CN104894217A - 一种人外周血淋巴细胞基因组损伤的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人外周血淋巴细胞基因组损伤的检测方法，属于细胞遗传及分子生物技术领域；本方法取少量的人外周血样本，通过淋巴细胞的分离、计数和培养，加CB到培养基中，离心收集细胞，制片，将制片细胞空气干燥、固定和染色，计数由CB阻滞的1000个双核细胞BNC中微核MN、核质桥NPB、核芽NBud的数目，以其出现频率为基础，进行基因组损伤测评分析；本方法通过检测人外周血淋巴细胞基因组损伤，可评价个体基本的遗传健康状况，为矫正受试者的基因组损伤、使其处于利好状态提供基础数据，再结合个体的血清生化指标及相关遗传多态性、饮食和生活方式、年龄及其健康史，进行微营养素和生活方式的干预，达到降低基因组损伤、消减遗传-环境相关疾病风险的目标。

Description

一种人外周血淋巴细胞基因组损伤的检测方法

技术领域

本发明涉及一种人外周血淋巴细胞基因组损伤的检测方法，属于细胞遗传及分子生物技术领域。

背景技术

胞质阻断基因组损伤分析(cytokinesis-block genomic damage assay，CBGD)是一种可同时评价基因组损伤、细胞周期停滞、细胞死亡的综合试验体系，包括染色体断裂、DNA错配修复、染色体丢失、染色体不分离、细胞坏死、凋亡以及细胞淤积，它比单纯的微核分析更加全面、系统。其原理是利用细胞松弛素B(cytochalasin B，CB)进入细胞后在不影响细胞核分裂(karyokinesis)的同时阻断胞质分裂(cytokinesis)，从而形成双核细胞(binucleated cell，BNC)(见图1CBGD分析中各指标显微图，A)。CBGD分析评价基因组损伤的优点在于单次分裂后的细胞被CB诱导成BNC，从而可同时检测出染色体数量以及结构的变异。因此，细胞核内未被修复的遗传损伤被完整地保留在了BNC中，表现为三类不同的遗传损伤端点：微核(MN)(图1，B)、核质桥(NPB)(图1，D)和核芽(NBud)(图1，C)；另外，在基因组损伤严重的细胞中会同时存在多个端点，如单个BNC同时含有MN和NPB(图1，E)或MN和NBud(图1，F)。

MN通常形成于染色体断片或整条染色体在细胞分裂中期的滞后，染色体上因DNA双链断裂或者因单链断裂而在复制过程中引发的双链断裂会使断裂的无着丝粒染色体片段形成MN。而染色体着丝粒上的卫星DNA缺失或低甲基化以及细胞周期调控基因的突变或缺失都有可能导致整条染色在有丝分裂后期分离过程中发生滞后，最后形成MN。

当两个断裂染色体被错配修复而融合在一起，或是因染色体末端的端粒危机(端粒过度缩短、端粒加帽蛋白丢失或是端粒凝集缺陷)而发生完整染色体末端融合会形成双着丝粒染色体，双着丝粒染色体上的两个着丝粒在有丝分裂后期被纺锤丝反方向牵引、拉伸形成NPB。因此，NPB是染色体重排和端粒异常的指示端点。此外，某些基因突变可导致姐妹染色单体之间发生交联，使得交联的姐妹染色单体在后期无法正常分离而被拉伸形成NPB。

NBud与MN在外观上很相似，以一种柄状染色质结构与细胞内的主核相连接。基因异常扩增的DNA序列会被出芽的方式排挤出主核，因此NBud是形成微核的中间态，核出芽过程是细胞排除过多的扩增DNA的一种机制，因此核芽是基因扩增的生物标记。MN、NPB和NBud看似相互独立，分别代表不同遗传损伤的端点，但是这三者的形成彼此之间存在一定关联，共同反应了基因组的损伤状况。

基因组损伤是众多人类遗传-环境疾病的基础诱因，与出生缺陷、免疫系统缺陷、退行性疾病如老年性痴呆、帕金森氏病、高血压、心血管疾病、糖尿病、骨质疏松症、肿瘤等疾病密切相关。当个体暴露于遗传毒性物质或微营养物质的摄入不足都可能造成遗传损伤，通过CBGD分析检测人外周血淋巴细胞中的遗传损伤是一种较好的分析人活体中遗传损伤，进而评估基因组稳定性的方法。

现有技术多为检测个体是否携带与某疾病相关的基因，如单基因病多为检测某个相关基因，多基因病通常检测一系列相关基因，通过检测只是让个体有知情权，了解个体的患病风险高低，并不能作出改变或校正。而本技术是对个体整个基因组健康状况的检测，并在了解个体遗传损伤状况的基础上，可以通过营养干预、调整饮食和生活方式，使遗传损伤较高的个体得到校正，改善其基因组的稳定性，同时降低相关疾病，特别是退行性疾病的患病风险，目前在国内还没有相关技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种人外周血淋巴细胞基因组损伤的检测方法，结合个体的血清生化指标及相关遗传多态性、饮食和生活方式、年龄及其健康史，进行微营养素和生活方式的干预，达到降低基因组的损伤，进而消减遗传-环境相关疾病风险的目标。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种人外周血淋巴细胞基因组损伤的检测方法，包括如下步骤：

