆碱种类的含量。在另一个实施方案中，修改(如与对照植物的种子油中的含量相比，增加或减少)种子油中至少一种在表190中所示的磷脂酰乙醇胺种类的含量。在另一个实施方案中，修改(如与对照植物的种子油中的含量相比，增加或减少)种子油中至少一种在表191中所示的溶血磷脂酰乙醇胺种类的含量。在另一个实施方案中，修改(如与对照植物的种子油中的含量相比，增加或减少)种子油中至少一种在表192中所示的三酰甘油种类的含量。
已作必要修正的情况下，上文给出的定义和解释优选地适用于以下情况(例如，就“植物”、“对照植物”等而言)。
已经在奠定本发明的研究背景下显示，生成的植物产生米德酸(20：3n-9、参见实施例29)。米德酸可以因d6Des、d6Elo和d5Des的副活性产生，利用18：1n-9(由d6Des)产生18：2n-9，随后(由d6Elo)产生20：2n-9，随后(由d5Des)产生20：3n-9。有意义地，仅将d12Des突变成无活性，才在真菌中产生米德酸(Takeno等人2005App.Environ.Microbiol.71(9)：5124-5128)。但是，奠定本发明的研究令人惊讶地显示甚至当d12Des过量表达时，也在产生植物中米德酸。
因此，本发明涉及一种相对于对照植物增加植物中米德酸(20：3n-9)含量的方法，所述方法包括在植物中表达至少一个编码Δ-6-去饱和酶的多核苷酸、至少一个编码Δ-6-延伸酶的多核苷酸和至少一个编码Δ-5-去饱和酶的多核苷酸。
此外，本发明涉及一种相对于对照植物在植物中产生米德酸(20：3n-9)的方法，所述方法包括在植物中表达至少一个编码Δ-6-去饱和酶的多核苷酸、至少一个编码Δ-6-延伸酶的多核苷酸和至少一个编码Δ-5-去饱和酶的多核苷酸。
前述方法还可以包括表达其他去饱和酶或延伸酶、尤其Δ-12-去饱和酶、ω-3-去饱和酶、aΔ-5-延伸酶、和Δ-4-去饱和酶中一者或多者。因此，可以在植物中表达至少一种、二种、三种或尤其四种其他酶活性。
在一个实施方案中，这些方法还包括在植物中表达至少一个编码Δ-12-去饱和酶的多核苷酸。
在一个实施方案中，这些方法还包括在植物中表达至少一个编码ω-3-去饱和酶的多核苷酸。
在一个实施方案中，这些方法还包括在植物中表达至少一个编码Δ-5-延伸酶的多核苷酸。
在一个实施方案中，这些方法还包括在植物中表达至少一个编码Δ-4-去饱和酶的多核苷酸。在一个实施方案中，表达至少一种CoA依赖性Δ-4-去饱和酶和至少一种磷脂依赖性Δ-4去饱和酶。
在一个具体的优选实施方案中，这些方法还包括在植物中表达至少一个编码Δ-12-去饱和酶的多核苷酸、至少一个编码ω-3-去饱和酶的多核苷酸、至少一个编码Δ-5-延伸酶的多核苷酸和至少一个编码Δ-4-去饱和酶的多核苷酸。
上文描述了优选的编码去饱和酶和延伸酶的多核苷酸。
上文描述的基因剂量效应还可以用于在植物中产生米德酸或增加米德酸含量。
因此，构思表达至少一个编码Δ-6-去饱和酶的多核苷酸、至少两个编码Δ-6-延伸酶的多核苷酸和至少两个编码Δ-5-去饱和酶的多核苷酸。另外，可以进一步表达至少一个编码Δ-12-去饱和酶的多核苷酸、至少三个编码ω-3-去饱和酶的多核苷酸、至少一个编码Δ-5-延伸酶的多核苷酸和/或至少两个编码Δ-4-去饱和酶的多核苷酸(优选地至少一种CoA依赖性Δ-4-去饱和酶和至少一种磷脂依赖性Δ-4去饱和酶)。
在一个实施方案中，表达至少一个编码来自球蒴藓的Δ-6延伸酶的多核苷酸、至少一个编码来自假微型海链藻的Δ-6延伸酶的多核苷酸、和至少两个编码来自破囊壶菌物种的Δ-5去饱和酶的多核苷酸。另外，可以表达至少一个编码来自致病疫霉的ω-3-去饱和酶的多核苷酸、至少两个编码来自畸雌腐霉的ω-3去饱和酶的多核苷酸、至少一个编码来自托瑞蚝球藻的Δ-5延伸酶的多核苷酸、和至少一个编码来自破囊壶菌属物种的Δ-4去饱和酶的多核苷酸、和/或至少一个编码来自路氏巴夫藻的Δ-4去饱和酶的多核苷酸。
优选地，待表达的多核苷酸是重组多核苷酸。更优选地，多核苷酸在植物基因组包含的一个T-DNA上存在。因此，T-DNA稳定整合入基因组。优选地，编码如本文中所述的去饱和酶和延伸酶的多核苷酸包含于相同的T-DNA中。
优选地，编码去饱和酶或延伸酶的多核苷酸(即每个多核苷酸)与表达控制序列(定义参见本文他处)有效连接。另外，多核苷酸可以与终止子连接，因而形成包含表达控制序列、靶基因和终止子的表达盒。
在一个具体的优选实施方案中，在植物的种子中表达多核苷酸。因此，表达控制序列可以是种子特异性启动子。优选的种子特异性启动子例如在实施例部分的表11中公开。
在一个实施方案中，通过在植物中引入并且表达多核苷酸，表达多核苷酸。如何向植物引入多核苷酸是本领域熟知的。本文他处描述优选的方法。在一个实施方案中，多核苷酸通过农杆菌介导的转化法引入植物。
在一个实施方案中，如与对照植物的种子中的米德酸相比，种子中的米德酸含量增加。优选地，如与对照植物的种子油中的米德酸相比，种子的种子油中的米德酸含量增加。
上文描述了优选的植物。在一个实施方案中，植物是油籽植物。优选地、植物选自亚麻(亚麻属物种(Linum sp.))、油菜(芸苔属物种(Brassica sp.))、大豆(大豆属(Glycine)和野大豆亚属物种(Soja sp.))、向日葵(向日葵属物种(Helianthus sp.))、棉花(棉属物种(Gossypium sp.))、玉米(玉蜀黍)、橄榄(木犀榄属物种(Olea sp.))、红花(红花属物种(Carthamus sp.))、可可(可可树(Theobroma Cacoa))、花生(花生属物种(Arachis sp.))、大麻、亚麻荠属植物、两节荠属植物、油棕榈、椰子、落花生、芝麻、蓖麻、雷斯克勒(lesquerella)、乌桕、牛油树、油桐、木棉果、罂粟籽、霍霍巴籽和紫苏。更优选地，植物是十字花科植物，优选地是芸苔属植物并且最优选地是下述物种的植物，所述物种包含甘蓝、黑芥和芜青物种，因此尤其欧洲油菜、埃塞俄比亚芥、芥菜、甘蓝、黑芥或芜青物种中一个或两个成员的基因组。
在一个实施方案中，该方法还包括选择植物的步骤，所述植物具有、尤其在种子油中具有增加的米德酸含量。在实施方案中，选择基于米德酸含量进行。该步骤可以因此包括确定植物种子、或种子油中米德酸含量的步骤。例如，在实施例29中描述如何确定米德酸含量。
米德酸优选地是酯化的米德酸。
一旦在植物的种子中表达上文所提及的多核苷酸，则产生米德酸。因此，表达所述多核苷酸的植物、尤其植物的种子应当包含/产生米德酸。优选地，植物的种子油中米德酸(20：3n-9)的含量在种子油的总脂肪酸含量(尤其酯化脂肪酸的总含量)的约0.1％和2％之间、更优选地在约0.1％和1％之间、最优选地在约0.1％和0.5％之间。其他VLC-PUFA可以存在于种子油中(如与本发明油有关在本文他处描述)。
本发明还涉及构建体或T-DNA，所述构建体或T-DNA包含如增加米德酸含量的方法的背景下所述的去饱和酶和延伸酶的表达盒。因此，本发明还涉及包含至少一个Δ-6-去饱和酶表达盒、至少一个Δ-6-延伸酶表达盒和至少一个Δ-5-去饱和酶表达盒的构建体。构建体或T-DNA还可以包含至少一个Δ-12-去饱和酶表达盒、至少一个ω-3-去饱和酶表达盒、至少一个Δ-5-延伸酶表达盒和/或至少一个Δ-4-去饱和酶表达盒。
在一个实施方案中，构建体或T-DNA包含至少一个来自球蒴藓的Δ-6延伸酶的表达盒、至少一个来自假微型海链藻的Δ-6延伸酶的表达盒、和至少两个来自破囊壶菌属物种(尤其破囊壶菌属物种ATCC21685)的Δ-5去饱和酶的表达盒和任选地至少两个来自畸雌腐霉的ω-3去饱和酶的表达盒、至少一个来自致病疫霉的ω-3-去饱和酶的表达盒、至少一个来自托瑞蚝球藻的Δ-5延伸酶的表达盒、和至少一个来自破囊壶菌属物种的Δ-4去饱和酶的表达盒和/或至少一个来自路氏巴夫藻的Δ-4去饱和酶的表达盒。
本发明还涉及i)本发明构建体或T-DNA或ii)至少一个编码Δ-6-去饱和酶的多核苷酸、至少一个编码Δ-6-延伸酶的多核苷酸、至少一个编码Δ-5-去饱和酶的多核苷酸用于a)相对于对照植物(尤其对照植物的种子中)，增加植物(尤其种子中)的米德酸含量或者在植物中、尤其在植物种子中产生米德酸的用途。
优选地，还可以使用如增加米德酸的方法背景下提到的编码去饱和酶和/或延伸酶的其他多核苷酸(如编码Δ-12-去饱和酶的多核苷酸)。
本发明还涉及用i)本发明构建体或T-DNA或ii)至少一个编码Δ-6-去饱和酶的多核苷酸、至少一个编码Δ-6-延伸酶的多核苷酸、至少一个编码Δ-5-去饱和酶的多核苷酸转化或包含前者的植物或植物细胞。在一个实施方案中，植物或植物细胞进一步用如增加米德酸的方法背景下提到的编码去饱和酶和/或延伸酶的其他多核苷酸(如编码Δ-12-去饱和酶的多核苷酸)转化或包含前述多核苷酸。上文公开了用于去饱和酶和延伸酶的优选多核苷酸序列。
另外，本发明涉及一种产生米德酸的方法，所述方法包括步骤
i)培育本发明的植物，从而获得其含油种子，
ii)收获所述种子，并且
iii)从步骤ii中收获的所述种子提取包含米德酸的油。
优选地，油是如本文上述的油。特别地，油应当具有如上文所述的米德酸含量。
如上述的，本发明涉及产生VLC-PUFA的植物(并涉及产生米德酸的植物)。所述植物应当包含一个或多个T-DNA，所述T-DNA包含如本文中详细解释的某些去饱和酶和延伸酶的表达盒。优选地，所述表达盒包含于相同T-DNA(或构建体)中。
在本发明的一个实施方案中，本发明的T-DNA或构建体还包含至少一个表达盒，所述表达盒包含编码乙酰羟酸合酶(缩写AHAS酶，又称作乙酰乳酸合酶)的多核苷酸，其中所述乙酰羟酸合酶赋予咪唑啉酮类除草剂耐受性。因此，AHAS酶优选地是突变的AHAS酶。
赋予咪唑啉酮类除草剂耐受性的突变的AHAS酶是本领域已知的并且例如在通过引用方式完整并入的WO 2008/124495中公开。在一个实施方案中，突变的AHAS酶是突变的拟南芥AHAS酶。如与野生型酶相比，构思的酶在两个位置突变。使构思的酶在位置653处由天冬酰胺替换丝氨酸并且在位置122处由苏氨酸替换丙氨酸。
还优选地，编码赋予咪唑啉酮类除草剂耐受性的AHAS酶的多核苷酸选自：
a)核酸序列，其具有如SEQ ID NO：277中所示的核苷酸序列，
c)编码多肽的核酸序列，所述多肽具有如SEQ ID NO：278中所示的氨基酸序列，
c)核酸序列，其与具有如SEQ ID NO：277中所示核苷酸序列的核酸序列至少70％、80％或90％相同，
d)编码多肽的核酸序列，所述多肽与具有如SEQ ID NO：278中所示氨基酸序列的多肽至少60％、70％、80％或90％相同，
e)核酸序列，其能够在严格条件下与i)具有如SEQ ID NO：277中所示核苷酸序列的核酸序列，或ii)编码具有如SEQ ID NO：278中所示氨基酸序列的多肽的核酸序列杂交。
应当理解由所述多核苷酸编码的多肽应当赋予咪唑啉酮类除草剂耐受性。在一个实施方案中，多肽因此应当在与SEQ ID NO：278的位置653相对应的位置具有丝氨酸至天冬酰胺置换，和/或在与SEQ ID NO：278的位置122相对应的位置具有丙氨酸至苏氨酸置换。
咪唑啉酮类除草剂优选地是选自咪草烟(imazethapyr)、甲基咪草烟(imazapic)、咪草啶酸(imazamox)、灭草喹(imazaquin)、imazethabenz和灭草烟(imazapyr)、尤其咪草啶酸(imazamox)(IUPAC：(R/S)-2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-甲氧甲基烟酸)。更具体地，咪唑啉酮类除草剂可以选自但不限于2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸、[2-(4-异丙基)-4-][甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-3-喹啉羧]酸、[5-乙基-2-(4-异丙基-]4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸、2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧甲基)-烟酸、[2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-]咪唑啉-2-基)-5-甲基烟酸。优选使用5-乙基-2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸和[2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧甲基)-烟酸。特别优选使用[2-(4-异丙基-4-]甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧甲基)-烟酸。
此外，本发明涉及一种控制本发明植物附近的杂草的方法，所述方法包括向杂草并向本发明的植物施加至少一种咪唑啉酮类除草剂，因而抑制本发明植物附近的杂草生长。
在前述方法背景下的本发明植物应当包含如本文他处解释的去饱和酶和延伸酶表达盒(优选地，至少一个包含表达盒的T-DNA)和包含编码乙酰羟酸合酶的多核苷酸的表达盒，其中所述乙酰羟酸合酶赋予咪唑啉酮类除草剂耐受性。在一个实施方案中，去饱和酶和延伸酶的表达盒和包含编码乙酰羟酸合酶的多核苷酸的表达盒包含于相同的T-DNA中。本发明还涉及前述的植物。
优选地，如上述的编码乙酰羟酸合酶的多核苷酸过量表达。在一个实施方案中，所述多核苷酸与组成型启动子有效连接。在一个实施方案中，所述组成型启动子是CaMV 35S启动子。在另一个实施方案中，所述组成型启动子是欧芹遍在蛋白启动子(对于SEQ ID NO：3中的位置，实施例中用于表达突变的AHAS基因的启动子，参见表11)。
因此，本发明的优选植物含有抵抗咪唑啉酮类的基因，所述基因抑制植物的乙酰羟酸合酶(AHAS)基因。赋予抗性的基因是AHAS的修饰变体。编码乙酰羟酸合酶的多核苷酸的表达盒可以与如本文提到的延伸酶和去饱和酶表达盒包含于相同的T-DNA或不同T-DNA。优选地，表达盒包含于相同的T-DNA中。
在一个实施方案中，本发明的T-DNA或构建体包含(尤其按这种顺序)编码以下酶的多核苷酸：来自球蒴藓的Δ-6延伸酶；来自来自破囊壶菌属物种ATCC21685的Δ-5去饱和酶；来自托瑞蚝球藻的Δ-6去饱和酶；来自假微型海链藻的Δ-6延伸酶；来自大豆疫霉的Δ-12去饱和酶；来自畸雌腐霉的ω-3去饱和酶；来自致病疫霉的ω-3-去饱和酶；来自破囊壶菌属物种(尤其物种ATCC21685)的Δ-5去饱和酶；来自破囊壶菌属物种的Δ-4去饱和酶；来自畸雌腐霉的ω-3去饱和酶；来自路氏巴夫藻的Δ-4去饱和酶；来自托瑞蚝球藻的Δ-5延伸酶，和赋予咪唑啉酮除草剂耐受性的乙酰羟酸合酶(参见上文定义)。例如在表130中给出多核苷酸和多肽的序列。
有意义地，酶AHAS与脂肪酸生物合成分享共同代谢前体(丙酮酸)。过量表达AHAS的一个结果可以增加丙酮酸消耗，导致含油量降低和氨基酸或蛋白质含量可能增加(参见例如Blombach等人2009，Applied and Environment Microbiology 75(2)：419-427，其中AHAS过量表达导致细菌中赖氨酸产生增加；还参见Muhitch 1988 Plant Physiol 83：23-27，其中描述了AHAS在氨基酸供应中的作用)。因此，出人意料的是，AHAS变体的过量表达，尤其与AHAS抑制型除草剂组合时、并不导致种子中蛋白质、油或VLC-PUFA的含量变化(参见实施例18)。因而，本发明提供一种产生VLC-PUFA的方法，其中用AHAS抑制型除草剂喷洒田间培育的植物。优选地，所述除草剂是咪唑啉酮类。
本发明借助后附实施例和附图进一步描述，然而，所述实施例和附图不意在限制本文所述的本发明范围。
实施例
实施例1：一般克隆方法
如Sambrook等人(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press：ISBN 0-87965-309-6)中所述那样开展多种克隆方法，例如，使用限制性核酸内切酶在特异性位点切割双链DNA、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段的纯化、转移核酸到硝酸纤维素膜和尼龙膜上，连接DNA片段、转化大肠杆菌细胞和细菌的培养。使用PhusionTM高保真DNA聚合酶(NEB，法兰克福，德国)，根据生产商的说明，进行聚合酶链反应。通常，设计在PCR中使用的引物，从而该引物3＇端的至少20个核苷酸与模板完美复性以扩增。通过连接识别位点的相应核苷酸至引物5＇端，添加限制性位点。使用例如由K.Heckman和L.R.Pease，Nature Protocols(2207)2，924-932描述的融合PCR作为备选方法以连接两个目的片段，例如，将启动子与基因连接或将基因与终止子连接。例如由Czar等人(Trends in Biotechnology，2009，27(2)：63-72)描述，基因合成由Life Technologies使用其服务执行。WO2013049227中所述的技术允许产生长度数个碱基对(bp)的遗传元件并且在本发明中用来产生约60,000bp的完整质粒。对于短DNA片段，使用核苷酸至多核苷酸的化学合成法，其中使用如WO2013049227中所述的常规克隆技术组合，所述短DNA片段随后按依次、模块化方式组合成大小尺寸渐增的片段。
实施例2：不同类型的植物转化质粒适于将多个编码多种蛋白质的表达盒转移入植物基因组。
对于基于农杆菌的植物转化，DNA构建体优选地符合多种标准：(1)构建体携带多种遗传元件，所述遗传元件在‘T-DNA左边界’(LB)和‘T-DNA右边界’之间的所谓转移DNA(T-DNA)上意在插入植物基因组中。(2)构建体在大肠杆菌中复制，因为大部分克隆步骤要求在大肠杆菌中的DNA增殖步骤。(3)构建体在农杆菌(例如，根癌农杆菌或发根农杆菌)中复制，因为植物转化方法依赖于使用农杆菌插入目的遗传元件至农杆菌感染的细胞的植物基因组中。(4)构建体含有编码蛋白质的支持性遗传元件，其中感染植物细胞及所需遗传元件转移并整合至农杆菌感染的植物细胞的植物基因组中要求所述蛋白质，或构建体与含有在相同农杆菌细胞存在的这类支持性遗传元件的第二构建体组合使用。(5)构建体可以含有选择标记，所述选择标记促进选择或鉴定含有整个构建体的细菌细胞，并且含有所需遗传元件的植物细胞。在Komori等人(2007)中给出了可用质粒的概述。
农杆介导的转化导致目的基因元件几乎随机整合(连同多种因素所致的某些偏倚)入植物细胞的染色体。转化的目的是将整个T-DNA从T-DNA左边界至T-DNA右边界整合入随机染色体的随机位置。也可能想要将整个T-DNA整合入基因组两次或三次，例如，以增加由T-DNA编码的基因的植物表达水平。为了避免多重整合的复杂孟德尔分离，优选令全部T-DNA在一个基因组位置(‘基因座’)插入。已经发现向植物基因组插入多于25,000bp T-DNA是本发明中的特殊挑战。特别地，已经发现在本发明中，携带供大肠杆菌和/或农杆菌中复制质粒的ColE1/pVS1复制起点的质粒在约25,000bp以上不稳定。实施例3中描述本发明的这类质粒。因为这种限制，可以将在一个含有T-DNA的质粒上不多于约4至5个基因表达盒转移入植物基因组。但是，对于本发明，合并的大小约44,000bp的至多13个基因表达盒需要转移入植物基因组。与含有供大肠杆菌和/或农杆菌中高拷贝质粒复制的ColE1/pVS1复制起点的质粒相反，发现含有供大肠杆菌和/或农杆菌中单拷贝质粒复制的F因子/pRi复制起点的BiBAC质粒(Hammilton 1997)至多大小约60,000bp在本发明中稳定。实施例4中描述本发明的这类质粒。本发明中遵循上文描述的两种方案。
实施例3：在含有ColE1/pVS1复制起点的T-质粒内部装配合成EPA和DHA所需要的基因
为了在欧洲油菜种子中合成VLC-PUFA，将编码VLC-PUFA代谢途径的蛋白质的成组基因与表达元件(启动子、终止子、内含子)组合并且转移至用于农杆菌介导植物转化法的双元t-质粒中。归因于庞大数目的各自促进一种蛋白质表达的表达盒，两种双元t-质粒用于克隆合成EPA和DHA所需的整套蛋白质。为此目的，采用图3中所述的常用克隆策略：尽管图3描述了总体策略，在实施例10至14中描述的最终植物表达载体的克隆不限于这个策略；特别地，已经使用本领域技术人员已知的全部方法(如克隆、利用限制性核酸内切酶产生粘末端和平末端、合成和融合PCR)的组合。按照图3中描述的模块化克隆方案，由GeneArt(雷根斯堡)从cDNA合成基因或使用PhusionTM高保真DNA聚合酶(NEB，法兰克福，德国)根据制造商的说明书，从cDNA以PCR扩增基因。在两种情况下，在5′末端引入Nco I和/或Asc I限制性位点，并在3’末端引入PacI限制性位点(图3A)，以便能够使用这些限制性位点，将这些基因克隆在功能性元件如启动子和终止子之间(参见这个实施例中下文)。通过以下方式产生启动子-终止子模块或启动子-内含子-终止子模块：由GeneArt(雷根斯堡)完整合成或使用如实施例1中所述的融合PCR连接相应的表达元件并且根据制造商的说明书，将PCR产物克隆至TOPO-载体pCR2.1(Invitrogen)中(图3B)。通过合成完整盒或使用融合PCR，将终止子序列连接至启动子序列或启动子-内含子序列，同时将图3中所示的限制性核酸内切酶识别序列添加至这些模块的任一侧，并且将限制性核酸内切酶Nco I、Asc I和Pac I的识别位点在启动子和终止子之间或内含子和终止子之间引入(参见图3B)。为了获得最终表达模块，将PCR扩增的基因经Nco I和/或Pac I限制性位点克隆在启动子和终止子或内含子和终止子之间(图3C)。使用定制多克隆位点(MCS)，根据需要，将这些表达模块中的至多三个模块组合成由pENTR/A、pENTR/B或pENTR/C中任一者携带的表达盒(图3D)。最后，多位点GatewayTM系统(Invitrogen)用来组合由pENTR/A、pENTR/B和pENTR/C携带的三个表达盒(图3E)，以获得用于植物转化的最终双元pSUN T质粒：VC-LJB2197-1qcz、VC-LJB2755-2qcz rc、VC-LLM306-1qcz rc、VC-LLM337-1qcz rc、VC-LLM338-3qcz rc和VC-LLM391-2qcz rc。对双元载体及其用途的综述由Hellens等人，Trends in Plant Science(2000)5,446-451给出。
在表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7中给出质粒VC-LJB2197-1qcz、VC-LJB2755-2qcz rc、VC-LLM306-1qcz rc、VC-LLM337-1qcz rc、VC-LLM338-3qcz rc、VC-LLM391-2qczrc和VC-LTM217-1qcz rc的结构。
遗传元件的命名：
j-表明两个遗传元件的之间接头
c-编码性序列
t-终止子
p-启动子
i-内含子
T-DNA转移的DNA
RB T-DNA的右边界
LB T-DNA的左边界
实施例4：在含有F因子/pRI复制起点的BiBAC T-质粒内部装配合成EPA和DHA所需要的基因
为了在欧洲油菜种子中合成VLC-PUFA，将编码VLC-PUFA代谢途径的蛋白质的成组基因与表达元件(启动子、终止子和内含子)组合并且转移至用于农杆菌介导植物转化法的双元t-质粒中。尽管庞大数目各自促进表达一种蛋白质的表达盒在实施例3中分布到两个双元t-质粒T-DNA上，在这个实施例中，全部表达盒已经组合到单个双元T-质粒上。DNA合成法的进步允许多家企业提供这样的服务：在没有初始模板的情况下，利用化学合成法和分子生物技术的组合从头合成直到微生物基因组大小的多核苷酸。构建本实施例中所述质粒时所使用的合成过程由Life Technologies使用其服务执行。WO2013049227中描述的技术允许产生数个碱基对(bp)长度的遗传元件并且在本发明中用来产生具有每个构建体总大小约61,000bp的植物转化用双元T-质粒VC-RTP10690-1qcz_F、VC-RTP10691-2qcz、VC-LTM595-1qcz rc和VC-LTM593-1qcz rc。在表8、表9、表10和表11中给出质粒VC-RTP10690-1qcz_F、VC-RTP10691-2qcz、VC-LTM595-1qcz rc和VC-LTM593-1qcz rc的结构。
表8：质粒RTP10690-1qcz_F的遗传元件。列出了元件的名称、在RTP10690-1qcz_F中的位置(核苷酸编号，注意：对于SEQ ID NO：6的互补链编码的元件，起始位置大于终止位置)、元件的功能和来源。转化过程期间整合至植物基因组中的T-DNA旁侧分布有右边界(RTP10690-1qcz_F的核苷酸59918至148)和左边界(RTP10690-1qcz_F的核苷酸43853至43718)。该区域外部的元件(＝载体主链)是在大肠杆菌和/或农杆菌中克隆和稳定维持必需的。
表9：质粒RTP10691-2qcz的遗传元件。列出了元件的名称、在RTP10691-2qcz中的位置(核苷酸编号，注意：对于RTP10691-2qcz的互补链编码的元件，起始位置大于终止位置)、元件的功能和来源。转化过程期间整合至植物基因组中的T-DNA旁侧分布有右边界(RTP10691-2qcz的核苷酸60923至148)和左边界(RTP10691-2qcz的核苷酸44858至44723)。该区域外部的元件(＝载体主链)是在大肠杆菌和/或农杆菌中克隆和稳定维持必需的。
表10：质粒VC-LTM595-1qcz rc的遗传元件。列出了元件的名称、在VC-LTM595-1qcz rc中的位置(核苷酸编号，注意：对于VC-LTM595-1qcz rc的互补链编码的元件，起始位置大于终止位置)、元件的功能和来源。转化过程期间整合至植物基因组中的T-DNA旁侧分布有右边界(VC-LTM595-1qcz rc的核苷酸60913至148)和左边界(VC-LTM595-1qcz rc的核苷酸44848至44713)。该区域外部的元件(＝载体主链)是在大肠杆菌和/或农杆菌中克隆和稳定维持必需的。
表11：质粒VC-LTM593-1qcz rc的遗传元件。列出了元件的名称、在VC-LTM593-1qcz rc中的位置(核苷酸编号，注意：对于VC-LTM593-1qcz rc的互补链编码的元件，起始位置大于终止位置)、元件的功能和来源。转化过程期间整合至植物基因组中的T-DNA旁侧分布有右边界(VC-LTM593-1qcz rc的核苷酸59895至148)和左边界(VC-LTM593-1qcz rc的核苷酸43830至43695)。该区域外部的元件(＝载体主链)是在大肠杆菌和/或农杆菌中克隆和稳定维持必需的。
使用这些表达盒的简化术语，表13比较了全部不同构建体和构建体组合之间基因表达盒的顺序，定义参见表12。实施例10至19中的数据证明了不同构建体或构建体组合之间就转基因种子中测量的PUFA特征方面的显著差异。甚至当消除影响PUFA水平的全部其他来源(例如，不同环境、植物间变异性、种子含油量、T-DNA拷贝数)时，构建体和构建体组合之间的差异依然明显。例如，VC-RTP10690-1qcz_F和VC-LMT593-1qcz rc是同基因的，即两个构建体含有完全相同的基因表达盒。因为RTP10690-1qcz_F和VC-LMT593-1qcz之间的相似性，所以例如，当比较全部单拷贝事件的平均转化效率时，将期望完全相同的途径步骤转化效率。但是，图39显示VC-RTP10690-1qcz_F具有32％的Δ-4去饱和酶转化效率(52个单拷贝T0事件的T1种子的平均数)，而VC-LMT593-1qcz rc具有47％的Δ-4去饱和酶转化效率(241个单拷贝T0事件的T1种子的平均数)。这并非预期，并且可以由转录物水平解释，这些转录物水平转而决定蛋白质水平。转录物水平受VC-LMT593-1qczrc中Δ-4去饱和酶盒侧翼的遗传元件影响。两个构建体之间的观察结果是意料之外的结果，并且表示，不仅基因组影响Δ-4去饱和酶转化效率，而且T-DNA本身也影响，如实施例19中所述，所述转化效率依赖于“基因剂量”。另外，实施例10至19中的数据显示，可能将表达盒与这类影响隔绝。如可以在那些实施例10-19中见到，当消除影响PUFA水平的全部其他来源(例如，不同环境、植物间变异性、种子含油量)时，全部单拷贝事件均能够产生几乎完全相同的VLC-PUFA水平。当比较实施例18中的全部单拷贝事件时，这尤其令人震惊。比较总C20+C22 VLC-PUFA含量，这主要受多少量由Δ-12去饱和酶和Δ-6去饱和酶转化控制，令人震惊地观察到，在例如从构建体组合VC-LJB2197-1qcz+VC-LLM337-1qcz rc获得的单拷贝事件LANPMZ、和实施例18中列出的全部单拷贝事件之间，实际上不存在差异。为此目的，重要的是要注意，编码完整途径(实施例15至18)或该途径的至少第一步骤至多ARA和EPA产生(实施例10至14)的T-DNA的一侧总是含有AHAS基因，所述AHAS基因赋予除草剂耐受性，但不涉及VLC-PUFA途径。编码完整途径(实施例15至18)或该途径的至少第一步骤至多ARA和EPA产生(实施例10至14)的T-DNA的另一侧在大多数情况下来自球蒴藓的Δ-6延伸酶(实施例13和14中例外)。如实施例19中所述，球蒴藓基因编码的Δ-6延伸酶蛋白质工作接近于最大转化效率(＞90％)，因此，因增加转录物水平的任何作用所致的Δ-6延伸酶酶水平的任何增加将实际上不影响C20和C22VLC-PUFA水平。有效地，决定VLC-PUFA累积总水平的T-DNA在两侧分布有其中表达水平差异将不影响VLC-PUFA累积的基因。由于这两种基因由尺寸数千bp的表达盒编码，所以似乎令T-DNA内部的基因屏蔽/隔绝于基因组环境本可能对那些基因的表达水平产生的任何影响(例如，Δ-12-去饱和酶，与实施例19比较)。这种影响与双拷贝事件在总C20和C22VLC-PUFA水平方面明显更多差异的观察结果一致：因为在许多情况下，额外的T-DNA插入是不完整的(参见实施例10至18)，从而导致T-DNA内部的基因暴露于基因组。当这些基因易受基因剂量效应影响(这些基因的转化效率取决于转录物的量和衍生的酶量，与实施例19比较_)时，则在某些基因组位置，基因组环境助长转录物水平。
实施例5：使用共转化方案产生转基因植物的程序
通常，根据DeBlock等人，1989，Plant Physiology，91：694-701的修改方案产生转基因油菜植物。为产生就两个不同T-DNA而言转基因的油菜植物，将实施例3中所述的双元载体转化至发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)SHA001(关于使用农杆菌的完整描述，参见WO2006024509A2)。为了转化油菜植物(栽培品种Kumily)，使用共转化策略。用二个不同农杆菌菌株进行转化，所述菌株携带在表14中列出并在实施例3、实施例4、实施例6和/或实施例7中详细描述的二个不同质粒之一。
