CN112040766A - 栽培含lc-pufa的转基因芸苔属植物的方法 - Google Patents

Abstract

所公开的各种实施方案涉及增加多个芸苔属植物诸如卡诺拉所产生的种子油中的ω‑3脂肪酸的比例，所述多个芸苔属植物经转基因修饰以产生包含EPA、DHA和DPA中的至少一者的种子油。转基因芸苔属植物诸如转基因卡诺拉经受在该转基因植物的种子成熟期期间具有至少13℃的平均日昼夜温差的环境。该种子油为至少5重量％EPA。该种子油为至少1重量％DPA。该种子油为至少0.2重量％DHA。该种子油为至少5.2重量％的EPA与DHA的混合物。该种子油为至少6重量％长链ω‑3脂肪酸。

Description

栽培含LC-PUFA的转基因芸苔属植物的方法

相关专利申请的交叉引用

本申请要求2018年4月13日提交的名称为“METHOD OF CULTIVATING LC-PUFACONTAINING TRANSGENIC BRASSICA PLANTS(栽培含LC-PUFA的转基因芸苔属植物的方法)”的美国临时专利申请序列号62/657128的权益，该申请据此全文以引用方式并入本文。

背景技术

ω-3脂肪酸是能带来一系列健康益处的多不饱和脂肪酸，它对于人类和其他动物的健康发育必不可少。养殖鱼类为人类提供ω-3脂肪酸的重要膳食来源，但鱼类也需要ω-3脂肪酸，特别是长链ω-3脂肪酸，而这通常将从野生的海洋来源获得。水产养殖目前消耗了占全球ω-3脂肪酸供应量的大部分。历来都是向养殖鱼类提供从海洋来源获得的饲料以输送所需的营养物。然而，为养殖鱼类提供源自野生海洋来源的营养物可加剧野生鱼类种群的下降并且使其他海洋资源变得紧张。尽管某些ω-3脂肪酸易从植物来源获得，但是植物基膳食通常无法提供存在于海产品油中的长链ω-3脂肪酸类型的足够膳食量。长链ω-3脂肪酸包括EPA(二十碳五烯酸)、DPA(二十二碳五烯酸)和DHA(二十二碳六烯酸)。长链ω-3脂肪酸的其他来源包括微藻或经由生物反应器产生。

最近，已描述了长链ω-3脂肪酸的新的陆地植物基来源。例如，已对油料植物(诸如卡诺拉(canola)和其他芸苔属(Brassica)植物)进行基因修饰以提供长链ω-3脂肪酸，包括EPA、DPA和DHA(WO2016/075303、WO 2016/075325、WO 2016/075327、WO 2015/089587、WO2013/153404、WO 2004/071467和US 7807849B2)。此类植物源ω-3脂肪酸可单独使用或与海产品源ω-3脂肪酸一起使用以补充或完全提供ω-3脂肪酸(包括长链ω-3脂肪酸)的膳食来源(WO 2017/210426)。转基因卡诺拉可为长链ω-3脂肪酸的可规模化的植物基来源。此类植物具有提供不破坏或耗尽天然海洋资源的长链ω-3脂肪酸来源的优点。

卡诺拉是重要的芸苔属植物作物，它是价格实惠的健康膳食油来源。卡诺拉植物在全球范围内均有种植并且收获其种子，这些种子具有高含油量。例如，卡诺拉种子可含有44％油，该值是大豆含油量的两倍。当卡诺拉植物成熟时，它们绽放黄花并结出种子角果，这些角果的颜色从绿色逐渐变为淡黄色，然后变为棕褐色。每个种子角果中装满种子，这些种子从半透明变为绿色，然后变为黑色。收获种子，并且从其中提取油。

在卡诺拉植物初花期之后大约35-45天，种子角果的种子灌浆期可完成。到初花期之后的40天为止，种子可完全改变颜色。然而，当种子角果成熟时，它们变脆并且易于裂角。卡诺拉的主要缺点是该植物在体质上易受天气和自然环境的影响。霜对卡诺拉种子可具有破坏性并且成熟种子角果可裂角。如果卡诺拉植物在田地上保留太长时间，它们有越来越大的风险会受病害、霜侵袭或体质上遭受重创而使得种子角果裂角和该作物被毁坏。卡诺拉植物保持未收获的时间越长，该作物将损失的可能性越大。由于这些原因，卡诺拉生产者力求尽早收获以避免损失。

为了避免裂角和作物损失，可在从初花期起40-45天内通过直接联合法来收获卡诺拉。还可通过割晒法来收获卡诺拉，并且这种做法较为普遍，因为其允许比直接联合法早8至10天收获。割晒法涉及收割作物并且形成可铺放在割茬上的料堆。割晒的卡诺拉作物在田地中干燥和熟化并且与未收割作物相比能更好地避免裂角。割晒的卡诺拉展现出种子的一些进一步颜色变化，但一旦割晒，这些植物就不会产生更多种子并且种子不会积累更多营养物。可在30％至40％或至多60％种子的颜色已从绿色变为黑色时执行割晒法。

发明内容

本公开提供了一种增加转基因芸苔属油料植物，诸如卡诺拉植物中的长链ω-3脂肪酸产量的方法。本公开还提供了一种栽培转基因芸苔属油料植物的方法。本公开还提供了具有增加的ω-3脂肪酸比例的转基因芸苔属种子。本公开有利地提供了具有增加的长链ω-3脂肪酸级分的种子油。

本公开提供了一种增加多个转基因芸苔属油料植物所产生的种子油中的长链ω-3脂肪酸的比例的方法，该方法包括使转基因芸苔属油料植物经受在转基因卡诺拉植物的种子成熟期期间具有至少13℃的平均日昼夜温差的环境；并且其中已对转基因芸苔属油料植物进行转基因修饰以产生包含EPA、DHA和DPA中的至少一者的种子油。

本公开提供了一种栽培多个转基因芸苔属油料植物(诸如卡诺拉植物)的方法，该方法包括将这些植物种植于在转基因卡诺拉植物的种子成熟期期间具有至少7℃的平均日昼夜温差的环境中；并且其中转基因卡诺拉植物结出包含EPA、DHA和DPA中的至少一者的种子。

本公开还提供了芸苔属植物种子，这些芸苔属植物种子包含为至少17重量％长链ω-3脂肪酸的种子油。

通过本公开的各种实施方案实现了优点，其中一些优点是出乎意料的。例如，本公开的方法可具有以转基因油料植物所产生的油的百分比的形式增加期望的ω-3脂肪酸的优点。本文所述的方法可具有每株转基因油料植物产生更大ω-3脂肪酸总量的优点。本公开的方法还可具有每平方英尺油料植物种植区产生更大ω-3脂肪酸总量的优点。本公开的方法还可具有提供油料种子和种子油的优点，这些油料种子和种子油能更具成本效益地加工且废弃物少，以产生具有更高浓度ω-3脂肪酸的油产品。本公开的方法可具有生产结有种子的植物作物的优点，这些种子在种子和种子油中的ω-3脂肪酸量方面具有改善的一致性。本公开有利地提供了具有高浓度ω-3脂肪酸的种子和种子油。可用其他种子和种子油稀释此类具有高浓度ω-3脂肪酸的种子和种子油以易于提供具有期望量的ω-3脂肪酸和其他脂肪酸的油产品。在各种实施方案中，本公开具有提供非海产品或植物基ω-3脂肪酸来源的优点。在各种实施方案中，这些优点涉及期望的长链ω-3脂肪酸，或进一步涉及一种或多种具体期望的长链ω-3脂肪酸，诸如DHA、EPA和DPA。