1.取血：用抗凝管(肝素或EDTA)通过静脉穿刺取外周血4ml用于淋巴细胞的分离；

2.淋巴细胞培养基配置：20ml的RPMI1640培养基中含有10％2ml胎牛血清FBS，200μl浓度为200mM的L-谷氨酰胺L-Glu和200μl浓度为100mM的丙酮酸盐，将配制好的培养基放入一个无菌的组织培养级的玻璃或者塑料瓶中，按培养的要求准备少量的培养基，培养基可以在4℃储存一个星期，超过一周的培养基不能再继续使用，需重新配置；

3.淋巴细胞的分离和计数(约需要3小时)：

S1、将全血与Hank's平衡盐溶液HBSS以1：1的比例稀释，温度为20～22℃，并轻轻地颠倒混匀；

S2、轻轻地将稀释的血液铺在淋巴细胞分离液表面上，淋巴细胞分离液：稀释血液的比值为1:3，小心不要破坏分离界面；

S3、称量使离心管平衡，于18～20℃以400g离心30分钟；

S4、淋巴细胞层位于淋巴细胞分离液与稀释的血浆的界面之间，用无菌并带塞的巴斯德移液管收集淋巴细胞层放入一个新管中，注意不要收集到太多的淋巴细胞分离液；

S5、得到的淋巴细胞悬浮液为淋巴细胞和单核细胞的混合物，加入其体积3倍的HBSS，于室温20～22℃时轻轻混匀，180g离心10分钟；

S6、弃上清，用巴斯德移液管加入2ml HBSS，重新悬浮呈淡米色细胞球状面，于18～20℃以100g离心10分钟；

S7、弃上清，于室温加入200μl培养基，轻轻悬浮细胞；

S8、用血球计数板进行细胞计数；

4.淋巴细胞培养(约需要44h)：

S9、调整细胞数量，使其达到在培养基中细胞数为1×10⁶/ml，根据每ml的细胞数把细胞悬液分开，根据细胞数确定培养体积，最大体积不超过750μl；

S10、加植物细胞凝集素PHA刺激淋巴细胞分裂，加20μl质量浓度为2.25mg/ml的PHA溶液到750μl的培养液中，若细胞数量较少可以适当的提高PHA的量；

S11、剩的体积补培养基，重悬浮细胞，使细胞混匀；

S12、细胞在37℃温育，盖子扎松，在湿润并含有5％CO₂的环境中培养44h以上，细胞松弛素B(CB)必须在加入PHA44小时以后加入；

S13、第二天观察细胞管，正常情况下细胞已经开始生长，出现小颗粒，培养基变黄，第一天培养体积少的可以根据生长状况补一定的培养基，通常补到终体积为800μl；

5.加CB到培养基中(约需要28h)：

S14、解冻装有100μl CB溶液的储备液，CB溶解在二甲亚砜DMSO的浓度为600μg/ml；

S15、将置于室温的900μl培养基无菌加入CB储备瓶中，即得质量浓度为60μg/ml的CB溶液1000μl；

S16、从步骤S13制备的800μl培养物的顶层取出60μl培养基，加入60μl质量浓度60μg/ml的CB溶液，使CB的终浓度为4.5μg/ml；

S17、将培养物重新放入培养箱中继续培养28小时；

6.通过细胞离心收集细胞(约需要30分钟)

S18、准备一个细胞浓度，使其足以在每个点都能产生单层细胞，淋巴细胞是在圆底试管中进行培养，由于细胞易于沉于培养瓶底部，则只须根据细胞浓度丢弃一定量的表面培养物质，如：从培养物中约取出400μl，剩下400μl，加7.5％的DMSO 30μl，处理8～10min；

S19、迅速将80μl细胞悬浮液加入到每个离心杯的孔中，根据培养物中的细胞浓度和用于涂片的最佳细胞密度，这些都取决于试验和误差，所需的量可能还需要做轻微调整；

S20、重新放置转子上的盖子，按压中间的按钮以锁定，放置细胞离心机中的转子并使主要的盖子闭锁发出喀哒声，按照厂家的推荐设置时间和速度参数进行涂片；

7.细胞的干燥、固定和染色及片子的准备(约需要30分钟)：

S21、拆除每个片子固定器，小心不要抹掉片子上的斑点，将滤纸丢进生物危害箱内，将离心杯用纯净水仔细清洗6次，自然风干，不要直接加热使杯子干燥；

S22、将片子水平地放在片子盘中，使细胞在室温下风干10分钟，片子风干的时间不要超过10分钟，否则细胞和核的形态改变将难以对片子进行计数；

S23、按照3:1的比例配置甲醇：冰醋酸固定液，固定10min，自然风干过夜；

S24、吉姆萨母液用pH为7.4、浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲液按1：10稀释(通常取3ml的母液加30ml的磷酸缓冲液)配置成工作液，染色5min，蒸馏水水洗，干燥，要是颜色不深可以复染；

S25、用二甲苯透明处理5min，中性树脂封片；

8.计数：是在100×光学显微镜下，计数由CB阻滞的1000个双核细胞BNC中微核MN、核质桥NPB、核芽NBud的数目，若一个BNC中出现多个遗传损伤指标应按出现个数计数，至少2人重复计数后误差在30％以内数据可用，每个个体各指标的频率以千分率计算(如：MN/1000BN)。