表14：在实施例3中描述的共转化策略中用于产生携带二个不同T-DNA的植物的组合的概述
在含抗生素((20mg/L氯霉素、5mg/L四环素、25mg/L壮观霉素)的YEB培养基中配制意在共转化的两个菌株的过夜培养物并在28℃培育。在次日，在600nm波长检查培养物的光密度。它达到约1.0。延长光密度较低的培养物的培育时间。将光密度高于1.3的培养物用YEB培养基稀释至大约0.2的OD并且培养直至它们达到1.0的OD。
将培养物以约4000g沉淀并重悬于含100mg/L乙酰丁香酮的液态MS培养基(Murashige和Skoog 1962)，pH 5.8，3％蔗糖中以达到0.1的OD600nm。
与待共转化的两种构建体分别相对应的农杆菌悬液按相等份数混合并且用于接种从5日龄黄化籽苗制备的下胚轴段。
使用来自Duchefa的MSB5培养基(Duchefa Biochemie，PO Box 809 2003 RVHaarlem，荷兰)，pH 5.8，3％蔗糖和0.8％Oxoid琼脂，使种子在低光照条件(＜50μMol/m2s)下萌发。光照条件下的萌发产生外植体，所述外植体与黄化的下胚轴相比更稳定并更易操作。将4至7mm长度的下胚轴段在农杆菌细胞浴中温和振摇下接种至多4分钟，随后筛分外植体。将感染的植物转移至其表面上携带一层Whatman滤纸的含有共培养培养基的皮式培养皿，培养基是MS培养基，pH 5.6，3％蔗糖，0.6g/L MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)，18g/L甘露糖醇，0.7％植物琼脂(Duchefa Biochemie，PO Box 809 2003 RV Haarlem，荷兰，货品数目SKU：P1003)，100mg/L乙酰丁香酮，200mg/L L-半胱氨酸，1mg/L 2，4D(2，4-二氯苯氧基乙酸)。将皮式培养皿用胶带密封并且在23℃于长日照条件(16小时光照/8小时黑暗)下孵育三天。在三天共培养时间后，将外植体转移至MS培养基，pH 5.6，3％蔗糖，0.6g/L MES，18g/L甘露糖醇，07％植物琼脂，1mg/L 2，4D和500mg/L羧苄青霉素防止农杆菌生长，并且对于恢复期，在与共培养相同的物理条件下孵育7天。
为了选择性再生，将外植体在恢复期后转移至MS培养基，pH 5.8，3％蔗糖，0.7％植物琼脂，2.5mg/L AgNO3，3mg/L BAP(6-苄氨基嘌呤)，0.1mg/L GA(赤霉酸)，0.1mg/L NAA(1-萘乙酸)，500mg/L羧苄青霉素，100nM咪草烟(Pursuit)，并且在如上文所述的长日照条件下培养2周。每两周进行继代培养。激素如下逐步减少：BAP：3至0.5至0.05mg/L；GA(赤霉酸)：0.1至0.25至0.25mg/L；NAA：0.1至0至0mg/L。
可以在第二轮选择性再生后收获正在发育的小苗。将小苗切下并转移至伸长/生根培养基(MS培养基，pH 5.8，2％蔗糖，100mg/L肌-肌醇，40mg/L硫酸腺嘌呤，500mg/L MES，0.4％Sigma琼脂，150mg/L特美汀，0.1mg/L IBA(吲哚-3-丁酸))或转移至离体长日照条件下在覆盖的箱中以1/10体积无蔗糖的MS培养基，pH 5.8浇灌的岩棉/石棉或泡沫垫(Grodan，GRODAN Group P.O.Box 1160，6040 KD Roermond The Netherlands，或Oasis，919 Marvin Street，Kent，OH 44240 USA)上。
苗伸长并在体外培养基中生根并且直接转移至土壤。
对体外苗或GH适应的苗采样供分子分析。
使用高压灭菌(以下组分例外：抗生素、激素、添加物如L-半胱氨酸、乙酰丁香酮、咪唑啉酮)或过滤消毒制备(将琼脂组分高压灭菌，允许冷却至42℃并且随后使用)的培养基。
实施例6：使用BiBAC产生转基因植物的程序
对于BiBAC转化，使用如对共转化方案所述那样相同的方案，例外仅使用一种构建体。根据双元质粒的原核卡那霉素抗性基因，使用50mg/L卡那霉素而非壮观霉素供农杆菌生长。在这项研究期间观察到，携带BiBAC的农杆菌生长非常缓慢，经常耗时18小时以达到视为最佳用于植物转化的液体培养物OD600nm。下表给出在转化构建体LTM593期间记录的某个关键数据的一个例子
通过上文描述的植物转化方案产生的单拷贝事件的量是45％，并且38％在分别转化构建体LTM593和LTM595后选择的无载体主链事件是单拷贝事件(参见表15)。
表15：采用两个BiBAC菌株VC-LTM593-1qcz rc和VC-LTM595-1qcz rc进行的转化实验中具有和没有载体主链的单拷贝事件和双拷贝事件的统计结果
转化成功的一个重要的关键结果是选出农杆菌菌株。尽管最初方法(参见De Bloc等人(1989)Plant Physiology 91：694-701)使用根癌农杆菌菌株C58C1pMP90，但所描述的方法基于发根农杆菌菌株SHA001(关于SHA001和SHA017，参见WO2006024509 A2)。甚至在发根农杆菌菌株内部，我们已经实现转化成功对所用菌株和构建体的明确响应(参见表16)。
表16：发根农杆菌菌株对成功转化BiBAC的影响
表17：所用各种质粒和农杆菌菌株的转化效率。就整合T-DNA而言，可能的是，多拷贝或单拷贝的完整或截短的或重复的T-DNA可以插入基因组中。术语单拷贝或多拷贝指插入植物基因组的特定T-DNA或T-DNA片段的拷贝数。术语基因座指植物基因组内向其插入T-DNA单拷贝或多拷贝的许多不同位置，并且定义为基因组内部的不平衡区域并且可能在植物物种之间和甚至在给定物种的栽培品种内部变动。出于这个定义的目的，这处于一个遗传图单元或厘摩范围内。
实施例7：温室和田间的种子萌发和植物生长
在温室和田间栽培转化的植物供种子产生和表型评估。温室生长条件是16小时光照时间，随后8小时黑暗时间。温度是光照时间(也称作昼间时间)期间20摄氏度，光水平对应于200-300微摩尔光子m-2s-1(这是在植物顶部的入射光并且根据与植物的距离调整光以实现这个比率)。在昼间时间期间，温室中的光范围在130和500微摩尔光子m-2s-1之间变动。超出刚才提及的昼间范围则触发使用人工照明灯以引起光水平至200-300微摩尔光子m-2s-1或遮蔽和/或关闭照明灯以引起光水平返回200-300微摩尔光子m-2s-1。黑暗时间(也称作夜晚时间)温度是18℃。光照时间开始之前四小时，降低温度至15℃持续黑暗时间的剩余部分。按需对植物进行灌溉并且处理昆虫。土壤类型是Floragard(Oldenburg，德国)提供的50％Floradur B Seed+50％Floradur B Cutting(包含细砂和珍珠岩)。通过补充养分增强植物生长。养分与每日浇灌组合。0.1％(w/v)肥料液(Hakaphos Blue 15(N)-10(P)-15(K)，Compo GmbH&Co KG，明斯特，德国)用来浇灌植物。按需供水(例如，根据植物生长阶段、水消耗量等)。为了避免交叉授粉，植物在首花开放的时间套袋。每天检查植物以确保全部开放的花用袋子覆盖。恰当地移除未覆盖的开放花。
对于田间培育的植物，在气候上对应于USDA生长区3a-4b和5a的六个位置和气候上对应于USDA生长区8a-9b和11的五个位置培育植物。在夏季培育在对应于USDA生长区3a-4b和5a的地区培育的植物，并且在冬季培育在对应于USDA生长区8a-9b和11的地区培育的植物。遵循卡诺拉油菜标准园艺惯例。如培育者认为必要，使用保护免遭禽类和昆虫影响的架网和其他措施，除草剂和肥料应用也是如此。全部位置的种植密度均是每平方米八十粒种子，萌发率为95％或更高。
在出于种子质保或控制目的，需要确定萌发率或在萌发种子以获得子叶或籽苗组织是有利的情况下，使用以下方案：
使用150mm X 15mm皮氏培养板和切割成120mm圆片的Whatman(2号)滤纸。滤纸用无菌去离子水预先润湿。获得一百粒适宜株系的种子并且均匀撒遍预先润湿的滤纸。
清洁和无菌镊子用来撒播种子，以获得如上文所示的均匀样式。添加额外的无菌水以确保种子和纸润湿、但不漂浮。每个皮氏培养板使用的水总量是大约20mL。对于测试的每个基因型，处理三块平板。平板用外科胶带VWR(1050 Satellite Blvd.Suwanee，GA30024 USA)目录编号56222-110密封。在密封平板后，随后将它们在设定至90％湿度、设定至16小时光周期伴以20摄氏度昼间温度和15摄氏度夜间温度的萌发室中孵育。光强度是每平方米每秒90-120微摩尔。评定萌发两次，一次在安置平板至生长箱后四个天时进行并且在孵育后八天时再次进行。
实施例8：植物油的脂质提取和脂质分析
通过在例如上文所述的合适条件下培育植物并且对增强所需分子(例如脂类或某种脂肪酸)的产生而分析生长培养基和/或细胞组分，确定基因修饰在植物中的结果或对产生所需分子(例如某种脂肪酸)的影响。如标准文献中所述那样提取脂质，所述标准文献包括Ullman，Encyclopedia of Industrial Chemistry，Bd.A2，S.89-90和S.443-613，VCH：Weinheim(1985)；Fallon，A.，等人，(1987)″Applications of HPLC in Biochemistry″引自：Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Bd.17；Rehm等人(1993)Biotechnology，Bd.3，Kapitel III：″Product recovery and purification″，S.469-714，VCH：Weinheim；Belter，P.A.，等人(1988)Bioseparations：downstreamprocessing for Biotechnology，John Wiley and Sons；Kennedy，J.F.和Cabral，J.M.S.(1992)Recovery processes for biological Materials，John Wiley and Sons；Shaeiwitz，J.A.和Henry，J.D.(1988)Biochemical Separations，引自：Ullmann’sEncyclopedia of Industrial Chemistry，Bd.B3；第11章，S.1-27，VCH：Weinheim；和Dechow，F.J.(1989)Separation and purification techniques in biotechnology，Noyes Publications。
公认的是，可以使用不同于上文援引的其他方案，如Cahoon等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(22)：12935-12940和Browse等人(1986)AnalyticBiochemistry 152：141-145中所述，实施脂质和脂肪酸的提取。在Christie，William W.，Advances in Lipid Methodology，Ayr/Scotland：Oily Press(Oily Press LipidLibrary；2)；Christie，William W.，Gas Chromatography and Lipids.A PracticalGuide-Ayr，Scotland：Oily Press，1989，Repr.1992，IX，307S.(Oily Press LipidLibrary；1)；″Progress in Lipid Research″，Oxford：Pergamon Press，1(1952)-16(1977)u.d.T.：Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN中描述了用于定量和定性分析脂质或脂肪酸的方案。
为了产生含有实施例3和4中描述的遗传元件的转基因植物以在种子中产生EPA和DHA，将油菜(欧洲油菜)如实施例5和6中所述那样转化。在实施例7援引的条件下培育选出的含有实施例3和4中描述的遗传元件的植物，直至成熟的种子形成。如上文所述从收获的种子提取脂肪酸并且使用如上文所述的气相色谱法进行分析。脂肪酸含量(水平)在本发明自始至终表述为(全部脂肪酸的总重量)的(特定脂肪酸的重量)百分数。类似地，油的其他组分的含量以“％w/w”给出。例如，TAG或PC的含量(水平)在本发明自始至终表述为全部TAG或PC的总重量、尤其本发明油或脂质中存在的全部TAG或PC的总重量的(特定TAG或PC的重量)百分数。在一个实施方案中，化合物的含量如实施例中所述测定。例如，含量可以如实施例29、31或32中那样测定。种子油含量在本发明自始至终表述为(种子的总重量)的(油重量)百分数。
表18：使用气相色谱分析的脂肪酸
实施例9：籽苗的单片子叶中脂质的非破坏性分析
根据实施例5和实施例6中描述的方法转化植物导致了T-DNA随机整合至基因组中。已知这类整合还可以按不完整方式发生，可能发生完整和不完整T-DNA的进一步多重整合。T0植物的自我授粉将导致产生这样的T1种子，所述T1种子将根据Gregor Mendel(Mendel，1866)观察到并且现在成为生命科学基本常识组成部分的比率对T-DNA插入分离。归因于孟德尔分离；对于每种T-DNA整合，四分之一(约25％)的T1种子已经丢失该整合，并且可以称作“无效分离子”。50％的T1种子将在母方染色体(25％)或父方染色体(25％)上携带T-DNA整合；这些种子是与T-DNA整合相关‘杂合的’或‘半合的’。剩余四分之一(约25％)的T 1种子将在母方染色体和父方染色体上携带T-DNA；这些种子是与T-DNA整合相关‘纯合的’。对于遵循这种有性繁殖的植物，必需通过选择针对T-DNA整合为纯合的子代，遗传地固定T-DNA整合。
为了鉴定其中性状必需的每个T-DNA整合为理想的纯合T1籽苗，可以进行定量PCR以直接测量T-DNA整合的拷贝数。备选地，可以分析因存在T-DNA而赋予的性状，这至少能够实现鉴定不含全部目的T-DNA的全部种子(无效分离子)。对于实施例10至实施例14中描述的全部构建体并且在指示的情况下，对VLC-PUFA产生进行非破坏性分析。为此目的，将T1种子于黑暗下在湿滤纸上萌发三天。三天后，切下两片子叶之一令其接受如实施例8中所述的脂质分析。另一片子叶，包括下胚轴和根，栽种在土壤中。作为一个实施例，图22中显示来自这些子叶的脂质含量分析结果，其中所述子叶来自从实施例11中描述的构建体组合获得的发生分离的T1籽苗事件LANPMZ；图23中显示从实施例15中描述的构建体组合获得的事件LBDIHN的结果。在这两幅图中，观察到四分之一的种子不产生显著量的VLC-PUFA，而产生野生型水平的油酸(无效分离子籽苗)。可以在这两幅图中进一步观察到产生不同量VLC-PUFA的籽苗的两个额外聚类，参见图23。计数相应这些聚类中种子的数目，对产生(约0VLC-PUFA)∶(中间水平VLC-PUFA)∶(较高水平VLC-PUFA)的聚类观察到1∶2∶1分离比率。观察结果证明了‘基因剂量’(基因组中存在的T-DNA拷贝的数目)和VLC-PUFA水平之间的关系。对于实施例10至实施例13中描述的全部构建体并且在指示的情况下，利用这种关系鉴定其中至少一个T-DNA基因座已经变得纯合或其中至少存在多个T-DNA整合基因座或一些纯合而其他仍分离的T1植物。可以对事件LANPMZ证明这种方法的适用性，参见图22，产生VLC_PUFA的事件LANPMZ的全部杂合(半合子)和纯合T1种子均能够同时产生EPA和DHA。由于DHA产生需要两种T-DNA的存在，可以得出结论，VC-LJB2197-1qcz的T-DNA的至少一个拷贝和VC-LLM337-1qcz rc的T-DNA的至少一个拷贝已经插入基因组中，或许插在相同的基因座处。已经选择具有最高VLC-PUFA水平的LANPMZ事件的那288株籽苗中的13株T1籽苗并且已经将其培育为成熟植物。对表40中所示的这13株选定植物的拷贝数分析表明，两种T-DNA均以单拷贝存在，并且对13株T1植物的平均结果比较T0植物拷贝数结果表明，这些单一T-DNA插入是纯合的(重复的拷贝数)。所有合并的结果提供如下信息：事件LANPMZ含有VC-LJB2197-1qcz构建体的T-DNA和VC-LLM337-1qcz rc构建体的T-DNA，各自为一个拷贝，而两种T-DNA在单个基因座中共分离。
对于单T-DNA整合入基因组，1/4的T1种子预计对这个T-DNA整合为纯合。对于每种额外的T-DNA整合，仅四分之一对全部其他T-DNA整合纯合的全部种子对额外的T-DNA整合是纯合的，因此，对于双T-DNA整合入基因组事件，1/16的T1种子预计对两种T-DNA整合为纯合；对于三种T-DNA整合入基因组，1/64的T1种子预计对全部三种T-DNA整合为纯合；对于四种T-DNA整合入基因组，1/256的T1种子预计对全部四种T-DNA整合为纯合，等。实施例10至实施例14中的全部植物均含有最小二个T-DNA插入事件(每种质粒提供一个)，以便植物含有全部必需基因以产生充分重建PUFA途径的全部所需酶以产生VLC-PUFA：DHA和EPA以及ARA。
实施例10：含有VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM306-1qcz rc的质粒的T-DNA(实施例5中的组合A)的植物，以供在种子中产生EPA和DHA
在这个实施例中，将合成EPA和DHA所要求的遗传元件在两个不同的T-DNA上转移入植物基因组。为此目的，将含有两个不同T-DNA的两种不同质粒VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM306-1qcz rc克隆入农杆菌，并且将植物组织根据实施例5与这两种农杆菌培养物同时温育孵育，其中除含有VC-LJB2197-1qcz或VC-LLM306-1qcz rc之外，所述农杆菌培养物是相同的。归因于除草剂抗性选择标记，再生植物至少含有VC-LJB2197-1qcz的T-DNA。仅保留还含有质粒VC-LLM306-1qcz rc的T-DNA的那些植物，如通过实施例24(含有用于确定基因表达和基因拷贝数的PCR的描述)中所述那样实施的PCR证实。仅同时含有质粒VC-LJB2197-1qcz的T-DNA和质粒VC-LLM306-1qcz rc的T-DNA的植物含有种子中合成EPA和DHA需要的全部遗传元件。表1中列出了VC-LJB2197-1qcz的遗传元件和每种元件的功能。表3中列出了VC-LLM306-1qcz rc的遗传元件和每种元件的功能。出于方便，表19中额外列出在携带VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM306-1qcz rc的两种T-DNA的植物的种子中表达的全部酶，所述酶是合成EPA和DHA必需的。
表19：由质粒VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM306-1qcz rc的T-DNA携带的EPA和DHA合成有用的基因的合并列表。
夏季期间温室栽培的携带质粒VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM306-1qcz rc的T-DNA的T0植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
表20、表21和表22中的数据显示，在植物中比较一个拷贝与二个拷贝的每种T-DNA(VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM306-1qcz rc)时，存在DHA和EPA含量的增加。已经通过测量T0世代中T-DNA的左边界，确定构建体VC-LJB2197-1qcz的拷贝数，并且没有其他遗传元件与T-DNA在一起(参见表20)。有可能的是，88株代表单拷贝类别的植物实际上含有额外的不完整T-DNA插入，并且86株代表双拷贝类别的植物可能实际上缺少T-DNA之一的一部分。因此，归因于将T0植物正确划分成“单拷贝”组和“双拷贝”组的数据不足，两种群体重叠。双拷贝和三拷贝T-DNA之间的比较揭示，存在DHA和EPA的最小增加，从而显示当考虑拷贝数直至三时，每种基因的双拷贝足以实现VLC-PUFA生物合成途径(C20和C22PUFA，包括但不限于EPA、DHA和ARA)的最大性能。值得注意的是，这个实施例大部分插入是单拷贝或双拷贝事件。表23表示，就PUFA途径或编码PUFA途径基因的T-DNA的拷贝数而言，当植物携带单拷贝、双拷贝或三拷贝目的T-DNA时，对植物形态或发育不存在明显的影响。
冬季期间温室栽培的携带质粒VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM306-1qcz rc的T-DNA的T1植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
拷贝数分析显示，LALTHK对VC-LJB2197-1qcz T-DNA的双拷贝纯合并且对VC-LLM306-1qcz rc的单拷贝纯合，而LALJCX对两种T-DNA(VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM306-1qcz rc)的双拷贝纯合。其他事件仍部分地对T-DNA分离，但是在全部植物中均含有每个T-DNA的至少一个拷贝。事件LALTHK不积累DHA，这显示在插入T-DNA期间可能发生的截短作用的影响。LALTHK例外，这些事件处于误差范围内，就EPA+DHA积累而言彼此相似。事件拷贝数的相似性(参见表23)表示，可能增强或阻抑基因表达的插入位点效应同等地影响全部事件。EPA和DHA积累缺少显著变异表明，构建体设计中可能存在缓冲效应，从而T-DNA以最大限度减少T-DNA中基因表达的位置效应的方式整合入基因组。具有VLC-PUFA、尤其EPA和DHA最高积累的事件是LALFWA，相对于成熟种子中的总脂肪酸含量，该事件具有4.2％DHA和16％EPA的最大积累，但平均而言类似于其他事件。
夏季期间温室栽培的携带质粒VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM306-1qcz rc的T-DNA的T2植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
拷贝数分析(参见表28)表明，选出的事件大多对VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM306-1qcz rc的T-DNA上编码的基因是纯合的。除LALTLE外的全部事件均具有插入基因组的双拷贝T-DNA。LALTLE似乎具有多于二个拷贝，同时某种分离仍正在发生。基于拷贝数分析，LALJDF已经整合单拷贝的d4Des(Eg_GA)基因并且LALTLE正在相对于该基因的单拷贝或双拷贝分离。表29和表30中的EPA数据和DHA数据表明，基于表30，各事件表现同等地良好，同时LALJDF或许积累较少的DHA。对于检验的全部事件，植物形态相同。如上文对温室中培育的T1植物所讨论，事件间变异很小，从而显示插入位点位置效应的影响(积极和消极)对全部事件相似。插入位点效应的缺少表示质粒设计/T-DNA拓扑结构正在产生正常化效应/缓和插入位点效应。
在夏季期间USDA生长区带3a-4b和5a田间试验栽培的携带质粒VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM306-1qcz rc的T-DNA的T2植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
表32和表33上的田间数据显示了T2和T3的一致性跨世代性能。数据显示温室培育植物的PUFA(EPA和DHA)积累更高。除了VLC-PUFA水平外，与温室相比还观察到存在种子含油量差异(例如，比较表34和表31)。这项分析的结果在实施例20中描述。田间数据还显示，温室数据精确地显示事件之间EPA和DHA积累方面的一致性，尽管并非是总体水平。如上文对温室中培育的T1和T2植物所评论，这个构建体的事件间变异很低，这表明T-DNA或多个T-DNA设计似乎对基因沉默效应和其他位置效应产生缓冲/缓解效应。
表34：田间栽培的含有质粒VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM306-1qcz rc的T-DNA的卡诺拉油菜事件的T2植物的表型评定。第一列中显示事件，连同依照事件评定的田间小区的数目。油：含油量(％种子重量)，蛋白质：蛋白质含量(无油的种籽饼粕％)
实施例11：含有质粒VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM337-1qcz rc的T-DNA(实施例5中的组合B)的植物用于在种子中产生EPA和DHA
在这个实施例中，将合成EPA和DHA所要求的遗传元件在两个不同的T-DNA上转移入植物基因组。为此目的，将含有两个不同T-DNA的两种不同质粒VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM337-1qcz rc克隆入农杆菌，并且将植物组织根据实施例5与这两种农杆菌培养物同时孵育，其中除含有VC-LJB2197-1qcz或VC-LLM337-1qcz rc之外，所述农杆菌培养物是相同的。归因于除草剂抗性选择标记，再生植物含有VC-LJB2197-1qcz的T-DNA。仅保留还含有质粒VC-LLM337-1qcz rc的T-DNA的那些植物，如通过实施例24(含有用于分析基因表达和拷贝数的PCR方案)中所述那样实施的PCR证实。仅含有质粒VC-LJB2197-1qcz的T-DNA和质粒VC-LLM337-1qcz rc的T-DNA的植物组合了种子中合成EPA和DHA需要的全部遗传元件。表1中列出了VC-LJB2197-1qcz的遗传元件和每种元件的功能。表4中列出了VC-LLM337-1qczrc的遗传元件和每种元件的功能。出于方便，表35额外列出在携带VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM337-1qcz rc的两种T-DNA的植物的种子中表达的全部酶，所述酶是合成EPA和DHA必需的。
表35：由质粒VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM337-1qcz rc的T-DNA携带的EPA和DHA合成必需的基因的合并列表。
夏季期间温室栽培的携带质粒VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM337-1qcz rc的T-DNA的T0植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
表34表示T-DNA优势地作为单拷贝和双拷贝整合。如实施例10中观察到，来自两个构建体的T-DNA单拷贝和双拷贝之间存在EPA和DHA的增加，参见表36，但是在双拷贝和三拷贝之间差异较小。表37中的T1数据也反映这点。如实施例10中所示，不存在携带来自两种构建体的T-DNA的植物的观测表型改变，无论拷贝数是多少(至多三个)。
冬季期间温室栽培的携带质粒VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM337-1qcz rc的T-DNA的T1植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
表39的数据显示，这两种T-DNA(VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM337-1qcz rc)的整合已经以如此方式发生，从而引入的在给定的T-DNA上各个基因的拷贝数变异(显示随着插入的多重拷贝一起的截短和缺失)。例如，表39上的事件LAMABL相对于单拷贝AHAS(纯合)、双拷贝j-t-StCAT_p2_p-LuPXR(纯合)、可能的三拷贝c-d6Elo(Pp_GA)(或许纯合，不过它可能是相对于全部三个拷贝并非纯合的三个拷贝)和三拷贝j-i-Atss18_c-d6Elo(Pp_GA2)(相对于全部三个拷贝均纯合)正在分离。表42至表45上脂肪酸特征的数据显示事件之间的某种变异，尽管差异不大。表41上所列的对DHA和EPA平均而言最高的事件是LAMRHL，它具有相对于种子总脂肪酸含量百分数而言1.9的DHA和10.5的EPA并且含有或许仍正在分离的VC-LJB2197-1qcz单拷贝T-DNA，而VC-LLM337-1qcz rc似乎是一个单拷贝纯合插入。相对于种子总脂肪酸含量百分数，具有最低EPA和DHA组合水平的LANMGC事件含有3.7的EPA和0.8的DHA。LANMGC似乎对于VC-LJB2197是纯合单拷贝并且携带VC-LLM337的至少两个独立整合。对于EPA和DHA的最高单株植物水平，事件LAPWLP具有相对于种子中总脂肪酸百分数而言3.2％的DHA和15.9％的EPA，表43。数据显示，插入位点的位置对这种构建体组合中的EPA和DHA积累重要。如先前实施例中所见，单拷贝插入与双拷贝插入的比较揭示，在含有单拷贝和含有双拷贝的植物之间存在VLC-PUFA水平增加，但是在含有双拷贝和含有三拷贝的植物之间区别较小。表46证明了表型评分/评估并且显示各事件之间和在转化的植物和未转化的参比之间地上部分表型的某些微小差异。
夏季期间温室栽培的携带质粒VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM337-1qcz rc的T-DNA的T2植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
表48显示选定事件的拷贝数分析。这些事件含有一至二个纯合插入并且某些事件具有额外的仍正在分离的插入。例如，LANBCH作为纯合相对于每个构建体的一个T-DNA插入而分离，而LANPMZ作为纯合相对于每个构建体的两个T-DNA插入而分离。LALXOL似乎相对于VC-LLM337-1qcz rc的一个非纯合插入分离，并且相对于LJB2197-1qcz_F的一个纯合插入连同另一个拷贝分离，其中所述另一个拷贝除了j-t-StCAT_p2_p-LuPXR周围区域外并非纯合，似乎是相对于每个拷贝纯合的双拷贝事件。对于选定的T2事件，DHA和EPA合并水平是种子中存在的总脂肪酸的9％至13％。同时，选定的T3事件具有从11％至23％变动的DHA和EPA合并水平，而相对于种子中总脂肪酸含量，LALWPA具有5％的DHA水平和18％的EPA水平，参见表50。相对于彼此或相对于野生型，选定的事件未显示出形态学或解剖缺陷。
