CN104450921B - 一种精确鉴定长丰鲫的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种精确鉴定长丰鲫的方法，通过比较鲫鱼线粒体NADH4基因中110-866位点序列信息与鲤鱼线粒体基因序列的相似度，或是通过流式细胞术鉴定染色体倍性，或是二者结合，可快速、精确区分长丰鲫与其他所有鲫鱼种群。可以对于长丰鲫鱼品种种质鉴定以及商业养殖中产生的纠纷提供准确的鉴定依据。

Description

一种精确鉴定长丰鲫的方法

技术领域

本发明属于鉴定鱼类物种的生物技术领域，具体涉及一种精确鉴定长丰鲫的方法。

背景技术

银鲫是我国水产养殖种的重要种类，生产上应用的有异育银鲫、方正银鲫、长丰鲫以及众多的银鲫地方种。银鲫在生产中种类较为混杂，各种养殖银鲫形态学均符合国家银鲫标准(GB16874-2006)，仅仅依靠形态学鉴别长丰鲫同其他鲫鱼是无效的。因此发明精确鉴别长丰鲫和各养殖种群的鉴别方法是必要的，可以较好的保护长丰鲫种质资源以及解决农业生产上的各种商业纠纷。

长丰鲫是中国水产科学研究院长江水产研究所自1991年从普通银鲫中开始进行系统选育。长丰鲫形态与银鲫相同，主要形态构造特征符合银鲫国家标准(GB16874-2006)。长丰鲫为通过人工选育的的新品种，具有明显的生长优势和抗病性，在生产上应用较为广泛，目前已在市场上广泛流通。

本发明专利提供了精确联合两种方案对长丰鲫进行鉴别的技术方案。本方法利用长丰鲫独特基因信息可以精确区分长丰鲫和其他鲫鱼。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种精确鉴定长丰鲫的方法，该方法简单，准确，可靠，稳定性强，解决了长丰鲫和其他鲫鱼无法精确区分的问题。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种精确鉴定长丰鲫的方法，为以下两种方法之一或其结合：

1)比较鲫鱼线粒体NADH4基因中110-866位点序列信息与鲤鱼线粒体基因序列的相似度，相似度为99％或以上为长丰鲫，否则不是。

2)利用流式细胞术进行鲫鱼倍性鉴别，4倍体为长丰鲫，否则不是。

以上所述的方法中，优选的，方法1)具体为：利用引物F：CCTCCTAATTGCCTCCATCA；R：CCCATGTGACTTACGGATGA对鲫鱼的线粒体NADH4基因进行扩增，与SEQIDNO.1所示序列进行比对，序列相似度99％或以上则为长丰鲫。

以上所述的方法，一种精确鉴定长丰鲫的方法，包括以下步骤：

1)利用引物F：CCTCCTAATTGCCTCCATCA；R：CCCATGTGACTTACGGATGA对鲫鱼的线粒体NADH4基因进行扩增，与SEQIDNO.1所示序列进行比，序列相似度99％或以上则为长丰鲫，用于进一步的步骤2)的确认；

2)进一步利用流式细胞术进行鲫鱼倍性鉴别，4倍体为长丰鲫，否则不是。

本发明提供的鉴别方法，方法可靠，利用基因信息鉴定稳定性强，可做为法律依据。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明首次针对长丰鲫养殖品种，发明了一种准确对长丰鲫和其他鲫鱼的鉴定技术，弥补了形态学鉴别的不足，为长丰鲫品种保护与解决养殖种的商业纠纷提供了参考。

目前生产上所有的养殖银鲫均为2倍体或者3倍体。经研究发现长丰鲫为4倍体，不同于目前生产上所有的养殖种，利用流式细胞术可以进行初步鉴别。同时在我们对长丰鲫线粒体基因组测序后发现，长丰鲫线粒体NADH4基因中110-866位点连续757个碱基序列为鲤鱼线粒体基因信息，而其他鲫鱼在此位点均为鲫鱼基因信息序列差异达到12％。该位点的鲤鱼基因组信息为长丰鲫独特的基因信息，利用该基因信息，可以精确区分长丰鲫与其他所有鲫鱼种群。可以对于长丰鲫鱼品种种质鉴定以及商业养殖中产生的纠纷提供准确的鉴定依据。