双核细胞计数标准：

用于计数微核的双核细胞应具备以下特征：

(1)细胞有两个核；

(2)BNC中的两个核具有完整的核膜，并位于同一个细胞质范围内；

(3)BNC中的两个核大小、染色模式和深度应大概一致；

(4)BNC中的两个主核可以接触，但一般不应相互重叠，如果BNC中的两个核相互重叠，但可以清晰地判断边界，也可以计入；

(5)BNC具有完整的细胞膜，能与临近的细胞区分边界。

双核细胞中微核的计数标准：

MN在形态上与主核相似但是比主核小，他们具有以下特征：

(1)人类淋巴细胞中的MN直径通常是主核平均直径的1/16到1/3，相当于BNC的1/256到1/9；

(2)MN是没有折射的，因此它们能与染料颗粒区别开来；

(3)MN与主核是不连接的；

(4)MN可能与主核接触，但不重叠，微核的边界应与主核边界能清晰区分；

(5)MN通常与主核的染色深度一致，但偶尔也会比主核深。

双核细胞中核质桥的计数标准：

计数的NPB应具备下特征：

(1)NPB的宽度可能变化比较大，但一般不超过所在细胞主核的1/4；

(2)NPB应与主核的染色深度一致；

(3)少数情况下，一个BNC中会出现多个NPB；

(4)一个含有NPB的BNC可能还有一个或多个MN。

双核细胞中核芽的计数标准：

计数的NBud应具备以下特征：

(1)NBud在外形上与MN一致，但其有一个细小的桥与主核相连；

(2)NBud通常与MN的染色深度一致；

(3)偶尔的，NBud会出在一个空泡里，并与主核相邻；

9.胞质阻断基因组损伤测评分析：

通过计数，对个体淋巴细胞中的微核MN、核质桥NPB以及核芽NBud的出现频率进行测评为基础，结合个体的血清生化指标及相关遗传多态性、饮食和生活方式、年龄及其健康史，进行微营养素和生活方式的干预，达到降低基因组的损伤，减少遗传-环境相关疾病风险的目标。

本发明的有益效果是：

1.现有技术多为检测疾病的风险基因，个体携带某些与疾病相关的基因患病风险便会增加，但通过检测只是让个体有知情权，并不能作出改变，而本发明在了解个体遗传损伤状况的基础上，可以通过营养干预和调整饮食和生活方式，使遗传损伤较高的个体得到校正，改善其基因组的稳定性，同时降低相关疾病的患病风险；

2.本发明的胞质阻断基因组损伤分析(cytokinesis-block genomic damage assay，CBGD)是一种可同时评价基因组损伤、细胞周期停滞、细胞死亡的综合试验体系，包括染色体断裂、DNA错配修复、染色体丢失、染色体不分离、坏死、凋亡以及细胞淤积，它比单纯的微核分析更加全面、系统。

附图说明

图1CBGD分析中各指标显微图。

具体实施方式

下面通过实例对本发明做进一步详细说明，这些实例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1

1.取血：用抗凝管(肝素或EDTA)通过静脉穿刺取外周血4ml用于淋巴细胞的分离；

2.淋巴细胞培养基配置：20ml的RPMI1640培养基中含有10％2ml胎牛血清FBS，200μl浓度为200mM的L-谷氨酰胺L-Glu和200μl浓度为100mM的丙酮酸盐，将配制好的培养基放入一个无菌的组织培养级的玻璃或者塑料瓶中，按培养的要求准备少量的培养基，培养基可以在4℃储存一个星期，超过一周的培养基不能再继续使用，需重新配置；

3.淋巴细胞的分离和计数(约需要3小时)：

S1、将全血与Hank's平衡盐溶液HBSS以1：1的比例稀释，温度为20℃，并轻轻地颠倒混匀；

S2、轻轻地将稀释的血液铺在淋巴细胞分离液表面上，淋巴细胞分离液：稀释血液的比值为1:3，小心不要破坏分离界面；

S3、称量使离心管平衡，于18℃以400g离心30分钟；

S4、淋巴细胞层位于淋巴细胞分离液与稀释的血浆的界面之间，用无菌并带塞的巴斯德移液管收集淋巴细胞层放入一个新管中，注意不要收集到太多的淋巴细胞分离液；

S5、得到的淋巴细胞悬浮液为淋巴细胞和单核细胞的混合物，加入其体积3倍的HBSS，于室温20℃时轻轻混匀，180g离心10分钟；

S6、弃上清，用巴斯德移液管加入2ml HBSS，重新悬浮呈淡米色细胞球状面，于18℃以100g离心10分钟；

S7、弃上清，于室温加入200μl培养基，轻轻悬浮细胞；

S8、用血球计数板进行细胞计数；

4.淋巴细胞培养(约需要44h)：

S9、调整细胞数量，使其达到在培养基中细胞数为1×10⁶/ml，根据每ml的细胞数把细胞悬液分开，根据细胞数确定培养体积，最大体积不超过750μl；

S10、加植物细胞凝集素PHA刺激淋巴细胞分裂，加20μl质量浓度为2.25mg/ml的PHA溶液到750μl的培养液中，若细胞数量较少可以适当的提高PHA的量；