在夏季期间USDA生长区带3a-4b和5a田间试验栽培的携带质粒VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM337-1qcz rc的T-DNA的T2植物的脂肪酸特征。
来自T3种子的田间数据显示，EPA和DHA的田间值比温室中观察值低，合并EPA和DHA的值从6％至13％的种子总脂肪酸含量变动。这些数据显示田间研究中观察到的种子含油量与温室相比存在差异(例如，比较表54与表51)，还参见实施例10。这项分析的结果在实施例20中描述。
冬季期间温室栽培的携带质粒VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM337-1qcz rc的T-DNA的T3植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
数据显示，在T4种子/世代中EPA和DHA仍由植物合成。
在冬季期间USDA生长区带8a-9a田间试验栽培的携带质粒VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM337-1qcz rc的T-DNA的T3植物的脂肪酸特征和表型。
数据显示在田间，T4种子产生EPA和DHA，但以低于夏季田间试验中所见(上文，夏季在田间栽培在的T2植物))的水平产生。温室数据显示与夏季田间试验相比更高的含油量(比较表61与表54)。实施例20中详细分析该数据。
在夏季期间USDA生长区带3a-4b和5a田间试验栽培的T4植物的脂肪酸特征和表型，该T4植物携带质粒VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM337-1qcz rc的T-DNA。
数据显示，直至T5世代，转化体仍以与夏季T2植物的田间试验一致的水平产生EPA和DHA。额外的观察结果是在这两个田间试验之间油水平相当。
实施例12：含有质粒VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM338-3qcz rc的T-DNA(实施例5中的组合C)的植物，用于在种子中产生EPA和DHA。
在这个实施例中，将合成EPA和DHA所要求的遗传元件在两个不同的T-DNA上转移入植物基因组。为此目的，将含有两个不同T-DNA的两种不同质粒VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM338-3qcz rc克隆入农杆菌，并且将植物组织根据实施例5与这两种农杆菌培养物同时孵育，其中除含有VC-LJB2197-1qcz或VC-LLM338-3qcz rc之外，所述农杆菌培养物是相同的。归因于除草剂抗性选择标记，再生植物含有VC-LJB2197-1qcz的T-DNA。仅保留还含有质粒VC-LLM338-3qcz rc的T-DNA的那些植物，如通过实施例5中所述那样实施的PCR证实。仅含有质粒VC-LJB2197-1qcz的T-DNA和质粒VC-LLM338-3qcz rc的T-DNA的植物组合了种子中合成EPA和DHA需要的全部遗传元件。表1中列出了VC-LJB2197-1qcz的遗传元件和每种元件的功能。表5中列出了VC-LLM338-3qcz rc的遗传元件和每种元件的功能。出于方便，表65中额外列出在携带VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM338-3qcz rc的两种T-DNA的植物的种子中表达的全部酶，所述酶是合成EPA和DHA必需的。
表65：由质粒VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM338-3qcz rc的T-DNA携带的EPA和DHA合成必需的基因的合并列表。
夏季期间温室栽培的携带质粒VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM338-3qcz rc的T-DNA的T0植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
表67和表68中的数据显示，对于这种构建体，当单拷贝事件与双拷贝事件比较时，EPA和DHA的增加更多难以察觉，但是双拷贝事件的EPA和DHA增加仍超过单拷贝事件。如其他实施例中观察到，不存在携带来自两种构建体的T-DNA的植物表型的明显观测到的改变。
实施例13：含有质粒VC-LJB2755-2qcz rc和VC-LLM391-2qcz rc的T-DNA(实施例5中的组合D)的植物，用于在种子中产生EPA和DHA。
在这个实施例中，将合成EPA和DHA所要求的遗传元件在两个不同的T-DNA上转移入植物基因组。为此目的，将含有两个不同T-DNA的两种不同质粒VC-LJB2755-2qcz rc和VC-LLM391-2qcz rc克隆入农杆菌，并且将植物组织根据实施例5与这两种农杆菌培养物同时孵育，其中除含有VC-LJB2755-2qcz rc或VC-LLM391-2qcz rc之外，所述农杆菌培养物是相同的。归因于除草剂抗性选择标记，再生植物含有VC-LJB2755-2qcz rc的T-DNA。仅保留还含有质粒VC-LLM391-2qcz rc的T-DNA的那些植物，如通过实施例5中所述那样实施的PCR证实。仅含有质粒VC-LJB2755-2qcz rc的T-DNA和质粒VC-LLM391-2qcz rc的T-DNA的植物组合了种子中合成EPA和DHA需要的全部遗传元件。表2中列出了VC-LJB2755-2qcz rc的遗传元件和每种元件的功能。表6中列出了VC-LLM391-2qcz rc的遗传元件和每种元件的功能。出于方便，表70额外列出在携带VC-LJB2755-2qcz rc和VC-LLM391-2qcz rc的两种T-DNA的植物的种子中表达的全部酶，所述酶是合成EPA和DHA必需的。
表70：由质粒VC-LJB2755-2qcz rc和VC-LLM391-2qcz rc的T-DNA携带的EPA和DHA合成必需的基因的合并列表。
夏季期间温室栽培的携带质粒VC-LJB2755-2qcz rc和VC-LLM391-2qcz rc的T-DNA的T0植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
表72、表73和表74中的数据显示这种构建体组合能够将T-DNA插入基因组，但是EPA和DHA积累水平再次比先前实施例更难以察觉。这些构建体依然成功地汇总该途径以产生EPA和DHA和ARA，同时不影响植物的地上部分。
冬季期间温室栽培的携带质粒VC-LJB2755-2qcz rc和VC-LLM391-2qcz rc的T-DNA的T1植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
表75、表76、表77、表78、表79、表80、表81和表82的数据显示，这对构建体成功汇总了该途径以产生VLC-PUFA(C20和C22，包括EPA、DHA和ARA)。每个基因的拷贝数从T-DNA纯合单一插入变动至部分T-DNA插入和/或T-DNA在插入基因组后缺失。脂肪酸特征显示，某些事件(参见表78，事件LAPCSC)能够积累多达18％合计的EPA和DHA)。表75表明，LAPCSC相对于每种T-DNA单一插入主要为纯合，例外是构建体VC-LJB2755-2qcz上的j-p-LuPXR_i-Atss15区域，其在这个标记物周围含有该区域的至少四个拷贝。表81上提出的数据表明，携带与构建体VC-LJB2755-2qcz和VC-LLM391-2qcz rc相对应的T-DNA的植物不存在明显的表型改变。
夏季期间温室栽培的携带质粒VC-LJB2755-2qcz rc和VC-LLM391-2qcz rc的T-DNA的T2植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
表83中的数据表明，所选事件的拷贝数是T3种子中纯合的单一插入。脂肪酸特征量值(参见表84和表85)表明，来自VC-LJB2755-2qcz和VC-LLM391-2qcz rc的T-DNA的组合在VLC-PUFA途径中能够引起ARA、EPA和DHA成功积累。表86上的数据显示，不存在VC-LJB2755-2qcz和VC-LLM391-2qcz rc引起的对植物地上部分的明显影响。
在夏季期间USDA生长区带3a-4b和5a田间试验栽培的携带质粒VC-LJB2755-2qczrc和VC-LLM391-2qcz rc的T-DNA的T2植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
携带来自VC-LJB2755-2qcz和VC-LLM391-2qcz rc中T-DNA的事件的T3种子的田间数据(表87和表88中所示)表明，植物能够在田间产生VLC-PUFA(ARA、EPA和DHA)，尽管不以温室中观察到的水平产生。然而，与温室相比，还存在观测到的种子含油量差异(例如，比较表89与表86)。这些观察结果与先前实施例一致，其中观察到田间培育的植物中含油量增加，同时VLC-PUFA，尤其EPA、DHA和ARA减少。实施例20中给出关于含油量和VLC-PUFA的观察结果的更详述描述。
冬季期间温室栽培的携带质粒VC-LJB2755-2qcz rc和VC-LLM391-2qcz rc的T-DNA的T3植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
来自事件LAODDN的T3植物的T4种子，其相对于来自VC-LJB2755-2qcz和VC-LLM391-2qcz rc的T-DNA均纯合(参见表90)，积累VLC-PUFA(尤其ARA、EPA和DHA，参见表91和表92)。这个事件的种子中，EPA和DHA的组合直至总脂肪酸含量的大约10％。
在冬季期间USDA生长区带8a-9a田间试验栽培的携带质粒VC-LJB2755-2qcz rc和VC-LLM391-2qcz rc的T-DNA的T3植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
携带来自VC-LJB2755-2qcz和VC-LLM391-2qcz rc的纯合T-DNA插入的两个事件的T4种子的田间数据(参见表83和表90和表84、表87、表91)表明，在温室和田间中培育时，这些事件的确积累EPA、DHA和ARA，不过如始终如一地观察到，田间培育的材料的确不积累VLC-PUFA(ARA、EPA、DHA)至温室中所观察到的程度(参见表94和表95，与表91、表92、表87和表88比较)。如实施例11的F部分中所观察到，与夏季田间试验相比，观察到更高的含油量(比较表96与表89)。实施例20中详细分析该现象。
在夏季期间USDA区带3a-4b和5a田间试验栽培的携带质粒VC-LJB2755-2qcz rc和VC-LLM391-2qcz rc的T-DNA的T4植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
数据显示，直至T5世代，事件LAODDN仍以与(D部分中描述的)田间试验一致的水平产生EPA和DHA。这两个田间试验之间的含油量也相当。
实施例14：含有质粒VC-LJB2755-2qcz rc和VC-LTM217-1qcz rc的T-DNA(实施例5中的组合E)的植物用于在种子中产生EPA和DHA。
在这个实施例中，将合成EPA和DHA所要求的遗传元件在两个不同的T-DNA上转移入植物基因组。为此目的，将含有两个不同T-DNA的两种不同质粒VC-LJB2755-2qcz rc和VC-LTM217-1qcz rc克隆入农杆菌，并且将植物组织根据实施例5与这两种农杆菌培养物同时孵育，其中除含有VC-LJB2755-2qcz rc或VC-LTM217-1qcz rc之外，所述农杆菌培养物是相同的。归因于除草剂抗性选择标记，再生植物含有VC-LJB2755-2qcz rc的T-DNA。仅保留还含有质粒VC-LTM217-1qcz rc rc的T-DNA的那些植物，如通过实施例5中所述那样实施的PCR证实。仅含有质粒VC-LJB2755-2qcz rc的T-DNA和质粒VC-LTM217-1qcz rc的T-DNA的植物组合了种子中合成EPA和DHA需要的全部遗传元件。表2中列出了VC-LJB2755-2qcz rc的遗传元件和每种元件的功能。表7中列出了VC-LTM217-1qcz rc的遗传元件和每种元件的功能。出于方便，表100额外列出在携带VC-LJB2755-2qcz rc和VC-LTM217-1qcz rc的两种T-DNA的植物的种子中表达的全部酶，所述酶是合成EPA和DHA必需的。
表100：由质粒VC-LJB2755-2qcz rc和VC-LTM217-1qcz rc的T-DNA携带的EPA和DHA合成必需的基因的合并列表。
冬季期间温室栽培的携带质粒VC-LJB2755-2qcz rc和VC-LTM217-1qcz rc的T-DNA的T0植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
表102和表103表明，VC-LJB2755-2qcz和VC-LTM217-1qcz rc的插入的单拷贝事件的确没有积累如双拷贝事件那样多的EPA和DHA。表103表示，对于T1种子中的最高产生者，合并的EPA和DHA含量处于15％的种子总脂肪酸含量范围内(5％的总种子脂肪酸含量是DHA，并且其10％是EPA)。
夏季期间温室栽培的携带质粒VC-LJB2755-2qcz rc和VC-LTM217-1qcz rc的T-DNA的T1植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
对来自所选T1事件的植物实施的测量显示与VC-LJB2755-2qcz和VC-LTM217-1qczrc相对应的T-DNA单拷贝纯合插入(参见表104，尤其表注释)并且T2以类似于T1的水平积累EPA和DHA。对T2种子的测量(参见表106和表107)显示，EPA和DHA积累直至种子总脂肪酸含量的13％(其中大约3％的种子总脂肪酸含量是DHA)。
实施例15：含有质粒RTP10690-1qcz_F的T-DNA的植物，其用于在种子中产生EPA和DHA
使用BiBAC质粒，将这个实施例中描述的合成EPA和DHA所要求的全部遗传元件在单个T-DNA上转移入植物基因组。为此目的，将质粒RTP10690-1qcz_F克隆入农杆菌，并且将植物组织根据实施例6与这种农杆菌培养物孵育。归因于除草剂抗性选择标记，再生植物含有RTP10690-1qcz_F的T-DNA。表8中列出了RTP10690-1qcz_F的遗传元件和每种元件的功能。出于方便，表109上额外列出在携带RTP10690-1qcz_F的两种T-DNA的植物的种子中表达的全部酶，所述酶是合成EPA和DHA必需的。
表109：由质粒RTP10690-1qcz_F的T-DNA携带的EPA和DHA合成必需的基因的列表。
冬季期间温室栽培的携带质粒RTP10690-1qcz_F的T-DNA的T0植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
如表110表明，观察到这种构建体比其他构建体更少的插入事件，单拷贝事件比双拷贝多，多大约四倍。表111和表112上的脂肪酸特征数据表明，DHA和EPA可以在单拷贝事件和双拷贝事件之间以相似性能在T1中积累直至总种子脂肪酸含量的4％，处于误差范围内。表113显示，T0中不存在与这种构建体相关的明显地上部分表型。
夏季期间温室栽培的携带质粒RTP10690-1qcz_F的T-DNA的T1植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
表115和表116中的数据显示就EPA和DHA而言T2种子与T1种子的性能相似，为了比较，还参见表111和表112。选择的事件均以相似的水平表现并且相对于每个基因的单拷贝至双拷贝分离。
实施例16：含有质粒RTP10691-2qcz的T-DNA的植物，其用于在种子中产生EPA和DHA
使用BiBAC质粒，将这个实施例中描述的合成EPA和DHA所要求的全部遗传元件在单个T-DNA上转移入植物基因组。为此目的，将质粒RTP10691-2qcz克隆入农杆菌，并且将植物组织根据实施例6与这种农杆菌培养物孵育。归因于除草剂抗性选择标记，再生植物含有RTP10691-2qcz的T-DNA。表9中列出了RTP10691-2qcz的遗传元件和每种元件的功能。出于方便，表118中额外列出在携带RTP10691-2qcz的两种T-DNA的植物的种子中表达的全部酶，所述酶是合成EPA和DHA必需的。
表118：由质粒RTP10691-2qcz的T-DNA携带的EPA和DHA合成必需的基因的列表。
实施例17：含有质粒VC-LTM595-1qcz rc的T-DNA的植物，其用于在种子中产生EPA和DHA
使用BiBAC质粒，将这个实施例中描述的合成EPA和DHA所要求的全部遗传元件在单个T-DNA上转移入植物基因组。为此目的，将质粒VC-LTM595-1qcz rc克隆入农杆菌，并且将植物组织根据实施例6与这种农杆菌培养物孵育。归因于除草剂抗性选择标记，再生植物含有VC-LTM595-1qcz rc的T-DNA。表10中列出了VC-LTM595-1qcz rc的遗传元件和每种元件的功能。出于方便，表119额外列出在携带VC-LTM595-1qcz rc的两种T-DNA的植物的种子中表达的全部酶，所述酶是合成EPA和DHA必需的。
表119：由质粒VC-LTM595-1qcz rc的T-DNA携带的EPA和DHA合成必需的基因的列表。
夏季期间温室栽培的携带质粒VC-LTM595-1qcz rc的T-DNA的T0植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
类似于VC-RTP10690-1qcz_F，完整T-DNA的插入数目不如多构建体转化获得的那样高，参见表120。表121和表122显示单拷贝、双拷贝和三拷贝T-DNA的脂肪酸特征量值，并且就EPA和DHA积累而言，显示双拷贝构建体表现得比单拷贝构建体略好并且可能比三拷贝构建体略好。脂肪酸特征数据进一步显示，EPA和DHA在T1种子中的积累直至的总脂肪酸的10％，在种子中DHA直至总脂肪酸的2％。表123上显示的表型量值表明开花时间(如DFF所代表)的某种变异性。
冬季期间温室栽培的携带质粒VC-LTM595-1qcz rc的T-DNA的T1植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
表124、表125和表126的数据显示，获得了T-DNA上所含基因的多种拷贝数，其中拷贝数值是1至3。为测量脂肪酸特征所选择的事件的表现(参见表127和表128)类似于先前实施例中观察到的表现，同时对于上限值，EPA和DHA合并值是种子总脂肪酸含量的大约10％。表129中的数据表明，如先前世代中对这个构建体所观察(参见实施例17的A部分)，各种事件之间存在开花时间的某种变异。
实施例18：含有质粒VC-LTM593-1qcz rc的T-DNA的植物，用于在种子中产生EPA和DHA
使用BiBAC质粒，将这个实施例中描述的合成EPA和DHA所要求的全部遗传元件在单个T-DNA上转移入植物基因组。为此目的，将质粒VC-LTM593-1qcz rc克隆入农杆菌，并且将植物组织根据实施例6与这种农杆菌培养物孵育。归因于除草剂抗性选择标记，再生植物含有VC-LTM593-1qcz rc的T-DNA。表11中列出了VC-LTM593-1qczrc的遗传元件和每种元件的功能。出于方便，表130上额外列出在携带VC-LTM593-1qcz rc的两种T-DNA的植物的种子中表达的全部酶，所述酶是合成EPA和DHA必需的。
表130：由质粒VC-LTM593-1qcz rc的T-DNA携带的EPA和DHA合成必需的基因的列表。笫4栏和笫5栏中显示优选的多核苷酸序列和蛋白质序列。
夏季期间温室栽培的携带质粒VC-LTM593-1qcz rc的T-DNA的T0植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
来自表131上数据的一个观察结果是，从VC-LTP593-1qcz获得的插入事件数目比从实施例16或17中的BiBAC构建体获得的插入事件数目高。表132和表133上的数据表明，就VLC-PUFA积累、尤其EPA和DHA而言，双拷贝事件比单拷贝事件积累更多并且三拷贝事件比双拷贝事件积累更多，而三拷贝事件的积累为总脂肪酸的大约8％(EPA和DHA合并，总脂肪酸积累物的1.6％是DHA)。最高量积累是种子中总脂肪酸含量的大约15％百分数，这是合并的EPA和DHA，总种子脂肪酸含量的3％是DHA，参见表133。这种构建体在T0植物和T1种子中的地上部分表型显示比实施例16或17中所见更少的变异。
冬季期间温室栽培的携带质粒VC-LTM593-1qcz rc的T-DNA的T1植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
对特定事件进一步检查拷贝数并且这些事件证明T-DNA插入数目的变异，从单一插入至不完整的双插入连同双插入。另外，存在基因拷贝数的某种变异(对应于不完整插入和可能的缺失)，参见表135、表136和表137。表138和表139上显示的脂肪酸特征数据表明合并EPA和DHA的积累上限范围是总种子脂肪酸含量的18％(事件LBFDAU)。在事件LBFDAU中，T1中15％的总种子脂肪酸含量是EPA，并且3％的总种子脂肪酸含量是DHA。分析LBFDAU显示不完整双拷贝的拷贝数。具有较高水平EPA和DHA的特定事件的另一个例子是LBFGKN，其中大约12％的总种子脂肪酸含量是EPA和DHA，10％的总种子脂肪酸含量是EPA并且其2％是DHA。T1世代LBFGKN仅具有单拷贝插入事件VC-LTM593-1qcz rc，而表140、表141和表142上的数据显示就T2种子脂肪酸特征而言，双拷贝双基因座事件趋向于积累比其他拷贝数和基因座数目更多的合并EPA和DHA。这个观察结果或许反映插入位点效应的性质和影响优良事件生成的各种因素。表142表示，就植物的地上部分表型而言，存在一系列开花时间，如从36-48的DFF(至首次开花天数)所示。事件LBFDAU未相距大部分其他事件显著变动，DFF值为43，因此显示未明显影响地上部分表型或未明显影响T1植物的种子和T2种子中的总油或蛋白质积累。
冬季期间USDA生长区11中田间试验栽培的携带质粒VC-LTM593-1qcz rc的T-DNA的T1植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
具有较高水平EPA和DHA的某些事件在田间测试并且检查T1世代中的脂肪酸特征、地上部分表型(如有)和拷贝数。检查了多种构建体，包括具有所证明的不完整双拷贝插入、单拷贝插入和双拷贝插入的那些(参见表144)。表145表明，LBFDAU具有大约13％总种子脂肪酸含量的EPA含量和大约3％总种子脂肪酸含量的DHA含量，以及3.6％总种子脂肪酸的最大DHA含量和17％总种子脂肪酸的最大EPA含量(表146)。来自LBFDAU的单个种子的量值具有多达26％的EPA和4.6％的DHA，参见表147。LBFDAU的总体田间性能匹敌或超过温室的性能。
夏季期间温室栽培的携带质粒VC-LTM593-1qcz rc的T-DNA的T2植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
表148中的数据表明，所选事件的拷贝数是T3种子中纯合的单一插入。脂肪酸特征量值(参见表149和表150)表明，来自VC-LTM593-1qcz rc的T-DNA的组合在VLC-PUFA途径中能够引起ARA、EPA和DHA成功积累。表151的数据显示，不存在VC-LTM593-1qcz rc引起的对植物地上部分的明显影响。
在夏季期间USDA生长区带3a-4b和5a栽培的携带质粒VC-LTM593-1qcz rc的T-DNA的T2植物的脂肪酸特征、拷贝数测量和表型观察结果。
携带来自VC-LTM593-1qcz rc中T-DNA的事件的T3种子的田间数据(表152和表153中所示)表明，植物能够在田间产生VLC-PUFA(ARA、EPA和DHA)，尽管不以温室中观察到的水平产生。以软件JMP11.0实施ANOVA。使用Tukey检验在95％置信度水平实施分析。为了抵消从田间试验所获得数据的不平衡(例如，归因于例如天气)，统计分析中使用最小二乘均数替代均数。表表154、表155和表156中的共同字母表示最小二乘均数无显著差异。表154显示农艺学参数的统计分析。
与温室相比，存在观测到的种子含油量差异(例如，比较表154与表151)，从而表明含油量和脂肪酸特征可能关联。这些观察结果与先前实施例(实施例10、11和13)一致，其中观察到田间培育的植物中含油量增加，同时VLC-PUFA，尤其EPA、DHA和ARA减少。实施例20中给出关于含油量和VLC-PUFA的观察结果的更详述描述。
表152中的EPA％和DHA％(与脂肪酸总重量相比的每种脂肪酸的％(w/w))可以与表154中的油量组合，以计算mg EPA+DHA/g转基因事件中产生的种子。使用这种计算，确定来自事件LBFGKN的整装种子具有25.7mg EPA+DHA/g种子并且确定来自事件LBFDAU的整装种子有47.4mg EPA+DHA/g种子。
对于种子产量(kg/公顷，图88)，在有或者无咪唑啉酮除草剂处理的情况下田间培育时，将这些事件与野生型Kumily比较，未发现有统计意义的差异(使用Tukey进行检验，0.05％水平)。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种或多种产生EPA和DHA的本发明转基因植物，优选地欧洲油菜植物，因而该植物的种子产量与对照植物80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同。优选地，植物的种子产量与无咪唑啉酮除草剂处理情况下培育的对照80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同，而本发明的植物在咪唑啉酮除草剂处理的情况下培育。
在一个实施方案中，从本发明植物、优选地从田间培育的植物收获的整批种子，具有比对照植物的产量低15％、8％、4％或优选地1％或更低的测量产量(kg种子/公顷)。优选地，植物的收获整批种子产量与无咪唑啉酮除草剂处理情况下培育的对照80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同，而本发明的植物在咪唑啉酮除草剂处理的情况下培育。
因此，本发明的转基因欧洲油菜植物能够在整批种子的油中产生多于1％EPH+DHA，优选地，它在整批种子中产生多于2％、例如，多于3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或多于10％的油。优选地，本发明植物的整批种子中的油与无咪唑啉酮除草剂处理情况下培育的对照植物80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同，而本发明的植物在咪唑啉酮除草剂处理的情况下培育。含量表述为(油或脂质中存在的)全部脂肪酸的总重量的百分数(EPA+DHA的重量)。因此，含量优选地作为重量百分数给出(％(w/w))。
对照植物优选地是与本发明植物(例如，与实施例中描述的植物)遗传上至少90％、95％、96％、97％、98％或优选地99％或99.5％或更多相同，但相同条件下培育时不产生任何VLC-PUFA的植物，例如，相同条件下培育的野生型。
与未经咪唑啉酮喷洒的植物相比，除草剂处理也对种子中的EPA和DHA含量(图89)、含油量(图90)或蛋白质含量(图91)没有持续的影响。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种或多种产生EPA和DHA的本发明转基因植物，优选地欧洲油菜植物，因而该植物的含油量(图90)或蛋白质含量(图91)与对照植物80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同。
对照植物优选地是与本发明植物(例如，与实施例描述中的植物)遗传上至少90％、95％、96％、97％、98％或优选地99％或99.5％或更多相同，但不产生任何VLC-PUFA的植物，尤其，在无咪唑啉酮除草剂处理的情况下培育的对照植物，而本发明的植物在咪唑啉酮除草剂处理的情况下培育。
因此，在一个实施方案中，本发明的转基因植物的整批种子包含了含有EPA和DHA的种子油，其中甚至在咪唑啉酮除草剂处理后，种子油中的EPA和DHA含量多于种子油中总脂肪酸含量的2％、3％、4％、5％、5.9％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％。
通过评定来自每个小区的多株植物上不育性荚果的百分数，评估植物在田间的能育性。评估WT Kumily和事件LBFDGG、LBFGKN、LBFIDT、LBFIHE、LBFLDI和LBFPRA的能育性。按评分0至10，评分0意指0％荚果不育，1意指10％的荚果不育，2意指20％的荚果不育等直至10，其意指100％的荚果不育。全部小区之间野生型Kumily对照植物的平均能育性评分是0.17，意指1.7％的荚果不育。转基因事件的平均评分是0.33至0.63，意指3.3％至5.3％的荚果不育。
有意义地，表达编码如本文提到的去饱和酶或延伸酶的多核苷酸并未显著地影响所生成植物的能育性。如与对照植物(野生型植物)相比，能育性仅略微降低。
因此在一个实施方案中，本发明涉及转基因植物，优选地涉及转基因欧洲油菜，植物种子，当田间条件下培育时，其在种子油中含有多于2％、2.5％、3％、4％、5％、6％、7％、8％；9％、10％、12％或更多的EPA和DHA。如下测量植物的平均能育性，如通过随机选择多株植物，随后观察具有一个或多个不育荚果/芽的植物的百分数所测量的，该具有一个或多个不育荚果/芽的植物是对照植物中(例如，相同条件下培育的野生型植物中)观察到的相同测量的30％或更小，或是20％或更小，或是约10％或更小或是5％或更小或是4％或更小或是3.3％或更小，优选地在1％和10％之间，更优选的在3％和7％之间，例如，在3.3％和5.3％之间。
优选地对照植物优选地是遗传上与本发明的植物(例如实施例中公开的植物)至少90％、95％、96％、97％、98％或优选地99％或99.5％或更多相同，但不产生任何VLC-PUFA的植物。