附图说明

图1示出了绘图，该绘图描绘了三种转基因卡诺拉杂交种中种子成熟期间的昼夜温度对ω-3脂肪酸累积％的影响。

具体实施方式

现在将详细参考所公开的主题的某些实施方案。虽然将结合所列举的权利要求来描述所公开的主题，但是应当理解，例示的主题并不旨在将权利要求限于所公开的主题。

在整个文件中，以范围格式表示的值应以灵活的方式解释为不仅包括明确列举为该范围限值的数值，而且包括该范围内所涵盖的所有单个数值或子范围，如同明确列举了每个数值和子范围一样。例如，“约0.1％至约5％”或“约0.1％至5％”的范围应解释为不仅仅包括约0.1％至约5％，而且包括指定范围内的单个值(例如，1％、2％、3％和4％)和子范围(例如，0.1％至0.5％，1.1％至2.2％，3.3％至4.4％)。除非另外指出，否则陈述“约X至Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。同样，除非另外指出，否则陈述“约X、Y或约Z”具有与“约X、约Y或约Z”相同的含义。

在本文件中，除非上下文另有明确规定，否则术语“一个”、“一种”或“该”用于包括一个或多于一个。除非另外指出，否则术语“或”用于指非排他性的“或”。陈述“A和B中的至少一者”具有与“A、B或A和B”相同的含义。另外，应当理解，本文所采用的并且没有另外定义的措词或术语仅是出于描述的目的，而不是限制的目的。章节标题的任何使用均旨在帮助阅读文件，而不应理解为限制性的；与章节标题相关的信息可以出现在该特定章节之内或之外。本文件中所引用的任何出版物、专利和专利文件都以引用的方式全文并入本文，就像以引用的方式单独并入一样。如果本文件与以引用的方式这样并入的那些文件之间用法不一致时，应将并入的参考文献中的用法视为对本文件的用法的补充；对于不可调和的不一致之处，以本文件中的用法为准。

在本文所述的方法中，在不背离本公开原理的前提下，可以以任何顺序执行动作，除了当明确列举了时间或操作顺序时以外。此外，除非有明确的声明语言陈述了指定的动作是分开执行的，否则它们可以同时执行。例如，可以在单个操作中同时进行要求保护的进行X的动作和要求保护的进行Y的动作，并且所得过程将落在要求保护的过程的字面范围内。

如本文所用，术语“约”可允许值或范围有一定程度的可变性，例如，在规定值或范围的规定限值的10％以内、5％以内或1％以内，并且包括确切的规定值或规定范围。

如本文所用，术语“基本上”是指大多数或大部分，如同至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.99％，或至少约99.999％或以上，或100％。

除非另有定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。特定术语的定义可包含在该部分内，或者可并入到下面的文本部分中。

“多个”是指具有两个或更多个成员的任何组。因此多个植物可为2个或更多个植物的组、10个或更多个植物的组、100个或更多个植物的组、1,000个或更多个植物的组、10,000个或更多个植物的组、100,000个或更多个植物的组或1,000,000个或更多个植物的组。多个植物还可为2至10个植物、2至100个植物、10至100个植物、100至1,000个植物、1,000至10,000个植物、10,000至100,000个植物、100,000至1,000,000个植物、1,000,000至10,000,000个植物。

如本文所用，术语“天”和“日”是指24小时的时间段。在各种实施方案中，24小时的时间段是日历天。

如本文所用，术语“日昼夜温差”是指一天内发生的平均昼间气温与平均夜间气温之间的气温差。在各种实施方案中，天可为任何24小时的时间段。在各种实施方案中，天可为日历天。

如本文所用，术语“日高低温差”是指一天内发生的最高气温与最低气温之间的气温差。在各种实施方案中，天可为任何24小时的时间段。在各种实施方案中，天可为日历天。

如本文所用，术语“平均日昼夜温差”是指由与指定时间段中的每一天相对应的所有日昼夜温差计算的平均(均值)差。指定时间段可为种子成熟期。作为一个示例，将通过以下方式计算初花期之后45天时间段内的平均日昼夜温差：对该45天时间段内的所有日昼夜温差求和并且除以45。

如本文在单个植物的情况下所用，术语“初花期”是指该植物盛开其第一朵花的日期。如在一片植物的情况下所用，“初花期”意指该田地中至少10％的植物盛开了至少一朵花的日期。

如本文所用，术语“最小日昼夜温差”是指与指定时间段中的每一天相对应的整组日昼夜温差中的最小日昼夜温差。

如本文所用，术语“夜间低温”是指在日落(含)与日出(含)之间的时间期间发生的低气温。

如本文所用，术语“昼间高温”是指在日出(含)与日落(含)之间的时间期间发生的高气温。

如本文所用，术语“油”可指主要由脂肪酸形成的物质。本文的油在室温下可为液体或固体并且可呈液体或固体形式(例如，干脂肪)。油可指主要由脂肪酸形成，例如呈甘油三酯或磷脂(例如，卵磷脂)形式。本文的油的示例包括各种植物油(诸如芸苔属植物油)以及海产品油(诸如鱼油或磷虾油)、动物脂肪(诸如家禽脂肪)和磷脂(诸如大豆卵磷脂)。油还可包括通常与脂肪相关联的其他化合物，诸如甾醇(例如，胆固醇)或生育酚。

如本文所用，术语“脂肪酸”可以指包含烃链和末端羧酸基团的分子。如本文所用，脂肪酸的羧酸基团可以被修饰或酯化，例如与将脂肪酸掺入甘油酯或磷脂中或连接至另一分子诸如乙酰辅酶A(例如COOR，其中R是指例如碳原子)时发生的情形一样。另选地，羧酸基团可以是游离脂肪酸或盐的形式(即COO″或COOH)。

“饱和”脂肪酸是在烃链中不含任何碳-碳双键的脂肪酸。“不饱和”脂肪酸含有一个或多个碳-碳双键。“多不饱和”脂肪酸含有多于一个的此类碳-碳双键，而“单不饱和”脂肪酸仅含一个碳-碳双键。碳-碳双键可以呈表示为顺式和反式的两种立体构型中的一种。天然存在的不饱和脂肪酸通常为“顺式”形式。不饱和脂肪酸可例如为ω-6(或n-6或w-6)或ω-3(n-3或w-3)型。ω-6脂肪酸在从脂肪酸链的甲基端起的第六位处具有第一双键，而ω-3脂肪酸在从该链的甲基端起的第三位处具有第一双键。术语“长链”在应用于ω-3或ω-6脂肪酸时意指具有20个或更多个碳的链。

可将本文所述存在于植物和油中的脂肪酸掺入各种甘油酯中。术语“三酰基甘油”、“甘油三酯”和“TAG”可在本文中互换使用，是指包含甘油的分子，该甘油在其三个羟基基团中的每个羟基基团处均被脂肪酸酯化并因此包含三个脂肪酸。术语“二酰基甘油”、“甘油二酯”和“DAG”是指包含甘油的分子，该甘油仅在其三个可用羟基基团中的两个羟基基团处被脂肪酸酯化，使得其仅含有两个脂肪酸。同样，术语“甘油单酯”是指仅在三个可用羟基基团中的一个羟基基团处被脂肪酸修饰的甘油，因此其仅包含一个脂肪酸。

还可将本文所述存在于植物和油中的脂肪酸掺入各种“磷脂”(本文缩写为“PL”)中。磷脂是包含如下组分的分子：甘油二酯、磷酸基团和另一种分子诸如胆碱(“磷脂酰胆碱”；本文缩写为“PC”)、乙醇胺(“磷脂酰乙醇胺”；本文缩写为“PE”)、丝氨酸(“磷脂酰丝氨酸”；本文缩写为“PS”)或肌醇(“磷脂酰肌醇”；本文缩写为“PI”)。磷脂例如是细胞膜的重要组分。