S11、剩的体积补培养基，重悬浮细胞，使细胞混匀；

S12、细胞在37℃温育，盖子扎松，在湿润并含有5％CO₂的环境中培养44h以上，细胞松弛素B(CB)必须在加入PHA44小时以后加入；

S13、第二天观察细胞管，正常情况下细胞已经开始生长，出现小颗粒，培养基变黄，第一天培养体积少的可以根据生长状况补一定的培养基，通常补到终体积为800μl；

5.加CB到培养基中(约需要28h)：

S14、解冻装有100μl CB溶液的储备液，CB溶解在二甲亚砜DMSO的浓度为600μg/ml；

S15、将置于室温的900μl培养基无菌加入CB储备瓶中，即得质量浓度为60μg/ml的CB溶液1000μl；

S16、从步骤S13制备的800μl培养物的顶层取出60μl培养基，加入60μl质量浓度60μg/ml的CB溶液，使CB的终浓度为4.5μg/ml；

S17、将培养物重新放入培养箱中继续培养28小时；

6.通过细胞离心收集细胞(约需要30分钟)

S18、准备一个细胞浓度，使其足以在每个点都能产生单层细胞，淋巴细胞是在圆底试管中进行培养，由于细胞易于沉于培养瓶底部，则只须根据细胞浓度丢弃一定量的表面培养物质，如：从培养物中约取出400μl，剩下400μl，加7.5％的DMSO 30μl，处理8min；

S19、迅速将80μl细胞悬浮液加入到每个离心杯的孔中，根据培养物中的细胞浓度和用于涂片的最佳细胞密度，这些都取决于试验和误差，所需的量可能还需要做轻微调整；

S20、重新放置转子上的盖子，按压中间的按钮以锁定，放置细胞离心机中的转子并使主要的盖子闭锁发出喀哒声，按照厂家的推荐设置时间和速度参数进行涂片；

7.细胞的干燥、固定和染色及片子的准备(约需要30分钟)：

S21、拆除每个片子固定器，小心不要抹掉片子上的斑点，将滤纸丢进生物危害箱内，将离心杯用纯净水仔细清洗6次，自然风干，不要直接加热使杯子干燥；

S22、将片子水平地放在片子盘中，使细胞在室温下风干10分钟，片子风干的时间不要超过10分钟，否则细胞和核的形态改变将难以对片子进行计数；

S23、按照3:1的比例配置甲醇：冰醋酸固定液，固定10min，自然风干过夜；

S24、吉姆萨母液用pH为7.4、浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲液按1：10稀释(通常取3ml的母液加30ml的磷酸缓冲液)配置成工作液，染色5min，蒸馏水水洗，干燥，要是颜色不深可以复染；

S25、用二甲苯透明处理5min，中性树脂封片；

8.计数：是在100×光学显微镜下，计数由CB诱导的1000个BNC中MN、NPB、NBud的数目，若一个BNC中出现多个遗传损伤指标应按出现个数计数，至少2人重复计数后误差在30％以内数据可用，每个个体各指标的频率以千分率计算(如：MN/1000BN)。

双核细胞计数标准：

用于计数微核的双核细胞应具备以下特征：

(1)细胞有两个核；

(2)BNC中的两个核具有完整的核膜，并位于同一个细胞质范围内；

(3)BNC中的两个核大小、染色模式和深度应大概一致；

(4)BNC中的两个主核可以接触，但一般不应相互重叠，如果BNC中的两个核相互重叠，但可以清晰地判断边界，也可以计入；

(5)BNC具有完整的细胞膜，能与临近的细胞区分边界。

双核细胞中微核的计数标准：

MN在形态上与主核相似但是比主核小，他们具有以下特征：

(1)人类淋巴细胞中的MN直径通常是主核平均直径的1/16到1/3，相当于BNC的1/256到1/9；

(2)MN是没有折射的，因此它们能与染料颗粒区别开来；

(3)MN与主核是不连接的；

(4)MN可能与主核接触，但不重叠，微核的边界应与主核边界能清晰区分；

(5)MN通常与主核的染色深度一致，但偶尔也会比主核深。

双核细胞中核质桥的计数标准：

计数的NPB应具备下特征：

(1)NPB的宽度可能变化比较大，但一般不超过所在细胞主核的1/4；

(2)NPB应与主核的染色深度一致；

(3)少数情况下，一个BNC中会出现多个NPB；

(4)一个含有NPB的BNC可能还有一个或多个MN。

双核细胞中核芽的计数标准：

计数的NBud应具备以下特征：

(1)NBud在外形上与MN一致，但其有一个细小的桥与主核相连；

(2)NBud通常与MN的染色深度一致；

(3)偶尔的，NBud会出在一个空泡里，并与主核相邻；

9.胞质阻断基因组损伤测评分析：

通过计数，对个体淋巴细胞中的微核MN、核质桥NPB以及核芽NBud的出现频率进行测评为基础，结合个体的血清生化指标及相关遗传多态性、饮食和生活方式、年龄及其健康史，进行微营养素和生活方式的干预，达到降低基因组的损伤，减少遗传-环境相关疾病风险的目标。

实施例2

1.取血：用抗凝管(肝素或EDTA)通过静脉穿刺取外周血4ml用于淋巴细胞的分离；

2.淋巴细胞培养基配置：在20ml的RPMI1640培养基中加入2ml 10％胎牛血清FBS，200μl浓度为200mM的L-谷氨酰胺L-Glu和200μl浓度为100mM的丙酮酸盐，将配制好的培养基放入一个无菌的组织培养级的玻璃或者塑料瓶中，按培养的要求准备少量的培养基，培养基可以在4℃储存一个星期，超过一周的培养基不能再继续使用，需重新配置；