在一个实施方案中，本发明的植物用中等(＞10,000碱基对)或巨大(＞30,000碱基对)的T-DNA插入物(例如，实施例中描述的T-DNA)转化。在一个实施方案中，T-DNA由1000bp至10,000bp，例如，3000bp至9000bp，优选地4000bp至8500bp组成。
表156：USDA生长区3a-4b和5a中栽培供田间试验的含有质粒VC-LTM593-1qcz rc的T-DNA的卡诺拉油菜事件的T2植物的除草剂耐受性。第一列中显示事件。IMI损伤：
根据表157中详述的量表的损伤(DAT＝处理后天数)。除草剂咪草啶酸按70g咪草啶酸/公顷的2x比率施加。作为否则相对于该事件为同基因的非转基因对比品系，欧洲油菜cv Kumily按6至7评定并且从统计分析移除，以令Tukey检验更灵敏地检测在其耐受性方面非常相似的事件之间的显著差异。
表157：针对除草剂评定卡诺拉油菜量表
实施例19：基因拷贝数对每个途径步骤处观测的转化效率的影响。
当分析本发明中所列的各种构建体的VLC-PUFA水平时，观察到T-DNA拷贝数增加时各途径步骤处的转化效率明显差异。当比较(1)相对于双拷贝T-DNA插入而具有单拷贝T-DNA插入的事件、(2)杂合植物与纯合植物和(3)分析如实施例9中所述和图22和图23中所示的分离性单个种子时的VLC-PUFA水平时，观察到这一点。这证明了‘基因剂量’(基因组中存在的T-DNA拷贝的数目)和VLC-PUFA水平之间的关系。当进一步研究时，显然当该步骤处基因数目和/或基因的表达水平或活性增加时，就针对VLC-PUFA途径的影响而言，该途径的某些基因/步骤得益更多。尽管存在来自每个基因的贡献，当存在编码活性相同的酶的多个基因难以评估时(例如，技术上难以评估两种不同ω-3-去饱和酶)，可以通过使用图2中显示的公式，计算每个途径步骤的转化效率。对代表某种基因剂量的各个植物群体计算每个途径步骤的这些转化效率，旨在研究观察到的转化效率增长是否可以归属于一个或多个独立途径步骤(例如，由于在途径的一个早期步骤增加基因剂量而增加的转化效率可以简单地在稍后步骤通过提供更多限制性底物，增加转化效率)。
转化效率有时称作“表观”转化效率，因为对于这些计算中的某些，认可计算不考虑可能影响反应的全部因素。作为可能影响反应，但在计算转化效率期间不予考虑的因素的例子；产生Δ-6-去饱和酶的底物，同时在磷脂的sn-2位置结合，而Δ-6-去饱和酶的产物形成，同时脂肪酸与CoA结合。因此并不马上显而易见的是，图33中所示的较低Δ-6-去饱和酶转化效率是否是由于通过反式酯化从PC(磷脂酰胆碱)结合型LA/ALA至CoA结合型LA/ALA的向Δ-6-去饱和酶的底物无效提供，或Δ-6-去饱和酶是否具有低活性/低转化效率。
为了解释转化效率，重要的是还要注意，任何催化的底物至产物转化过程均依赖于底物浓度、催化剂(酶)浓度和产物浓度。
依据途径步骤分析途径步骤的数据，可以进行图32至图39中的以下观察：
Δ-12-去饱和的转化效率
Δ-12-去饱和酶转化效率涵盖影响底物浓度、产物浓度和酶浓度的全部步骤。从实施例21中的数据，显而易见的是Δ-12-去饱和酶(c-d12Des(Ps_GA))酶促产生磷脂酰胆碱结合型18：2n-6(图26，小图A)，这提示底物是磷脂酰胆碱结合型18：1n-9。新形成的18：1n-9的主要通量衍生自质体产生的18：1n-9，后者输出至细胞溶胶中，在那里它与CoA结合。因此，Δ-12-去饱和的前提是CoA-结合型18：1n-9借助LPCAT(溶血磷脂酰胆碱乙酰转移酶EC 2.3.1.23)或借助LPAAT(溶血磷脂酸酰基转移酶E.C.2.3.1.51)掺入磷脂酰胆碱的sn2位置，形成的(sn2)18：1n-9-磷脂酸后续转化成(sn2)18：1n-9-DAG(DAG是二酰甘油的缩写)，因而(sn2)18：1n-9-DAG借助PDCT(磷脂酰胆碱二酰甘油磷酰胆碱转移酶EC2.7.8.2)直接转化成Δ-12-去饱和酶的底物(sn2)18：1n-9-PC(PC是磷脂酰胆碱的缩写)，或借助CPT(CPT是sn-1，2-二酰甘油：磷酰胆碱转移酶EC 2.7.8.2的缩写)获得待转化成(sn2)18：1n-9-PC的磷酰胆碱头部基团。这种掺入质体合成的18：1n-9的效率直接影响Δ-12-去饱和酶底物浓度。如已经提到，PC由PDCT转化成DAG，DAG随后转化成TAG。作为Δ-12-去饱和酶反应的组成部分的PC结合型Δ-12-去饱和酶底物和产物的量因此还直接与PDCT的底物专一性相关。
Δ-12-去饱和转化效率与Δ-12-去饱和酶的拷贝数存在强相关性(图32)。当T0单拷贝植物的平均转化效率(每种构建体的全部事件之间)与T0双拷贝植物的平均转化效率(每种构建体的全部事件之间)比较时，这显而易见。可以在T1世代中见到相同的相关性。当比较归因于杂合T-DNA整合(相对于纯合T-DNA整合)所致的拷贝数差异时，还观察到Δ-12-去饱和转化效率与Δ-12-去饱和酶拷贝数的强相关性：T0世代总是由杂合植物组成，而T1世代主要由因实施例10至实施例18中施加的选择所致的纯合植物组成。当T0单拷贝植物的平均转化效率(每种构建体的全部事件之间)与T1单拷贝植物的平均转化效率(每种构建体的全部事件之间)比较时，Δ-12-去饱和转化效率增加。类似地，当平均转化效率T0双拷贝植物(每种构建体的全部事件之间)与T1双拷贝植物的平均转化效率(每种构建体的全部事件之间)比较时，Δ-12-去饱和转化效率增加。唯一例外是：
1)T0单拷贝事件与含有VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM337-1qczrc的T-DNA的T0双拷贝事件：尽管不如VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM306-1qcz rc那样明显，但这里还存在Δ-12-去饱和酶转化效率的微妙差异。轻微差异归因于T0世代中将事件精确归属至含有构建体VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM337-1qcz rc的T-DNA的事件的双拷贝数类别的数据不足，并且
2)T0单拷贝事件与含有VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM338-3qczrc的T-DNA的T0双拷贝事件：尽管不如VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM306-1qcz rc那样明显，但Δ-12-去饱和酶转化效率的微妙差异这里也归因于T0世代中将事件精确归属至含有构建体VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM338-3qcz rc的T-DNA的事件的双拷贝数类别的数据不足，并且
3)T1单拷贝事件与含有构建体VC-LTM593-1qcz rc的T1单拷贝(单基因座)事件：这些组之间不存在因2倍拷贝数差异对转化效率所致的影响。单拷贝(单基因座)事件组受额外的现象影响，因而与杂合T0植物的分离性T1种子相比，这个纯合组的T1植物的T2种子中的平均VLC-PUFA水平下降而非增加。可以在图35中见到这个组是离群组的又一个指示，其中显而易见的是与杂合植物相比，纯合植物中Δ-5-去饱和酶转化效率显著较低。
考虑Δ-12-去饱和酶的高转化效率，通过LPCAT提供底物可能并非瓶颈。另外，数据表明，有效移除Δ-12-去饱和酶产物有助于高的转化效率。但是，考虑油中积累的18：2n-6水平高和低Δ-6-转化效率，显而易见的是并非Δ-12-去饱和的全部18：2n-6均借助反酯化作用从PC移至CoA(下一个途径步骤的作用部位)。关于18：2n-6的命运；我们的观察结果表明，Δ-12-去饱和的18：2n-6或许通过PDCT将不饱和的PC直接转化成DAG而移除，如Bates等人，(2012)Plant Physiology 160：1530-1539讨论。通过向Δ-12-去饱和酶提供新鲜的18：1n-9-PC底物，与此同时移走18：2n-6-PC产物(通过转化成DAG)，PDCT的这种活性有力地支持Δ-12-去饱和酶高转化效率。但是，后一种活性为途径的持续性带来强瓶颈，这因Δ-6-去饱和酶低转化效率而显而易见。
当分析超过6,000株植物的PUFA特征时，已经观察到这种增加Δ-12-去饱和酶转化效率的作用，所述植物已经通过将多于300个多基因构建体转化卡诺拉油菜和拟南芥获得，而全部这些构建体均携带具有花生四烯酸合成所要求的必需活性的基因。在超过300个的这些构建体当中，已经研究了超过10种不同的Δ-12-去饱和酶。
Δ-6-去饱和的转化效率
对于Δ-6-去饱和，特别重要的是强调，对这个步骤观察到的转化效率取决于底物浓度(其是CoA结合型亚油酸)、催化剂浓度(其是Δ-6-去饱和酶)和产物浓度。正是Δ-12-去饱和酶产生的PC结合型18：2n-6才需要在Δ-6-去饱和可以发生之前反酯化成CoA型。实施例10-18中不存在18：3n-6和18：4n-3积累强烈地表明，CoA-结合型18：3n-6和CoA-结合型18：4n-3被Δ-6-延伸酶高效转化，从而有效地防止18：3n-6和18：4n-3的任何明显积累。通常，全部构建体的Δ-6-去饱和酶转化效率低。考虑到高效移除产物不是瓶颈，低转化效率可能归因于Δ-6-去饱和酶的低活性，或原因在于PC结合型底物无效转化成CoA结合型底物。无论是否如此，均存在Δ-6-去饱和转化效率与Δ-6-去饱和酶拷贝数的明确相关性。以类似于Δ-12-去饱和酶的方式，观察到这一点，无论拷贝数增加的原因是什么(杂合与纯合，单拷贝基因组整合与双拷贝基因组整合)。实际上，具有构建体组合VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM306-1qcz Fc的植物在T-DNA上含有额外拷贝的Δ-6-去饱和酶。因此，22株双拷贝T1植物的组始终将在T2种子中具有不同构建体的全部相似双拷贝组的最高Δ-6-去饱和酶转化效率。
对于Δ-6-去饱和酶，观察到与Δ-12-去饱和酶相同的这个拷贝数效应例外情况。在这种情况下，设想对Δ-12-去饱和酶提到的为什么观察到这些例外情况的解释也是适用于Δ-6-去饱和酶的原因的相同解释。例外情况是：
1)T0单拷贝事件与含有VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM306-1qczrc的T-DNA的T0双拷贝事件，和
2)T0单拷贝事件与含有VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM337-1qczrc的T-DNA的T0双拷贝事件，和
3)T0单拷贝事件与含有VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM338-3qczrc的T-DNA的T0双拷贝事件，和
4)T1单拷贝事件与含有构建体VC-LTM593-1qcz rc的T1单拷贝(基因座)事件。
如对Δ-12-去饱和酶所证明的，Δ-12-去饱和酶产物的量随Δ-12-去饱和酶的拷贝数增加而增加，这暗示Δ-6-去饱和酶的底物量增加。由于全部实施例10至18中Δ-12-去饱和酶和Δ-6-去饱和酶均含于相同的T-DNA上，所以当Δ-12-去饱和酶的拷贝数增加时，Δ-6-去饱和酶的拷贝数也将增加，例外是其中T-DNA的截短型插入含有Δ-12-去饱和酶并且不含Δ-6-去饱和酶或反之亦然的事件。
总之，不仅Δ-12-去饱和酶的基因拷贝重复的影响令人惊讶，还出乎意料的是，Δ-6-去饱和酶的拷贝数增加导致Δ-6-去饱和酶蛋白的量增加，并且这种增加量的蛋白质可以转化额外量的Δ-12-去饱和的脂肪酸，连同转化速率增加。为了显示这种影响，这里作为示例，比较了实施例10至18中所示的具有基因拷贝数差异“四”的两个组：
组A：全部275株含有构建体VC-LTM593-1qcz Fc的T-DNA单拷贝的杂合T0植物
组B：全部64株在两个不同染色体基因座处含有构建体VC-LTM593-1qcz rc的T-DNA双拷贝的纯合T1植物。
在组A中，含有因Δ-12-去饱和酶活性所致双键的脂肪酸的总量是47.3％并且含有因Δ-6-去饱和酶活性所致双键的脂肪酸的总量是11.2％。因此，全部脂肪酸的23.7％接受Δ-12-去饱并且还接受Δ-6-去饱和。
在组B中，含有因Δ-12-去饱和酶活性所致双键的脂肪酸的总量是61％并且含有因Δ-6-去饱和酶活性所致双键的脂肪酸的总量是23.7％。因此，全部脂肪酸的38.8％接受Δ-12-去饱并且还接受Δ-6-去饱和。
因此，组B中该途径的Δ-6-去饱和酶下游全部的脂肪酸的总量两倍于组A。
当分析超过6,000株植物的PUFA特征时，已经观察到这种增加Δ-6-去饱和酶转化效率的作用，其中所述植物已经通过将多于300个多基因构建体转化入卡诺拉油菜和拟南芥获得，而全部这些构建体均携带具有花生四烯酸合成所要求的必需活性的基因。在超过300个的这些构建体当中，已经研究了超过5种不同的Δ-6-去饱和酶。
Δ-6-延伸的转化效率
如图34中显而易见，Δ-6-延伸作用的转化效率极高，无论拷贝数是多少。因为，拷贝数介导对转化效率的影响有时不显著，但有时清晰地观察到。例如，对构建体组合VC-LJB2755-2qcz rc+VC-LLM391-2qcz rc和组合LJB2755-2qcz rc和VC-LTM217-1qcz rc获得的事件含有相对于全部构建体最低的Δ-6-延伸转化效率，这可以归因于如下事实：这些构建体组合仅编码一种Δ-6-延伸酶[c-d6Elo(Tp_GA2)]，而非两种[(c-d6Elo(Tp_GA2))、c-d6Elo(Pp_GA2)]。
Δ-5-去饱和的转化效率
图35中的数据未显示Δ-5-去饱和酶的一致性构建体非依赖的拷贝数依赖性。
ω-3-去饱和的转化效率
图36显示了已经通过不包括图2中所示C18底物和产物而算得的ω-3-去饱和酶转化效率，因而不包括ω-3-去饱和酶的Δ-15-去饱和酶比活性。图37显示了已经通过包括C18底物和产物而算得的ω-3-去饱和酶转化效率，因而包括ω-3-去饱和酶的Δ-15-去饱和酶比活性。由于本发明中使用的两种ω-3-去饱和酶均实际上没有Δ-15-去饱和酶活性，因此从图36最佳引出关于拷贝数影响ω-3-去饱和酶的结论。尽管不如针对Δ-12-去饱和酶或Δ-6-去饱和酶观察到的那样明显，但是在许多情况下，在ω-3-去饱和酶拷贝数和ω-3-去饱和酶转化效率之间存在清晰联系。对于具有构建体组合如VC-LJB2197-1qcz+VC-LLM338-3qcz rc的植物这是特别明显的，该植物显示相对于全部其他构建体最低的ω-3-去饱和酶转化效率，这可以归因于以下事实：这种构建体组合仅编码一种ω-3-去饱和酶酶[c-03Des(Pi_GA2)]，而非两种[(c-03Des(Pi_GA2))、c-03Des(Pir_GA)]。ω-3-去饱和酶转化效率的拷贝数依赖性例外是：
1)含有构建体RTP10690-1qcz_f的T-DNA的植物，和
2)含有构建体VC-LTM595-1qcz rc的T-DNA的植物，和
3)含有VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM338-3qcz rc的T-DNA的植物，并且
Δ-5-延伸的转化效率
可以通过比较图38与图35看到全部途径步骤转化效率彼此间复杂的相互依赖性：两组含有构建体VC-LTM593-1qcz rc的T-DNA的植物(813株T1双拷贝植物组，700株双拷贝/单基因座植物组)的高Δ-5-延伸转化效率实际上不归因于高Δ-5-延伸转化效率，而归因于Δ-5-去饱和酶途径步骤处向Δ-5-延伸酶供应底物不足。类似于ω-3-去饱和酶，尽管不如Δ-12-去饱和酶或Δ-6-去饱和酶那样明显，但在Δ-5-延伸酶拷贝数和Δ-5-延伸酶转化效率之间存在联系。
Δ-4-去饱和的转化效率
如可以在图39中见到，不存在Δ-4-去饱和酶转化效率依赖Δ-4-去饱和酶拷贝数的直接证据。已经对含有构建体LJB2755-2qcz rc和VC-LTM217-1qcz rc的T-DNA的植物观察到的最高Δ-4-去饱和酶转化效率。这种构建体组合仅与组合VC-LJB2755-2qcz rc+VC-LLM391-2qcz rc差异在于d4Des(Eg)由c-d4Des(Pl_GA)2替换。作为实施例10至18中所示的植物数据和实施例22中所示的酵母数据的结论，可以明确看到，使用基因c-d4Des(Tc_GA)和d4Des(Eg)时，Δ-4-去饱和转化效率达到不能通过增加基因拷贝数克服的上限。编码c-d4Des(Pl_GA)2而非d4Des(Eg)的全部构建体均具有较高的Δ-4-去饱和转化效率，并且唯一例外是含有构建体RTP10690-1qcz_F的植物。如实施例25中所示那样，这归因于两种Δ-4-去饱和酶的表达很低。这转而凸显转化效率的确取决于基因表达，而不能克服上限。
实施例20：对VLC-PUFA水平的环境影响。每个途径步骤处含油量、VLC-PUFA水平和观测的转化效率之间的相关性
分析实施例10至18中呈现的VLC-PUFA水平，我们已经观察到，在大多数情况下，遗传上相同的植物群体(例如，其中全部植物在遗传上相同的遗传稳定事件)内部存在某个水平的变异性，甚至当这些植物在受控温室环境中培育时也是如此。为了更清晰地显示这种影响，实施例10至18中显示在几种类型植物群体当中具有最高EPA+DHA水平的种子批次的VLC-PUFA特征。这类植物群体是(1)遗传上相同，原因在于T-DNA整合(即具有相同事件的全部植物，其中全部或至少大部分植物相对于那些事件中的全部T-DNA整合为纯合)，或(2)涉及T-DNA拷贝数相同，并且这些群体已经在相同环境中培育。例如，249株分离性T1籽苗当中，针对事件LBFDAU(参见实施例18)，已经在温室中鉴定10株T1植物在具有一个完整T-DNA整合和一个截短型T-DNA整合方面相同，而发现两个T-DNA插入为纯合(表135)。在平行实施的田间试验中，大约分离性T1籽苗当中，已经鉴定4株植物为两种T-DNA插入纯合(表144)。发现在随机选择的种子中测量的平均EPA+DHA含量是13.9％EPA+2.6％DHA，其中所述种子来自这10株温室培育的植物的种子批次。类似地，发现4株田间培育植物的EPA+DHA含量是13.4％EPA+2.7％DHA。在10株温室培育的植物当中存在产生直至15.1％EPA+3.0％DHA的植物(表139)。类似地，在4株田间培育的植物当中存在产生直至17.6％EPA+3.6％DHA的植物(表146)。分析这株田间培育植物的单个种子，找到了具有直至26.2％EPA+4.9％DHA或23.6％EPA+5.8％DHA的单个种子(表147)。在这95粒种子当中找到的最低EPA+DHA含量含有13.5％EPA和2.5％DHA，并且这些种子当中的平均含量是18.2％EPA和3.7％DHA，这与如表146中所示的在随机选择两次15粒种子中测量的含量(17.6％EPA+3.6％DHA)相匹配。这个事件LBFDAU正是显示对于每个事件和全部构建体而言均存在植物间变异性和种子间变异性的代表性例子。实施例10至18中显示植物间变异性的程度，而显示某些群体的平均PUFA特征(例如，属于相同事件并且遗传相同的全部植物，或全部植物均为单拷贝、杂合)总与独立植物中观察到的特征不同。为了显示这种变异性的幅度，实施例10至18显示这类群体的平均PUFA特征并且还显示具有最高EPA+DHA水平的单个植物的特征。
尽管事件LBFDAU能够在遗传相同的植物群体中在给定环境下产生约13.5％EPA+2.6％DHA，但在这个群体内部存在这样的独立植物，所述独立植物产生直至约18％EPA+3.7％DHA作为这株植物产生的全部种子的平均数，并且这株植物的单个种子可以实现直至约26％EPA和约5％DHA。这些EPA+DHA水平差异归因于事件的遗传组分与环境的相互作用。但是，始终观察到的是，与田间相比，可比性群体在温室中产生更高的VLC-PUFA水平。这种趋势通常与温室中与田间相比含油量较低相关。为了更详细地研究这个观察结果，在图40中将单拷贝事件LANPMZ(实施例11中描述的事件)的全部纯合种子批次中测量的含油量对相同种子批次中测量的Δ-12-去饱和酶下游的全部VLC-PUFA(参见图2)的总量作图。同样处理事件LAODDN(实施例13中描述的事件)并且在图41中作图。还对实施例18中描述的两个事件即事件LBFGKN(图42)和事件LBFLFK(图43)进行这项分析。在这两种参数之间观察到强相关性。对野生型的相同分析(图72)未揭示这种相关性，反而图72显示在温室培育和田间培育的野生型植物之间的差异，在于与温室培育的野生型植物相比，田间培育的野生型植物具有更高水平的18：2n-6和18：3n-3和较低的18：1n-9。
为了详细分析图40中对事件LANPMZ所述的这种相关性是否可以归因于某些途径步骤，已经计算每个途径步骤的转化效率和图40中分析的每个种子批次的转化效率，并且在图44、图48、图52、图56、图60、图64，和图68中作图。同样分析事件LAODDN，并且在图45、图49、图53、图57、图61、图65和图69中作图。还同样分析事件LBFGKN(在图46、图50、图54、图58、图62、图66和图70中作图)和事件LBFLFK(图47、图51、图55、图59、图63、图67和图71)。比较全部这些图，可以看到，图40和图41中观察到的相关性主要归因于Δ-12-去饱和酶途径步骤(图44至图47)、Δ-6-去饱和酶途径步骤(图48至图51)和Δ-4-去饱和酶途径步骤(图68至图71)：在这些图中，在途径步骤和种子含油之间可见与构建体和事件无关的负相关性，其中不能对其他途径步骤观察到这点。
在野生型植物中观察到Δ-12-去饱和酶途径与事件LANPMZ中种子含油量的负相关性，如图72中所示。另外，图72显示与温室培育的野生型植物相比，田间培育的野生型植物具有更高水平的18：2n-6和18：3n-3和较低的18：1n-9。这可以最可能用先前观察结果(Xiao等人，2014)解释，在于天然卡诺拉油菜内源Δ-12-去饱和酶受温度调节并且在转录物水平和蛋白质水平对Δ-12-去饱和酶的温度调节是植物中反复出现的主题(Kargiotidou等人，2008；Tang等人，2005；Sanchez-Garcia等人，2004)，而与温室条件相比，在田间条件下Δ-12-去饱和酶将上调。但是，可以得出结论：野生型卡诺拉油菜植物中观察到的含油量依赖性中不存在对Δ-12-去饱和酶的调节。因此将图72与图40至图43比较，它可以进一步得出结论：仅引入的转基因Δ-12-去饱和酶易受种子含油量依赖性的调节作用影响。
进一步观察结果是，与温室培育的植物相比，田间培育的转基因植物并不具有更高的Δ-12-去饱和酶转化效率，即便对图72中的野生型植物明确观察到这点。可以得出结论：内源天然Δ-12-去饱和酶并不显著地促进本发明转基因植物中总体观察到的Δ-12-去饱和酶转化效率。
除将途径步骤转化效率对种子含油量作图之外，某些关键脂肪酸的水平已经对种子含油量作图(图81、图82、图83、图84)。已经通过以下方式在那些图中拟合数据：使用全部所述事件的全部数据点以确定回归的斜率，并且随后使用单个事件的全部数据点以确定(图81，图82、图83、图84)中显示的回归的回归线与x-轴(0％含油量)的截距。表158中显示这项分析的结果。
表158：如实施例20中所述在图81、图82、图83、图84中拟合数据的回归方程。列出了该方程的参数，方程是：(脂肪酸)＝(种子含油量)＊斜面+截距。
实施例21：酶活性的体外证明
从转基因酵母分离的微粒体中的去饱和酶活性
在酿酒酵母中完成去饱和酶和延伸酶的表达。简而言之，将含有适宜质粒的酵母株在30℃(在SD-培养基-尿嘧啶+蜜三糖中)培育过夜并且随后用来以初始OD600＝0.2接种(在SD-培养基-尿嘧啶+蜜三糖+半乳糖中)更大的培养物。在30℃24小时后，将培养物(一般OD600＝0.6-0.8)通过离心收获并且在25mM Tris缓冲液(pH 7.6)中洗涤一次。使用标准程序完成从表达编码去饱和酶和延伸酶的基因的酵母制备粗提物和微粒体。简而言之，将表达去饱和酶的细胞重悬于2ml去饱和酶破裂缓冲剂(0.1M磷酸钾pH 7.2、0.33M蔗糖、4mMNADH、1mg/ml BSA(无脂肪酸)、4000U/ml过氧化氢酶和蛋白酶抑制剂(无EDTA完全(Roche))中并且使用二氧化硅/锆珠在BeadBeater中破碎的。通过在8,000xg，4℃离心两次，澄清粗提物。在100,000xg(30分钟在4℃)额外离心后，使微粒体沉淀并最终重悬于去饱和酶破裂缓冲剂(300微升)中。使用二辛可宁酸(BCA)法测量粗提物和微粒体中的蛋白质浓度(Smith，P.K.等人，(1985)Anal.Biochem.(150)：76-85)。
去饱和酶活性总体测定法：
在去饱和酶测定法中，提供[14C]-标记的酰基-CoA作为底物；并且在反应后，将酰基-CoA(和磷脂)水解并甲基化成使用涂银-TLC分析的脂肪酸甲酯(FAME)。一般分析条件修改自Banas等人，(Banas等人(1997)Physiology，Biochemistry and Molecular Biologyof Plant Lipids(Williams，J.P.，Khan，M.U.和Lem，N.W.编著)第57-59页)。
测定法以总体积200μl含有：由0.1M K-磷酸盐pH 7.2，0.33M蔗糖，4mM NADH，1mg/ml BSA和蛋白酶抑制剂组成的缓冲液中1mg酶(粗提物)或150μg(微粒体级分)，10nmol[14C]-酰基-CoA(3000dpm/nmol)，7.2mM NADH(总)，0.36mg BSA(总)。在30℃孵育所需时间后，添加MeOH∶H2O(1∶4)中的200μl 2M KOH并在90℃孵育20分钟。通过添加3M HCl(200μl)、1.5ml MeOH∶CHCl3(2∶1)和CHCl3(500μl)提取脂肪酸。将氯仿相回收，在N2(气)下干燥并且通过添加2ml含有MeOH的2％H2SO4并且在90℃孵育30分钟，使脂肪酸甲基化。通过添加2mlH2O和2ml己烷提取FAME并且通过AgNO3-TLC和庚烷∶二乙醚∶乙酸(70∶30∶1)作为溶剂予以分离。使用瞬时成像仪，通过电子放射自显影术可视化并定量放射性脂质。
Δ-12去饱和酶(大豆疫霉)，c-d12Des(Ps GA)酶活性：使用重悬的从表达c-d12Des(Ps_GA)蛋白的酵母株分离的微粒体，进行酶测定法，并且与从含有空载体(LJB2126)的对照酵母株分离的微粒体比较。在[14C]18：1n-9-CoA存在下，16：0-溶血磷脂酰胆碱(LPC)和含有c-d12Des(Ps_GA)的NADH膜形成与已知合成标准品相似的可以作为甲基酯分离并且在AgNO3-TLC[庚烷∶二乙醚(90∶10)]上解析的[14C]18：2-脂肪酸。这种酶活性需要NADH并且在分离自空载体对照菌株的膜中未观察到。无16：0-LPC的对照测定法含有少量活性，假定地归因于酵母微粒体中存在的内源16：0-LPC。另外，酶促反应后磷脂与游离脂肪酸分离和表征分离的脂肪酸甲酯显示，c-d12Des(Ps_GA)酶促产生的全部18：2n-6-脂肪酸甲酯(FAME)均存在于磷脂酰胆碱级分中。
也可以使用包括但不限于[14C]18：2n-6-CoA、[14C]20：3n-6-CoA、[14C]20：4n-6-CoA、[14C]22：5n-3-CoA的其他[14C]酰基-CoA证明c-d12Des(Ps_GA)酶活性。
Δ-6去饱和酶(托瑞蚝球藻)，c-d6Des(Ot febit)酶活性：可以在分离自表达c-d6Des(Ot_febit)蛋白的酵母株的微粒体中使用[14C]酰基-CoA，以上文描述的一般测定法证明c-d6Des(Ot_febit)酶活性和底物专一性。[14C]酰基-CoA可以包括但不限于：[14C]18：1n-9-CoA、[14C]18：2n-6-CoA、[14C]20：3n-6-CoA、[14C]20：4n-6-CoA、[14C]22：5n-3-CoA。可以使用AgNO3-TLC和庚烷∶二乙醚∶乙酸(70∶30∶1)作为溶剂，解析从酶底物和产物衍生的分离的脂肪酸甲酯。另外，可以显示c-d6Des(Ot_febit)酶使酰基-CoA底物直接去饱和，如”去饱和酶头部基团(CoA与PC)偏好性”中所述，如先前报道提出(Domergue等人，(2005)Biochem.J.389：483-490)。
Δ-5去饱和酶(破囊壶菌属某些物种)，c-d5Des(Tc GA2)酶活性：可以在分离自表达c-d5Des(Tc_GA2)蛋白的酵母株的微粒体中使用[14C]酰基-CoA，以如上文描述的一般测定法证明c-d5Des(Tc_GA2)酶活性和底物专一性。[14C]酰基-CoA可以包括但不限于：[14C]18：1n-9-CoA、[14C]18：2n-6-CoA、[14C]20：3n-6-CoA、[14C]20：4n-6-CoA、[14C]22：5n-3-CoA。可以使用反相-TLC(硅凝胶60RP-18)和乙腈(100％)作为溶剂，解析从酶底物和产物衍生的分离的脂肪酸甲酯。
ω-3去饱和酶(致病疫霉)，c-o3Des(Pi GA2)酶活性：可以在分离自表达c-o3Des(Pi_GA2)蛋白的酵母株的微粒体中使用[14C]酰基-CoA，以上文描述的一般测定法证明c-o3Des(Pi_GA2)酶活性和底物专一性。[14C]酰基-CoA可以包括但不限于：[14C]18：1n-9-CoA、[14C]18：2n-6-CoA、[14C]20：3n-6-CoA、[14C]20：4n-6-CoA、[14C]22：5n-3-CoA。可以使用反相-TLC(硅凝胶60RP-18)和乙腈(100％)作为溶剂，解析从酶底物和产物衍生的分离的脂肪酸甲酯。
ω-3去饱和酶(畸雌腐霉)，c-o3Des(Pir GA)酶活性：可以在分离自表达c-o3Des(Pir_GA)蛋白的酵母株的微粒体中使用[14C]酰基-CoA，以上文描述的一般测定法证明c-o3Des(Pir_GA)酶活性和底物专一性。[14C]酰基-CoA可以包括但不限于：[14C]18：1n-9-CoA、[14C]18：2n-6-CoA、[14C]20：3n-6-CoA、[14C]20：4n-6-CoA、[14C]22：5n-3-CoA。可以使用反相-TLC(硅凝胶60RP-18)和乙腈(100％)作为溶剂，解析从酶底物和产物衍生的分离的脂肪酸甲酯。
Δ-4去饱和酶(破囊壶菌属某些物种)，c-d4Des(Tc GA)酶活性：可以在分离自表达c-d4Des(Tc_GA)蛋白的酵母株的微粒体中使用[14C]酰基-CoA，以上文描述的一般测定法证明c-d4Des(Tc_GA)酶活性和底物专一性。[14C]酰基-CoA可以包括但不限于：[14C]18：1n-9-CoA、[14C]18：2n-6-CoA、[14C]20：3n-6-CoA、[14C]20：4n-6-CoA、[14C]22：5n-3-CoA。可以使用反相-TLC(硅凝胶60RP-18)和乙腈(100％)作为溶剂，解析从酶底物和产物衍生的分离的脂肪酸甲酯。