本文可以按油的总脂肪酸含量的百分比来提供特定类型的脂肪酸的含量。除非另外明确指出，否则此类百分比是分别基于油组分中的总脂肪酸、TAG或PL的重量百分比，如通过实验计算。因此，例如，如果提供了具体种类或组的脂肪酸(例如EPA或EPA+DHA或EPA+DPA+DHA)的百分比，则这是基于油中检测到的总脂肪酸的重量百分比。油的脂肪酸组成可以通过本领域众所周知的方法确定。美国油脂化学家协会(AOCS)主张对植物油进行的各种测试的分析方法。使油的组分水解产生游离脂肪酸，将游离脂肪酸转化为甲酯并通过气液色谱法(GLC)进行分析是确定油样的脂肪酸组成的公认标准方法。AOCS程序Ce 1-62描述了所使用的程序。

如本文所用，术语“多不饱和脂肪酸”和“PUFA”是指包含至少两个双键的脂肪酸。PUFA可包含三个、四个、五个或六个双键。PUFA可在脂肪酸链中包含例如18至24个碳原子。长链PUFA(″LC-PUFA)可在脂肪酸链中具有例如20至24个碳原子。

术语“ω-3脂肪酸”包括脂肪酸，并且还可包括其衍生物，诸如甘油三酯、酯和磷脂。ω-3脂肪酸具有多个双键，每个双键由亚甲基键分开。从脂肪酸的终末(w)碳端数起，在从终末端起的第三个碳和第四个碳之间出现ω-3脂肪酸的第一双键。ω-3脂肪酸可具有例如三个双键、四个双键、五个双键或六个双键。ω-3脂肪酸可具有全顺式双键。如本文所用，术语“长链”ω-3脂肪酸是指脂肪酸链中具有二十(20)个或更多个碳原子的ω-3脂肪酸。

术语“EPA”是指ω-3脂肪酸全顺式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸，也表示为20∶5(n-3)。EPA是长链多不饱和脂肪酸。

术语“DHA”是指ω-3脂肪酸全顺式-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸，也表示为22∶6(n-3)。DHA是长链多不饱和脂肪酸。

术语“DPA”是指ω-3脂肪酸全顺式-7，10131619-二十二碳五烯酸，也表示为22∶5(n-3)。DPA是长链多不饱和脂肪酸

术语“ALA”是指ω-3脂肪酸全顺式-9，12，15-十八碳三烯酸，也表示为18∶3(n-3)。ALA是短链多不饱和脂肪酸。

术语“SDA”是指ω-3脂肪酸全顺式-6，9，12，15-十八碳四烯酸，也表示为18∶4(n-3)。SDA是短链多不饱和脂肪酸。

如本文所用，术语“种子油”或“来自油料植物的油”及相关术语是指来源于油料作物植物的种子或其他部分的油。在各种实施方案中，还可以以各种方式例如通过脱胶、精炼、漂白、脱蜡和/或脱臭来对油进行化学处理或精炼。种子油可为来自芸苔属油料植物的油。种子油可为来自转基因芸苔属油料植物的油。来自油料植物的油可为卡诺拉油。在各种实施方案中，该油包含一种或多种ω-3脂肪酸，诸如例如EPA、DHA、DPA、ALA和SDA。该油可包含二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸和十八碳三烯酸的ω-3脂肪酸。该油还可包含一种或多种ω-6脂肪酸，诸如例如γ-亚麻酸、亚油酸、双高-γ-亚麻酸和花生四烯酸。本公开的方法所产生的种子可用于生产商品，诸如但不限于种子油。术语“商品”是指销售给消费者的任何产品。因此本文所述方法所产生的种子可用于食品、饲料、燃料或其他商业或工业目的，或可用于种植或繁殖物种的目的。

如本文所用，术语“转基因油料植物”可指这样的植物物种，其已经过基因修饰以产生长链ω-3脂肪酸，诸如EPA、DPA和/或DHA。所得的油可称为“来自转基因修饰的油料植物的油”或类似术语。术语转基因、转基因修饰、修饰或基因修饰在此处用于将产长链ω-3脂肪酸的植物或来源于此类植物的油与不产生长链ω-3脂肪酸的其他植物品系的那些区分开N00593-WO-PCT10。不受理论的限制，可能已对这些植物进行修饰以表达由前体脂肪酸产生EPA、DPA和DHA所需的酶。如果油料植物是例如芸苔属或亚麻荠属(Camelina)物种，则可使用术语“转基因芸苔属油料植物”或“转基因亚麻荠属油料植物”。除了已进行修饰以产生长链ω-3脂肪酸诸如EPA、DPA和/或DHA之外，还可以以附加方式对“转基因油料植物”进行转基因修饰，诸如以获得除草剂抗性或修改某些其他脂肪酸在其油中的比例。在各种实施方案中，将转基因油料植物与尚未进行修饰以产生长链ω-3脂肪酸诸如EPA、DPA和/或DHA的油料植物进行比较。此类未经修饰的植物仍可为以其他方式进行修饰(例如诸如以获得除草剂抗性)的转基因植物，但未对该植物进行修饰，使得其产生长链ω-3脂肪酸。

在各种实施方案中，本发明的转基因油料植物包含事件LBFLFK(ATCC名称PTA-121703)。该实施方案中还涵盖事件LBFLFK的种子和子代。在另一个实施方案中，本发明的转基因油料植物包含事件LBFDAU(ATCC名称PTA-122340)。该实施方案中还涵盖事件LBFDAU的种子和子代。此类转基因油料植物可为芸苔属植物。申请人已依照《国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约》(Budapest Treaty on the International Recognitionof the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure)的规定将芸苔属事件LBFLFK(ATCC名称PTA-121703)和芸苔属事件LBFDAU(ATCC名称PTA-122340)的种子保藏在美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，Manassas，VA，USA)。申请人无权免除依法对生物材料的转移或其在商业上的运输所施加的任何限制。申请人不豁免对本专利下授予的其权利或《植物品种保护法(Plant Variety Protection Act)》(《美国法典》第7篇第2321节及以下章节)下适用于保藏事件的权利的任何侵犯，未经授权的种子禁止繁殖。可根据国家法律监管该种子。种子的保藏仅是为了本领域技术人员方便起见进行的，并不构成或暗示要求保藏的种子全面描述本发明、使本发明完全可行或实施本发明或本发明的任何部分或方面的任何供述、承认、声明或主张。

因此本公开可涉及用于制造通常从芸苔属获得的商品的植物LBFLFK和LBFDAU。LBFLFK和LBFDAU的种子可被加工成粕或油，以及可用作陆生动物和水生动物的动物饲料中的油来源。来自事件LBFLFK和LBFDAU的含LC-PUFA的油可例如用作食品添加剂以增加人类和动物的w-3脂肪酸摄入量，或用于药物组合物中以增强其治疗效果，或用作化妆品组合物的组分等。

LBFLFK和LBFDAU事件及其子代所产生的LC-PUFA可包括DHGLA、ARA、ETA、EPA、DPA和DHA。LBFLFK和LBFDAU事件及其子代所产生的VLC-PUFA可包括ARA、EPA和DHA。LBFLFK和LBFDAU事件及其子代所产生的VLC-PUFA可包括EPA和/或DHA。LBFLFK和LBFDAU事件及其子代还可产生在合成期间出现的LC-PUFA的中间体。可通过本发明的多肽的去饱和酶、酮脂酰辅酶A合酶、酮脂酰辅酶A还原酶、脱水酶和烯脂酰辅酶A还原酶活性来由底物形成此类中间体。此类底物可包括LA、GLA、DHGLA、ARA、二十碳二烯酸、ETA和EPA。