3.淋巴细胞的分离和计数(约需要3小时)：

S1、将全血与Hank's平衡盐溶液HBSS以1：1的比例稀释，温度为22℃，并轻轻地颠倒混匀；

S2、轻轻地将稀释的血液铺在淋巴细胞分离液表面上，淋巴细胞分离液：稀释血液的比值为1:3，小心不要破坏分离界面；

S3、称量使离心管平衡，于20℃以400g离心30分钟；

S4、淋巴细胞层位于淋巴细胞分离液与稀释的血浆的界面之间，用无菌并带塞的巴斯德移液管收集淋巴细胞层放入一个新管中，注意不要收集到太多的淋巴细胞分离液；

S5、得到的淋巴细胞悬浮液为淋巴细胞和单核细胞的混合物，加入其体积3倍的HBSS，于室温22℃时轻轻混匀，180g离心10分钟；

S6、弃上清，用巴斯德移液管加入2ml HBSS，重新悬浮呈淡米色细胞球状面，于20℃以100g离心10分钟；

S7、弃上清，于室温加入200μl培养基，轻轻悬浮细胞；

S8、用血球计数板进行细胞计数；

4.淋巴细胞培养(约需要44h)：

S9、调整细胞数量，使其达到在培养基中细胞数为1×10⁶/ml，根据每ml的细胞数把细胞悬液分开，根据细胞数确定培养体积，最大体积不超过750μl；

S10、加植物细胞凝集素PHA刺激淋巴细胞分裂，加20μl质量浓度为2.25mg/ml的PHA溶液到750μl的培养液中，若细胞数量较少可以适当的提高PHA的量；

S11、剩的体积补培养基，重悬浮细胞，使细胞混匀；

S12、细胞在37℃温育，盖子扎松，在湿润并含有5％CO₂的环境中培养44h以上，细胞松弛素B(CB)必须在加入PHA44小时以后加入；

S13、第二天观察细胞管，正常情况下细胞已经开始生长，出现小颗粒，培养基变黄，第一天培养体积少的可以根据生长状况补一定的培养基，通常补到终体积为800μl；

5.加CB到培养基中(约需要28h)：

S14、解冻装有100μl CB溶液的储备液，CB溶解在二甲亚砜DMSO的浓度为600μg/ml；

S15、将置于室温的900μl培养基无菌加入CB储备瓶中，即得质量浓度为60μg/ml的CB溶液1000μl；

S16、从步骤S13制备的800μl培养物的顶层取出60μl培养基，加入60μl质量浓度60μg/ml的CB溶液，使CB的终浓度为4.5μg/ml；

S17、将培养物重新放入培养箱中继续培养28小时；

6.通过细胞离心收集细胞(约需要30分钟)

S18、准备一个细胞浓度，使其足以在每个点都能产生单层细胞，淋巴细胞是在圆底试管中进行培养，由于细胞易于沉于培养瓶底部，则只须根据细胞浓度丢弃一定量的表面培养物质，如：从培养物中约取出400μl，剩下400μl，加7.5％的DMSO 30μl，处理10min；

S19、迅速将80μl细胞悬浮液加入到每个离心杯的孔中，根据培养物中的细胞浓度和用于涂片的最佳细胞密度，这些都取决于试验和误差，所需的量可能还需要做轻微调整；

S20、重新放置转子上的盖子，按压中间的按钮以锁定，放置细胞离心机中的转子并使主要的盖子闭锁发出喀哒声，按照厂家的推荐设置时间和速度参数进行涂片；

7.细胞的干燥、固定和染色及片子的准备(约需要30分钟)：

S21、拆除每个片子固定器，小心不要抹掉片子上的斑点，将滤纸丢进生物危害箱内，将离心杯用纯净水仔细清洗6次，自然风干，不要直接加热使杯子干燥；

S22、将片子水平地放在片子盘中，使细胞在室温下风干10分钟，片子风干的时间不要超过10分钟，否则细胞和核的形态改变将难以对片子进行计数；

S23、按照3:1的比例配置甲醇：冰醋酸固定液，固定10min，自然风干过夜；

S24、吉姆萨母液用pH为7.4、浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲液按1：10稀释(通常取3ml的母液加30ml的磷酸缓冲液)，染色5min，蒸馏水水洗，干燥，要是颜色不深可以复染；

S25、用二甲苯透明处理5min，中性树脂封片；

8.计数：是在100×光学显微镜下，计数由CB诱导的1000个BNC中MN、NPB、NBud的数目，若一个BNC中出现多个遗传损伤指标应按出现个数计数，至少2人重复计数后误差在30％以内数据可用，每个个体各指标的频率以千分率计算(如：MN/1000BN)。