Δ-4去饱和酶(路氏巴夫藻)，c-d4Des(Pl GA)2酶活性：可以在分离自表达c-d4Des(Pl_GA)2蛋白的酵母株的微粒体中使用[14C]酰基-CoA，以上文描述的一般测定法证明c-d4Des(Pl_GA)2酶活性和底物专一性。[14C]酰基-CoA可以包括但不限于：[14C]18：1n-9-CoA、[14C]18：2n-6-CoA、[14C]20：3n-6-CoA、[14C]20：4n-6-CoA、[14C]22：5n-3-CoA。可以使用反相-TLC(硅凝胶60RP-18)和乙腈(100％)作为溶剂，解析从酶底物和产物衍生的分离的脂肪酸甲酯。
Δ-4去饱和酶(纤细裸藻)，c-d4Des(Eg)酶活性：可以在分离自表达c-d4Des(Eg)蛋白的酵母株的微粒体中使用[14C]酰基-CoA，以上文描述的一般测定法证明c-d4Des(Eg)酶活性和底物专一性。[14C]酰基-CoA可以包括但不限于：[14C]18：1n-9-CoA、[14C]18：2n-6-CoA、[14C]20：3n-6-CoA、[14C]20：4n-6-CoA、[14C]22：5n-3-CoA。可以使用反相-TLC(硅凝胶60RP-18)和乙腈(100％)作为溶剂，解析从酶底物和产物衍生的分离的脂肪酸甲酯。
从转基因欧洲油菜分离的微粒体中的去饱和酶活性
使用改编自Bafor，M.等人，Biochem J.(1991)280，507-514的方法从转基因欧洲油菜的不成熟种子分离了含有能够合成二十二碳六烯酸(22：6n-3)的重组去饱和酶和延伸酶的微粒体。简而言之，将不成熟种子首先自卡诺拉油菜荚果分离并且随后将正在发育的胚与种皮分离并转移至冰冷的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)。将正在发育的胚随后用新鲜的磷酸盐缓冲液洗涤，转移至冰冷的研钵，并在提取缓冲液(0.1M磷酸盐、pH 7.2、0.33M蔗糖、1mg/ml BSA(基本上无脂肪酸)、4000U/ml过氧化氢酶、4mM NADH和蛋白酶抑制剂-完全-无EDTA(Roche))中研磨成均一溶液。将裂解的正在发育的胚溶液用额外的提取缓冲液稀释20倍并且穿过2层Miracloth进入离心管。在18,000xg在4℃离心10分钟后，使澄清的上清液穿过Miracloth进入超速离心管。在105,000xg在4℃后离心60分钟后，将上清液从微粒体沉淀物取出，将所述微粒体沉淀物随后用提取缓冲液洗涤一次并且随后使用Dounce匀浆器，在提取缓冲液(每500个胚约1ml)中重悬为均一溶液。
可以使用上文在“从转基因酵母分离的微粒体中的去饱和酶活性”对分离自酵母表达菌株的微粒体所描述的测定法，证明去饱和酶的酶活性。
总之，在“从转基因酵母分离的微粒体中的去饱和酶活性”中，我们已经提供一种允许毫无疑义证明脂酰基去饱和酶活性的方法。我们提供显示以下情况的数据：(1)基因c-d12Des(Ps_GA)编码来自大豆疫霉的Δ-12去饱和酶蛋白(c-d12Des(Ps_GA))，所述酶蛋白在分离自表达这种蛋白质的转基因酵母(图24，小图A)和转基因欧洲油菜事件(图25，小图A)的两种微粒体中使油酸(18：1n-9)去饱和，以形成亚油酸(18：2n-6)，(2)基因c-o3Des(Pi_GA2)编码来自致病疫霉的蛋白质(c-o3Des(Pi_GA2))，所述蛋白质在分离自表达这种蛋白质的转基因酵母(图24，小图B)的微粒体中使花生四烯酸(20：4n-6)去饱和，以形成二十碳五烯酸(20：5n-3)，(3)基因c-o3Des(Pir_GA)编码来自畸雌腐霉的ω-3去饱和酶蛋白(c-o3Des(Pir_GA))，所述酶蛋白在分离自表达这种蛋白质的转基因酵母(图24，小图B)的微粒体中使花生四烯酸(20：4n-6)去饱和，以形成二十碳五烯酸(20：5n-3)，(4)转基因欧洲油菜事件(含有编码来自致病疫霉(c-o3Des(Pi_GA2))和畸雌腐霉(c-o3Des(Pir_GA))的ω-3去饱和酶蛋白的基因)含有至少一种定位至微粒体的能够使花生四烯酸(20：4n-6)去饱和以形成二十碳五烯酸(20：5n-3)的酶(图85，小图C)，(5)基因c-d4Des(Tc_GA)编码来自破囊壶菌属物种的Δ-4去饱和酶蛋白(c-d4Des(Tc_GA))，所述酶蛋白在分离自表达这种蛋白质的转基因酵母(图24，小图C)的微粒体中使二十二碳五烯酸(22：5n-3)去饱和，以形成二十二碳六烯酸(22：6n-3)，(6)基因c-d4Des(Pl_GA)2编码来自路氏巴夫藻的Δ-4去饱和酶蛋白(c-d4Des(Pl_GA)2，所述酶蛋白在分离自转基因酵母的微粒体中使二十二碳五烯酸(22：5n-3)去饱和，以形成二十二碳六烯酸(22：6n-3)(图24，小图D)，(7)转基因欧洲油菜事件(含有编码来自破囊壶菌物种(基因c-d4Des(Tc_GA))的Δ-4去饱和酶蛋白的基因和来自路氏巴夫藻的基因c-d4-Des(Pl_GA))含有至少一种定位至微粒体的能够使二十二碳五烯酸(22：5n-3)去饱和以形成二十二碳六烯酸(22：6n-3)的酶(图25，小图C)，(8)含有基因的转基因欧洲油菜事件，所述基因编码来自托瑞蚝球藻的Δ-6去饱和酶蛋白(c-d6Des(Ot_febit))，所述酶蛋白能够使亚油酸(18：2n-6)去饱和以形成γ-亚麻酸(18：3n-6)(图85，小图A)，和(9)含有基因的转基因欧洲油菜事件，所述基因编码来自破囊壶菌属某些物种的Δ-5去饱和酶蛋白(c-d5Des(Tc_GA2))，所述酶蛋白能够使二高-γ-亚麻酸(20：3n-6)去饱和以形成花生四烯酸(20：4n-6)(图85，小图B)。除了在芸苔属中具有已知内源酶的c-d12Des(Ps_GA)之外，证明的全部其他实施例在分离自对照酵母株(图24)或对照芸苔株系(图25和图85)的微粒体中均不含有可检出的内源去饱和酶活性。
使用在“从转基因酵母分离的微粒体中的去饱和酶活性”中对去饱和酶蛋白描述的方法，表达或检出的酶活性的水平可能受天然蛋白的融合标签的存在或不存在的影响。去饱和酶的融合标签或蛋白质可以连接至蛋白质的氨基端(N端融合物)或羧基端(C端融合物)并且可以包括但不限于：FLAG、六组氨酸、麦芽糖结合蛋白和壳多糖结合蛋白。
我们已经提供多种方法，以在卡诺拉油菜中建立从油酸(18：1n-9)生物合成二十二碳六烯酸(DHA，22：6n-3)的工程化途径中所需要的酶催化去饱和反应。开发了实施例21中提出的方法，“从转基因酵母分离的微粒体中的去饱和酶活性”，以在表达独立去饱和酶的酵母株中证明去饱和酶活性，并且这些方法可以进一步用来证实转基因卡诺拉油菜中相应的去饱和酶活性，如实施例21，”从转基因欧洲油菜分离的微粒体中的去饱和酶活性”中所述和证明那样。另外，这些方法可以由本领域技术人员并入，以测量包括但不限于以下的其他生物中的去饱和酶活性：酿酒酵母、拟南芥、芸苔属某些物种、亚麻荠(Camelinasativa)、红花和西班牙鼠尾草(Salvia hispanica)。
去饱和酶头部基团(CoA与PC)偏好性
脂肪酸去饱和酶催化从脂肪酸的烃链摘取二个氢原子以形成不饱和脂肪酸中的双键并且可以根据与其底物：酰基-CoA、酰基-ACP(ACP，酰基载体蛋白)或酰基-脂质连接的主链分类。迄今，存在其中已经证实酰基-CoA底物的一些例子。这些涉及纯化的酶并且例子包括亚油酰-CoA去饱和酶(Okayasu等人，(1981)Arch.Biochem.Biophys.206：21-28)、来自大鼠肝的硬脂酰-CoA去饱和酶(Strittmatter等人(1974)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 71：4565-4569)和来自鳄梨的硬脂酰-ACP去饱和酶(Shanklin J和Somerville C(1991)ProcNatl Acad Sci USA 88：2510-2514)。
备选地，Heinz和合作者已经报道了一项利用体内输送底物至表达去饱和酶的酵母株以检验去饱和酶的底物专一性的策略(Domergue等人，(2003)J.Biol.Chem.278：35115-35126；Domergue等人，(2005)Biochem.J.389：483-490)。在这些研究中，对去饱和酶的酰基-脂质底物偏好性的预测基于从生长时间过程范围内透彻分析CoA、磷脂和中性脂质汇集物中去饱和产物所获得的数据。但是，在多种汇集物(例如，CoA、ACP和脂质)之间转移酰基的高度有活性的内源酰基转移酶可能影响或复杂化这些数据(Domergue等人，(2005)Biochem.J.389：483-490；Meesapyodsuk，D.，Qui，X.(2012)Lipids 47：227-237)。因此，这种方法仍受缺少(如从体外测定法获得的需要确定目的去饱和酶利用的底物主链的结论)直接证据限制。
这里，使用蛋白质的微粒体制备物，我们提供先前未报道的方法以区分使酰基-CoA脂肪酸去饱和的酶与使磷脂连接的脂肪酸去饱和的酶。我们已经通过以下方式改进了初始报道的策略以原位产生[14C]-磷脂酰胆碱类似物(Stymne，S.和Stobart，A.K.(1986)Biochem.J.240：385-393；Griffiths，G.，Stobart，A.K.和Stymne，S.(1988)Biochem.J.252：641-647)：(1)监测溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)催化的初始酰基-转移反应以确立全部[14C]-酰基-CoA已经耗尽，并且(2)纳入外源溶血磷脂酰胆碱(LPC)。我们的改进因此确立当启动去饱和酶测定法时仅存在[14C]-磷脂酰胆碱类似物并且通过添加其相应的溶血脂质，允许检验其他磷脂。另外，在证明磷脂酰胆碱特异性中描述的用于检验去饱和酰基-磷脂底物的测定法可以通过为监测酰基-CoA形式的底物去饱和所开发的测定法中检验来补充。具体而言，我们构思了证明酰基-CoA特异性中描述的策略，其中待检验的底物保留其酰基-CoA形式并且不由溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)并入磷脂(例如，磷脂酰胆碱)。通过比较(在其中与酰基-CoA形式相比，底物处于酰基-磷脂形式的测定法中观察到的)相对去饱和酶活性，可以确定与去饱和的脂肪酸产物共价结合的实际主链(例如，磷脂酰胆碱或CoA)。
证明磷脂酰胆碱特异性：
为了检验去饱和酶是否接受酰基-脂质(例如，磷脂)底物，酶反应如上文“从转基因酵母分离的微粒体中的去饱和酶活性”所述进行，但是在外源溶血磷脂酰胆碱(LPC)存在下预孵育后进行。将表达目的酶的酵母株的微粒体级分与[14C]标记的酰基-CoA底物在16：0-溶血磷脂酰胆碱存在下预孵育，其一般为50μM，但是可以从0-500μM变动。在预孵育期间，微粒体中存在的内源溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)将[14C]脂肪酸从CoA转移至16：0-LPC，原位产生[14C]脂肪酸-磷脂酰胆碱(PC)(Jain等人，(2007)J.Biol.Chem.282：30562-30569；Riekhof等人(2007)J.Biol.Chem.282：36853-36861；Tamaki等人(2007)J.Biol.Chem.282：34288-34298))。在预孵育(一般15分钟，但是可以从1-300分钟变动)后，基本上全部[14C]标记的酰基-CoA底物耗尽，如通过水相的闪烁计数法和TLC分析所测量的。
终止反应并且使用Bligh和Dyer的方法(Bligh，E.G.和Dyer，J.J.(1959)CanJ.Biochem.Physiol.37：911-918)，通过添加200μl 0.15M乙酸和1ml MeOH∶CHCl3(1∶1)提取脂质。通过闪烁计数法分析CHCl3相的部分(约10％)(含有磷脂酰胆碱(PC)和游离脂肪酸(FFA))并且将其余施加至硅胶薄层色谱(TLC)板。将该板首先在极性溶剂[CHCl3∶MeOH∶乙酸(90∶15∶10∶3)，并随后在庚烷∶二乙醚∶乙酸(70∶30∶1)中展开(developed)，并且测量向PC的掺入和FFA的量(或许通过硫酯酶产生)。将PC和FFA从该板刮下并且通过添加含有MeOH的2％H2SO4在90℃持续30分钟进行甲基化。将甲基酯在己烷中提取并如上文对相应酶所述那样分析(实施例21，“从转基因酵母分离的微粒体中的去饱和酶活性”)。反应混合物提取过程的上层(水)相含有酰基-CoA并且将其通过添加等体积在MeOH∶H2O(1∶4)中的2M KOH水解并在90℃孵育20分钟。随后通过闪烁计数法分析水相的部分，之后通过添加3M HCl(0.7ml)，1.4ml MeOH和CHCl3(1.9ml)提取脂肪酸。将氯仿相回收，在N2(气)下干燥并且通过添加2ml含有MeOH的2％H2SO4并且在90℃孵育30分钟，使脂肪酸甲基化。通过添加2mlH2O和2ml己烷提取FAME并且通过AgNO3-TLC和庚烷∶二乙醚∶乙酸(70∶30∶1)作为溶剂或反相-TLC(硅凝胶60RP-18，使用乙腈(100％))予以分离。使用瞬时成像仪，通过电子放射自显影术可视化并定量放射性脂质。
Δ-12去饱和酶(大豆疫霉)，c-d12Des(Ps GA)底物偏好性：可以进一步表征在“从转基因酵母分离的微粒体中的去饱和酶活性”中证明的c-d12Des(Ps_GA)酶活性以确立油酸底物的主链。在“去饱和酶头部基团(CoA与PC)偏好性”中描述的含有16：0-溶血磷脂酰胆碱(LPC)的去饱和酶测定法中，观察到明显的去饱和。在缺少16：0-LPC的对照反应中观察到显著减少，但可检测的去饱和酶活性，这或许因含有d12Des(Ps_GA)蛋白的酵母微粒体存在的内源LPC酰化所致。但是，与20：1n-9-CoA的预孵育产生以20：1n-9饱和的PC，因此排除[14C]-18：1n-9掺入PC(在“酰基-CoA特异性的证明”中描述)。另外，酶促反应后磷脂与游离脂肪酸分离和表征可分离的脂肪酸甲酯显示，d12Des(Ps_GA)酶促产生的全部18：2n-6-脂肪酸甲酯(FAME)均存在于磷脂酰胆碱级分中(图26，小图A和图86，小图A)。另外，在证明酰基-CoA特异性的测定法中d12Des(Ps_GA)活性可忽略(图86，小图B)，显示18：1n-9-酰基-CoA不是Δ-12去饱和酶(大豆疫霉)的优选底物。总之，Δ-12去饱和酶(大豆疫霉)明确地使PC共价结合的18：1n-9去饱和，但不使18：1n-9-酰基CoA底物去饱和。
Δ-4去饱和酶(破囊壶菌某些物种)，c-d4Des(Tc GA)底物偏好性：可以进一步表征在“从转基因酵母分离的微粒体中的去饱和酶活性”中证明的c-d4Des(Tc_GA)酶活性以确立二十二碳五烯酸底物的主链。在“去饱和酶头部基团(CoA与PC)偏好性”中描述的无额外16：0-溶血磷脂酰胆碱(LPC)的去饱和酶测定法中，观察到去饱和(图26，小图B)，并且这或许因含有c-d4Des(Tc_GA)蛋白的膜中存在内源16：0-LPC所致。通过在测定法中纳入额外的16：0-LPC，大幅度刺激c-d4Des(Tc_GA)去饱和酶活性(图26，小图B)，与下述观察结果一致：微粒体中存在的内源溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)将[14C]22：5n-3从CoA转移至16：0-LPC，从而产生去饱和的[14C]22：5n-3-磷脂酰胆碱(PC)。另外，酶促反应后磷脂与游离脂肪酸分离和表征可分离的脂肪酸甲酯显示，c-d4Des(Tc_GA)酶促产生的基本上全部22：6n-3-脂肪酸甲酯(FAME)均存在于磷脂酰胆碱级分中(图26，小图B和小图C)。
酰基-CoA特异性的证明：
分析条件如上文在“从转基因酵母分离的微粒体中的去饱和酶活性”中所述。将表达目的酶的酵母株的微粒体级分与10nmol 20：1n-9-CoA(50μm)和0.5mM DTNB(5，5＇-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)预孵育10分钟，之后添加NADH和[14C]标记的酰基-CoA底物。与20：1n-9-CoA的预孵育最大限度减少[14C]标记的底物掺入PC。DTNB防止了LPCAT逆反应并且因而酰基-CoA通过酰基交换进入PC。这个测定法还可以包括备选性酰基-CoA，如：18：1n-9-CoA、18：2n-6-CoA、20：3n-6-CoA、20：4n-6-CoA、22：5n-3-CoA。终止反应并且使用Bligh和Dyer的方法(Bligh，E.G.和Dyer，J.J.(1959)Can J.Biochem.Physiol.37：911-918)，通过添加200μl 0.15M乙酸和1ml MeOH∶CHCl3(1∶1)提取脂质。通过闪烁计数法分析CHCl3相的部分(约10％)(含有磷脂酰胆碱(PC)和游离脂肪酸(FFA))并且将其余施加至硅胶薄层色谱(TLC)板。将该板首先在极性溶剂[CHCl3∶MeOH∶乙酸(90∶15∶10∶3)，并随后在庚烷∶二乙醚∶乙酸(70∶30∶1)中展开，并且测量向PC的掺入和FFA的量(或许通过硫酯酶产生)。将PC和FFA从该板刮下并且通过添加含有MeOH的2％H2SO4在90℃持续30分钟进行甲基化。将甲基酯在己烷中提取并如上文“从转基因酵母分离的微粒体中的去饱和酶活性”对相应酶所述那样分析。反应混合物提取过程的上层(水)相含有酰基-CoA并且将其通过添加等体积在MeOH∶H2O(1∶4)中的2M KOH水解并在90℃孵育20分钟。通过添加3M HCl(0.7ml)，1.4ml MeOH和CHCl3(1.9ml)提取脂肪酸。将氯仿相回收，在N2(气)下干燥并且通过添加2ml含有MeOH的2％H2SO4并且在90℃孵育30分钟，使脂肪酸甲基化。通过添加2ml H2O和2ml己烷提取FAME并且通过AgNO3-TLC和庚烷∶二乙醚∶乙酸(70∶30∶1)作为溶剂或反相-TLC(硅凝胶60RP-18，使用乙腈(100％))予以分离。使用瞬时成像仪，通过电子放射自显影术可视化并定量放射性脂质。
为了证明酰基-CoA依存关系，测试两种方法。如果去饱和在确定PC-特异性(添加LPC和预孵育，之后添加NADH)的方法中未出现并且用于确定酰基-CoA特异性(添加20：1-CoA和DTNB)的方法导致H2O相中的去饱和产物(或任何脂质汇集物PC/FFA/H2O中的产物，原因在于如果底物未并入PC，则PC依赖性酶不可能有活性(参见图86，小图B))，可以得出结论：该酶具有酰基-CoA依赖性(参见图27和图87，小图A和B)。类似地，如果去饱和酶在PC特异性测定法中证明有活性，但是在其中底物作为酰基-CoA存在的测定法中未证明有活性，则可以得出结论：该酶利用与磷脂酰胆碱共价连接的脂肪酸作为底物。
Δ-9去饱和酶(酿酒酵母)，d9Des(Sc)底物偏好性。
在证明酰基-CoA依存关系的测定法中d9Des(Sc)反应期间分析[14C]-分布，显示超过95％放射性活度(底物和产物)存在于H2O(CoA)和FFA-汇集物(数据未显示)中，表明向PC的掺入过程不明显。在反应期间，酰基-CoA汇集物中的产物(16：1n-9)线性增加直至60分钟，显示该酶偏好地转化与CoA共价结合的16：0(图87，小图B)。H2O级分中16：1n-9的量随后持平或略微减少，而FFA汇集物中的16：1n-9增加，归因于分离的膜中存在的硫酯酶降解酰基-CoA。
在显示PC特异性的测定法中，d9Des(Sc)未显示活性(图87，小图A)，这表明当16：0脂肪酸与PC(或FFA)连接时，它不是优选的底物。
与“磷脂酰胆碱特异性”测定法中缺少活性相比，“酰基-CoA特异性”测定法中确切存在去饱和酶活性，这表明Δ-9去饱和酶(酿酒酵母)利用与辅酶A共价连接的16：0。有意义地，已经最近报道了结合硬脂酰-CoA的人和小鼠硬脂酰-CoA去饱和酶的晶体结构，从而证实这种去饱和酶利用辅酶A底物(Wang等人(2015)Nat Struct Mol Bio 22：581-585和Bai等人(2015)Nature 524：252-257)。
总之，我们呈现了先前未报道的方法以区分使酰基-CoA脂肪酸去饱和的酶与使磷脂连接的脂肪酸去饱和的酶。本发明的这个实施方案使用酶的微粒体制备物并且不象先前例子中那样需要纯化目的酶。另外，这个实施方案允许分离完整的去饱和的酶促产物，从而允许表征与之连接的主链(例如，脂质-脂肪酸、CoA-脂肪酸或游离脂肪酸)。一项重要考虑是，酵母衍生的微粒体中存在的内源溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)可以利用类型广泛的酰基-CoA(Jain等人，(2007)J.Biol.Chem.282：30562-30569；Riekhof等人(2007)J.Biol.Chem.282：36853-36861；Tamaki等人(2007)J.Biol.Chem.282：34288-34298))，这使其它适于产生广泛类型用于分析去饱和酶的不同磷脂酰胆碱衍生物。LPCAT能够接受18：1n-9-CoA和20：4n-6-CoA并且这种酶可以用22：5n-3-CoA酰化LPC。从任何细胞或组织分离的微粒体可以用于本发明的这个实施方案中，所述细胞或组织包括但不限于细菌细胞(例如，大肠杆菌、铜绿假单胞菌(Psuedomonas aeruginosa)、苏云金芽孢杆菌)、哺乳动物组织(例如，肝)和植物组织(例如，叶、根、种子和荚果)，并且如果需要，可能利用外源供应的酿酒酵母溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶。对这里提出的一般方法的轻微修改可以包括与替代性酰基-CoA’而不与潜在去饱和酶底物预孵育，这减少因膜中存在的内源LPC所致的观测背景并且还最大限度减少硫酯酶降解酶底物或产物酰基-CoA。
延伸酶活性。
如上文对“从转基因酵母分离的微粒体中的去饱和酶活性”中去饱和酶所述那样在酵母中表达延伸酶。总体上如上文在“从转基因酵母分离的微粒体中的去饱和酶活性”中所描述那样和由Denic(Denic，V.和Weissman(2007)Cell 130，663-677)描述，分离含有表达延伸酶的微粒体。简而言之，将源自酵母表达培养物(50ml)的细胞重悬于1ml延伸酶破裂缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.9，10mM MgCl2，1mM EDTA，5％甘油，0.3M硫酸铵，蛋白酶抑制剂)中，与1ml二氧化硅/锆珠(0.5mm)混合并且在BeadBeater中破碎。在离心后(在8000xg，4℃两次5分钟)，将粗提物回收，并在第二次离心(100,000xg，在4℃，2小时)后，将微粒体级分重悬于500μl分析缓冲液(50mM HEPES-KOH pH 6.8，150mM KOAc，2mM MgOAc，1mM CaCl2，蛋白酶抑制剂)中。根据BCA方法测量微粒体中的蛋白质浓度。将重悬的微粒体等分并冷冻在N2(液)中并储存在-80℃。
在延伸酶测定法中，提供[14C]-标记的丙二酸单酰-CoA和非标记的酰基-CoA作为底物。在反应已经推进适宜时间后，取决于实验目的，所述适宜时间可以在0-300分钟之间变动，反应混合物经受水解和甲基化，并且使用瞬时成像仪，通过与电子放射自显影术组合的RP-TLC，分析FAME。
该测定法以总体积100μl含有约170μg微粒体蛋白、7.5nmol[14C]丙二酸单酰-CoA(3000dpm/nmol)、5nmol酰基-CoA。在30℃孵育所需时间后，通过添加MeOH中的100μl 2MKOH(1∶4)终止反应，随后在90℃孵育20分钟。通过添加3M HCl(100μl)、0.75ml MeOH∶CHCl3(2∶1)和CHCl3(250μl)提取脂肪酸。将氯仿相回收，在N2(气)下干燥并且通过添加2ml含有MeOH的2％H2SO4并且在90℃孵育30分钟，使脂肪酸甲基化。通过添加2ml H2O和2ml己烷提取FAME并且通过反相-TLC(硅凝胶60RP-18)，使用乙腈∶四氢呋喃(85∶15)溶剂予以分离。使用瞬时成像仪，通过电子放射自显影术可视化并定量放射性脂质。
另外，该测定法可以包括额外组分(例如，1mM NADPH，2mM MgCl2和100μM变蓝菌素)以通过内源酵母酶完成脂肪酸还原循环，但是限制酰基-CoA的进一步延伸。
Δ-6延伸酶(假微型海链藻)，c-d6Elo(Tp GA2)酶活性：可以在分离自表达c-d6Elo(Tp_GA2)蛋白的酵母株的微粒体中使用[14C]丙二酸单酰-CoA和酰基-CoA，以上文描述的一般延伸酶测定法证明c-d6Elo(Tp_GA2)酶活性和底物专一性。酰基-CoA可以包括但不限于：18：1n-9-CoA、18：2n-6-CoA、18：3n-6-CoA、20：3n-6-CoA、20：4n-6-CoA、20：5n-3-CoA、22：5n-3-CoA。
Δ-6延伸酶(球蒴藓)，c-d6Elo(Pp GA2)酶活性：可以在分离自表达c-d6Elo(Tp_GA2)蛋白的酵母株的微粒体中使用[14C]丙二酸单酰-CoA和酰基-CoA，以上文描述的一般延伸酶测定法证明c-d6Elo(Pp_GA2)酶活性和底物专一性。酰基-CoA可以包括但不限于：18：1n-9-CoA、18：2n-6-CoA、18：3n-6-CoA、20：3n-6-CoA、20：4n-6-CoA、20：5n-3-CoA、22：5n-3-CoA。
Δ-5延伸酶(托瑞蚝球藻)，c-d5Elo(Ot GA3)酶活性：可以在分离自表达c-d5Elo(Ot_GA3)蛋白的酵母株的微粒体中使用[14C]丙二酸单酰-CoA和酰基-CoA，以上文描述的一般延伸酶测定法证明c-d5Elo(Ot_GA3)酶活性和底物专一性。酰基-CoA可以包括但不限于：18：1n-9-CoA、18：2n-6-CoA、18：3n-6-CoA、20：3n-6-CoA、20：4n-6-CoA、20：5n-3-CoA、22：5n-3-CoA。
在NADPH和[14C]丙二酸单酰-CoA存在下，18：3n-6-CoA由分离自假微型海链藻(Tp)和球蒴藓(pp)的Δ-6延伸酶延长成20：3n-6-CoA，如图28，小图A和小图B中显示。在两种Δ-6延伸酶反应中，观察到的FAME-产物与20：3n-6-甲基酯标准品共迁移并具有放射性，与二碳从[14C]-丙二酸单酰-CoA转移至18：3n-6-CoA一致。在NADPH存在下，脂肪酸还原循环完成，产生饱和的酶促产物。但是在NADPH不存在的情况下，直接酶促产物(3-酮-20：3n-6-CoA)的衍生物作为FAME分离。分离的酶促产物经脱羧并转化成2-酮-19：3n-6-FAME，如前述(Bernert，J.T和Sprecher，H.(1977)J.Biol.Chem.252：6736-6744和Paul等人(2006)J.Biol.Chem.281：9018-9029)。适宜的对照显示，这个延伸反应依赖于Δ-6Elo(Tp)或Δ-6Elo(pp)，并且不受内源酵母酶催化。
在NADPH和[14C]丙二酸单酰-CoA存在下，20：5n-3-CoA由c-d5Elo(Ot_GA3)延长成22：5n-3-CoA，并含有N末端FLAG标签或C末端FLAG标签，如图28，小图C中所示。在Δ-5延伸酶反应中，观察到的FAME-产物与22：5n-3-甲基酯标准品共迁移并具有放射性，与二碳从[14C]-丙二酸单酰CoA转移至20：5n-3-CoA一致。在NADPH存在下，脂肪酸还原循环完成，产生饱和的酶促产物。但是在NADPH不存在的情况下，直接产物3-酮-22：5n-3-CoA的衍生物作为FAME分离。分离的酶促产物经脱羧并转化成2-酮-21：5n-3-FAME，如前述(Bernert，J.T和Sprecher，H.(1977)J.Biol.Chem.252：6736-6744和Paul等人(2006)J.Biol.Chem.281：9018-9029)。适宜的对照显示，这个延伸反应依赖于Δ-5Elo(Ot)，并且不受内源酵母酶催化。
这里，使用高灵敏的延伸酶测定法，我们已经证明所用Δ-6延伸酶(图28，小图A和B)和Δ-5延伸酶(图28，小图c)的酶活性，酶是将卡诺拉油菜工程化以生物合成二十二碳六烯酸的核心。对于这些延伸酶的每一种，我们已经显示，在[14C]丙二酸单酰-CoA和适宜的脂酰基CoA酯底物存在下，这些酶可以将二碳(含有[14C])从丙二酸单酰-CoA转移至适宜的脂酰基-CoA酯，以合成已经延长二个碳的新脂肪酸。在一些情况下，观察到延伸酶的直接酶促产物(3-酮-酰基CoA酯)的衍生物(脱羧的2-酮化合物)，然而在NADPH不存在的情况下，仅观察到这种脱羧的2-酮化合物，与Napier的先前观察结果一致(Bernert，J.T和Sprecher，H.(1977)J.Biol.Chem.252：6736-6744和Paul等人(2006)J.Biol.Chem.281：9018-9029)。
总之我们已经提供一种允许明确证明脂酰基延伸酶活性的方法。我们提供显示以下情况的数据：(1)基因c-d6Elo(Tp_GA2)编码来自假微型海链藻的Δ-6延伸酶蛋白(c-d6Elo(Tp_GA2)，所述酶蛋白在分离自转基因酵母的微粒体中使18：3n-6-CoA转化成20：3n-6-CoA(图28，小图A)；(2)基因c-d6Elo(Pp_GA2)编码来自球蒴藓的Δ-6延伸酶蛋白(c-d6Elo(Pp_GA2)，所述酶蛋白在分离自转基因酵母的微粒体中使18：3n-6-CoA转化成20：3n-6-CoA(图28，小图B)；(3)转基因欧洲油菜事件(含有编码来自假微型海链藻的Δ-6延伸酶蛋白的基因(基因c-d6Elo(Tp_GA2))和编码来自球蒴藓的Δ-6延伸酶蛋白的基因(基因c-d6Elo(Pp_GA2))含有至少一种定位至微粒体、能够使18：3n-6-CoA延长成20：3n-6-CoA的酶(图28，小图A)；(4)基因c-d5-Elo(Ot_GA3)编码来自托瑞蚝球藻的Δ-5延伸酶蛋白(c-d5Elo(Ot_GA3))，所述酶蛋白在分离自转基因酵母(图28，小图C)和转基因欧洲油菜事件(图29，小图B)的微粒体中使20：5n-3-CoA转化成22：5n-3-CoA。在展示的全部实施例中，在分离自对照酵母株((图28))或对照芸苔株系(图29)的微粒体中均未检出内源去饱和酶活性。
使用在“延伸酶活性”中对延伸酶蛋白所描述的方法，表达或检出的酶活性的水平可能受天然蛋白的融合标签的存在或不存在影响。去饱和酶的融合标签或蛋白质可以连接至蛋白质的氨基端(N端融合物)或羧基端(C端融合物)并且可以包括但不限于：FLAG、六组氨酸、麦芽糖结合蛋白和壳多糖结合蛋白。
