CN103276092A

CN103276092A - 淡水四大家鱼分子鉴定的方法

Info

Publication number: CN103276092A
Application number: CN2013102249870A
Authority: CN
Inventors: 汪登强; 程晓凤; 陈大庆; 刘绍平; 段辛斌; 王珂; 刘明典
Original assignee: Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2013-06-07
Filing date: 2013-06-07
Publication date: 2013-09-04

Abstract

淡水四大家鱼分子鉴定的方法，该方法包括以下步骤：（1）基因组DNA提取；（2）PCR扩增；（3）PCR反应：反应程序94℃预变性5min,然后94℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸1min，共进行30个循环，循环结束后72℃再延伸8min；（4）电泳检测：PCR结束后，取2~5μL溶液在1%琼脂糖凝胶上电泳，观察照相；（5）结果判断。本发明操作简单、判断准确、费用低。

Description

淡水四大家鱼分子鉴定的方法

技术领域

本发明涉及水产科学领域，特别涉及到鱼类鉴定方法。

背景技术

青鱼 (Mylopharyngodon piceus)、草鱼 (Ctenopharyngodon idellus) 鲢 (Hypophthalmichthys molitrix)、鳙 (Aristichthys nobilis)隶属于鲤形目、鲤科，是中国传统淡水养殖的“四大家鱼”，原产于长江、珠江和黑龙江流域，现全国各地均有养殖，并被全世界70多个国家引进，在部分国家已经形成自然种群。近年来, 由于长江水系自然环境的剧烈变化，四大家鱼野生群体的资源受到严重干扰。为了快速评估四大家鱼的遗传多样性和资源现状，以制定科学的渔业管理措施，有必要建立一种快速、准确的鉴定四大家鱼物种的方法。

目前对四大家鱼的鉴别方法主要有3种：（1）形态法：通过对四大家鱼的外部形态特征进行鉴定，如侧线鳞、鳍条数等。该法简便、经济、直观，适用于成体个体的鉴定，但是并不适用于卵、胚胎和仔稚鱼的鉴定研究，因为四大家鱼的卵、胚胎的形态特征不明显，与其他鱼类，如鳊、铜鱼等十分相似，四大家鱼之间更为相似，而早期发育的仔稚鱼外部特征同样不明显，主要根据身体色素的特征来鉴定，但仔稚鱼的色素在不同的培养环境下是会改变的，并且经乙醇或甲醛固定后会脱水、变形、某些色素会有所消失，在判断时依赖鉴定人的经验和主观意思，准确性和实用性受到一定限制。（2）同工酶法：主要通过聚丙烯酰胺凝胶或淀粉凝胶电泳分析不同种类的同工酶谱系特征（李思发，1990）。同工酶法尽管也能够鉴定种类，但需要新鲜样本，且需要足够量的组织，对于乙醇保存的组织或组织量不足时就无能为力。（3）分子标记法：随机扩增多态性DNA（RAPD）技术是常用于物种鉴定中，如邓怀等（1998）对10种常见淡水鱼类进行RAPD比较，发现每一种鱼都有其独有的特征条带，可以作为区分物种的分子标记，但RAPD标记重复性和稳定性较差。（4）DNA条形码法：利用线粒体DNA序列的差异性判断物种种类（库喜英，2009）。该方法首先通过PCR扩增线粒体DNA特定区域，并进行DNA测序，通过对测序结果与参考序列进行比对，根据序列的相似度来判断种类。此外，国外报道了设计鲢和鳙种类特异引物，通过PCR直接鉴定鲢和鳙的方法（Jerde et al. 2011），但不包括青鱼和草鱼。

发明内容

本发明目的是提供一种利用四大家鱼线粒体DNA序列的特异性，通过PCR技术和琼脂糖凝胶电泳检测对淡水四大家鱼进行物种鉴定的方法，该方法简单、快速、准确。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

淡水四大家鱼分子鉴定的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

（1）引物设计：青鱼引物为MypmitDF：5′TTGCATAAACCAAATATCC3′和MypmitDR：5′TTAGGCCAATATTTTGGGGA 3′；草鱼引物为CtimitDF：5′CACCCCTGGCTCCCAAAGCCA 3′和CtimitDR：5′GATTTTTAGGCTAATATTTGGAA 3′；鲢鱼引物为：HymDR F：5′CATAATGCATTAGTACTAG 3′和HymDR R：5′TGCATGCGGAGTTTCTTAGGAC 3′；鳙鱼引物为：HnomitDF：5′- ACAAATTCCACCCCCGT -3′和HymDR：5′- TGCATGCGGAGTTTCTTAGGAC -3′；