本发明的方法，可准确将长丰鲫与市面上已有的异育银鲫、方正银鲫、滁州鲫以及众多的银鲫地方种。

附图说明

图1为实施例2中鸡血DNA血红细胞相对含量示意图。

图中所示峰值为200。

图2为实施例2中异育银鲫血红细胞DNA相对含量示意图。

图中所示峰值为300。

图3为实施例2中长丰鲫血红细胞DNA相对含量示意图。

图中所示峰值为400。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。本发明实施例1-3利用了50条长丰鲫和50条异育银鲫中科3号的混合群体，以测定本发明所述技术方案的准确性。实施例1：

一种精确鉴定长丰鲫的方法，包括以下步骤：

长丰鲫线粒体NADH4基因鉴定：

(1)使用TIANGEN基因组DNA提取试剂盒提取长丰鲫DNA，进行PCR反应：

引物为：F：CCTCCTAATTGCCTCCATCA；R：CCCATGTGACTTACGGATGA。

PCR反应体系

PCR反应过程为：94℃预变性5min，35个循环(94℃变性1min，退火56℃1min，72℃延伸1min)

(2)扩增产物连接：

加入试剂：

16℃反应30min

全量加入至商业购买的感受态细胞中(takara公司)，冰中放置30min。

42℃加热45s后，再在冰中放置1min。

加入800μl不含AmpLB液体培养基，37℃，50rpm/min震荡45min。

在含有Amp的LB固体培养基平板上过夜培养。

挑取单菌落，至含Amp液体培养基中，37℃，280rpm/min培养3h。

(3)将挑选的单菌落送至测序公司测序(生工生物工程(上海)股份有限公司)

(4)序列比对

方法A：

将测序公司测定的序列输入NCBI(美国国立生物技术信息中心)数据库进行信息比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#alnHdr_146142357)，可获得该序列信息的详细比对信息，如测定的序列与公开提交的鲤鱼序相似度达到99％，则判定该鱼为长丰鲫。

或者方法B(本实施例使用该方法)：

利用序列比对软件DNAman，将测定的序列与以下标准序列(SEQIDNO.1)做比较。序列相似度99％或以上为长丰鲫，相似度99％以下则为其他鲫鱼。

标准序列为：CAGCCTAACATGACTGAAATGAACATCCGAAACTGGGTGAACTTCCTCCAACATATACCTAGCCACAGACCCACTATCAACCCCCCTATTAGTCCTAACATGCTGACTACTCCCACTTATAATCCTAGCCAGCCAAAACCATATTAATCCCGAACCAATTAGCCGGCAACGCCTATACATCACACTCCTCGCCTCACTACAAACCTTTCTGATCATAGCATTCGGTGCCACAGAAATCATTATATTCTACATCATATTTGAAGCCACACTCATTCCAACCCTCATTATTATTACCCGCTGAGGGAACCAAACCGAACGCCTTAACGCCGGAACCTACTTCTTATTCTATACCCTAGCAGGATCCCTTCCGCTTTTAGTCGCCCTACTCCTTCTTCAACAATCCACAGGTACACTATCAATACTTGTACTACAATATTCACAACCCCTACAACTCAACTCTTGAGGTCACATGTTTTGATGAGCTGGCTGCCTAATCGCATTCCTAGTCAAGATACCACTATATGGTGTCCACCTGTGATTACCAAAAGCACACGTAGAAGCCCCCGTAGCAGGATCGATAGTACTAGCAGCAGTATTACTAAAACTTGGTGGATACGGAATAATACGTATAATAGTAATACTAGATCCCCTATCAAAAGAACTCGCCTACCCATTTATTATCCTAGCCCTCTGAGGAATCATTATAACCGGATCAATTTGCCTCCGACAAACAGACCTAAAATCACTAATCGCCTA.