我们已经提供多种方法，以在卡诺拉油菜中建立从油酸(18：1n-9)生物合成二十二碳六烯酸(DHA，22：6n-3)的工程化途径中所需要的酶催化的延伸酶反应。开发实施例21中提出的方法，旨在表达各自延伸酶的酵母株中证明延伸酶活性，并且这些方法可以进一步用来证实转基因卡诺拉油菜中相应的延伸酶活性。另外，这些方法可以由本领域技术人员并入，以确立包括但不限于以下的其他生物中的延伸酶活性：酿酒酵母、拟南芥、芸苔属某些物种、亚麻荠、红花和西班牙鼠尾草(Salvia hispanica)。
实施例22：作用模式的体内证明：底物专一性、底物选择性
向酵母表达载体克隆基因：
对于单基因表达，使用酵母表达载体pYES2.1/V5-His-TOPO(Invitrogen)。根据生产商的说明设计侧翼引物，并且使用有校阅能力的聚合酶Phusion高保真度聚合酶(NewEngland Biolabs)，从植物表达载体扩增基因。在琼脂糖凝胶电泳后，将PCR片段切割并使用EZ-10离心柱凝胶提取试剂盒(Bio Basic Inc.)纯化，克隆入酵母表达载体pYES2.1/V5-His-TOPO(Invitrogen)，转化入大肠杆菌，并且通过PCR检查基因取向。为了共表达多个基因，将基因克隆入pESC酵母表达载体(Stratagene)处于GAL1启动子控制下。为此目的，将适宜的限制性位点通过PCR引入编码区的上游和下游，随后是片段分离，TA-克隆入pGEM-T载体，通过酶消化释放基因片段并连接入pESC载体。对于全部构建体，使用EZ-10离心柱质粒DNA微量制备试剂盒(Bio Basic Inc.)分离质粒。全部构建体均在转化酵母之前测序。在测序后，根据生产商的操作方案，使用Sc EasyComp转化试剂盒(Invitrogen)，将质粒转化入酿酒酵母株INVSc1(Invitrogen)，并且在缺少适宜氨基酸的平板上选择。
酵母中表达异源基因：
将酵母培养物在30℃在含有2％葡萄糖的drop out基质(DOB-URA：1.7g/L酵母氮源、5g硫酸铵和除去用于选择的适宜氨基酸的完整补充混合物)中培育过夜。获得过夜酵母培养物的OD600和培养物浓度在样品之间标准化。将样品用含有2％半乳糖的DOB-URA洗涤，并且在20℃在补充有外源脂肪酸和0.01％tergitol的相同培养基中实施表达3天。对于外源脂肪酸输入，除非另外显示，否则细胞饲以0.25mM适宜的脂肪酸。脂肪酸底物和FAME标准品购自Nu-Chek Prep Inc(Elysian，MN)。
通过气相色谱分析脂肪酸：
将5mL培养物通过离心沉淀并用诱导缓冲液洗涤一次及用水洗涤一次。移除上清液，并且添加2mL 3N甲醇-HCl(Supelco)至细胞沉淀物。在温和混合后，将混合物在80℃孵育40分钟，冷却至室温，并且添加1mL 0.9％NaCl加2mL己烷。将样品涡旋混合和离心，并且取出己烷相并在氮气下干燥。脂肪酸甲酯(FAME)重悬于100μl己烷中，并使用配备DB-23柱的Agilent 6890N气相色谱仪，通过气相色谱分析。使用的热程序是160℃1分钟，随后温度以速率4℃/分钟增至240℃。基于已知的标准品鉴定FAME并且转化百分数计算为：[(产物)x100％]/(底物+产物)。
时间过程研究：
在30℃培育样品过夜，样品浓度在饲喂之前标准化，并且在20℃诱导培养物。对于某些时间过程研究，样品在饲喂之前预诱导过夜，如结果中所示。将样品(1ml培养物)按指示的时间间隔收集，用0.5％tergitol洗涤一次并用双蒸水洗涤一次，并且沉淀物储存在-80℃直至时间过程完成。脂肪酸提取和GC分析基本上遵循对“通过气相色谱分析脂肪酸”描述的方法，然而1mL甲醇HCl和0.5mL 0.9％NaCl和1mL己烷用于脂肪酸提取，并且最终重悬在100tL己烷中进行。
采用单一脂肪酸的饲喂研究：
在30℃培育样品过夜，样品浓度在饲喂之前标准化，并且在20℃诱导培养物3天。来自至少3个克隆的量值用来计算平均数。
采用多种脂肪酸的饲喂研究：
基于来自上述实验的结果，选择共饲喂用脂肪酸，其中表达每种构建体细胞饲以全部可能的底物。给定酶的阳性底物一并饲喂，然而，如果一种底物形成还是已知底物的产物(例如，对于某些延伸酶)，则使用分立的混合物。对于ω-3-去饱和酶，两种混合物用于饲喂，各自含有SDA作为标准品。最初，培养物饲以含有0.25mM总脂肪酸底物的混合物。但是，归因于摄取量的差异，需要优化脂肪酸混合物，从而底物A+产物A的水平等于底物B+产物B水平±5％。所用的最终脂肪酸混合物还经历GC以获得相对摄取量的估计值。
在获得适宜的脂肪酸混合物后，进行如上文所述的诱导和饲喂(酵母中表达异源 基因)。在诱导后，将酵母细胞在20℃诱导3天，之后如上文所述收获细胞和GC分析(酵母中 表达异源基因和通过气相色谱分析脂肪酸)。全部实验均重复三次。
酵母中共表达异源基因：
基因共表达方案基本遵循为单基因表达实验所提供的那些。将培养物在30℃培育过夜，样品浓度在饲喂之前标准化，并且在20℃诱导培养物3天。共表达以下基因集合(pY＝pYES2.1/V5-His-TOPO；pT＝pESC-Typ，pL＝pESC-Leu)：
1)pY-c-d12Des(Ps_GA)/pT-c-d6Des(Pir_GA)
2)pY-c-d12Des(Ps_GA)/pT-c-d6Des(Ot_febit)
3)pY-c-d6Elo(Tp_GA2)/pT-c-d6Des(Ot_febit)
4)pY-c-d6Elo(Tp_GA2)/pT-c-d6Des(Pir_GA)
5)pL-c-d6Elo(Tp_GA2)/pY-c-d5Des(Tc_GA2)
6)pL-c-d8Des(Eg)/pY-c-d5Des(Tc_GA2)
7)pL-c-d6Elo(Tp_GA2)/pY-c-d5Des(Sa)
8)pL-c-d8Des(Eg)/pY-c-d5Des(Sa)
脂质的分离和分析：
为了表达去饱和酶或延伸酶，将酵母培养物在30℃于含有2％葡萄糖的Drop out基质(DOB-ura)中培育过夜。将样品用含有2％半乳糖的诱导培养基(DOB-ura)洗涤，并且在20℃在补充有适宜脂肪酸和0.01％tergitol(NP-40)的相同培养基中诱导表达3天。孵育3天后，通过离心收集酵母细胞并用蒸馏水洗涤两次。添加15mL氯仿∶甲醇(1∶1)至收集的酵母沉淀物，并且将样品在振摇下室温孵育3小时。孵育3小时后，将样品离心并且收集水相并储存在-20℃。添加氯仿∶甲醇(2∶1)至沉淀物，并且将它在4℃孵育过夜，随后经历离心。收集水相并且与先前收集的水相汇集。添加9mL 0.45％NaCl至汇集的水相，涡旋混合样品，并在通过在1500xg离心3分钟分离后收集有机相。将有机相在氮气下干燥并重悬于100uL氯仿中，以产生总脂肪酸级分。通过GC分析5uL总脂肪酸部分，并且通过如下文描述的TLC分离剩余部分。
在使用前，将TLC板在120℃热激活至少3小时。用来分离脂肪酸的流动相由氯仿∶甲醇∶乙酸(65∶35∶8)组成并且樱草素(100mL丙酮∶水，80∶20中5mg)用来在紫外线下观察分离的脂质级分。使用标准品鉴定各个脂质级分(PC、PE、PI+PS和中性脂质)并且分别从TLC板取下。为了从二氧化硅提取脂质，添加400uL水、2mL氯仿和2mL甲醇，样品强有力地涡旋混合，并添加2mL 0.2M H3PO4/1M KCl。收集下部有机相并通过添加2mL氯仿再提取剩余水相。在氮气下干燥汇集的有机相，并且通过气相色谱分析各个脂质级分的脂肪酸特征。通过以下方式进行GC：添加2mL 3N甲醇HCl，随后在80℃孵育40分钟，随后添加1ml 0.9％NaCl和2mL己烷并涡旋混合。将己烷相收集，在氮气下干燥，并重悬于100μL己烷中供GC分析。使用配备DB-23柱的Agilent 6890N气相色谱仪和组成如下的热程序进行气相色谱：160℃1分钟，随后温度以速率4℃/分钟增至240℃。在初始GC分析后，将低浓度的样品重悬于40μL己烷中并再次分析。
时间过程研究：
最初，用c-d5Des(Tc_GA2)测试一系列条件(图30)。当培养物在诱导开始饲以0.25mM外源底物时，产物量和底物量及去饱和百分数从大约48-92小时保持稳定(图30，小图A)。因此，这些条件用于进一步的时程实验。
为了确定这些条件是否为全部基因构建体可接受，用分别表达全部10个基因的酵母培养物实施时间过程。外源供应每种酶的优选底物(图31)。
尽管脂肪酸摄取速率和酶活性变动，但产物水平、底物水平和延伸或去饱和的百分数在72小时时间点相对稳定(图31)。因此除非另外指出，否则采集在72小时时的数据用于全部进一步实验。
用全部脂肪酸分析全部酶：
当分离基因时，测定植物构建体中所用每种去饱和酶和延伸酶的主要活性。但是，许多去饱和酶和延伸酶具有次要活性。当全部酶共同存在时，这类次要活性影响所需脂肪酸的总体产生速率，或导致副产物产生。在这个实验中，我们用预计可能在表达全部10个基因的植物中存在的全部脂肪酸测试了全部酶。这个实验中使用的酶和脂肪酸如下列出：
尽管用每种单独的酶测试每种单独的底物脂肪酸，但是仅给出其中获得可检出活性水平的脂肪酸/酶组合的结果(参见表159、表160和表161)。
尽管我们观察到去饱和酶的一些副活性，如GLA由c-d5Des(Tc_GA2)转化成SDA和DHGLA由c-d4Des(Tc_GA)转化成ARA，但这些活性水平低并且产生的脂肪酸将是DHA合成途径中期望的(表159)。
我们还分析了c-d12Des(Ps_GA)和c-d4Des(Pl_GA)2的单点突变体的底物特征。相对于野生型形式的c-d12Des(Ps_GA)，c-d12Des(Ps_GA)中导致F83L突变的单核苷酸变化不导致底物偏好性或去饱和效率的任何显著变化(表159中所示的数据)。类似地，相对于野生型形式的d4Des(Pl_GA)2，d4Des(Pl_GA)2)中导致A102S突变的单核苷酸变化不导致底物偏好性或去饱和效率的任何显著变化(表159中所示的数据)。
表159.去饱和酶转化外源脂肪酸的百分数
延伸酶通常显示更高水平的副活性(表160、表161)。尽管两种Δ-6延伸酶对主要底物GLA和SDA显示相似的转化百分数，球蒴藓的酶对LA和ALA显示较高水平的活性，并且仅球蒴藓Δ-6延伸酶对ARA和EPA显示可检测的活性。然而，对GLA和SDA的活性水平显著较高，从而显示如果这些脂肪酸(预期在途径中可获得)将是酶优选的底物。
表160.Δ-6延伸酶转化外源脂肪酸的百分数
c-d5Elo(Ot_GA3)能够连续延伸大部分脂肪酸(表161)。但是，按巨大余量，所需的EPA至DPAn-3转化是最高转化。在工程化的植物系统中，两种Δ-4去饱和酶可用于去饱和DPAn-3，防止进一步延长。鉴于酵母系统中存在高水平底物并且不存在竞争性酶，由这种延伸酶产生的含有24碳的脂肪酸的水平低。
表161.c-d5Elo(Ot_GA3)延伸酶转化外源脂肪酸的百分数
底物值和产物值代表总脂肪酸的％。
底物 产物1 产物2 产物3 延伸％
LA 20：2n-6
24.34±1.28 0.41±0.07 1.64±0.18
DHGLA 22：3n-6
12.92±0.93 1.24±0.22 8.73±1.10
DHAn-3 24：6n-3
9.41±0.86 1.37±0.12 12.84±1.84
DPAn-3 24：5n-3
10.85±0.46 2.15±0.28 16.59±2.37
GLA DHGLA 22：3n-6
23.95±3.22 1.0±0.13 0.24±0.03 4.91±0.24
ARA 22：4n-6 24：4n-6
7.12±1.33 11.23±0.28 0.26±0.05 61.92±5.22
EPA DPAn-3 24：5n-3
0.85±0.01 6.76±0.85 1.74±0.21 90.8±0.98
SDA 20：4n-3 22：4n-3 24：4n-3
14.42±1.18 0.47±0.04 4.17±0.12 0.26±0.03 25.48±1.72
ALA 20：3n-3 22：3n-3 24：3n-3
20.09±3.23 1.79±0.28 1.70±0.35 0.15±0.03 15.38±2.06
由于20：4n-3不是市售的，所以通过共表达c-d6Elo(Tp_GA2)与其他去饱和酶或延伸酶的每一种，在体内生成它。因此当供应外源SDA时，20：4n-3由c-d6Elo(Tp_GA2)产生并且测量第二种酶转化这种脂肪酸的效率。
表162.对20：4n-3的酶活性。
*培养物饲以SDA并且20：4n-3(Δ-6延伸)作为去饱和酶或延伸酶的底物产生。测量三个重复。
pY：pYES2.1/V5-His-TOPO表达载体；pL：pESC-Leu表达载体。全部基因均置于Ga11启动子的控制下。N/A：不适用；DES：去饱和酶；ELO：延伸酶
c-d4Des(Tc_GA)、c-d5Des(Tc_GA2)、ec-d6Des(Ot_febit)和c-d5Elo(Ot_GA3)能够利用20：4n-3作为底物(表162)。c-d5Des(Tc_GA2)显示最高的转化百分数，这是可以预期的，因为已知20：4n-3是Δ-5去饱和酶的底物。c-d5Elo(Ot_GA3)还能够有效产生22：4n-3。在一个构建体中使用两种Δ-6延伸酶时，观察到基因剂量效应；在两种c-d6Elo(Tp_GA2)或由c-d6Elo(Tp_GA2)和c-d6Elo(Pp_GA2)组成的基因对存在下，Δ-6延伸酶活性增加。
本发明去饱和酶和延伸酶的脂肪酸特异性
向酶提供脂肪酸的混合物以允许在两种底物同时存在时比较相对活性；当单独供应底物时，酶对底物A的活性可能比对底物B更高，但是当同时供应它们时，酶对每种底物的相对活性可能变化。优选地同时提供相同长度的脂肪酸，因为它们将很可能同时存在于植物中。调整脂肪酸的混合物从而(底物1+产物1)的水平＝(底物2+产物2)的水平±5％。
表163.延伸酶和去饱和酶的脂肪酸偏好性
如表163中所述，ω-3去饱和酶的相对活性遵循如先前所述的顺序(表159)，但是当DHGLA和ARA可用时，两种ω-3去饱和酶对DTA的活性均较低。当ω-3底物和ω-6底物等量存在时，两种Δ-4去饱和酶对ω-3底物显示偏好性。当两种底物均可获得时，c-d6Des(Ot_febit)对ω-3底物的偏好性也增加(表163)。对于Δ-5延伸酶，当主要底物或优选底物可用时，次要底物的相对延长通常下降(表163)。
支持MoA(CoA与PC)的附加酶活性
向pYES2.1/V5-His-TOPO表达载体克隆来自S.arctica和破囊壶菌属物种的Δ-5去饱和酶基因，并且将c-d6Elo(Tp_GA2)和c-d8Des(Eg)克隆入pESC-Leu表达载体。将酵母用适宜载体对转化并且依据DOB-尿嘧啶-亮氨酸选择。培育并诱导阳性培养物，并且如上文在实施例23中所述那样实施GC分析。同时培育全部培养物。
表164.推导的Δ-5去饱和酶的作用模式。
如表164中所述，c-d5Des(Sa)对DHGLA的Δ-5去饱和酶活性是相似的，无论DHGLA是否衍生自辅酶A(CoA)汇集物中延伸或磷脂酰胆碱(PC)汇集物中去饱和。相反，表164还显示如果DHGLA底物衍生自CoA汇集物中延伸，则c-d5Des(Tc_GA2)的Δ-5去饱和酶活性高得多。结合来自TLC分析脂质的数据，这表明c-d5Des(Tc_GA2)能够使CoA汇集物中的底物去饱和，不过未显示去饱和作用限于这种汇集物。
在PC汇集物中有活性的去饱和酶(c-d6Des(Pir_GA))及认为在CoA汇集物中有活性去饱和酶(c-d6Des(Ot_febit))去饱和后测定Δ-6-延伸的水平。由于延伸在酰基-CoA汇集物中发生，更高效的延伸可能在酰基-CoA依赖性去饱和酶去饱和后发生。还在一种对PC底物有活性的Δ-12去饱和酶存在下表达两种去饱和酶，以允许比较后续Δ-6去饱和作用的效率。最后，比较各个去饱和酶基因和成对去饱和酶基因对延伸酶活性和去饱和酶活性的影响以确定剂量效应。
表165.多种Δ-6去饱和酶对后续Δ-6延伸作用的影响＊。
构建体 Δ-6Des％ Δ-6ELO％
pT-c-d6Des(Ot_febit)与pY-c-d6Elo(Tp_GA2) 44.9±1.0 89.3±1.4
pT-c-d6Des(Pir_GA)和pY-c-d6Elo(Tp_GA2) 19.7±0.5 63.7±4.8
＊培养物饲以LA并且测量GLA(Δ-6去饱和)和DHGLA(Δ-6延伸)的产生。pY：pYES2.1/V5-His-TOPO表达载体；pT：pESC-trp表达载体。全部基因均处于Gal1启动子的控制下。
表166.Δ-12去饱和作用对后续Δ-6延伸作用的影响＊。
构建体 Δ-12DES％ Δ-6DES％
pT-c-d6Des(Ot_febit)与pY-c-d12Des(Ps_GA) 60.2±2.9 23.2±0.1
pT-c-d6Des(Pir_GA)与pY-c-d12Des(Ps_GA) 62.8±1.4 17.1±1.7
＊向培养物供应外源18：1n-9。测量LA(Δ-12去饱和)和GLA(Δ-6去饱和)的产生。pY：pYES2.1/V5-His-TOPO表达载体；pT：pESC-trp表达载体。全部基因均处于Gal1启动子的控制下。
与通过c-d6Des(Pir_GA)去饱和作用衍生的GLA相比，通过c-d6Des(Ot_febit)去饱和作用衍生GLA时，借助c-d6Elo(Tp_GA2)的GLA转化作用更高(表165)。这显示c-d6Des(Ot_febit)在酰基-CoA汇集物中发挥作用，令所产生的底物更轻易为Δ-6延伸酶可获得，并且因此导致更高的延伸酶活性。相应地，如果底物衍生自在PC汇集物中的Δ-12去饱和，则c-d6Des(Ot_febit)的Δ-6去饱和酶活性降低几乎一半(表165和表166)，而无论底物(LA)从PC汇集物中OA的Δ-12-去饱和衍生或外源地供应，c-d6Des(Pir_GA)的Δ-6去饱和酶活性是相似的(表165和表166)。认为外源供应的底物以酰基-CoA的形式进入酵母细胞。结合来自TLC分析脂质的数据，该数据表明，c-d6Des(Ot_febit)是酰基-CoA依赖性酶，与先前预测(Domergue等人，(2005)Biochem.J.389：483-490)一致。
表167.底物汇集物和基因剂量对ALA的Δ-6-去饱和作用和后续Δ-6-延伸作用的影响。
*培养物饲以ALA并且测量SDA(Δ-6去饱和)和20：4n-3(Δ-6延伸)的产生。pY：pYES2.1/V5-His-TOP0表达载体；pL：pESC-Leu表达载体；pT：PESC-trp。均受Ga11启动子调节。
N/A：不适用；DES：去饱和转化百分数。来自至少3个克隆的数据用于每次测量。
表168.底物汇集物和基因剂量对LA的Δ-6-去饱和作用和后续Δ-6-延伸作用的影响。
*培养物饲以LA并且三次重复测量GLA(Δ-6去饱和)和DHGLA(Δ-6延伸)的产生。pY：pYES2.1/V5-His-TOPO表达载体；pL：pESC-Leu表达载体；pT：PESC-trp。全部基因均置于Ga11启动子的控制下。N/A：不适用；DES：去饱和转化百分数。
当共表达c-d6Elo(Tp_GA2)和c-d6Des(Ot_febit)(CoA)时，与共表达c-d6Elo(Tp_GA2)和c-d6Des(Pir_GA)(PC)相比，实现更高的延伸酶转化效率，无论是否外来供应n-3底物或ω-6底物(表167、表168)。无论相关去饱和酶基因是否克隆入pYes载体或pESC-trp载体，均观察到这种情况。在两个去饱和酶基因存在下，观察到去饱和效率轻微增加，特别在供应ω-3底物ALA的培养物中。与携带单一c-d6Des(Ot_febit)的培养物相比，延长的底物的比例在两种酰基-CoA依赖性c-d6Des(Ot_febit)存在下或在两种去饱和酶存在下仅略微地增强。c-d6Elo(Tp_GA2)与双拷贝c-d6Des(Pir_GA)(PC)的共表达在携带两种去饱和酶的培养物当中导致最低的延伸转化水平。酰基-CoA依赖性Δ-6去饱和酶的存有助于较高Δ-6延伸活性，无论它是否表达单独或与第二种去饱和酶一起表达，这进一步表明这个基因对VLC-PUFA合成的效能。
在一种已知在CoA汇集物中发挥作用的辅助酶c-d5Elo(Ot_GA3)存在下，确定底物汇集物对多种Δ-4去饱和酶的影响。还确定了Δ-4去饱和酶基因的基因剂量效应。
表169.底物汇集物和基因剂量效应对Δ-4去饱和酶(供应外源EPA)的影响。
*培养物饲以EPA并且测量至少三份样品的DPA(Δ-5延伸)和DHA(Δ-4去饱和)的产生。pY：pYES2.1/V5-His-TOPO表达载体；pL：pESC-Leu表达载体；pT：PESC-trp。全部基因均置于Ga11启动子的控制下。N/A：不适用。剂量效应：括号内的数字＝双去饱和酶构建体的转化效率/(单基因A构建体的转化效率+单基因B构建体的转化效率)。
表170.底物汇集物和基因剂量效应对Δ-4去饱和酶(供应外源ARA)的影响。
*培养物饲以ARA并且测量DTA(Δ-5延伸)和DPAn-6(Δ-4去饱和)的产生。pY：pYES2.1/V5-His-TOPO表达载体；pL：pESC-Leu表达载体；pT：PESC-Trp表达载体。全部基因均置于Ga11启动子的控制下。N/A：不适用。剂量效应：括号内的数字＝双去饱和酶构建体的转化效率/(单基因A构建体的转化效率+单基因B构建体的转化效率)。
通过路氏巴夫藻和c-d4Des(Tc_GA)实现的去饱和水平是相似的。当使用两种Δ-4去饱和酶时，仅对路氏巴夫藻/破囊壶菌属物种对观察到明显的基因剂量效应，并随双拷贝的破囊壶菌属物种去饱和酶观察到最低基因剂量效应。在延长的ARA(表170)和EPA(表169)存在时，观察到这些趋势。但是，对于n-6延伸底物(ARA)，与ω-3底物(EPA)相比，去饱和转化百分数通常略微较低。
实施例23：含有转录因子结合基序的间隔区
如实施例3和4中所示，在本发明中所用的构建体的每个表达盒之间存在100-200碱基对的间隔区。对于BiBAC T-DNA，各基因盒之间的短段序列(其已经成为共转化载体中的多隆位点和Gateway位点序列)经受随机化以维持GC含量并移除具有相同序列的多个重复序列。技术人员将认识到，在构建体、尤其大型多基因构建体内部多个重复序列的存在可能导致内部缺失和重排，当质粒克隆入大肠杆菌并且经所用的农杆菌菌株/物种传代时。在移除重复序列和调整GC含量后，随后对间隔区的序列检查转录因子和其他DNA相互作用蛋白的任何潜在结合位点。所用的间隔区序列是RTP10690_1至RTP10690_12(包含AtAHAS启动子和终止子)、RTP10690_5′、LJB2197_5’和LJB2197_1至LJB2197_4。加下划线的数字还代表这样的顺序，其中按前进的盒中GOI的有义方向，从右边界读向左边界该间隔区在盒中出现。例如，RTP10690_1是构建体VC-RTP10690-1qcz_F中第一盒的终止子之后和第二盒的启动子之前的序列。还检查AHAS选择盒的终止子和第一盒的5’区域。
＞RTP10690_1
TTAATTCAGCTAGCTAGCCTCAGCTGACGTTACGTAACGCTAGGTAGCGTCACGTGACGTTAGCTAACGCTAGGTAGCGTCAGCTGAGCTTACGTAAGCGCTTAGCAGATATTT
＞RTP10690_2
TTACTGATTGTCTACGTAGGCTCAGCTGAGCTTACCTAAGGCTACGTAGGCTCACGTGACGTTACGTAAGGCTACGTAGCGTCACGTGAGCTTACCTAACTCTAGCTAGCCTCACGTGACCTTAGCTAACACTAGGTAGCGTCAGCTCGACGGCCCG
＞RTP10690_3
GGCGGAGTGGGGCTACGTAGCGTCACGTGACGTTACCTAAGCCTAGGTAGCCTCAGCTGACGTTACGTAACGCTAGGTAGGCTCAGCTGACACGGGCAGGACATAG
＞RTP10690_4
GAATGAAACCGATCTACGTAGGCTCAGCTGAGCTTAGCTAAGCCTACCTAGCCTCACGTGAGATTATGTAAGGCTAGGTAGCGTCACGTGACGTTACCTAACACTAGCTAGCGTCAGCTGAGCTTAGCTAACCCTACGTAGCCTCACGTGAGCTTACCTAACGCTACGTAGCCTCACGTGACTAAGGATGACCTACCCATTCTT
＞RTP10690_5
GCGGCCGCTAGCTAGCCTCAGCTGACGTTACGTAACGCTAGGTAGCGTCACGTGACGTTAGCTAACGCTAGGTAGCGTCAGCTGAGCTTACGTAAGCGCCACGGGCAGGACATAGGGACTACTACAA
＞RTP10690_6
CGAATGAAACCGATCTACGTAGGCTCAGCTGAGCTTACCTAAGGCTACGTAGGCTCACGTGACGTTACGTAAGGCTACGTAGCGTCACGTGAGCTTACCTAACTCTAGCTAGCCTCACGTGACCTTAGCTAACACTAGGTAGCGTCAGCTTAGCAGATAT
＞RTP10690_7
CCGTTCAATTTACTGATTGTCTACGTAGCGTCACCTGACGTTACGTAAGGCTACCTAGGCTCACGTGACGTTACGTAACGCTACGTAGCGTCAGGTGAGGTTAGCTAACGCTAGCTAGCCTCACCTGACGTTAGGTAAGGCTACGTAGCGTCACCTGAGATTAGCTAAGCCTACCTAGACTCACGTGACCTTAGGTAACGCTACGTAGCGTCAAAGCTTTACAACGCTACACAAA
＞RTP10690_8
TTACCTAACTTAGAACTAAAATCAACTCTTTGTGACGCGTCTACCTAGAGTCAGCTGAGCTTAGCTAACGCTAGCTAGTGTCAGCTGACGTTACGTAAGGCTAACTAGCGTCACGTGACCTTACGTAACGCTACGTAGGCTCAGCTGAGCTTAGCTAACCCTAGCTAGTGTCACGTGAGCTTACGCTACTATAGAAAATGTGTTATAT
＞RTP10690_9
TTCAGTCTAAAACAACTACGTAGCGTCACGTGACGTTACCTAAGCCTAGGTAGCCTCAGCTGACGTTACGTAACGCTAGGTAGGCTCAGCTGACTGCAGCAAATTTACACATTGCCA
＞RTP10690_10
TAATTCGGCGTTAATTCAGCTACGTAGGCTCAGCTGAGCTTACCTAAGGCTACGTAGGCTCACGTGACGTTACGTAAGGCTACGTAGCGTCACGTGAGCTTACCTAACTCTAGCTAGCCTCACGTGACCTTAGCTAACACTAGGTAGCGTCAGCACAGATGAATACTAGCTGTTGTTCA
＞RTP10690_11
ATCATGATGCTTCTCTGAGCCGTGTTTGCTAGCTAGCCTCAGCTGACGTTACGTAACGCTAGGTAGCGTCACGTGACGTTAGCTAACGCTAGGTAGCGTCAGCTGAGCTTACGTAAGCGCACAGATGAATACTAGCTGTTGTTCACA
＞RTP10690_12
CTTCTCTGAGCCGTGTTTGCTAGCTAGCCTCAGCTGACGTTACGTAACGCTAGGTAGCGTCACGTGACGTTAGCTAACGCTAGGTAGCGTCAGCTGAGCTTACGTAAGCGCTTAATTAAAGTACTGATATCGGTACCAAATCGAATCCAAAAATTACGGATATGAATAT
＞RTP10690_5′
ATTACAACGGTATATATCCTGCCAGTCAGCATCATCACACCAAAAGTTAGGCCCGAATAGTTTGAAATTAGAAAGCTCGCAATTGAGGTCTACAGGCCAAATTCGCTCTTAGCCGTACAATATTACTCACCGGTGCGATGCCCCCCATCGTAGGTGAAGGTGGAAATTAATGGCGCGCCTGATCACTGATTAGTAACTATTACGTAAGCCTACGTAGCGTCACGTGACGTTAGCTAACGCTACGTAGCCTCAGCTGACGTTACGTAAGCCTACGTAGCGTCACGTGAGCTTAGCTAACGCTACCTAGGCTCAGCTGACGTTACGTAACGCTAGCTAGCGTCACTCCTGCAGCAAATTTACACA
＞t-AtAHASL
GAGATGAAACCGGTGATTATCAGAACCTTTTATGGTCTTTGTATGCATATGGTAAAAAAACTTAGTTTGCAATTTCCTGTTTGTTTTGGTAATTTGAGTTTCTTTTAGTTGTTGATCTGCCTGCTTTTTGGTTTACGTCAGACTACTACTGCTGTTGTTGTTTGGTTTCCTTTCTTTCATTTTATAAATAAATAATCCGGTTCGGTTTACTCCTTGTGACTGGCTCAGTTTGGTTATTGCGAAATGCGAATGGTAAATTGAGTAATTGAAATTCGTTATTAGGGTTCTAAGCTGTTTTAACAGTCACTGGGTTAATATCTCTCGAATCTTGCATGGAAAATGCTCTTACCATTGGTTTTTAATTGAAATGTGCTCATATGGGCCGTGGTTTCCAAATTAAATAAAACTACGATGTCATCGAGAAGTAAAATCAACTGTGTCCACATTATCAGTTTTGTGTATACGATGAAATAGGGTAATTCAAAATCTAGCTTGATATGCCTTTTGGTTCATTTTAACCTTCTGTAAACATTTTTTCAGATTTTGAACAAGTAAATCCAAAAAAAAAAAAAAAAATCTCAACTCAACACTAAATTATTTTAATGTATAAAAGATGCTTAAAACATTTGGCTTAAAAGAAAGAAGCTAAAAACATAGAGAACTCTTGTAAATTGAAGTATGAAAATATACTGAATTGGGTATTATATGAATTTTTCTGATTTAGGATTCACATGATCCAAAAAGGAAATCCAGAAGCACTAATCAGACATTGGAAGTAGG
＞LJB2197_5′
ACATACAAATGGACGAACGGATAAACCTTTTCACGCCCTTTTAAATATCCGATTATTCTAATAAACGCTCTTTTCTCTTAGGTTTACCCGCCAATATATCCTGTCAAACACTGATAGTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGATCACTGATTAGTAACTAAGGCCTTTAATTAATCTAGAGGCGCGCCGGGCCCCCTGCAGGGAGCTCGGCCGGCCAATTTAAATTGATATCGGTACATCGATTACGCCAAGCTATCAACTTTGTATAGAAAAGTTGCCATGATTACGCCAAGCTTGGCCACTAAGGCCAATTTCGCGCCCTGCAGCAAATTTACACA