可通过以下方式对LBFLFK和LBFDAU植物进行育种：首先使从转基因LBFLFK或LBFDAU芸苔属植物(或其子代)长成的第一亲本芸苔属植物与分别缺少LBFLFK或LBFDAU事件的EPA/DHA谱和咪唑啉酮耐受性的第二亲本芸苔属植物有性杂交，从而产生多个第一子代植物；然后选择展示期望的咪唑啉酮耐受性的第一子代植物并且使第一子代植物自交，从而产生多个第二子代植物；之后选择展示期望的咪唑啉酮耐受性和EPA/DHA谱的第二子代植物。这些步骤还可包括第一产EPA/DHA的子代植物或第二产EPA/DHA的子代植物与第二亲本芸苔属植物或第三亲本芸苔属植物的回交，从而产生展示期望的咪唑啉酮耐受性和EPA/DHA谱的芸苔属植物。还已经认识到，不需要分析子代的表型。如别处所公开的各种方法和组合物可用于检测和/或鉴定LBFLFK或LBFDAU事件。(参见例如WO 2016/075303)。

还可使两个不同转基因植物有性杂交以产生含有两个独立分离的外源基因的后代。适当子代的自交可产生对于这两个外源转基因插入片段均为纯合的植物。还设想了向亲本植物的回交和与非转基因植物的远交，和营养繁殖一样。通常用于不同性状和作物的其他育种方法的描述可见于若干参考文献之一，例如Fehr，载于Breeding Methods forCultivar Development，Wilcos编辑，American Society of Agronomy，Madison Wis.(1987)，以及Buzza，Plant Breeding，载于Brassica Oilseeds：Production andUtilization.D.S.Kimber和D.I.McGregor编辑，Cab International，Wallingford，UK(1995)。

在各种实施方案中，转基因油料植物可涵盖WO 2016/075327中描述或使用该专利中所述的方法制备的植物，该专利描述了产EPA和DHA的芸苔属品系和如何产生此类品系以及其他实施方案。在各种实施方案中，经修饰的油料作物植物可涵盖WO 2016/075325中描述或使用该专利中所述的方法制备的植物，该专利描述了含PUFA的植物脂质的修饰以及其他实施方案。在各种实施方案中，经修饰的油料作物植物可涵盖WO 2016/075303中描述或使用该专利中所述的方法制备的植物，该专利描述了芸苔属事件及其子代。在各种实施方案中，经修饰的油料作物植物可涵盖WO2015/089587中描述或使用该专利中所述的方法制备的植物，该专利描述了产EPA和DHA的油料植物和如何产生此类品系以及其他实施方案。在各种实施方案中，经修饰的油料作物植物可涵盖WO 2004/071467中描述或使用该专利中所述的方法制备的植物，该专利描述了产EPA和DHA的芸苔属品系和如何产生此类品系以及其他实施方案。在各种实施方案中，经修饰的油料作物植物可涵盖美国专利号7807849 B2中描述或使用该专利中所述的方法制备的植物，该专利描述了产EPA和DHA的拟南芥(Arabidopsis)品系和如何产生此类品系。在各种实施方案中，经修饰的油料作物植物可涵盖WO 2013/153404中描述或使用该专利中所述的方法制备的植物，该专利描述了产EPA和DHA的亚麻荠品系和如何产生此类品系。这些文件中的每份文件就其对经修饰的植物品系和如何产生此类品系的公开内容而言全部以引用方式并入本文。

可例如通过以下方式产生转基因“事件”：用异源DNA构建体转化植物细胞，该异源DNA构建体包含具有一个或多个感兴趣转基因的核酸表达盒；从各包含插入的转基因的细胞再生植物群体；以及选择通过插入到特定基因组位置中来表征的特定植物。事件在表型上可通过转基因的表达来表征。在基因水平上，事件可为植物的基因组成的一部分。术语“事件”是指包含异源DNA的初始转化体和该转化体的子代。术语“事件”还指通过转化体与另一个品种之间的有性远交产生的包含异源DNA的子代。即使在向轮回亲本重复回交之后，来自转化亲本的插入DNA和旁侧DNA也存在于杂交子代的相同染色体位置处。术语“事件”还指来自初始转化体的包含插入DNA和与插入DNA紧密相邻的旁侧序列的DNA，该DNA预期会因包含插入DNA的一个亲本品系(例如，初始转化体和自交产生的子代)和不包含插入DNA的亲本品系的有性杂交而转移给子代。如本文所用，“插入DNA”可指用于转化植物材料的表达盒内的异源DNA，而“旁侧DNA”可包含生物体(诸如植物)中天然存在的基因组DNA或经由转化过程引入的对于初始插入DNA分子而言外源的外来(异源)DNA(例如，与转化事件相关联的片段)。如本文所用，“旁侧区”或“旁侧序列”是指要么位于初始外来插入DNA分子的紧接上游并与初始外来插入DNA分子邻接，要么位于初始外来插入DNA分子的紧接下游并与初始外来插入DNA分子邻接的至少20、50、100、200、300、400、1000、1500、2000、2500或5000个碱基对或更大的序列。芸苔属LBFLFK事件的子代可包含LBFLFK基因座1或LBFLFK基因座2中的任一者，或LBFLFK基因座1和LBFLFK基因座2两者；芸苔属LBFDAU事件的子代可包含LBFDAU基因座1或LBFDAU基因座2中的任一者，或LBFDAU基因座1和LBFDAU基因座2两者。有关这些事件和其他事件以及可如何将此类事件掺入油料作物中的示例，参见WO 2016/075303、WO2016/075325和WO 2016/075327，这些专利各自全文以引用方式并入。

如本文所用，术语“芸苔属”意指任何芸苔属植物并且包括可与芸苔属繁育的所有植物品种。如本文所定义，芸苔属物种包括甘蓝型油菜(B.napus)、白菜型油菜(B.rapa)、芥菜型油菜(B.juncea)、甘蓝(B.oleracea)、黑芥(B.nigra)和埃塞俄比亚芥(B.carinata)。在各种实施方案中，芸苔属物种包含LBFLFK和LBFDAU事件。在各种实施方案中，芸苔属物种是包含LBFLFK和LBFDAU事件的甘蓝型油菜及其子代。在各种实施方案中，芸苔属植物可为卡诺拉植物。芸苔属植物可为杂交种。

根据上下文，术语“卡诺拉”可指卡诺拉植物和从其衍生的卡诺拉油两者。如本文所用，卡诺拉是指该术语作为食用菜籽油和衍生该食用菜籽油的植物的通用用法，并且还可指术语卡诺拉的任何成文用法。例如，在各种实施方案中，卡诺拉可满足以下要求：芸苔属(甘蓝型油菜(Brassica napus)、白菜型油菜(Brassica rapa)或芥菜型油菜(Brassicajuncea))的种子所产生的油应在其脂肪酸谱中含有少于2％芥酸，并且固体组分应含有每克风干、无油固体少于30微摩尔的3-丁烯基硫代葡萄糖苷、4-戊烯基硫代葡萄糖苷、2-羟基-3丁烯基硫代葡萄糖苷和2-羟基-4-戊烯基硫代葡萄糖苷中的任何一者或任何混合物(加拿大油菜籽理事会(Canola Council of Canada))。在各种实施方案中，卡诺拉可为任何食用菜籽油或衍生食用菜籽油的任何植物。在各种实施方案中，卡诺拉可为食用菜籽油或产生此类油的植物。在各种实施方案中，卡诺拉可为食用菜籽油并且还应在其脂肪酸谱中含有少于2％芥酸，或可为产生此类油的植物。在各种实施方案中，卡诺拉可为食用菜籽油并且其所含的固体组分具有每克风干、无油固体少于30微摩尔的3-丁烯基硫代葡萄糖苷、4-戊烯基硫代葡萄糖苷、2-羟基-3丁烯基硫代葡萄糖苷和2-羟基-4-戊烯基硫代葡萄糖苷中的任何一者或任何混合物或为产生此种油的植物。术语卡诺拉包括转基因和非转基因卡诺拉。