双核细胞计数标准：

用于计数微核的双核细胞应具备以下特征：

(1)细胞有两个核；

(2)BNC中的两个核具有完整的核膜，并位于同一个细胞质范围内；

(3)BNC中的两个核大小、染色模式和深度应大概一致；

(4)BNC中的两个主核可以接触，但一般不应相互重叠，如果BNC中的两个核相互重叠，但可以清晰地判断边界，也可以计入；

(5)BNC具有完整的细胞膜，能与临近的细胞区分边界。

双核细胞中微核的计数标准：

MN在形态上与主核相似但是比主核小，他们具有以下特征：

(1)人类淋巴细胞中的MN直径通常是主核平均直径的1/16到1/3，相当于BNC的1/256到1/9；

(2)MN是没有折射的，因此它们能与染料颗粒区别开来；

(3)MN与主核是不连接的；

(4)MN可能与主核接触，但不重叠，微核的边界应与主核边界能清晰区分；

(5)MN通常与主核的染色深度一致，但偶尔也会比主核深。

双核细胞中核质桥的计数标准：

计数的NPB应具备下特征：

(1)NPB的宽度可能变化比较大，但一般不超过所在细胞主核的1/4；

(2)NPB应与主核的染色深度一致；

(3)少数情况下，一个BNC中会出现多个NPB；

(4)一个含有NPB的BNC可能还有一个或多个MN。

双核细胞中核芽的计数标准：

计数的NBud应具备以下特征：

(1)NBud在外形上与MN一致，但其有一个细小的桥与主核相连；

(2)NBud通常与MN的染色深度一致；

(3)偶尔的，NBud会出在一个空泡里，并与主核相邻；

9.胞质阻断基因组损伤测评分析：

通过计数，对个体淋巴细胞中的微核MN、核质桥NPB以及核芽NBud的出现频率进行测评为基础，结合个体的血清生化指标及相关遗传多态性、饮食和生活方式、年龄及其健康史，进行微营养素和生活方式的干预，达到降低基因组的损伤，减少遗传-环境相关疾病风险的目标。

实施例3

1.取血：用抗凝管(肝素或EDTA)通过静脉穿刺取外周血4ml用于淋巴细胞的分离；

2.淋巴细胞培养基配置：在20ml的RPMI1640培养基中加入2ml 10％胎牛血清FBS，200μl浓度为200mM的L-谷氨酰胺L-Glu和200μl浓度为100mM的丙酮酸盐，将配制好的培养基放入一个无菌的组织培养级的玻璃或者塑料瓶中，按培养的要求准备少量的培养基，培养基可以在4℃储存一个星期，超过一周的培养基不能再继续使用，需重新配置；

3.淋巴细胞的分离和计数(约需要3小时)：

S1、将全血与Hank's平衡盐溶液HBSS以1：1的比例稀释，温度为21℃，并轻轻地颠倒混匀；

S2、轻轻地将稀释的血液铺在淋巴细胞分离液表面上，淋巴细胞分离液：稀释血液的比值为1:3，小心不要破坏分离界面；

S3、称量使离心管平衡，于19℃以400g离心30分钟；

S4、淋巴细胞层位于淋巴细胞分离液与稀释的血浆的界面之间，用无菌并带塞的巴斯德移液管收集淋巴细胞层放入一个新管中，注意不要收集到太多的淋巴细胞分离液；

S5、稀释淋巴细胞悬浮液，为淋巴细胞和单核细胞的混合物，加入其体积3倍的HBSS，于室温21℃时轻轻混匀，180g离心10分钟；

S6、弃上清，用巴斯德移液管加入2ml HBSS，重新悬浮呈淡米色细胞球状面，于19℃以100g离心10分钟；

S7、弃上清，于室温加入200μl培养基，轻轻悬浮细胞；

S8、用血球计数板进行细胞计数；

4.淋巴细胞培养(约需要44h)：

S9、调整细胞数量，使其达到在培养基中细胞数为1×10⁶/ml，根据每ml的细胞数把细胞悬液分开，根据细胞数确定培养体积，最大体积不超过750μl；

S10、加植物细胞凝集素PHA刺激淋巴细胞分裂，加20μl质量浓度为2.25mg/ml的PHA溶液到750μl的培养液中，若细胞数量较少可以适当的提高PHA的量；

S11、剩的体积补培养基，重悬浮细胞，使细胞混匀；

S12、细胞在37℃温育，盖子扎松，在湿润并含有5％CO₂的环境中培养44h以上，细胞松弛素B(CB)必须在加入PHA44小时以后加入；

S13、第二天观察细胞管，正常情况下细胞已经开始生长，出现小颗粒，培养基变黄，第一天培养体积少的可以根据生长状况补一定的培养基，通常补到终体积为800μl；

5.加CB到培养基中(约需要28h)：

S14、解冻装有100μl CB溶液的储备液，CB溶解在二甲亚砜DMSO的浓度为600μg/ml；

S15、将置于室温的900μl培养基无菌加入CB储备瓶中，即得质量浓度为60μg/ml的CB溶液1000μl；

S16、从步骤S13制备的800μl培养物的顶层取出60μl培养基，加入60μl质量浓度60μg/ml的CB溶液，使CB的终浓度为4.5μg/ml；

S17、将培养物重新放入培养箱中继续培养28小时；

6.通过细胞离心收集细胞(约需要30分钟)

S18、准备一个细胞浓度，使其足以在每个点都能产生单层细胞，淋巴细胞是在圆底试管中进行培养，由于细胞易于沉于培养瓶底部，则只须根据细胞浓度丢弃一定量的表面培养物质，如：从培养物中约取出400μl，剩下400μl，加7.5％的DMSO 30μl，处理9min；