＞LJB2197_1
CAATTTACTGATTGTGTCGACGCGATCGCGTGCAAACACTGTACGGACCGTGGCCTAATAGGCCGGTACCCAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGATTACGCCAAGCTTGGCCACTAAGGCCAATTTAAATCTACTAGGCCGGCCATCGACGGCCCGGACTGTA
＞LJB2197_2
GGCGGAGTGGGGGGCGCCTACTACCGGTAATTCCCGGGATTAGCGGCCGCTAGTCTGTGCGCACTTGTATCCTGCAGGTTAGGCCGGCCACACGGGCAGGACATAGGG
＞LJB2197_3
AAACCGAATGAAACCGATGGCGCCTACCGGTATCGGTCCGATTGCGGCCGCTTAAAGGGCGAATTCGTTTAAACACTGTACGGACCGTGGCCTAATAGGCCGGTACCACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGCCATGATTACGCCAAGCTTGGCCACTAAGGCCAATTTAAATCTACTAGGCCGGCCATAAGGATGACCTACCCATTCTT
＞LJB2197_4
TTAATTCAGGGCCGGCCAAAGTAGGCGCCTACTACCGGTAATTCCCGGGATTAGCGGCCGCTAGTCTGTGCGCACTTGTATCCTGCAGGTTAGGCCGGCCATTAGCAGATATTT
表171：构建体VC-RTP10960-1qcz_F和VC-LJB2197-1qcz中所含的盒及其前方位于启动子区5’的间隔区。粗体字母表示对应于上文所列Seq ID的间隔区。
已知转录因子结合DNA的某些序列，并且从这个与染色体相互作用的点，它们调节某个基因或基因子集的转录。由转录因子结合的特定序列称作DNA结合基序并且可以是处于数十碱基对至少到四碱基对范围内。大部分DNA结合基序由不到十碱基对组成，但是已经记录这些基序是与其结合的转录因子上调或下调转录所必需的并且足以使所述转录因子上调或下调转录。关于转录因子基序的例子和用来支持基序的可能数据；参见；Hattori等人，2002；Keller等人，1995；Kim等人，2014；Lopez等人，2013；Machens等人，2014；Muino，2013；Sarkar，2013；Dubos等人，2014)。鉴定的基序已经在公众可以访问和查询的多个数据库中维护并归档，如PLACE(Higo等人，1999)。尽管使用某些表征的启动子作为调节本发明中给定转基因表达的主要手段，转基因的备选性调节作用可能在本发明描述的植物中因间隔区中存在一个或多个活跃转录因子结合基序而出现。公共文献中人工/合成性启动子的例子支持这条推理线；关于通过随机装配核苷酸和迭代检验产生的启动子以及经装配以产生人工启动子的具有已知转录活性的特定片段的例子，参见Kong等人，(2014)，Nishikata等人，(2013)和Brown等人，(2014)。因此，除使用的内含子、终止子和启动子之外，本发明中给定转基因的调节区还包括处于含有转基因的盒的前方的间隔区。
表172：存在于区域和核苷酸序列中的间隔区和转录因子结合基序列表。大写字母指基序，而周围的碱基表示可能相邻于预测的基序、但并非该基序在调节转录中发挥作用所必需的序列的例子
表172中特别需要注意的是数目高得令人惊讶的序列，所述序列含有构建体VC-RTP10690-1qcz_F的脱落酸相关转录因子结合基序。脱落酸是涉及种子成熟、干燥和应激反应的植物激素，全面综述，参见Cutler等人，(2010)。根据关于脱落酸及其影响种子成熟的已知内容，观察到的大数目的涉及响应于脱落酸调节基因表达的基序可能在VC-RTP10690-1qcz_F中基因的观测转录物水平和基因表达时程中发挥某种作用。除了对转录的可能影响之外，文献中还已知，形态受GC含量影响(参见Wachter等人，2014)并且谨慎的是在T-DNA中具有尽可能与宿主匹配的GC含量。除了降低缺失和重排的可能性之外，减少重复序列的量还将影响DNA形貌和基因调节(Ramamoorthy等人，2014)。间隔区将有助于T-DNA对局部染色质结构的总体影响，这转而将影响怎样调节和转录该区域中的基因(Parker等人，2009；Meggendorfer等人，2010)。
实施例24基因表达、拷贝数确定和事件检测
根据授粉后日期，收获代表野生型BiBAC VC-RTP10690-1qcz_F和共转化构建体：VC-LJB2197-1qcz连同VC-LLM337-1qcz rc、VC-LJB2755-2qcz rc连同VC-LLM391-2qcz rc和VC-LJB2755-2qcz rc连同VC-LTM217-1qcz rc的植物材料。表1、表2、表4、表6、表7和表8中展示构建体细节(基因和启动子)。基于与所用生长条件下发育阶段相关的授粉后日期，将种子合并成汇集物。汇集的种子立即地冷冻在液氮中并随后储存在-80℃。在7ml管中使用24-Dual技术和两种陶瓷珠(6500Hz，2-3次，20秒)，将三分之一冷冻的不成熟种子匀浆。从每份汇集物中，使用三个等分试样的50-70mg组织分离RNA。将冷冻的组织研磨成细粉末并且遵循本领域技术人员熟悉的基本方法提取(关于从不成熟种子和样品提取RNA及RNA操作的概述，参见Ruuska等人，2000及Focks和Benning，1998以及Sambrook等人，1989)。根据方案“SG-MA_0007-2009RNA分离”，使用Spectrum植物总RNA试剂盒货号STRN50(SIGMA-ALDRICH GmbH，Munich，德国)提取RNA。总RNA的浓度平均是约450ng/μl。260/280比率在2.2并且260/230比率在2.3。
为了合成cDNA供qPCR，用DNAseI(DEOXYRIBUNUCLEASE I(AMP-D1，来自SIGMA-Aldrich，GmbH的扩增级)根据供应商的方案处理1μg总RNA。在DNAseI处理后，以用于qRT-PCR的SuperScriptTM III First-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen，目录号11752-250)及寡聚dT和随机六聚物组合进行逆转录反应，以确保彻底和均匀地代表全部转录物，无论长度如何。
定量实时pcr方案
使用本领域技术人员视为标准的方法，实施定量实时PCR测量转录物；参见Livak和Schmittgen(2001)。将qPCR反应作为单纯TaqMan反应进行。内部分离内源参比基因并基于观察到与发育期间拟南芥中直向同源物相对应的转录物的稳定性，因预测的转录物稳定性而使用。分离卡诺拉油菜直向同源物，并且基因，SEQ ID，是糖基-磷脂酰肌醇氨基转移酶途径(GPI)的组成部分。将上文描述的cDNA反应1∶4稀释。采用JumpStart TAQ ReadyMix(P2893-400RXN Sigma-Aldrich，GmbH)，每10μl qPCR反应使用对应于25ng总RNA的2μlcDNA。正向引物和反向引物的引物/探针浓度是900nmol并且TaqMan探针的浓度是100nmol。用FAM/BHQ1标记针对目的靶的TaqMan探针，并且用Yakima Yellow/BHQ1标记参比基因。
伴随来自汇集物VC-RTP10690-1qcz_F、非模板对照、三个RT对照(VC-RTP10690-1qcz_F、VC-LTM593-1qcz rc(约4w)和共转化VC-LJB2197-1qcz+VC-LLM337-1qcz rc)的cDNA，每个qPCR测定法包括1∶1稀释曲线(5个稀释步骤)。从每份汇集物测量cDNA的三个独立等分试样作为技术性重复。伴随以下PCR条件使用ABI 7900序列检测系统(Applied Biosystem)：
初始变性 95℃300秒 1个循环
扩增 95℃15秒/60℃60秒 重复40个循环
原始数据分别是靶的Ct值和内源参比基因的Ct值。通过扣减法计算dCt值：Ct(GOI)-Ct(Ref)。参比dCt值设定为等于零，这解读为意指，如果GPI和目的基因之间不存在差异(dCt＝0)，则表达＝1。表达倍数等于2-dCt(其中dCt＝(Ct(GOI)-Ct(Ref)-0))。从每种汇集物取得三份样品并且计算几何平均数(geomean)以及阳性和阴性几何偏差。计算每个目的基因和内源参比基因(GPI)的稀释曲线斜率作为扩增效率的指标。表173、表174和表175显示了用来为qPCR测定法扩增基因的探针和引物。
表173：qPCR反应中所用的探针
表174：qPCR中使用的正向引物
表175：用于qPCR的反向引物
BiBAC和共转化的基因表达时间过程的转录物分析。
如上文所述分析四个构建体的转化体，并且遵循本领域技术人员已知的标准方案以及随所用试剂盒提供的说明书，如所述那样测量相对于单一标准品的转录物丰度。图16、图17、图18、图19、图20和图21中的曲线代表所列基因随时间推移的丰度，其中误差由阳性和阴性几何偏差代表。时间在横坐标上列出并且表示授粉后天数，并且纵坐标含有相对于内标物(卡诺拉油菜GPI)的目的基因表达。具有所列的两个构建体的株系代表共转化事件。
受VfUSP启动子驱动的附带CaMV35S终止子的基因o3Des(Pi_GA2)存在于VC-LJB2755-2qcz、VC-LLM337-1qcz rc和VC-RTP10960-1qcz_F中。在图16中观察到，C-RTP10960-1qcz_F具有相对低的转录物积累，而VC-LJB2755-2qcz和VC-LLM391-2qcz rc的共转化组合含有来自基因o3Des(Pi_GA2)的转录物的最高积累。具有启动子、终止子、内含子和启动子前方间隔区的这种转录物的总体趋势是在种子发育范围内增加。
受LuCnl启动子驱动的附带AgrOCS 192bp[LED12]终止子的基因d4Des(Pl_GA)2存在于VC-LTM217-1qcz rc和VC-RTP10960-1qcz_F二者中。在图19中对两种构建体观察到，相对于GPI参比的积累处于4-12倍范围内，在种子发育范围内逐渐积累，同时VC-RTP10960-1qcz_F积累少于VC-LTM217-1qcz rc。
o3Des(Pir_GA)基因存在于VC-LJB2755-2qcz和VC-RTP10960-1qcz_F中，受LuCnl启动子驱动，附带AtPXR 400bp[LLL823]终止子，而它存在于VC-LLM337-1qcz rc中，受VfSBP_perm3启动子驱动，附带StCATHD-pA终止子。在误差范围内，难以将某个样式归于任何构建体，但是如图17中所示，构建体组合VC-LJB2755-2qcz和VC-LLM391-2qcz的单拷贝事件具有趋向种子成熟的峰，其未在任何其他构建体观察到所述峰。受BnSETL启动子驱动和由BnSETL终止子终止的该基因的附加拷贝存在于RTP10960-1qcz_F中。但是，类似于受相同控制元件集合控制的d5Des(Tc_GA2)基因，在p-BnSETL启动子控制下的o3Des(Pir_GA)拷贝以低于具有不同控制元件的其他基因的水平表达(图18)。
基因d4Des(Tc_GA)含于VC-LLM337-1qcz rc、RTP10960-1qcz_F和VC-LTM217-1qczrc中并且受ARC5_perm1启动子驱动，附带pvarc终止子。这个基因的单点突变体d4Des(Tc_GA)_T564G含于VC-LLM391-2qcz rc中并且受ARC5_perm1启动子连同pvarc终止子调节。采用这种间隔区、启动子和终止子组合的表达的总体趋势在种子发育范围内增加并且随后趋向种子成熟时下降，如图20中所示。有意义地，构建体对VC-LJB2755-2qcz与VC-LLM391-2qcz rc并不遵守这种趋势，反而在种子发育范围内继续增加并且具有比其他构建体和构建体组合更稳健的表达。如先前观察到，VC-RTP10960-1qcz_F具有最低的表达水平。
VC-LLM337-1qcz rc和VC-LLM391-2qcz rc含有受LuCnl启动子驱动的d4Des(Eg_GA)连同AgrOCS 192bp[LED12]终止子。可以在图21中见到，随含有这两种构建体之一的单拷贝事件观察到种子发育期间增加的相似表达水平。
拷贝数
为了评估是否将整个PUFA生物合成途径带入植物并且评估选择的事件中重复和/或缺失出现至何种程度，对某些基因连同T-DNA实施拷贝数分析。
DNA提取
除两个其他事件的正在萌发的种子的子叶之外，还分析了来自三个事件的加棕色点的不成熟种子。根据与Sambrook等人，1982一致的标准方案分离gDNA。为了分离植物组织DNA，使用Wizard Magnetic 96DNA植物系统(Promega，Madison，WI USA货号FF3760)。遵循供应商的方案，同时执行列出的改变以增加提取的DNA的量：提取缓冲液体积增加至200微升并且所用珠的体积增加到90微升，同时洗脱缓冲液体积降至20微升。
使用定量PCR JumpStart TaqReadyMix(Sigma，D7440)进行双链体qPCR反应。根据qPCR标准方案验证qPCR测定法，参见Demeke和Jenkins(2010)及Livak和Schmittgen(2001)。基于单拷贝事件已知的汇集物的参比dCt值的均数，用ddCt法计算基因组拷贝数。使用Excel函数“频率”，逐靶和逐事件计数0、1、2、3、＞4的组。进行卡方检验以检验以下假设：家族正在对单个T-DNA分离。对于单个T-DNA分离，P值的临界值设在＞0-0499。
使用列出的引物和探针和根据本领域技术人员使用的标准方案，实施PCR拷贝数分析，参见Livak和Schmittgen(2001)及Demekes T.和Jenkins RG(2010)。
下文按名称列出引物对和探针并且可以在序列表中找到序列：
来自转基因事件分离基因组侧翼序列
测定在事件LANBCH、LBFDGG、LBFDHG、LBFGKN、LBFIHE、LBFLFK、LBFPRA和LBFDAU中每个T-DNA插入旁侧分布的基因组DNA序列。从温室培育的植物收获叶样品并冷冻。研磨叶组织并且使用植物基因组DNA提取标准方案，提取基因组DNA。随后通过衔接头连接介导的PCR，将一个等分量的来自每个事件的基因组DNA用来分离侧翼序列，如O’Malley等人2007Nature Protocols2(11)：2910-2917中所述。使用这项技术，生成含有T-DNA边界和相邻基因组DNA的序列的PCR产物。对于每个事件，获得与每个T-DNA基因座的左边界和右边界相对应的不同PCR产物。将各个PCR产物分离并使用标准DNA测序方案测序，以确定侧翼区的序列。事件LANBCH的侧翼序列是SEQ ID NO：212、SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：216和SEQ ID NO：217。事件LBFDGG的侧翼序列是SEQ ID NO：218和SEQ IDNO：219。事件LBFDHG的侧翼序列是SEQ ID NO：220、SEQ ID NO：221、SEQ ID NO：222和SEQID NO：223。事件LBFGKN的侧翼序列是SEQ ID NO：224和SEQ ID NO：225。事件LBFIHE的侧翼序列是SEQ ID NO：226和SEQ ID NO：227。事件LBFLFK的侧翼序列是SEQ ID NO：228、SEQ IDNO：229、SEQ ID NO：230和SEQ ID NO：231。事件LBFPRA的侧翼序列是SEQ ID NO：232、SEQID NO：233、SEQ ID NO：234、SEQ ID NO：235和SEQ ID NO：236。事件LBFDAU的侧翼序列是SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：239和SEQ ID NO：240。侧翼序列可用于确定T-DNA插入的基因组位置和包围插入的基因组DNA的完整性。例如，事件LBFGKN含有质粒VC-LTM593-1qcz rc的单个T-DNA插入。SEQ ID NO：224和SEQ ID NO：3的DNA序列比对结果可以用来揭示与T-DNA右边界对应的侧翼序列部分。与T-DNA不相同的侧翼序列部分因此对应于毗邻于T-DNA右边界的基因组DNA。同样地，可以比对SEQ ID NO：225和SEQ ID NO：3以鉴定毗邻于T-DNA左边界的基因组DNA序列。对于事件LBFGKN，与T-DNA的右边界和左边界毗邻的基因组DNA片段可以定位至欧洲油菜Darmor参比基因组的染色体C04。基于欧洲油菜参比基因组注释，事件LBFGKN的T-DNA远离任何预测的基因或编码区超过5000bp插入。此外，与基因组DNA对应的侧翼序列部分表明，T-DNA插入周围无基因组DNA重排。
因此，在一个实施方案中，本发明的植物是产生EPA和/或DHA、优选地EPA和DHA的本发明转基因植物，优选地转基因欧洲油菜植物，所述植物包含一个或多个T-DNA以表达一个或多个产生EPA和/或DHA的基因，从而每个插入的T-DNA拷贝不破坏任何基因，例如，不破坏内源基因或转基因。优选地，整装种子中的EPA和DHA含量是10mg、15mg、20mg、24mg、30mg、31mg、35mg、38mg或更多EPA和DHA/g种子。在一个实施方案中，整装种子中的EPA和DHA含量在10mg和70mg之间、在15mg和60mg、20mg和50mg之间或在24mg和38mg之间。
在一个实施方案中，T-DNA的遗传性插入远离任何内源性基因＞5000碱基对存在。
本发明的植物可以包含一个T-DNA的一个或多个拷贝。在一个实施方案中，植物是纯合的，T-DNA单拷贝整合在每个纯合基因座中，在另一个实施方案中，它是纯合的，T-DNA双拷贝整合在每个纯合基因座中。另外，本发明的植物可以是杂合的，例如，T-DNA的一个或两个拷贝整合在一个杂合基因座中。
事件特异性检测
从事件LANBCH、LBFDGG、LBFDHG、LBFGKN、LBFIHE、LBFLFK、LBFPRA和LBFDAU分离的侧翼序列用于设计事件特异性检测分析以检验T-DNA插入的存在。在这个实施例中提供特异性引物对，但是公开的侧翼序列可以用来设计不同引物对以产生针对每个事件的每个基因座的诊断性扩增子。开发了检测基因座的终点Taqman qPCR测定法并且在这个实施例中描述。其他方法可以是已知的并由本领域技术人员用于检测事件LANBCH、LBFDGG、LBFDHG、LBFGKN、LBFIHE、LBFLFK、LBFPRA和LBFDAU。表176中列出用于测定法的寡核苷酸引物。检测来自LBFDAU和LBFLFK的每个基因座需要使用正向引物、反向引物和探针的特定组合。用FAM/BHQ1标记针对目的靶的TaqMan探针。本文所述的方法针对来自Life Technologies的QuantstudioTM 12K Flex实时PCR系统优化，不过多种方法可以适应于其他系统，附带本领域技术人员已知的少量改良。用JumpStart TaqReadyMix(Sigma，P2893)在384孔平板(Lifetechnologies，目录号4309849)中以10微升/孔的总体积实施终点Taqman qPCR测定法。将每个反应2μl模板DNA与8微升qPCR反应混合物混合。用Optical AdhesiveFilm(Life Technologies，目录号4311971)密封平板。
对于事件特异性检测，如下制备qPCR反应混合物：
qPCR反应如下实施：
表176：用于事件特异性检测的引物和探针。
下文按碱基对(加或减10bp)给出预期的扩增子大小：
扩增子 扩增子大小加或减10bp
扩增子LANBCH基因座1(N5) 100bp
扩增子LANBCH基因座1(N9) 150bp
扩增子LANBCH基因座2(N5) 150bp
扩增子LANBCH基因座2(N9) 120bp
扩增子LBFDAU基因座1 110bp
扩增子LBFDAU基因座2 95bp
扩增子LBFDGG 100bp
扩增子LBFDHG基因座1 200bp
扩增子LBFDHG基因座2 140bp
扩增子LBFGKN 140bp
扩增子LBFIHE 110bp
扩增子LBFLFK基因座1 160bp
扩增子LBFLFK基因座2 170bp
扩增子LBFPRA基因座1 570bp
扩增子LBFPRA基因座2 190bp
扩增子LBFPRA基因座3e 90bp
实施例25蛋白质水平
来自四周龄果荚的汇集种子材料用于蛋白质提取。为了富集膜蛋白并减少背景信号、从研磨的种子组织分离的微粒体用来分析以下酶的蛋白质水平：c-o3Des(Pi_GA2)、c-o3Des(Pir_GA)、d4Des(Eg)、c-d4Des(Pl_GA)2和c-d6Elo(Tp_GA2)。对于c-o3Des(Pir_GA)和c-d6Elo(Tp_GA2)，微粒体进一步用去垢剂提取并用于ELISA。给定基因的多种形式(称作GA、GA2等)均编码与所列基因相对应的相同蛋白质。
最初，在液氮冷却的研钵中，将种子按1g种子/4ml缓冲液的比率在提取缓冲液(25mM Tris，pH 7.4；140mM NaCl；3mM KCl；3mM DTT；200mM山梨糖醇；和无EDTA蛋白酶抑制剂(Roche))中研磨成细粉末。将植物细胞残片通过离心移除(5000x g，10分钟，4℃)，通过用1.5ml提取缓冲液如上文所述碾磨第二次进行再提取并且随后通过离心(5000x g，10分钟，4℃)再次分离。来自这两次提取的上清液合并代表无细胞提取物(一般3.5ml/g种子)。通过超速离心(100,000x g，60分钟，4℃)从无细胞提取物获得微粒体沉淀物。对于c-o3Des(Pi_GA2)、d4Des(Eg)、c-d4Des(Pl_GA)2，将酶微粒体沉淀物悬浮于悬浮缓冲液(1x TBST+1％TritonX-100)中。1X TBST由50mM Tris，150mM NaCl，0.05％Tween 20去垢剂组成，在4℃最终pH为7.6。
对于c-o3Des(Pir_GA)和c-d6Elo(Tp_GA2)，微粒体级分如上文所述分离，并且蛋白质用1x TBST缓冲液和选择的去垢剂增溶(详情请参见下表)。对于c-d4Des(Tc_GA)、c-d5Elo(Ot_GA3)、c-d5Des(Tc_GA2)、c-d6Des(Ot_febit)、c-d6Elo(Pp_GA2)、c-d12Des(Ps_GA)，将种子粉末在液氮中进一步研磨并用1x TBST+1％Triton x 100+蛋白酶抑制剂按1：3W/V比率提取。在4℃使用微量离心机，将上清液在13,000g澄清20分钟并且随后在13,000g离心10分钟。澄清的上清液用于ELISA和总蛋白测定法。
抗体/抗原杂交条件：平板用300μl/孔新鲜制备的封闭液封闭。将平板密封并孵育1小时，连续振荡。在1小时孵育后，用1X TBST洗涤平板两次。
来自上述的提取物用于ELISA测定中。将平板与100μl标准品或样品提取物在4℃孵育过夜，无振摇。将标准品1∶3连续稀释。将平板密封并在4℃孵育过夜。在平板孵育过夜后，用1X TBST洗涤平板五次。在洗涤后，将平板与封闭液中100μl的检测抗体孵育1小时，密封伴以连续振荡。在一小时孵育步骤结束时，用1X TBST洗涤平板五次。随后在密封的平板中，将平板与封闭液中100ml HRP缀合的驴抗动物第二抗体(1∶10,000)孵育1小时，伴以连续振荡。在封闭步骤结束时，随后用1X TBST洗涤平板五次。随后添加100μl一步法TMB并且将平板在室温孵育20分钟，密封伴以连续振荡。在二十分钟后，添加100μl 1M HCl溶液并且在450nm读取平板。
仅用于c-d6Elo(Tp_GA2)：全部步骤与其他蛋白质相同，替代用于其他蛋白质的HRP缀合的驴抗体系统，使用100μl在2％BSA/1X TBST中1∶40,000稀释的生物素缀合的驴抗兔IgG。在这个孵育步骤期间，将平板密封并连续振摇，这进行一小时。在这个步骤结束时，用1X TBST洗涤平板五次。为了读取这个平板，将平板与100μl在2％BSA/1X TBST中1∶40,000稀释的extravidin-过氧化物酶孵育，密封并孵育1小时，伴以连续振荡。随后用1X TBST洗涤平板五次。在450nm读取平板。
表177：用于蛋白质检测和定量的杂交的概述。TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)是辣根过氧化物酶的底物，其用来可视化蛋白质条带，由Sigma-Aldrich T-0565供应并根据生产商的说明书使用。
表178：目的蛋白的水平表述为纳克(ng)/毫克总蛋白。值是来自大约四周龄种子材料的三个技术性量值的平均数和标准偏差。如观察，对于表达的基因，构建体VC-RTP10690-1qcz_F具有比组合VC-LJB2197-1qcz和VC-LLM337-1qcz rc总体较少的蛋白质。
实施例26：与表达这些酶的卡诺拉油菜事件中观察到的脂肪酸特征相比，酵母中观察到的去饱和酶和延伸酶底物专一性和选择性
如实施例10-18中所示那样，工程化卡诺拉油菜以令内源脂肪酸如油酸(18：1n-9)和LA(18：2n-6)转化成20：5n-3和22：6n-3需要引入几种去饱和酶和延伸酶。尽管生物信息学可用于预测大型、充分研究类型的酶(例如Δ-12去饱和酶)的功能，但必须经验地确定酶的精确底物耐受性。因此，如实施例21和22中所示，我们确定了引入卡诺拉油菜的每种去饱和酶和延伸酶的底物耐受性(实施例10-18)。理解每种引入的酶的底物特征允许最佳工程化卡诺拉油菜以通过以下方式产生EPA和DHA：
(1)将三种最优势的卡诺拉油菜内源脂肪酸(OA、LA和ALA，参见实施例10-18中的Kumily特征)转化成EPA和DHA，
(2)最大限度减少副反应，并且
(3)提供改道发送副产物返回EPA和DHA生物合成的校阅机制。
本文提供的实施例更详细地描述了所引入去饱和酶和延伸酶的推导的特异性怎样允许最佳地工程化卡诺拉油菜以产生富含EPA和DHA的油。
Δ-6-去饱和酶：
酵母饲喂研究(表159和表163)显示，Δ-6-去饱和酶(托瑞蚝球藻)可以轻易地接受含有LA(18：2n-6)和ALA(18：3n-3)的底物。如表148-152中所示，所产生的GLA(18：3n-6)Δ-6-去饱和酶(托瑞蚝球藻)产物可以由两种Δ-6-延伸酶(球蒴藓或假微型海链藻)之一、接着由Δ-5-去饱和酶(破囊壶菌属物种ATCC21685)、由两种ω-3-去饱和酶(致病疫霉或畸雌腐霉)之一、Δ-5-延伸酶(托瑞蚝球藻)并且最终由两种Δ-4-去饱和酶(破囊壶菌属物种和路氏巴夫藻)之一加工，以产生DHA(22：6n-3)。所得到的ALA去饱和产物，SDA(18：4n-3)，可以由(球蒴藓或假微型海链藻)Δ-6-延伸酶之一转化成含有20：4n-3的脂肪酸(参见表160)，后者可以由Δ-5-去饱和酶(破囊壶菌属物种ATCC21685)接受，以产生如表162中所示的EPA(20：5n-3)连接的脂肪酸。对实施例(10-18)中工程化卡诺拉油菜株系展示的脂肪酸分析数据显示了相对于非转基因Kumily对照而言较低水平的ALA，与ALA工程化转化成20：5n-3和22：6n-3一致。
Δ-6-延伸酶：
酵母饲喂研究(表160和表163)显示两种Δ-6-延伸酶(球蒴藓和假微型海链藻)均接受18-碳链底物，但是优选在碳-6去饱和的分子(参见GLA(18：3n-6)和SDA(18：4n-3)与LA(18：2n-6)和ALA(18：3n-3)。来自假微型海链藻的Δ-6-延伸酶在识别Δ-6-去饱和脂肪酸方面比来自球蒴藓的对应酶严格得多。在实施例(10-18)提出的工程化卡诺拉油菜株系的脂肪酸分析中，检测到分别因去饱和LA和ALA产生的20：2n-6和20：3n-3。纳入这些来自球蒴藓和假微型海链藻的特定延伸酶允许优选转化在碳-6去饱和的脂肪酸，因此，提供EPA和DHA从GLA和SDA的最大转化。LTM593(实施例18)株系的脂肪酸特征显示，20：2n-6和20：3n-3的水平大约与野生型Kumily存在的水平相同，从而证实引入卡诺拉油菜时，来自球蒴藓和假微型海链藻的Δ-6延伸酶的特异性。
Δ-5-去饱和酶：
酵母饲喂研究(表159和表162和表163)显示，Δ-5-去饱和酶(破囊壶菌属物种ATCC21685)接受DHGLA(20：3n-6)和20：4n-3。如上所述(实施例26(本部分)，Δ-6-去饱和酶)，Δ-5-去饱和酶(破囊壶菌属物种ATCC21685)去饱和20：4n-3的能力对ALA和SDA转化成20：5n-3和22：6n-3重要。
ω-3-去饱和酶：
酵母饲喂研究显示，两种ω-3-去饱和酶(致病疫霉和畸雌腐霉)均可以接受ARA(20：4n-6)、DTA(22：4n-6)和DHGLA(20：3n-6)。这些ω-3-去饱和酶优选具有4个双键的分子。在实施例(10-18)中所述的转基因卡诺拉油菜株系中，如表163中所显示，这些ω-3-去饱和酶利用22：4n-6作为底物的能力允许再指引已经由Δ-5-延伸酶(托瑞蚝球藻)延长的ARA(20：4n-6)返回该途径作为合成DHA(22：6n-3)的22：5n-3(工程化Δ-4去饱和酶的底物)。LTM593(实施例18)株系的脂肪酸特征显示可检测、但低水平的22：4n-6，与这种脂肪酸在经工程化以合成DHA的所述卡诺拉油菜中体内转化成22：5n-3一致。
Δ-5-延伸酶：
酵母饲喂研究显示(表161和表163)，Δ-5-延伸酶(托瑞蚝球藻)优选20碳链底物，EPA(20：5n-3)和ARA(20：4n-6)，但是还可以延伸含有18碳链的脂质如SDA(18：4n-3)和ALA(18：3n-3)。在工程化卡诺拉油菜(实施例10-18)中，ω-3-去饱和酶(致病疫霉和畸雌腐霉)的存在允许因ARA延伸产生的22：4n-6产物转化成22：5n-3，并且后者随后由Δ-4-去饱和酶(破囊壶菌属物种和路氏巴夫藻)去饱和以产生终产物22：6n-3。实施例10-18中所述的转基因卡诺拉油菜株系的脂肪酸分析显示微小水平的22：4n-6，这或许归因于ω-3去饱和酶再指引这种脂质返回22：6n-6生物合成的能力。从延长SDA产生的20：4n-3是Δ-5-去饱和酶(破囊壶菌属物种ATCC21685)识别的底物并且可以转化成20：5n-3，Δ-5-延伸酶(托瑞蚝球藻)的优选底物。
Δ-4-去饱和酶：
酵母饲喂研究(表159和表163)显示，两种Δ-4-去饱和酶(破囊壶菌属物种和路氏巴夫藻)均可以接受22：5n-3和DTA(22：4n-6)，轻微偏好22：5n-3。
实施例27：定量性LC-MS中使用差异性标记的重肽监测消化效率。