如本文所用，所提及的一个或多个油料植物包括该植物及其子代，诸如其F1、F2、F3、F4和后续代植物。该植物或其子代可为杂交种。如本文所用，“品系”或“育种品系”是个体之间有至少一个性状展示出很少或无遗传变异(诸如特定基因突变或特定组基因突变)的一组植物。可通过若干代的自花授粉和选择或通过使用组织或细胞培养技术由单个亲本的营养繁殖来产生此类品系。“品种”是指用于商业生产的品系，其包括杂交种和自由授粉品种。作为示例，该植物可包括芸苔属、亚麻、亚麻籽、大麻、胡桃、月见草、大豆、向日葵、棉花、玉米、橄榄、红花、可可、花生、大麻、亚麻荠属、海甘蓝、棕榈树、椰子、芝麻、蓖麻子、雷斯克勒(lesquerella)、牛脂、seanut、油桐果、木棉果、罂粟、霍霍巴、紫苏或落花生物种。在各种实施方案中，油料植物是芸苔属物种或亚麻荠属物种。芸苔属植物可包括例如甘蓝型油菜、芥菜型油菜(和白菜型油菜(油菜籽)物种，而亚麻荠属物种包括例如印度大麻(C.sativa)。油料植物或油料作物植物可为卡诺拉。短语“杂种植物”是指基因不同的个体之间杂交产生的植物。本发明的上下文中的术语“杂交的”或“杂交”意指配子的融合，例如就植物而言经由授粉进行以产生子代(即，细胞、种子或植物)。该术语涵盖有性杂交(一个植物被另一个植物授粉)和就植物而言的自交(自花授粉，即当花粉和胚珠来自同一植物时)。

在各种实施方案中，芸苔属和其他植物的生长阶段可(但不要求)根据BBCH量表来理解，该BBCH量表列出了生长阶段，包括从萌发到收获的子阶段。例如，卡诺拉植物的生长阶段可根据BBCH量表中有关卡诺拉的以下生长阶段来理解：

生长阶段0-萌发

00.干种子(在该阶段进行拌种)

01.种子吸胀(吸水)

03.种子吸胀完成

05.胚根(根)从种子长出

06.根伸长、根毛和/或侧根形成

07.带子叶的下胚轴突破种皮

08.带子叶的下胚轴朝土壤表面生长

09.子叶突破土壤表面

生长阶段1：叶片发育

10.子叶完全展开

11.第一片真叶展开

12.两片叶片展开

13.三片叶片展开

14.四片叶片展开

15.五片叶片展开

16.六片叶片展开

17.七片叶片展开

18.八片叶片展开

19.九片或更多片叶片展开

生长阶段2：侧枝形成

20.无侧枝

21.侧枝发育开始

29.侧枝发育结束

生长阶段3：茎伸长

30.茎伸长(抽苔)开始；或无节间(“莲座丛”)

31.茎达最终长度的10％或1个明显延长的节间

32.茎达最终长度的20％或2个明显延长的节间

33.茎达最终长度的30％或2个明显延长的节间

34.茎达最终长度的40％或2个明显延长的节间

35.茎达最终长度的50％或2个明显延长的节间

36.茎达最终长度的60％或2个明显延长的节间

37.茎达最终长度的70％或2个明显延长的节间

38.茎达最终长度的80％或2个明显延长的节间

39.最大茎长或9个明显延长的节间

生长阶段4：(省略该BBCH阶段，因为其涉及孕穗)

生长阶段5：花序出现

50.存在花蕾，但仍被叶片包围

51.从上面可见花蕾(绿色花蕾)

52.花蕾外露，与最幼嫩叶片齐平

53.花蕾升高到最幼嫩叶片以上

55.可见单独花蕾(主花序)但仍未开放

58.可见单独花蕾(二级花序)但未开放

59.可见第一个花瓣，但花蕾仍未开放(黄色花蕾)

生长阶段6：开花

60.第一朵花盛开

61.主花序上的10％花朵盛开，主花序伸长

62.主花序上的20％花朵盛开

63.主花序上的30％花朵盛开

64.主花序上的40％花朵盛开

65.盛花-主花序上的50％花朵盛开，较老的花瓣凋落

67.花朵衰败-大部分花瓣凋落

69.花期结束

生长阶段7：种子发育

70. 0％角果达到最终尺寸

71. 10％角果达到最终尺寸

72. 20％角果达到最终尺寸

73. 30％角果达到最终尺寸

74. 40％角果达到最终尺寸

75. 50％角果达到最终尺寸

76. 60％角果达到最终尺寸

77. 70％角果达到最终尺寸

78. 80％角果达到最终尺寸

79-几乎所有角果都达到最终尺寸

生长阶段8：成熟

80.成熟开始-种子绿色，填充角果腔

81. 10％角果成熟，种子黑又硬

83. 30％角果成熟，种子黑又硬

85. 50％角果成熟，种子黑又硬

87. 70％角果成熟，种子黑又硬

89.完全成熟-几乎所有角果成熟，种子黑又硬

生长阶段9：衰老

97.植物干枯

99.收获产品

术语“初花期”是指多个植物中的最初10％植物已开花的时间。在无法确定10％植物(例如，由于所述多个植物具有少于10个植物)的情况下，“初花期”可被理解为至少10％植物已开花的第一时间点。例如，如果所述多个植物为5个植物，则初花期将为单个植物已开花的时候。在各种实施方案中，“初花期”可对应于BBCH量表阶段6，子阶段61。

如本文所用，术语“种子成熟期”可指油料种子首次出现的时间段，经过油料种子生长并成熟的时间段，一直到收获植物的时间段。种子成熟期也可指此类时间段的一部分。例如，在各种实施方案中，种子成熟期可对应于BBCH量表阶段7、BBCH量表阶段8、合在一起的BBCH量表阶段7和8或合在一起的BBCH量表阶段6、7和8。作为另外的示例，种子成熟期可为从首次出现全尺寸角果到收获，或其可为从首次出现成熟角果到收获，或其可为从角果中首次出现绿种子一直到收获。种子成熟期可开始于BBCH量表子阶段50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88或89，并且种子成熟期可结束于BBCH量表子阶段60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99。

本公开提供了一种增加多个转基因芸苔属油料植物所产生的种子油中的长链ω-3脂肪酸的比例的方法，该方法包括使转基因芸苔属油料植物经受在转基因卡诺拉植物的种子成熟期期间具有至少13℃的平均日昼夜温差的环境；并且其中已对转基因芸苔属油料植物进行转基因修饰以产生包含EPA、DHA和DPA中的至少一者的种子油。

本公开还提供了一种栽培多个转基因芸苔属油料植物的方法，该方法包括使转基因芸苔属油料植物经受在转基因卡诺拉植物的种子成熟期期间具有至少13℃的平均日昼夜温差的环境；并且其中已对转基因芸苔属油料植物进行转基因修饰以产生包含EPA、DHA和DPA中的至少一者的种子油。

在各种实施方案中，芸苔属油料植物可为卡诺拉。芸苔属油料植物可为甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜、甘蓝、黑芥或埃塞俄比亚芥。芸苔属油料植物可包含LBFLFK和LBFDAU事件。

在各种实施方案中，种子成熟期期间的平均日昼夜温差为约13℃或14℃。种子成熟期期间的平均日昼夜温差可为13℃至15℃、13℃至17℃或13℃至19℃。种子成熟期期间的平均日昼夜温差可为至少13℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃。

在各种实施方案中，种子成熟期期间的最小日昼夜温差为约13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃。种子成熟期期间的最小日昼夜温差可为13℃至14℃。种子成熟期期间的最小日昼夜温差可为至少13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃。

在各种实施方案中，种子成熟期期间的平均日高低温差为约13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃。种子成熟期期间的平均日高低温差可为13℃至15℃、13℃至17℃或13℃至19℃。种子成熟期期间的平均日高低温差可为至少13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃。

在各种实施方案中，种子成熟期期间的最小日高低温差为约13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃。种子成熟期期间的最小日高低温差可为13℃至15℃、13℃至17℃或13℃至19℃。种子成熟期期间的最小日高低温差可为至少13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃。