S19、迅速将80μl细胞悬浮液加入到每个离心杯的孔中，根据培养物中的细胞浓度和用于涂片的最佳细胞密度，这些都取决于试验和误差，所需的量可能还需要做轻微调整；

S20、重新放置转子上的盖子，按压中间的按钮以锁定，放置细胞离心机中的转子并使主要的盖子闭锁发出喀哒声，按照厂家的推荐设置时间和速度参数进行涂片；

7.细胞的干燥、固定和染色及片子的准备(约需要30分钟)：

S21、拆除每个片子固定器，小心不要抹掉片子上的斑点，将滤纸丢进生物危害箱内，将离心杯用纯净水仔细清洗6次，自然风干，不要直接加热使杯子干燥；

S22、将片子水平地放在片子盘中，使细胞在室温下风干10分钟，片子风干的时间不要超过10分钟，否则细胞和核的形态改变将难以对片子进行计数；

S23、按照3:1的比例配置甲醇：冰醋酸固定液，固定10min，自然风干过夜；

S24、吉姆萨母液用pH为7.4、浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲液按1：10稀释(通常取3ml的母液加30ml的磷酸缓冲液)，染色5min，蒸馏水水洗，干燥，要是颜色不深可以复染；

S25、用二甲苯透明处理5min，中性树脂封片；

8.计数：是在100×光学显微镜下，计数由CB诱导的1000个BNC中MN、NPB、NBud的数目，若一个BNC中出现多个遗传损伤指标应按出现个数计数，至少2人重复计数后误差在30％以内数据可用，每个个体各指标的频率以千分率计算(如：MN/1000BN)。

双核细胞计数标准：

用于计数微核的双核细胞应具备以下特征：

(1)细胞有两个核；

(2)BNC中的两个核具有完整的核膜，并位于同一个细胞质范围内；

(3)BNC中的两个核大小、染色模式和深度应大概一致；

(4)BNC中的两个主核可以接触，但一般不应相互重叠，如果BNC中的两个核相互重叠，但可以清晰地判断边界，也可以计入；

(5)BNC具有完整的细胞膜，能与临近的细胞区分边界。

双核细胞中微核的计数标准：

MN在形态上与主核相似但是比主核小，他们具有以下特征：

(1)人类淋巴细胞中的MN直径通常是主核平均直径的1/16到1/3，相当于BNC的1/256到1/9；

(2)MN是没有折射的，因此它们能与染料颗粒区别开来；

(3)MN与主核是不连接的；

(4)MN可能与主核接触，但不重叠，微核的边界应与主核边界能清晰区分；

(5)MN通常与主核的染色深度一致，但偶尔也会比主核深。

双核细胞中核质桥的计数标准：

计数的NPB应具备下特征：

(1)NPB的宽度可能变化比较大，但一般不超过所在细胞主核的1/4；

(2)NPB应与主核的染色深度一致；

(3)少数情况下，一个BNC中会出现多个NPB；

(4)一个含有NPB的BNC可能还有一个或多个MN。

双核细胞中核芽的计数标准：

计数的NBud应具备以下特征：

(1)NBud在外形上与MN一致，但其有一个细小的桥与主核相连；

(2)NBud通常与MN的染色深度一致；

(3)偶尔的，NBud会出在一个空泡里，并与主核相邻；

9.胞质阻断基因组损伤测评分析：

通过计数，对个体淋巴细胞中的微核MN、核质桥NPB以及核芽NBud的出现频率进行测评为基础，结合个体的血清生化指标及相关遗传多态性、饮食和生活方式、年龄及其健康史，进行微营养素和生活方式的干预，达到降低基因组的损伤，减少遗传-环境相关疾病风险的目标。

实施例4

人类基因组的损伤水平还可以通过口腔黏膜上皮细胞取材，同样通过细胞制片后计数完好的基底细胞和分化细胞中的MN和NBud频率，来判定个体的遗传损伤状况。但口腔上皮细胞代谢较快，7-21天就重新代谢更新，计数的各指标频率只能代表近期个体的损伤状况，同时，口腔上皮细胞遗传损伤频率受日常饮食的影响，而淋巴细胞中的遗传损伤频率相对比较稳定，能更好地反映个体遗传物质的损伤情况。

Claims (5)

1.一种人外周血淋巴细胞基因组损伤的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)取血：用抗凝管通过静脉穿刺取外周血用于淋巴细胞的分离；

(2)淋巴细胞培养基配置：20ml的RPMI1640培养基中含有10％2ml胎牛血清FBS，200μl浓度为200mM的L-谷氨酰胺L-Glu和200μl浓度为100mM的丙酮酸盐，将配制好的培养基放入一个无菌的组织培养级的玻璃或者塑料瓶中，4℃储存一个星期；