利用本实施例所述方法检测的50条长丰鲫和50条异育银鲫的混合群体，共检测出50个符合长丰鲫鉴定标准的样本(即有50个样本扩增出的序列与SEQIDNO.1所示序列的相似性大于或等于99％)，鉴定准确度为100％。

实施例2：

一种精确鉴定长丰鲫的方法，包括以下步骤：

流式细胞仪倍性鉴别：

(1)血液样品制备

待测样品：长丰鲫静脉血；对照：鸡血静脉血，异育银鲫静脉血。

(2)样品染色

将固定的红细胞混匀，用300目滤膜过滤，过滤后用CycleTESTPLUSDNAReagentkit试剂盒(美国BD公司)中的buffersolution洗涤细胞两次，1000r/min离心5min，弃上清。

用buffersolution调节细胞浓度为1×10⁶个/ml，取此浓度细胞悬浮液100μL，加入250μLCycleTESTPLUSDNAReagentkit试剂盒中A液250μL(打孔剂)。轻微震荡混匀后，室温作用10min。加入C液(PI染料)200μL，轻微震荡混匀后，2-8℃避光孵育30min后上机检测。

3)DNA含量测定

采用美国BD公司FACSCalibur型流式细胞仪，激发光源为2W氩离子激光器，输入功率300mW，激发波长488nm，分别进行单参数检测。上机前先以标准微球调整仪器，是CV<2％，检测前先做BD公司质控。以鸡血细胞作外定标，每个样品检测细胞总数为104个。

使用Cellquest软件收集数据(每秒收集100～300个细胞)，Modfit2.0软件进行DNA细胞周期及倍体分析。

3)数据和图形分析

测量数据和图有计算机自动进行相应资料处理并输出，然后将标准样品、对照样品盒待测样品的处理资料按照统计学进行计算机分析。

样品鱼DNA绝对含量依照以下公式计算：P1＝E2/E1×P2，式中：P1表示检测鱼红血球的DNA绝对含量(pg/N)，P2表示标准鸡红血球DNA绝对含量(2.5pg/N)；E1表示鸡红血球的相对DNA含量，E2表示检测鱼红血球的相对DNA含量。

4)图形输出及鉴别

利用本实施例所述方法检测了50条长丰鲫和50条异育银鲫的混合群体，共检测出50个符合长丰鲫鉴定标准的样本(即有50个的样本为四倍体)，鉴定准确度为100％。

实施例3：

一种精确鉴定长丰鲫的方法，包括利用PCR的方法扩增其线粒体NADH4并进一步的使用流式细胞仪对样品进行倍性鉴定(具体方法见实施例1和实施例2)，PCR引物为：F：CCTCCTAATTGCCTCCATCA；R：CCCATGTGACTTACGGATGA。

利用上述PCR的方法检测了50条长丰鲫和50条异育银鲫的混合群体，共检测出50个符合长丰鲫鉴定标准的样本(即有50个样本扩增出的DNA片段与SEQIDNO.1所示序列的相似性大于或等于99％)，将筛选出的50个样品进一步用流式细胞仪检测其倍性，这50个样本均为四倍体，鉴定准确度为100％。

SEQUENCELISTING

<110>中国水产科学院长江水产研究所

<120>一种精确鉴定长丰鲫的方法

<130>一种精确鉴定长丰鲫的方法

<160>1

<170>PatentInversion3.1

<210>1

<211>756

<212>DNA

<213>鲤鱼

<400>1

cagcctaacatgactgaaatgaacatccgaaactgggtgaacttcctccaacatatacct60

agccacagacccactatcaacccccctattagtcctaacatgctgactactcccacttat120

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cctccgacaaacagacctaaaatcactaatcgccta756

Claims (1)

1.一种精确鉴定长丰鲫的方法，包括以下步骤：

1)利用引物F：CCTCCTAATTGCCTCCATCA；R：CCCATGTGACTTACGGATGA对鲫鱼的线粒体NADH4基因进行扩增，与SEQIDNO.1所示序列进行比，序列相似度99％或以上则为长丰鲫，用于进一步的步骤2)的确认；

2)进一步利用流式细胞术进行鲫鱼倍性鉴别，4倍体为长丰鲫，否则不是。