在各种实施方案中，种子成熟期为从初花期到收获。种子成熟期可为从首次出现全尺寸角果到收获的时间段。种子成熟期可为从首次出现成熟角果到收获的时间段。种子成熟期可为从角果中出现绿种子一直到收获的时间段。种子成熟期可为种子角果灌浆的时间段。

在各种实施方案中，种子成熟期对应于BBCH量表阶段7、BBCH量表阶段8、合在一起的BBCH量表阶段7和8或合在一起的BBCH量表阶段6、7和8。

在各种实施方案中，种子成熟期开始于BBCH量表子阶段50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88或89中的任何一个子阶段并且结束于收获。

在各种实施方案中，环境是生长箱、温室、部分封闭的户外环境或露地。在环境是生长箱或温室的情况下，可经由气候控制来完全控制温度。在环境是部分封闭的户外环境或露地的情况下，温度可为环境气温。在各种实施方案中，将转基因芸苔属油料植物种植在田地中。田地可为至少500平方英尺。田地可为至少1000平方英尺。田地可为至少一英亩。田地可为至少10英亩。田地可为至少100英亩。田地可为至少1,000英亩。

在各种实施方案中，种子油为至少5重量％EPA。种子油可为至少8重量％、9重量％、10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％、15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％或20重量％EPA。种子油可为约1重量％、2重量％、3重量％、4重量％、5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％、15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％或20重量％EPA。种子油可为至多10重量％、15重量％、20重量％、25重量％EPA。从而，种子油可包含5重量％EPA至25重量％EPA。

在各种实施方案中，种子油为至少1重量％DPA。种子油可为至少0.5重量％、1重量％、2重量％、3重量％、4重量％、5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％、15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％或20重量％DPA。从而，种子油可包含1重量％DPA至20重量％DPA。

在各种实施方案中，种子油为至少0.2重量％DHA。种子油可为至少0.1重量％、0.2重量％、0.3重量％、0.4重量％、0.5重量％、0.6重量％、0.7重量％、0.8重量％、0.9重量％、1重量％、2重量％、3重量％、4重量％、5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％、15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％或20重量％DHA。种子油可为约0.1重量％、0.2重量％、0.3重量％、0.4重量％、0.5重量％、0.6重量％、0.7重量％、0.8重量％、0.9重量％、1重量％、2重量％、3重量％、4重量％、5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％、15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％或20重量％DHA。种子油可为至多10重量％、15重量％、20重量％、25重量％或30重量％DHA。从而，种子油可包含0.2重量％DHA至30重量％DHA。

种子油可为至少5.2重量％的EPA与DHA的混合物。种子油可为至少1重量％、2重量％、3重量％、4重量％、5重量％、5.1重量％、5.2重量％、5.3重量％、5.4重量％、5.5重量％、5.6重量％、5.7重量％、5.8重量％、5.9重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％、15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％或20重量％EPA和DHA。种子油可为约1重量％、2重量％、3重量％、4重量％、5重量％、5.1重量％、5.2重量％、5.3重量％、5.4重量％、5.5重量％、5.6重量％、5.7重量％、5.8重量％、5.9重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％、15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％或20重量％EPA和DHA。从而，种子油可包含1重量％至20重量％EPA和DHA。

在各种实施方案中，种子油为至少6重量％长链ω-3脂肪酸。种子油可为至少1重量％、2重量％、3重量％、4重量％、5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％、15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％或20重量％长链ω-3脂肪酸。种子油可为约1重量％、2重量％、3重量％、4重量％、5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％、15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％、20重量％、21重量％、22重量％、23重量％、24重量％、25重量％、26重量％、27重量％、28重量％、29重量％或30重量％长链ω-3脂肪酸。从而，种子油可包含1重量％长链ω-3脂肪酸至30重量％长链ω-3脂肪酸。

在各种实施方案中，种子油中增加的ω-3脂肪酸比例是增加的长链ω-3脂肪酸比例。种子油中增加的ω-3脂肪酸比例可为增加的EPA和/或DHAω-3脂肪酸比例。种子油中增加的ω-3脂肪酸比例可为增加的EPA、DPA和DHAω-3脂肪酸比例。与除了环境在种子成熟期期间具有小于7℃的平均日昼夜温差之外处于基本上相同的条件下的其他转基因芸苔属油料植物相比，ω-3脂肪酸的比例增加。

本公开还提供了卡诺拉种子，这些卡诺拉种子包含具有高比例长链ω-3脂肪酸的种子油。例如，本公开提供了卡诺拉种子，这些卡诺拉种子包含具有至少17重量％长链ω-3脂肪酸的种子油。在各种实施方案中，卡诺拉种子可包含具有至少6重量％长链ω-3脂肪酸的种子油。种子油可为至少1重量％、2重量％、3重量％、4重量％、5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％、15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％或20重量％长链ω-3脂肪酸。在各种实施方案中，卡诺拉种子可包含具有基于总油的约1重量％、2重量％、3重量％、4重量％、5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％、15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％、20重量％、21重量％、22重量％、23重量％、24重量％、25重量％、26重量％、27重量％、28重量％、29重量％或30重量％长链ω-3脂肪酸的种子油。在各种实施方案中，卡诺拉种子可包含具有基于总油的至多10重量％、15重量％、20重量％、25重量％、30重量％、35重量％或40重量％ω-3脂肪酸的种子油。从而，卡诺拉种子可包含具有基于总油的1重量％至40重量％ω-3脂肪酸的种子油。可通过本公开的方法来获得此类卡诺拉种子。

来自转基因油料植物的总油中EPA、DPA或DHA的实际百分比可变化。在各种实施方案中，转基因油料植物种子油包含至少5％EPA，诸如例如5-25％EPA或5-15％EPA。转基因油料植物种子油可包含5-6％、6-7％、7-8％、8-9％、9-10％、10-15％或＞15％EPA。转基因油料植物种子油可包含DPA。转基因油料植物种子油可包含至少1％DPA，诸如至少2％DPA，诸如1-10％DPA、1-5％DPA、2-5％DPA或＞10％DPA。在各种实施方案中，该油包含1-2％DPA、2-3％、3-4％或4-5％DPA。转基因油料植物种子油可经工程化改造以产生DHA。在各种实施方案中，转基因油料植物种子油可包含至少0.5％DHA，诸如至少1％DHA，诸如1-2％、2-3％、3-4％、1-4％、1-5％或＞5％DHA。

在各种实施方案中，该油的EPA+DHA含量为例如至少6％，诸如6-50％，诸如6-30％，诸如6-15％，诸如8-15％，诸如8.5-13.5％。在各种实施方案中，EPA+DHA含量为6-8％，在其他实施方案中，其为8-10％，在其他实施方案中，其为10-12％，在还其他实施方案中，其为12-14％。在各种实施方案中，通过将来自经修饰的植物的油与来自不产生长链ω-3脂肪酸的相同或类似物种的植物的油混合，而将种子油的EPA+DHA含量调整到具体百分比。这样，例如，可控制EPA和DHA的量，而不显著改变油中的其他脂肪酸的百分比。

在各种实施方案中，种子油中的EPA+DPA+DHA的量为例如至少8％，诸如介于8％和50％之间，诸如8-40％，诸如8-20％，诸如10-20％，诸如10-15％、15-20％或＞20％。

因此本公开提供了一种栽培多个转基因卡诺拉植物的方法，该方法包括将转基因卡诺拉植物种植于在转基因卡诺拉植物的种子成熟期期间具有至少7℃的平均日昼夜温差的环境中；并且其中转基因卡诺拉植物产生包含EPA、DHA和DPA中的至少一者的种子油。

实施例

可通过参考以举例说明方式提供的以下实施例来更好理解本公开的各种实施方案。本公开不限于本文给定的实施例。

杂交种A-C

杂交种A-C是转基因芸苔属油料植物，即卡诺拉Fl杂交种，它们各自经转基因修饰以包含事件LBFLFK。通过使LBFLFK事件渐渗到嘉吉公司(Cargill Incorporated)的标准卡诺拉本底中来制备杂交种A-C。(参见例如WO 2016/075303、WO 2016/075325和WO 2016/075327)。

表1.