（2）基因组DNA提取：提取DNA，将浓度调整至100-200ng/μL。

（3）PCR扩增：利用引物对DNA溶液扩增，扩增体系为：10×PCR buffer（含Mg²⁺）2.5μL、dNTPs 0.25 mmol/L、引物各20 pmol/L、Taq DNA聚合酶1 U、DNA模板10~200 ng，补充灭菌双蒸水至20μL。

（4）PCR反应程序：94℃预变性5 min, 然后94℃变性30 s、62℃退火30 s、72℃延伸1 min，共进行30个循环，循环结束后72℃再延伸8 min。

（5）电泳检测：PCR结束后，取2~5μL溶液在1%琼脂糖凝胶上电泳，电压为10 v/cm，电泳时间约20 min。电泳结束后在紫外灯下观察照相。

（6）结果判断：引物为CtimitDF：5′CACCCCTGGCTCCCAAAGCCA 3′和CtimitDR：5′GATTTTTAGGCTAATATTTGGAA 3′，且出现一条大小约900 bp DNA带的个体为草鱼；引物为MypmitDF：5′TTGCATAAACCAAATATCC3′和MypmitDR：5′TTAGGCCAATATTTTGGGGA 3′，且出现一条大小约750 bp DNA带的个体为青鱼；引物为：HymDR F：5′CATAATGCATTAGTACTAG 3′和HymDR R：5′TGCATGCGGAGTTTCTTAGGAC 3′，且出现一条大小约1000 bp DNA带的个体为鲢鱼；引物为：HnomitDF：5′- ACAAATTCCACCCCCGT -3′和HymDR：5′- TGCATGCGGAGTTTCTTAGGAC -3′，且出现一条大小约700 bp DNA带的个体为鳙鱼。其他种类无扩增产物或无明显目的大小的DNA带。

本发明的优点为：

1）操作简单，普通实验室和一般人员均可操作；

2）快速，从采样到出结果一天即可完成；

3）费用低，由于使用的都是常规分子生物学的试剂和耗材，单样本成本费用十分低廉；

4）判断依据明确、清晰，不掺杂人为主观判断。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明。

1）基因组DNA提取

各取32尾四大家鱼以及相关鱼类（参见表一）的鳍条，每一尾约 0.2 g，用灭菌双蒸水清洗两次，每次15 min。将清洗后的组织放入规格为2 mL的EP管，加入500 μL 的HOM buffer（80 mmol/L EDTA , 100 mmol/L Tris-base , 0.5%SDS，pH8.0）和10 μL 20 mg/mL Proteinase K ，55℃消化约3 h，每隔1 h轻摇混匀消化，至消化完全。加入500μL 4.5 mol/L NaCl溶液和300μL氯仿，充分混合5 min。12000 r/m离心10 min，取上清，加入600 μL 异丙醇(约0.7倍于上清液体积)混匀，并置于冰上30 min。12000 r/m离心10 min，去上清，加入1 mL 4℃预冷的75%乙醇，静置5-20 min。12000 r/m离心10 min，空气干燥后，加50 μL TE（10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, pH8.0）水溶解。

表一

1青鱼Mylopharyngodon piceus	14亮银鮈Squalidus nitens
		2鲢 Hypophthalmichthys molitrix	15长春鳊Parabramis pekinensis
3鳙 Aristichthysnobilis	16鳡Elopichthys bambusa
		4铜鱼Coreius heterodon	17鲫Carassius auratus
5圆筒吻鮈Rhinogobio cylindricus	18赤眼鳟Spualiobarbus Curriculus
		6宜昌鳅鮀Gobiobotia filifer	19似鳊Pseudobrama simoni
7异鳔鳅鮀Xenophysogobio boulengeri	20紫薄鳅Leptobotia taeniaps
		8红鳍原鲌Cultrichthys.sp	21中华沙鳅Botia superciliaris
9吻鮈Rhinogobio typus	22红唇薄鳅Leptobotia rubrilabris
		10翘嘴鲌Culter .sp	23长薄鳅Leptobotia elongata
11白条鱼Hemiculter.sp	24汉水扁尾薄鳅Leptobotia tientaiensis hansuiensis
		12长鳍吻鮈Rhinogobio ventralis	25犁头鳅Lepturichthys fimbriata
13蒙古鲌Culter mongolicus	26 中华金沙鳅Jinshaia sinensis