(3)淋巴细胞的分离和计数：

S1将全血与Hank's平衡盐溶液HBSS以1：1的比例稀释，温度为20～22℃，并轻轻地颠倒混匀；

S2轻轻地将稀释的血液铺在淋巴细胞分离液表面上，淋巴细胞分离液：稀释血液的比值为1:3；

S3称量使离心管平衡，于18～20℃以400g离心30分钟；

S4用无菌并带塞的巴斯德移液管收集淋巴细胞层放入一个新管中，注意不要收集到太多的淋巴细胞分离液，得到淋巴细胞和单核细胞混合的淋巴细胞悬浮液；

S5加入淋巴细胞悬浮液体积3倍的HBSS，于室温20～22℃时轻轻混匀，180g离心10分钟；

S6弃上清，用巴斯德移液管加入2ml的HBSS，重新悬浮呈淡米色的细胞球状面，于18～20℃以100g离心10分钟；

S7弃上清，于室温加入200μl培养基，轻轻悬浮细胞；

S8用血球计数板进行细胞计数；

(4)淋巴细胞培养：

S9调整细胞数量，使其达到在培养基中细胞数为1×10⁶/ml，根据每ml的细胞数把细胞悬液分开，根据细胞数确定培养体积，最大体积不超过750μl；

S10加植物细胞凝集素PHA刺激淋巴细胞分裂，加20μl质量浓度为2.25mg/ml的PHA溶液到750μl的培养液中；

S11补培养基，重悬浮细胞，使细胞混匀；

S12细胞在37℃温育，盖子扎松，在湿润并含有5％CO₂的环境中培养44h以上；

S13第二天观察细胞管，细胞开始生长，出现小颗粒，培养基变黄，根据生长状况补一定的培养基，补到终体积为800μl；

(5)加CB到培养基中：

S14解冻装有100μl CB溶液的储备液，CB溶解在二甲亚砜DMSO的浓度为600μg/ml；

S15将置于室温的900μl培养基无菌加入CB储备瓶中，即得质量浓度为60μg/ml的CB溶液1000μl；

S16从步骤S13制备的800μl培养物的顶层取出60μl培养基，加入60μl质量浓度60μg/ml的CB溶液，使CB的终浓度为4.5μg/ml；

S17将培养物重新放入培养箱中继续培养28小时；

(6)通过细胞涂片离心机收集细胞：

S18准备一个细胞浓度，使其足以在每个点都能产生单层细胞，根据细胞浓度从培养物中丢弃一定量的表面培养物质，剩下的加7.5％的DMSO 30μl，处理8～10min；

S19迅速将80μl细胞悬浮液加入到每个离心杯的孔中；

S20放置细胞离心机中的转子进行涂片；

(7)细胞的干燥、固定和染色及片子的准备：

S21拆除每个片子固定器，将离心杯用纯净水仔细清洗6次，自然风干；

S22将片子水平地放在片子盘中，使细胞在室温下风干，风干时间不超过10分钟；

S23按照3:1的比例配置甲醇：冰醋酸固定液，固定10min，自然风干过夜；

S24吉姆萨母液用pH为7.4、浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲液按1:10稀释配置成工作液，染色5min，蒸馏水水洗，干燥，颜色不深可以复染；

S25用二甲苯透明处理5min，中性树脂封片；

(8)计数：

在100×光学显微镜下，计数由CB阻滞的1000个双核细胞BNC中微核MN、核质桥NPB、核芽NBud的数目，一个BNC中出现多个遗传损伤指标应按出现个数计数，至少2人重复计数后误差在30％以内数据可用，每个个体各指标的频率以千分率计算；

(9)胞质阻断基因组损伤测评分析：

通过计数，对个体淋巴细胞中的微核MN、核质桥NPB以及核芽NBud的出现频率进行测评为基础，结合个体的血清生化指标及相关遗传多态性、饮食和生活方式、年龄及其健康史，进行微营养素和生活方式的干预，达到降低基因组的损伤，消减遗传-环境相关疾病风险的目标。

2.根据权利要求1所述一种人外周血淋巴细胞基因组损伤的检测方法，其特征在于：步骤(8)所述双核细胞计数标准：

用于计数微核的双核细胞应具备以下特征：

(1)细胞有两个核；

(2)BNC中的两个核具有完整的核膜，并位于同一个细胞质范围内；

(3)BNC中的两个核大小、染色模式和深度应一致；

(4)BNC中的两个主核可以接触，不相互重叠，BNC中的两个核相互重叠，可清晰地判断边界，也可以计入；

(5)BNC具有完整的细胞膜，能与临近的细胞区分边界。

3.根据权利要求1所述一种人外周血淋巴细胞基因组损伤的检测方法，其特征在于：步骤(8)所述双核细胞中微核的计数标准：

MN在形态上与主核相似但是比主核小，具有以下特征：

(1)人类淋巴细胞中的MN直径通常是主核平均直径的1/16到1/3，相当于BNC的1/256到1/9；

(2)MN是没有折射，因此它们能与染料颗粒区别开来；

(3)MN与主核是不连接的；

(4)MN可与主核接触，但不重叠，微核的边界应与主核边界能清晰区分；

(5)MN通常与主核的染色深度一致。

4.根据权利要求1所述一种人外周血淋巴细胞基因组损伤的检测方法，其特征在于：步骤(8)所述双核细胞中核质桥的计数标准：

计数的NPB应具备下特征：

(1)NPB的宽度不超过所在细胞主核的1/4；

(2)NPB应与主核的染色深度一致。

5.根据权利要求1所述一种人外周血淋巴细胞基因组损伤的检测方法，其特征在于：步骤(8)所述双核细胞中核芽的计数标准：

计数的NBud应具备以下特征：

(1)NBud在外形上与MN一致，但其有一个细小的桥与主核相连；

(2)NBud与MN的染色深度一致。