名称	杂交种
		杂交种A	11CA2034.014/04CF80.69*3/LBFLFK
杂交种B	11CA2034.014/09CF126.027*3/LBFLFK
		杂交种C	11CA2034.014/10CF635.003*3/LBFLFK

对于生长箱实验，按16/8小时昼/夜周期将植物种植在PGC-20生长箱(康威恩(Conviron))中。从萌发一直到花期结束用100ppm

20-20-20为植物施肥，并且根据需要为植物底部浇水以保持土壤潮湿。植物从萌发一直到花期均在22℃/19℃昼/夜温度下生长，在花期时温度转变成单独PGC-20生长箱中15℃/12℃、22℃/19℃或25℃/12℃的温度处理一直到成熟期，此时所有角果中的所有种子已经历从绿色到棕色的完全颜色变化。在花期时，对植物单独地套袋并且让植物自花授粉。从单独植物收获角果，将其混合为单个植物，并且对其进行二次采样以进行约30粒种子的脂肪酸谱分析。对于杂交种A和C而言，使10个植物在每个温度处理下生长。对于杂交种B而言，使6-8个植物在每个温度处理下生长。

使用约30粒种子和紧接破碎后的标准脂肪酸甲酯制备(摘自AOCS方法Ce 1-62)通过气相色谱法来测量种子的脂肪酸谱。GLC-566(NuChek Prep)用作标准品并且由ChemStation软件(安捷伦(Agilent))将脂肪酸谱确定为总脂肪酸的百分比。通过美国油脂化学家协会(AOCS)方案Ce1-62的修改版来确定种子的脂肪酸组成。在该程序中，将以酰基甘油形式存在的脂肪酸转化为脂肪酸甲酯，通过气液色谱法(GLC或GC)来分析该脂肪酸甲酯。对于待分析的每个样品而言，将20-30粒种子连同两个钢珠轴承一起放在15ml离心管中。盖上该管并且摇晃30秒或直到种子明显破碎。将大约0.6mL 2N KOH的甲醇溶液添加到该管中，并且再次摇晃该管大约一分钟。将该管及其内容物置于70±5℃的水浴中2min。在从水浴中取出该管之后，添加4mL被氯化钠饱和的水和2.0mL含100ppm BHT的异辛烷，摇晃该管并且在台式离心机中离心1min。将异辛烷上清液的一部分转移到气相色谱(GC)样品瓶并盖上该样品瓶。将样品瓶储存在0-4℃下直到分析，但不得超过五天。在配备有安捷伦科技公司(Agilent Technologies)的20m×0.18mm×0.2μm DB-225(50％氰丙基苯基)柱的仪器上以250℃的进样器温度对脂肪酸甲酯经受GC分析，并且使用0.8ml/min氢柱流量(恒流模式)以50∶1分流比进样1μl。初始温度为190℃/0min-＞15℃/min-＞220℃-＞220℃/9min，并且采用火焰离子化检测器。使用脂肪酸甲酯标准品(诸如NuChek Prep目录号GLC566)来校准该仪器。使用被归一化到这些脂肪酸的总峰面积的所报告的每种类型的脂肪酸的积分峰面积来确定具有14个碳原子(C14脂肪酸)至24个碳原子(C24脂肪酸)的脂肪酸的含量。

栽培

可使用芸苔属油料植物的常规种植技术来种植芸苔属油料植物。可将这些植物种植于生长箱、温室、部分封闭的田地和露地中。

收获

可根据用于油料植物的常规技术来进行收获。例如，可经由直接联合法或经由割晒法来进行收获。可通过以下方式进行割晒法：使用配有帆布带式或螺旋式铺条机的任何自走式或动力输出驱动牵引式割晒机来收割作物并且将料堆直接铺放在割茬上。允许所收割的作物大约在收割后5至10天干燥到均匀的种子水分含量。与直接联合法相比，可提早八至十天进行割晒法。在生长箱规模上，例如，可用手手动地进行收获。

种子油收集

可使用常规卡诺拉种子破碎工艺来获得种子油，所述常规卡诺拉种子破碎工艺包括回火、轧坯、生坯调理、螺旋压榨机压榨和过滤。

油分析

可如标准文献中所述的那样执行油分析，该标准文献包括Ullman，Encyclopediaof Industrial Chemistry，Bd.A2，S.89-90和S.443-613，VCH：Weinheim(1985)；Fallon，A.等人，(1987)“Applications of HPLC in Biochemistry”，载于：Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology，Bd.17；Rehm等人，(1993)Biotechnology，Bd.3，Kapitel III：“Product recovery and purification”，S.469-714，VCH：Weinheim；Belter，P.A.等人，(1988)Bioseparations：downstream processing for Biotechnology，John Wiley and Sons；Kennedy，J.F.和Cabral，J.M.S.(1992)Recovery processes forbiological Materials，John Wiley and Sons；Shaeiwitz，J.A.和Henry，J.D.，(1988)Biochemical Separations，载于：Ullmann′s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，Bd.B3；Kapitel 11，S.1-27，VCH：Weinheim；以及Dechow，F.J.，(1989)Separation andpurification techniques in biotechnology，Noyes Publicatiohs。众所周知，脂质和脂肪酸的提取可使用其他方案而非上文所引用的方案来进行，诸如Cahoon等人，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96(22)：12935-12940和Browse等人，(1986)AnalyticBiochemistry152：141-145中所述。用于脂质或脂肪酸的定量与定性分析的方案描述于Christie，William W.，Advances in Lipid Methodology，Ayr/Scotland：Oily Press(Oily Press Lipid Library；2)；Christie，William W.，Gas Chromatography andLipids.A Practical Guide-Ayr，Scotland：Oily Press，1989，Repr.1992，IX，307S.(OilyPress Lipid Library；1)；Progress in Lipid Research，Oxford：Pergamon Press，1(1952)-16(1977)u.d.T.：Progress in the Chemistry of Fats and Other LipidsCODEN。

实施例1-15℃昼/12℃夜下的种子成熟温度测试

将杂交种A-C种植于生长箱中。控制生长箱中的环境以模拟昼夜温度循环。在种子成熟期期间，使这些植物经受15℃的昼温和12℃的夜温。在种子成熟期间处于15℃/12℃的杂交种A的结果示于表1中。在种子成熟期间处于15℃/12℃的杂交种B的结果示于表2中。在种子成熟期间处于15℃/12℃的杂交种C的结果示于表3中。

表2.

表3.

表4.

实施例2-22℃昼/19℃夜下的种子成熟温度测试

将杂交种A-C种植于生长箱中。控制生长箱中的环境以模拟昼夜温度循环。在种子成熟期期间，使这些植物经受22℃的昼温和19℃的夜温。在种子成熟期间处于22℃/19℃的杂交种A的结果示于表5中。在种子成熟期间处于22℃/19℃的杂交种B的结果示于表6中。在种子成熟期间处于22℃/19℃的杂交种C的结果示于表7中。

表5.

表6.

表7.

实施例3-25℃昼/12℃夜下的种子成熟温度测试

将杂交种A-C种植于生长箱中。控制生长箱中的环境以模拟昼夜温度循环。在种子成熟期期间，使这些植物经受25℃的昼温和12℃的夜温。在种子成熟期间处于25℃/12℃的杂交种A的结果示于表8中。在种子成熟期间处于25℃/12℃的杂交种B的结果示于表9中。在种子成熟期间处于25℃/12℃的杂交种C的结果示于表10中。

表8.