2) PCR扩增

引物设计：青鱼引物为MypmitDF：5′TTGCATAAACCAAATATCC3′和MypmitDR：5′TTAGGCCAATATTTTGGGGA 3′；草鱼引物为CtimitDF：5′CACCCCTGGCTCCCAAAGCCA 3′和CtimitDR：5′GATTTTTAGGCTAATATTTGGAA 3′；鲢鱼引物为：HymDR F：5′CATAATGCATTAGTACTAG 3′和HymDR R：5′TGCATGCGGAGTTTCTTAGGAC 3′；鳙鱼引物为：HnomitDF：5′- ACAAATTCCACCCCCGT -3′和HymDR：5′- TGCATGCGGAGTTTCTTAGGAC -3′；

利用上述四大家鱼引物对样本基因组DNA进行PCR扩增，扩增体系为25 μL，包括10×PCR buffer（含Mg²⁺）2.5μL、dNTPs 0.25 mmol/L、引物各20 pmol/L、Taq DNA聚合酶1 U、DNA模板1μL（约10~200 ng），补充灭菌双蒸水至20μL。

3）PCR反应：PCR扩增条件为94℃预变性5 min, 然后94℃变性30 s、62℃退火30 s、72℃延伸1 min，共进行30个循环，循环结束后72℃再延伸8 min。

4）电泳检测

采用1×TAE缓冲液（0.04mol/L Tris-乙酸，2 mmol/L EDTA, pH8.5）配制1%琼脂糖凝胶，凝胶中加入终浓度约为0.5μg/ml的溴化乙锭（EB）。取3μL PCR产物与1μL Loading Buffer混合，加入点样孔， 10 v/cm电泳20 min。电泳结束后，将凝胶放在紫外灯下观察，照相。

5）结果判断：引物为CtimitDF：5′CACCCCTGGCTCCCAAAGCCA 3′和CtimitDR：5′GATTTTTAGGCTAATATTTGGAA 3′，且出现一条大小约900 bp DNA带的个体为草鱼；引物为MypmitDF：5′TTGCATAAACCAAATATCC3′和MypmitDR：5′TTAGGCCAATATTTTGGGGA 3′，且出现一条大小约750 bp DNA带的个体为青鱼；引物为：HymDR F：5′CATAATGCATTAGTACTAG 3′和HymDR R：5′TGCATGCGGAGTTTCTTAGGAC 3′，且出现一条大小约1000 bp DNA带的个体为鲢鱼；引物为：HnomitDF：5′- ACAAATTCCACCCCCGT -3′和HymDR：5′- TGCATGCGGAGTTTCTTAGGAC -3′，且出现一条大小约700 bp DNA带的个体为鳙鱼。其他种类无扩增产物或无明显目的大小的DNA带，与标记结果相符。

Claims

1.淡水四大家鱼分子鉴定的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：（1）基因组DNA提取：提取DNA备用；

（2）PCR扩增：利用引物对DNA溶液扩增，扩增体系为：10×PCR buffer（含Mg²⁺）2.5μL、dNTPs 0.25 mmol/L、引物各20 pmol/L、Taq DNA聚合酶1 U、DNA模板10~200 ng，补充灭菌双蒸水至20μL；

（3）PCR反应：反应程序94℃预变性5 min, 然后94℃变性30 s、62℃退火30 s、72℃延伸1 min，共进行30个循环，循环结束后72℃再延伸8 min；

（4）电泳检测：PCR结束后，取2~5μL溶液在1%琼脂糖凝胶上电泳，观察照相；

（5）结果判断：结合四大家鱼的引物，出现一条大小约900 bp DNA带的且与引物相对应的即为草鱼；出现一条大小约750 bp DNA带的且与引物相对应的即为青鱼；出现一条大小约1000 bp DNA带的且与引物相对应的即为鲢；出现一条大小约700 bp DNA带的且与引物相对应的即为鳙，其他种类无扩增产物或无明显目的 DNA带。

2.根据权利要求1所述的淡水四大家鱼分子鉴定的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的引物分别为：青鱼引物为MypmitDF：5′TTGCATAAACCAAATATCC3′和MypmitDR：5′TTAGGCCAATATTTTGGGGA 3′；草鱼引物为CtimitDF：5′CACCCCTGGCTCCCAAAGCCA 3′和CtimitDR：5′GATTTTTAGGCTAATATTTGGAA 3′；鲢鱼引物为：HymDR F：5′CATAATGCATTAGTACTAG 3′和HymDR R：5′TGCATGCGGAGTTTCTTAGGAC 3′；鳙鱼引物为：HnomitDF：5′- ACAAATTCCACCCCCGT -3′和HymDR：5′- TGCATGCGGAGTTTCTTAGGAC -3′。