所述的方法提供了在定向蛋白质组学实验中定量消化效率的途径。在大部分MRMLC-MS应用中，测量消化效率依赖于这样的间接测量，所述间接测量通过比较丢失裂解的(missed peptides)检出肽的数目与单独LC-MS实验中完全消化的检出肽的数目，检验样品的肽特征。尽管在这个实验中提供了胰蛋白酶效率的全貌，但是数据基本上未解决MRM实验中正在监测的靶序列的特异性消化问题。测量总体消化效率未解决胰蛋白酶活性中可能的序列特异性偏倚并且可能导致错误表述靶量。实际上，日益理解胰蛋白酶消化动力学强烈地受序列背景影响(Proc J.等人，2010.Journal of Proteome Res.9：5422-5437和Lowenthal M.等人，2014.Anal Chem.86：551-558)。为了测量序列特异性消化效率，我们使用两种差异性标记的重肽以获得消化效率的比率(方案1)。通过在两个胰蛋白酶剪切位点氨基端和羧基端包含四个氨基酸产生天然肽，肽3包含该靶的正确序列背景。通常，认为三个氨基酸足以令胰蛋白酶确定其剪切位点(Makriyannis T.和Y.Clonis.1997.BiotechBioeng.53：49-57)并且水解速率仅受最接近的两个氨基酸影响(Lowenthal M.等人，2014.Anal Chem.86：551-558)。这个方案允许我们同时评估特异性消化效率并且还获得靶分子的定量数据。在这个设计中，将两种肽在消化之前按等摩尔浓度内标入测试样品。在样品分析期间，监测靶肽和两种重肽产物的跃迁(transition)。比较从两种重肽获得的峰强度以得到消化效率的比率，并且靶肽强度用于定量。
方案1
实施例蛋白质：O3D(Pir)
序列：
MASTSAAQDAAPYEFPSLTEIKRALPSECFEASVPLSLYYTARSLALAGSLAVALSYARALPLVQANALLDATLCTGYVLLQGIVFWGFFTVGHDCGHGAFSRSHVLNFSVGTLMHSIILTPFESWKLSHRHHHKNTGHPVSRHLVMSLGSAWFAYLFAGFPPRTMNHFNPWEAMYVRRVAAVIISLGVLFAFAGLYSYLTFVLGFTTMAIYYFGPLFIFATMLVVTTFLHHNDEETPWYADSEVVTYVKGNLSSVDRSYGALIDNLSHNIGTHQIHHLFPIIPHYKLNDATAAFAKAFPELVRKNAAPIIPTFFRMAAMYAKYGVVDTDAKTFTLKEAKAAAKTKSS
靶肽(加下划线)，含于合成肽中用于消化效率的天然序列(加双下划线)
肽
DEIFYPQR(从样品测量的天然肽)
DEIFYPQ(15N13CR)(用于标准曲线和归一化)
NIDKDEIFY(15N13CP)Q(15N13CR)EADS(消化效率)
蛋白酶解之前，将标准肽(2)(3)按相同浓度内标入测试样品。在蛋白酶解后，在产物离子强度下比较产物肽(2)和DEIFY(15N13CP)Q(15N13CR)的跃迁，以根据以下等式确定所靶向的序列在其天然序列背景下的消化效率：
因此在测试样品中直接测量消化效率％并且它可以用来评估对检出的靶浓度的影响。
实施例28：使用不同种质优化VLC-PUFA的产生
在不同宿主植物如亚麻荠(Ruiz-Lopez等人，2014)中表达相同或非常相似的基因集合似乎导致比欧洲油菜中已经可达到的更大的VLC-PUFA产量。这种见解由表179中的数据说明。表179含有来自转基因欧洲油菜(LBJ1671)和转基因亚麻荠(RRes_EPA_品系)和相应野生型对照的种子的脂肪酸数据，所述转基因欧洲油菜和转基因亚麻荠用几乎相同的T-DNA转化。用来产生两个转基因系的构建体之间唯一的差异是用来产生转基因欧洲油菜(LBJ1671)的TDNA具有毗邻于右边界的额外GFP表达盒。当比较转基因欧洲油菜(LJB1671)与WT Kumily对照时，18：1脂肪酸的量减少并且18：2和18：3脂肪酸的量增加。18：2脂肪酸和18：3脂肪酸是LJB1671引入的途径的中间体，并且因此18：2脂肪酸和18：3脂肪酸延长成20C脂肪酸可以视为欧洲油菜中的瓶颈反应。在另一方面，当比较转基因亚麻荠(RRes_EPA_株系)与WT地照时，18：1脂肪酸的量减少并且18：2和18：3脂肪酸的量也减少。因此，亚麻荠中18：2和18：3脂肪酸的延长不是瓶颈。亚麻荠中不存在这个瓶颈导致20：5n-3(EPA)含量与转基因欧洲油菜相比高10倍。
18：1转化成18：2和18：2转化成18：3主要在磷脂膜中出现，而18C脂肪酸延长成20C脂肪酸严格出现在酰基-CoA汇集物中。底物专一性的这种差异意味着18C脂肪酸必须从膜磷脂释放以便延长。欧洲油菜中，这种释放明显地是瓶颈，但在亚麻荠中则不是。这两个物种之间18：2从PC流入CoA汇集物的差异可以归因于多种酶的活性差异，所述酶包括：1)磷脂酶、2)酰基-CoA合成酶，3)溶血-PC酰基转移酶，4)磷脂-二酰甘油胆碱转移酶，5)磷脂-二酰甘油酰基转移酶和其他。作为这些观察的结果，将实施例11至实施例18的任何构建体转化入多个物种和种质(如所谓禹氏三角中的其他芸苔属种质)，将导致本发明的优选实施方案(例如，EPA和DHA的量较高，和/或18：2n-6的量较低)。
实施例29：卡诺拉油菜油和商业油和固态样品的脂肪酸分析(总FAME分析)
卡诺拉油菜种子：
将10-15粒卡诺拉油菜种子转移入96样式托架上的管并用排盖封闭。在摆式磨机中使用3mm珠，2x2分钟以30Hz研磨种子。随后将托架在4000转/分钟离心5分钟，以从盖上除去粉末。通过以下方式实施油的提取：向样品添加800μL甲基叔丁基醚(MTBE)，随后在摆式磨机中以30Hz提取2x30秒。在4000转/分钟离心10分钟后，将40μL清亮的上清液转移入96孔微量托架并使用260μL MTBE稀释。通过向每份样品添加20μL三甲基氢氧化硫鎓物溶液(TMSH，甲醇中0.2M)，将脂质衍生化成脂肪酸甲酯(FAME)。使用硅氧烷/PTFE盖密封垫封闭托架并将其在室温孵育20分钟。
拟南芥种子：
将20mg种子转移至96样式托架上的管中。在全部其他步骤中遵循卡诺拉油菜种子方案。
卡诺拉油菜油和商业油样品：
将20μL油转移入玻璃小瓶并使用1mL MTBE稀释。将20-80μL样品溶液转移入96孔微量托架并使用260μL MTBE稀释。通过向每份样品添加20μL三甲基氢氧化硫鎓物溶液(TMSH，甲醇中0.2M)，将脂质衍生化成FAME。使用硅氧烷/PTFE盖密封垫封闭托架并将其在室温孵育20分钟。
商业固态样品：
固态样品在分析之前冻干。将20mg固态样品转移至96样式托架上的管中。在全部其他步骤中遵循卡诺拉油菜种子方案。
下表中提供样品概述。
表180：样品描述
GC分析：
与Agilent火焰离子化检测器偶联的Agilent 7890A气相色谱仪用于FAME分析。使用流量0.8mL/分钟的H2作为载气，在DB-225毛细管柱(20m x 180μm x 0.2μm，Agilent)上实施FAME分离。使用分流比1∶50在250℃的进样器温度以分流模式运行GC，进样量是1μL。炉温在190℃保持3分钟并且以15℃min-1增至220℃。温度在220℃保持另外6分钟。使用Agilent GC ChemStation软件(Rev.B.04.02 SP1)实施峰检测和积分。
表181：通过FAME分析确定的脂肪酸
市售37组分FAME混合用来从34种目标脂肪酸鉴定22种脂肪酸的保留时间，将10种其他脂肪酸内标入混合物或分别分析，以获得保留时间。对于两种目标FA，无商业标准品可用。
加合检出的目标脂肪酸的峰面积直至产生总峰面积。各种脂肪酸的脂肪酸特征和百分数随后计算为总峰面积的峰面积百分数。
表182中显示结果。在全部情况下，油数据是来自采集自田间培育植物的整批种子的数据，而不是来自温室环境的单个种子的数据。
在我们的转基因卡诺拉油菜样品中，20：3n-6(DHGLA)范围为1.6-3.1％。但是，含有EPA DHA的其他样品，如转基因拟南芥种子、鱼油和藻油(具有超过1％的组合的EPA和DHA)，不含有超过1.1％的DHGLA。DHGLA是Δ-6-延伸酶起作用于GLA的产物。
在我们的转基因卡诺拉油菜样品中，20：3 n-9(米德酸)为0.05-0.23％。我们还在转基因拟南芥和蛋黄中观察到20：3 n-9。但是，含有EPA DHA的其他样品，如鱼油和藻油(具有超过1％的联合的EPA和DHA)，不含有米德酸。因此，米德酸的积累不总是伴随EPA DHA产生。米德酸的产生因Δ-6-去饱和酶对18：1n-9有活性，随后Δ-6-延伸酶和Δ-5-去饱和酶的活性所致，并且它是导致米德酸产生的我们酶的联合特性。
在转基因卡诺拉油菜样品中，22：5 n-3(DPA)为1.9-4.1％。在一份藻油样品中DPA的量达到3.3％，但是在转基因拟南芥中仅积累0.1％的DPA。在经工程化以产生EPA和DHA的转基因亚麻荠植物和卡诺拉油菜中，DPA积累一般低于2％(Petrie等人，2014 PLoS One 9(1)e85061，和WO 2015/089587)。当转基因欧洲油菜中Δ-4-去饱和酶已经失活时(并且不产生DHA)时，才实现高于2％的DPA积累。在这个实施例中检验的事件内，存在双拷贝Δ-4-去饱和酶，并且我们产生了DHA，从而令人惊讶的是DPA积累。
在我们的转基因卡诺拉油菜中饱和脂肪酸的总量低。16：0范围在4.4至5.2％和18：0范围在2.5至2.7％。
在转基因卡诺拉油菜样品中，18：4 n-3(SDA)为0.1％至0.4％。这种SDA水平令人惊讶地低，因为我们的Δ-6-去饱和酶对ALA具有略高于LA的活性(表163)。
存在多种在转基因事件中出现、在WT Kumily植物中不出现的VLC-PUFA。这些脂肪酸包括18：2n-9、GLA、SDA、20：2n-9、20：3n-9、20：3 n-6、20：4n-6、22：2n-6、22：5n-6、22：4n-3、22：5n-3和22：6n-3。在转基因卡诺拉油菜样品中，这些脂肪酸的合计量范围从15.1％至24.8％。
实施例30：卡诺拉油菜油和商业油样品的脂质概况分析：
卡诺拉油菜种子：
将12-15粒卡诺拉油菜种子转移入96样式托架上的微量管并用排盖封闭。在摆式磨机中使用3mm珠，2x 2分钟以30Hz研磨种子。随后将托架在4000转/分钟离心5分钟，以从盖上除去粉末。通过以下方式实施油的提取：向样品添加800μL二氯甲烷/甲醇(DCM/MeOH，2∶1v/v)，随后在摆式磨机中以30Hz提取2x 30秒。在4000转/分钟离心10分钟后，将100μL清亮的上清液转移入玻璃小瓶并干燥以移除溶剂。
拟南芥种子：
将20mg种子转移至96样式托架上的管中。在全部其他步骤中遵循卡诺拉油菜种子方案。
卡诺拉油菜油和商业油样品：
将200μL油转移入96样式托架上的微量管并用排盖封闭。通过以下方式实施油的提取：向样品添加800μL二氯甲烷/甲醇(DCM/MeOH，2∶1v/v)，随后在摆式磨机中以30Hz提取2x 30秒。在4000转/分钟离心10分钟后，将100μL清亮的上清液转移入玻璃小瓶并干燥以移除溶剂。
正常相分级：
将干燥残余物重悬于100μL 2，2，4-三甲基戊烷和异丙醇(TMP/IPA(9∶1，v/v))中并彻底涡旋混合。将磷虾油样品用TMP/IPA进一步1∶30稀释。为了分离三酰甘油(TAG)，将油样品重悬于500μL TMP/IPA中，之后分级。使用导致脂质相互作用的正常相HPLC和基于脂质种类(例如，在磷脂的情况下头基团)而非脂肪酸链长度的稳定相，进行脂质类别的分离。使用Agilent 1200系列HPLC，所述HPLC包含G1322A脱气机、G1311A四元泵、G1310A等强度泵、G1316A恒温器柱温箱(TCC)、G1367B HiP自动进样器、G1330B FC/ALS恒温器和G1364分步收集器(均来自Agilent)，分步收集器偶联于Alltech 3300蒸发式光散射探测器(ELSD，Grace)。在PVA-Sil柱(150mm x 3mm x 5μm，YMC)上，来自TMP、MTBE、乙腈(MeCN)、DCM、甲酸(FA)、甲酸铵(0.5M)和水的四元梯度用于分离脂质种类，初始流量0.4mL/分钟。进样量是50μL。在玻璃小瓶中收集三酰甘油(TAG)、二酰甘油(DAG)、单酰甘油(MAG)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)的级分。移除溶剂并且残余物重悬于100μL甲苯中。使用20μLTMSH，实施脂质物种衍生化成FAME供随后脂肪酸剖析。如前文实施例29所述进行FAME分析，进样量为2μL。
表183至表187中显示结果。
比较表183、表184和表185中的数据，显而易见与TAG或MAG相比，转基因卡诺拉油菜植物在DAG中具有更高的EPA和DHA百分数。对于LBFLFK油，DAG中EPA对MAG的比率是1.6，并且在LBFDAU油中，该比率是1.5。DAG比MAG和TAG具有更多EPA的事实令人惊讶，尤其鉴于先前报道而令人惊讶，所述的先前报道显示EPA和DHA不太可能在sn-2位置存在，至少在亚麻荠植物中如此(Ruiz-Lopez等人2013The Plant Journal 77，198-208和Petrie等人2014PLoS One 9(1)e85061)。可以取得比MAG或TAG具有更多EPA DHA的DAG，以显示在DAG的sn-2位置存在更多EPADHA。
表186和表187中的数据显示转基因卡诺拉油菜中，PC和PE分别比TAG具有更高浓度的DHA。在事件LANPMZ中，PC中存在8.53％的DHA(并且PE中8.5％)，相比之下TAG中仅1％，而对于事件LBFLFK，PC中存在3.3％的DHA，相比之下TAG中为1.2％。与LANPMZ相比，事件LBFLFK中，TAG中的DHA积累相对于PC更高效，这可能原因在于事件LANPMZ中具有一个磷脂依赖性Δ-4-去饱和酶(d4Des(Tc))和一个CoA依赖性Δ-4-去饱和酶(d4Des(Pl))，而非两种磷脂依赖性酶。
表183至表187中的数据还显示转基因卡诺拉油菜样品的DPA和DHA之间比率的差异。对于全部转基因卡诺拉油菜样品，中性脂质(MAG、DAG和TAG)中DPA比DHA更多，而极性脂质(PC和PE)中DHA比DPA更多。
表183至表187中的数据显示，对于转基因卡诺拉油菜样品，中性脂质(MAG、DAG和TAG)中EPA对DHA的比率高于极性脂质(PC、PE)中EPA对DHA的比率。中性脂质中存在EPA比DHA更多，但极性脂质中DHA比EPA更多。
实施例31：磷脂种类剖析
稀释的来自实施例30的提取物用于磷脂种类分析
PC种类剖析
在偶联于API5500三重四极MS(ABSciex)的1290Agilent HPLC上实施磷脂酰胆碱(PC)种类分离。HPLC由G4227A Flex Cube、G4226A自动进样器、G1330B恒温器和G4220A二元泵组成。在Phenomenex Kinetex C8柱(150mm x 2.1mm x 1.7μm)上实施PC种类分离。流动相由H2O/MeOH/乙酸钠(50mM)作为溶剂A和MeOH/乙酸钠(50mM)作为溶剂B组成，流速为0.5mL/分钟。初始条件是40％A，随后是7分钟总运行时间内至25％A的线性梯度。使用安排的多重反应监测(sMRM)和1μL进样量，在源温度550℃时以正ESI模式运行MS。使用Analyst1.5.1实施数据采集，而在Multiquant 3.0.1(AB Sciex)中进行数据分析。从含有C14：0、C16：0、C16：1、C18：0、C18：1、C18：2、C18：3、C20：3、C20：4、C20：5、C22：5和C22：6脂肪酸的磷脂酰胆碱种类计算全部理论[M+Na]+，从而产生总计78个PC种类。在sMRM模式下，监测脂肪酸的中性丢失。从跃迁列表中移除在来自不同卡诺拉油菜源、鱼油源和藻油源的代表性试样集合中不存在的PC种类的MRM。
将目标PC种类的全部峰面积加合至总峰面积。计算中未纳入峰面积低于10,000计数的种类，因为认为它们低于定量限，具有差的信噪比。随后将PC种类特征计算为总PC种类的PC种类百分数。
LPC种类剖析
在偶联于API5500三重四极MS(ABSciex)的1290Agilent HPLC上实施溶血磷脂酰胆碱(LPC)种类分离。HPLC由G4227A Flex Cube、G4226A自动进样器、G1330B恒温器和G4220A二元泵组成。在Phenomenex Kinetex C8柱(150mm x 2.1mm x 1.7μm)上实施LPC种类分离。流动相由H2O/MeOH/甲酸作为溶剂A和MeOH作为溶剂B组成，流速为0.5mL/分钟并且线性梯度为历经总运行时间4分钟从80％A至0％A。使用多重反应监测(MRM)和1μL进样量，在源温度550℃时以正ESI模式运行MS。使用Analyst 1.5.1实施数据采集，而在Multiquant3.0.1(AB Sciex)中进行数据分析。从含有C14：0、C16：0、C16：1、C18：0、C18：1、C18：2、C18：3、C20：3、C20：4、C20：5、C22：5和C22：6脂肪酸的LPC种类计算全部理论[M+H]+。在sMRM模式下，监测脂肪酸的中性丢失。
添加目标LPC种类的全部峰面积至总峰面积。计算中未纳入峰面积低于12,500计数的种类，因为认为它们低于定量限，具有差的信噪比。随后将LPC种类特征计算为总LPC种类的LPC种类百分数。
PE/LPE种类剖析
在偶联于API5500三重四极MS(ABSciex)的1290Agilent HPLC上实施磷脂酰乙醇胺(PE)和溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)种类分离。HPLC由G4227A Flex Cube、G4226A自动进样器、G1330B恒温器和G4220A二元泵组成。在Phenomenex Kinetex C8柱(150mm x 2.1mmx1.7μm)上实施PE/LPE种类分离。流动相由H2O/MeOH/甲酸铵作为溶剂A和MeOH/甲酸铵作为溶剂B组成，流速为0.5mL/分钟。初始条件是100％A，随后是经历16分钟总运行时间内至0％A的线性梯度。使用安排的多重反应监测(sMRM)和1μL进样量，在源温度550℃时以负ESI模式运行MS。使用Analyst 1.5.1实施数据采集，而在Multiquant 3.0.1(AB Sciex)中进行数据分析。从含有C14：0、C16：0、C16：1、C18：0、C18：1、C18：2、C18：3、C20：3、C20：4、C20：5、C22：5和C22：6脂肪酸的PE种类和LPE种类计算全部理论[M-H]-，从而产生总计78个PE种类和12个LPE种类。
从跃迁列表移除在来自不同卡诺拉油菜源、鱼油源和藻油源的代表性试样集合中不存在的PE/LPE种类的MRM。
将目标PE种类和LPE种类的全部峰面积分别加合至总峰面积。的由于差信噪比而不纳入计算的LPE的峰面积截值是2000计数，对于PE，它是5000计数。随后将PE种类和LPE种类特征计算为总PE种类的PE种类百分数和总LPE种类的LPE种类百分数。
表188至191中显示结果。
在种子样品中比油样品中可检出更多的磷脂种类。这可能归因于油精制期间移除磷脂的事实。表186和表187显示，转基因卡诺拉油菜样品PC含有任何脂质级分中最多的DHA。对于全部转基因卡诺拉油菜样品，含有DHA的最充裕PC种类是PC18：222：6并且含有EPA的最充裕PC种类是PC18：220：5(表188)。DHA存在于鱼油样品和藻油样品的PC中，但仅存在于PC 18：322：6中。一个例外是磷虾油，但是PC 18：222：6总体上仅占PC种类的0.1％。含有DHA的最充裕PE种类是PE 18：222：6(表190)。在转基因卡诺拉油菜样品中降幅最大的PC种类是PC 18：118：1，而PC 18：218：2是增加最大的种类。因此，LPC 18：2是转基因卡诺拉油菜样品中最充裕的溶血PC种类。
实施例32：TAG种类分析
稀释的来自实施例29的提取物用于TAG(三酰甘油)种类分析。在偶联于API5500三重四极MS(ABSciex)的1290Agilent HPLC上实施TAG种类分析。HPLC由G4227A Flex Cube、G4226A自动进样器、G1330B恒温器和G4220A二元泵组成。在Thermo Accucore C30柱(250mmx 2.1mm x 2.6μm)上实施TAG种类分离。流动相由MeCN/IPA作为溶剂A和IPA作为溶剂B组成，流量为0.4mL/分钟。起始条件是100％A，随后是至20％A的线性梯度，总运行时间为30分钟。进样量是1μL。使用安排的多重反应监测(sMRM)，在离子源温度300℃时以正APCI模式运行质谱仪。使用Analyst 1.5.1实施数据采集，而在Multiquant 3.0.1(AB Sciex)中进行数据分析。从含有C14：0、C16：0、C16：1、C18：0、C18：1、C18：2、C18：3、C20：3、C20：4、C20：5、C22：5和C22：6脂肪酸的TAG种类计算全部理论[M+H]+，从而产生总计364个TAG种类。在MRM模式下，监测脂肪酸的中性丢失，因此也计算全部理论性产物离子。第一个四极设定成仅过滤目标TAG种类的那些[M+H]+，所述目标TAG种类随后在第二个四极中片段化，这导致脂肪酸丢失。对于含有三种不同脂肪酸的TAG种类，在第三个四极中监测三种产物离子，而具有两种不同脂肪酸的那些种类导致两种产物离子。在具有仅一种脂肪酸的TAG种类的情况下，仅可以检测到一个跃迁。
运行TAG(16：0/16：0/16：0)、(16：1/16：1/16：1)、(17：0/17：0/17：0)、(18：0/18：0/18：0)、(18：1/18：1/18：1)、(18：2/18：2/18：2)、(18：3/18：3/18：3)、(20：5/20：5/20：5)、(22：6/22：6/22：6)、(16：0/16：0/18：1)、(16：0/18：0/18：2)、(16：0/18：1/18：1)、(16：0/18：2/18：2)、(18：0/18：0/18：2)、(18：0/18：1/18：1)、(18：0/18：1/18：2)、(18：1/18：1/18：3)和(18：1/18：2/18：2)的单一标准品和混合标准品以鉴定TAG种类之间的保留时间样式。从跃迁列表移除在来自不同卡诺拉油菜源、鱼油源和藻油源的代表性试样集合中不存在的TAG种类的MRM。对于全部其他种类，鉴定保留时间旨在给定时间窗口内允许安排的MRM监测，所述给定时间窗口允许每个跃迁更多的数据点，因此导致更好的数据品质。
不能在合理的运行时间内部实现全部TAG种类的基线分离，因此使用峰高度替代峰面积。全部跃迁的总和用来计算总峰高度。计算中未纳入峰高度低于1000计数的种类，因为认为它们低于定量限，具有差的信噪比。随后将TAG种类特征计算为总TAG种类的TAG种类百分数。
表192中显示结果。
Kumily油中五种最充裕的TAG种类是TAG 181 181 183、TAG 181 182 183、TAG181 181 182、TAG 181 181 181和TAG 181 182 182。总共这些种类占据全部TAG种类的64.5％。这些种类在转基因卡诺拉油菜样品中特异性减少，其中总和范围从14.3％至21.2％。相反，转基因卡诺拉油菜系中最充裕的单一TAG种类是TAG 181 182 205，随后是TAG 181 181 205和TAG 182 182 205。合计，这三个种类占据转基因卡诺拉油菜样品中观察到的总TAG种类的20.6％至25.5％。转基因卡诺拉油菜样品中两个含有DHA的最充裕TAG种类是TAG 181 182 226和TAG 182 182 226，它们一起占全部TAG种类的1.5％至3.3％。重要的是，发现EPA和DHA连同18∶1和18∶2最频繁与TAG酯化。这种组成可能比含有多种PUFA的TAG种类在氧化上更稳定。在转基因卡诺拉油菜样品中，具有单一EPA、DPA或DHA的全部TAG种类的总和是42.3％至50.3％，而具有多于一种EPA、DPA和/或DHA的全部TAG种类的总和是3.4％至6.6％。在鱼油和藻油中，具有多于一种EPA、DPA和/或DHA的全部TAG种类的总和是21.1％至60.3％。因此，转基因卡诺拉油菜样品具有最高比例的氧化稳定的TAG种类。转基因卡诺拉油菜样品还具有低丰度的TAG 183 183 205和TAG 183 183 226，仅为总TAG种类的0.2％至0.6％。
表192：通过+APCI-HPLC-MS/MS以sMRM模式分析的从MTBE提取物出现的包含12种目标脂肪酸的TAG种类的三酰甘油种类特征。数据是均数，n＝2表述为种类的相对丰度。从表移除任何样品中未检出的种类
本发明的序列
表193按其名称显示本发明的序列及序列表的相关SEQ-ID编号。本发明的其他序列纳入序列表。
表193：序列名称与序列表中SEQ-ID的关联。
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Claims (19)

1.用于植物中表达靶基因的T-DNA，其中T-DNA包含左边界元件和右边界元件和至少一个包含与靶基因有效连接的启动子及其下游终止子的表达盒，其中从左边界元件至右边界元件测量并包含靶基因的T-DNA的长度具有至少30000bp长度。
2.T-DNA，包含实施例中所给出的表的任何单基因的编码性序列，优选地包含实施例中所给出的任何单个表的编码性序列和启动子、更优选地实施例中所给出的任何单个表的编码性序列和启动子及终止子，以及最优选地实施例的任何单个表的表达盒，尤其其中T-DNA包含实施例中表11的去饱和酶和延伸酶的编码性序列。
3.植物或种子或其部份，包含整合在其基因组中的本发明异源T-DNA。
4.植物，包含一种或多种T-DNA，所述T-DNA包含一个或多个表达盒，所述表达盒编码一种或多种d5Des、一种或多种d6Elo、一种或多种d6Des、一种或多种o3Des、一种或多种d5Elo和一种或多种D4Des。
5.根据权利要求3或4所述的植物，包含一种或多种T-DNA，所述T-DNA编码至少两种d6Des、至少两种d6Elo和/或至少两种o3Des。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的植物或其部份，包含编码至少一种CoA依赖性4Des和至少一种磷脂依赖性d4Des的T-DNA。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的植物、种子或其部份，所述植物、种子或其部份还编码一种或多种d12Des。
8.十字花科、优选地芸苔属的植物或其种子，具有赋予种子油VLC-PUFA含量的可遗传表型的基因型，从通过包括下述步骤的方法制备的后代系可获得或获得
i)将十字花科植物、优选地芸苔属植物、最优选地欧洲油菜、甘蓝、黑芥或埃塞俄比亚芥植物，所述植物包含了根据权利要求1或2中任一项所述的T-DNA和/或这种T-DNA的部分，与十字花科植物、优选地芸苔属(Brassica)植物、最优选地欧洲油菜(Brassica napus)、甘蓝(Brassica oleracea)、黑芥(Brassica nigra)或埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)植物(所述植物不包含所述T-DNA和/或其部份)杂交，以产生F1杂种，
ii)自交F1杂种至少一个世代，并且
iii)鉴定步骤(ii)的包含本发明T-DNA的后代，所述后代能够产生包含VLC-PUFA的种子，从而在40％含油量(w/w)时，18:1n-9下游的全部VLC-PUFA的含量是总种子脂肪酸含量的至少40％(w/w)，或者优选地在40％含油量(w/w)时，EPA的含量是总种子脂肪酸含量的至少6％、优选地至少7.5％(w/w)和/或DHA的含量是总种子脂肪酸含量的至少0.8％(w/w)、优选地1.2％。
9.用于产生植物的方法，所述植物具有向种子油VLC-PUFA含量赋予可遗传表型的基因型，从通过包括下述步骤的方法制备的后代系可获得或获得
i)将根据权利要求3或4中任一项所述的转基因植物与不包含根据权利要求1或2中任一项所述的T-DNA或其部份的植物杂交，所述后一种植物属于十字花科、优选地属于芸苔属、最优选地属于欧洲油菜、甘蓝、黑芥或埃塞俄比亚芥，以产生F1杂种，
ii)自交F1杂种至少一个世代，并且
iii)鉴定步骤(ii)的包含本发明T-DNA的后代，所述后代能够产生包含VLC-PUFA的种子，从而在40％含油量(w/w)时，18:1n-9下游的全部VLC-PUFA的含量是总种子脂肪酸含量的至少40％(w/w)，或者优选地在40％含油量(w/w)时，EPA的含量是总种子脂肪酸含量的至少6％、优选地至少7.5％(w/w)和/或DHA的含量是总种子脂肪酸含量的至少0.8％(w/w)、优选地1.2％(w/w)。
10.根据权利要求9所述的方法或根据权利要求8所述的植物，其中T-DNA是纯合的。
11.产生植物油的方法，包括步骤
i)培育根据权利要求3至8中任一项所述的植物，从而获得其含油种子，
ii)收获所述种子，并且
iii)从步骤ii)中收获的所述种子提取油，其中油具有基于总脂质含量以重量计至少1％的DHA含量和/或基于总脂质含量以重量计至少8％的EPA含量。
12.植物油，包含通过根据权利要求11所述的方法可获得或获得的多不饱和脂肪酸。
13.用于分析去饱和酶反应特异性的方法，包括步骤
i)向去饱和酶提供可检测标记的分子，所述分子包含脂肪酸部分和头部基团，
ii)允许去饱和酶在标记的分子上反应，并且
iii)检测去饱和产物。
14.用于分析延伸酶反应特异性的方法，包括步骤
i)向延伸酶提供可检测标记的延伸底物和待延长的分子，
ii)使用标记的延伸底物，允许延伸酶延长待延长的分子，并且
iii)检测延伸产物。
15.用于优化代谢途径的方法，包括步骤
i)提供代谢途径的酶和由所述途径的第一酶或酶类使用的一种或多种底物。
ii)使酶和底物反应以产生产物，所述产物转而还作为潜在底物暴露于途径的酶，并且
iii)确定产物的累积。
16.用于确定目标去饱和酶的CoA-依赖性的方法，包括步骤
i)提供延伸酶以产生目标去饱和酶的底物，并确定目标去饱和酶的转化效率，并且
ii)提供非CoA依赖性去饱和酶以产生目标去饱和酶的底物，并确定目标去饱和酶的转化效率，并且
iii)比较步骤i)和ii)的目标去饱和酶转化效率。
17.用于确定目标去饱和酶的CoA-依赖性的方法，包括步骤
i)提供延伸酶以延长目标去饱和酶的产物，并确定延伸酶的转化效率，
i)提供延伸酶以延长已知为非CoA依赖性的对比去饱和酶的产物，并确定延伸酶的转化效率，
iii)比较步骤i)和ii)的延伸酶转化效率。
18.相对于对照植物增加植物中米德酸(20:3n-9)含量的方法，包括在植物中表达至少一个编码Δ-6-去饱和酶的多核苷酸、至少一个编码Δ-6-延伸酶的多核苷酸和至少一个编码Δ-5-去饱和酶的多核苷酸。
19.根据权利要求18所述的方法，还包含表达Δ-12-去饱和酶、ω-3-去饱和酶、Δ-5-延伸酶和/或Δ-4-去饱和酶。
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