表9.

表10.

过论

实施例1-3出乎意料地显示出对于三个不同转基因芸苔属杂交种中的每一个而言，具有更大极值的昼/夜温度循环使得由其产生的种子油中有更高比例的长链ω-3脂肪酸，尤其是EPA、DPA和DHA。参见表11和图1，其提供了表2-10中列出的结果的总结。杂交种A提供了总体更低温度(15℃/12℃)下的一致结果，这与总体更高温度(22℃/19℃)下的情况一样。杂交种B提供了类似结果，但更高温度具有略微降低ω-3比例的效果。杂交种C显示出所产生的ω-3的比例的显著降低。这些结果甚至更令人惊讶的是，将昼温升高到25℃并将夜温降低到12℃引起了种子油中的ω-3脂肪酸百分比增加。

表11.

杂交种	温度处理	平均ω3％	标准偏差
				杂交种A	15℃/12℃	12.20	3.02
杂交种A	22℃/19℃	12.30	1.79
				杂交种A	25℃/12℃	14.92	1.44
杂交种B	15℃/12℃	12.05	2.12
				杂交种B	22℃/19℃	11.69	1.49
杂交种B	25℃/12℃	14.84	1.51
				杂交种C	15℃/12℃	11.10	1.58
杂交种C	22℃/19℃	9.84	0.83
				杂交种C	25℃/12℃	11.84	2.11

已经采用的术语和表达被用作描述而非限制的术语，并且不旨在使用这样的术语和表达排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，但是应当认识到，在本公开的实施方案的范围内，各种修改形式是可能的。因此，应当理解，尽管本公开已经由具体实施方案和任选特征具体地公开，但是本领域普通技术人员可以采取本文公开的概念的修改形式和变型形式，并且这些修改形式和变型形式被认为在本公开的实施方案的范围内。

附加实施方案

提供以下示例性实施方案，其编号不应解释为指定重要性级别：

实施方案1.提供了一种增加多个转基因芸苔属油料植物所产生的种子油中的长链ω-3脂肪酸的比例的方法，该方法包括使转基因芸苔属油料植物经受在转基因卡诺拉植物的种子成熟期期间具有至少7℃的平均日昼夜温差的环境；并且其中已对转基因芸苔属油料植物进行转基因修饰以产生包含EPA、DHA和DPA中的至少一者的种子油。

实施方案2.提供了一种栽培多个转基因芸苔属油料植物的方法，该方法包括将转基因芸苔属油料植物种植于在转基因卡诺拉植物的种子成熟期期间具有至少7℃的平均日昼夜温差的环境中；并且其中转基因卡诺拉植物结出包含EPA、DHA和DPA中的至少一者的种子。

实施方案3.提供了根据实施方案1-2中任一项所述的方法，其中芸苔属油料植物是卡诺拉。

实施方案4.提供了根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中平均日昼夜温差为约13℃。

实施方案5.提供了根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中该环境在转基因芸苔属油料植物的种子成熟期期间具有至少7℃的最小日昼夜温差。

实施方案6.提供了根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中种子成熟期为从初花期到收获。

实施方案7.提供了根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中种子成熟期为从首次出现全尺寸角果到收获。

实施方案8.提供了根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中种子成熟期为从首次出现成熟角果到收获。

实施方案9.提供了根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中种子成熟期为从角果中首次出现绿种子一直到收获。

实施方案10.提供了根据实施方案1-9中任一项所述的方法，其中该环境是生长箱、温室、部分封闭的户外环境或露地。

实施方案11.提供了根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中将转基因芸苔属油料植物种植在田地中。

实施方案12.提供了根据实施方案11所述的方法，其中田地为至少一英亩。

实施方案13.提供了根据至少实施方案1-12中任一项所述的方法，其中种子油为至少5重量％EPA。

实施方案14.提供了根据至少实施方案1-13中任一项所述的方法，其中种子油为至少5重量％DPA。

实施方案15.提供了根据至少实施方案1-14中任一项所述的方法，其中种子油为至少0.2重量％DHA。

实施方案16.提供了根据至少实施方案1-15中任一项所述的方法，其中种子油为至少5.2重量％的EPA与DHA的混合物。

实施方案17.提供了根据至少实施方案1-16中任一项所述的方法，其中种子油为至少14重量％的EPA与DHA的混合物。

实施方案18.提供了根据实施方案1-17中任一项所述的方法，其中种子油为至少6重量％长链ω-3脂肪酸。

实施方案19.提供了根据实施方案1-18中任一项所述的方法，其中种子油为至少17重量％长链ω-3脂肪酸。

实施方案20.提供了根据实施方案1-19中任一项所述的方法，其中与除了经受在种子成熟期期间具有小于7℃的平均日昼夜温差的环境之外处于基本上相同的条件下生长的转基因芸苔属油料植物相比，种子油中的ω-3脂肪酸比例增加。

实施方案21.提供了由根据实施方案1-20中任一项所述的方法获得的芸苔属油料植物种子。

实施方案22.提供了芸苔属油料植物种子，所述芸苔属油料植物种子包含为至少17重量％长链ω-3脂肪酸的种子油。

实施方案23。提供了卡诺拉种子，所述卡诺拉种子包含为至少17重量％长链ω-3脂肪酸的种子油。

实施方案24.提供了从根据实施方案21-24中任一项所述的种子获得的油。

实施方案25提供了根据实施方案1-20中任一项或任何组合所述的方法、或由该方法产生的植物、种子或油、或根据实施方案21-24所述的种子，其任选地被配置为使得所引用的所有要素或选项及其每个排列均可供使用或从中选择。

Claims (20)

1.一种增加多个转基因芸苔属油料植物所产生的种子油中的长链ω-3脂肪酸的比例的方法，所述方法包括使所述转基因芸苔属油料植物经受在转基因卡诺拉植物的种子成熟期期间具有至少13℃的平均日昼夜温差的环境；并且

其中已对所述转基因芸苔属油料植物进行转基因修饰以产生包含EPA、DHA和DPA中的至少一者的种子油。

2.一种栽培多个转基因卡诺拉植物的方法，所述方法包括将所述转基因卡诺拉植物种植于在所述转基因卡诺拉植物的种子成熟期期间具有至少13℃的平均日昼夜温差的环境中；并且

其中所述转基因卡诺拉植物产生包含EPA、DHA和DPA中的至少一者的种子油。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述转基因芸苔属油料植物是甘蓝型油菜植物。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述平均日昼夜温差为约15℃。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述环境在所述转基因芸苔属油料植物的所述种子成熟期期间具有至少13℃的最小日昼夜温差。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述种子成熟期为从初花期到收获。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述环境是生长箱、温室、部分封闭的户外环境或露地。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中将所述转基因芸苔属油料植物种植在田地中。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述种子油为至少5重量％EPA。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述种子油为至少1重量％DPA。

11.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述种子油为至少0.2重量％DHA。

12.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述种子油为至少5.2重量％的EPA与DHA的混合物。

13.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述种子油为至少6重量％长链ω-3脂肪酸。

14.根据权利要求1或2所述的方法，其中与除了所述环境在所述种子成熟期期间具有小于7℃的平均日昼夜温差之外处于基本上相同的条件下的转基因芸苔属油料植物相比，所述种子油中的ω-3脂肪酸的比例增加。

15.芸苔属植物种子，所述芸苔属植物种子包含为至少17重量％长链ω-3脂肪酸的种子油。

16.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述种子油包含5重量％EPA至25重量％EPA。

17.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述种子油包含1重量％DPA至20重量％DPA。

18.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述种子油包含0.2重量％DHA至30重量％DHA。

19.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述种子油包含1重量％至20重量％的EPA与DHA的混合物。

20.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述种子油包含1重量％长链ω-3脂肪酸至30重量％长链ω-3脂肪酸。

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