BR112015001587B1 - Método de ensaio de pcr para determinação da zigosidade de um gene rf4 em uma planta de milho - Google Patents

Abstract

MÉTODO DE ENSAIO DE PCR PARA DETERMINAR A ZIGOSIDADE DE ESTÁGIO FINAL DO GENE RF4 NO MILHO, E KIT DE DETECÇÃO DO DNA. Um método é fornecido para determinar a zigosidade de um gene RF4 em uma planta de milho. Um método pode incluir a execução de um primeiro ensaio de PCR, um segundo ensaio de PCR, sondas de quantificação utilizadas no primeiro e segundo ensaios de PCR, e comparar as sondas quantificadas para determinar a zigosidade.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

[0001] O presente pedido reivindica prioridade sob 35 U.S.C. § 119(e) para o Pedido Provisório U.S. No. de Série 61/674.556, depositado em 23 de julho de 2012, o qual é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DO MATERIAL ELETRONICAMENTE SUBMETIDO

[0002] Incorporada por ref na sua totalidade está uma listagem de sequências de leitura por computador apresentada simultaneamente em anexo e identificada como se segue: um arquivo de 28.831 bytes ASCII (texto) com o nome "6257-225989_SL.txt", criado em 23 de julho de 2013.

ANTECEDENTES

[0003] A esterilidade masculina citoplasmática (CMS) é uma incapacidade herdada maternalmente para produzir pólen funcional e tem sido utilizada com sucesso na produção comercial de sementes híbridas, evitando as desvatagens da mão ou emasculação mecânica (Kaul, 1988). Criadores produzem sementes híbridas utilizando um sistema de CMS através do desenvolvimento de linhagens femininas que carregam o citoplasma de CMS, mas carecem de genes restauradores e através do desenvolvendo de linhagens masculinas que carregam os genes restauradores apropriados. A semente híbrida F1 produzida pela linhagem feminina carrega o citoplasma de CMS, mas produz plantas férteis por causa da ação dos genes restauradores nucleares paternalmente contribuídas.

[0004] Mais de 40 fontes de CMS foram observadas no milho e foram classificadas em três grupos principais através de reações de restauração da fertilidade diferenciais. Estes grupos são designados como CMS-T (Texas), CMS-S (USDA) e CMS-C (Charrua) (Beckett, 1971). No grupo de CMS-T, dois genes dominantes, Rf1 e Rf2, localizados nos cromossomos 3 e 9, respectivamente, são requeridos para a restauração da fertilidade do pólen (Duvick 1965). O citoplasma S é restaurado por um único gene, Rf3 no cromossoma 2 (Laughnan and Gabay 1978).

[0005] Os genes Rf foram clonados ou mapeados ema altas resoluções de várias espécies de planta, por exemplo, Rf2 de milho (Zea mays) (Cui et al., 1996), Rf-PPR592 de petúnia (Petunia hybrida) (Bentolila et al., 2002), Rfo de rabanete (Raphanus sativus) (Brown et al., 2003;. Desloire et al., 2003; Koizuka et al., 2003), e Rf1 Rf2 de sorgo (Sorghum bicolor) (Klein et al., 2005), Rf1a e Rf1b de arroz (Oryza sativa) para CMS do tipo BT (Kazama and Toriyama, 2003; Akagi et al., 2004;. Komori et al., 2004; Wang et al., 2006), Rf17 (RMS) do arroz (Oryza sativa) para CMS tipo CW (Fujii & Toriyama, 2009), Rf1 & Rf2 de flor macaco (Mimulus guttatus) (Barr & Fishman, 2010). Rf4 para CMS tipo C de milho foi recentemente clonado.

SUMÁRIO

[0006] Aqui divulgado inclui métodos e reagentes para a detecção e quantificação da zigosidade do gene Rf4 nas plantas. Os métodos podem empregar e os reagentes podem incluir iniciadores e sondas de oligonucleotídeo configuradas por um ensaio multiplex de PCR quantitativa (qPCR) em tempo real.

[0007] Em uma modalidade, o presente método pode detectar e quantificar a zigosidade do gene Rf4 nas plantas de milho em uma única reação. O método pode empregar iniciadores e sondas de oligonucleotídeo que são específicos e podem distinguir entre alelos de Rf4.

[0008] Em uma modalidade, um método para a determinação da zigosidade de um gene Rf4 em uma planta de milho inclui: a) executar um primeiro ensaio de PCR utilizando uma primeira sonda, um primeiro iniciador direto, e um primeiro iniciador reverso em uma amostra de polinucleotídeo de uma planta de milho; b) executar um segundo ensaio de PCR utilizando uma segunda sonda, um segundo iniciador direto, e um segundo iniciador reverso na amostra de polinucleotídeo de uma planta de milho; c) quantificar as primeira e segunda sondas; e d) comparar as primeira e segunda sondas quantificadas para determinar a zigosidade. Em uma modalidade, as sondas são detectavelmente rotuladas. Em uma modalidade, os iniciadores e as sondas são específicos para o gene Rf4 em uma planta de milho. Em uma modalidade, um iniciador direto específico para o gene Rf4 compreende a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 15. Em uma modalidade, um iniciador reverso específico para o gene Rf4 compreende a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 18. Em uma modalidade, uma sonda específica para o gene Rf4 compreende a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 17.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0009] Fig. 1A. Gráficos de amplificação da PCR em tempo real com a unidade de fluorescência relativa (RFU) são mostrados para Rf4 com FAM e CMS-C. A fase de amplificação exponencial foi observada a partir dos ciclos 23 a 35 tanto para Rf4 quanto para CMS-C ou genes não restauradores.

[0010] Fig. 1B. Gráficos de amplificação da PCR em tempo real com a unidade de fluorescência relativa (RFU) são mostrados para Rf4 com CMS-C e não restaurador com VIC. A fase de amplificação exponencial foi observada a partir dos ciclos 23 a 35 tanto para Rf4 quanto para CMS-C ou genes não restauradores.

[0011] Fig. 2. Teste de zigosidade de Rf4 com ensaio TaqMan de estágio final utilizando KLIMS. Os dados de intensidade de fluorescência em bruto diretamente da leitora de placas foram analisados em KLIMS. Um gráfico com RFU de FAM como o eixo X e VIC como o eixo y foi gerado. As escalas de zigosidade foram feitas com base na separação de agrupamentos em uma visão de cluster.

DESCRIÇÃO DETALHADA Definições

[0012] O termo "amostra" refere-se a uma parte de qualquer espécie de plantas, mas de preferência é de milho (Zea mays). Tal pode estar no nível macro ou micro, em que os polinucleotídeos e/ou polipeptídeos podem ser extraídos.

[0013] O termo "planta" inclui referência às plantas inteiras, partes das plantas, sementes e células vegetais, e a sua descendência. Partes das plantas podem incluir, mas não são limitadas a estas, folhas, pólen, embriões, cotilédones, hipocótilos, células meristemáticas, raízes, pontas de raiz, anteras, flores, caules e vagens.

[0014] O termo "milho" refere-se a Zea mays ou milho e inclui todas as variedades de plantas que podem ser reproduzidas com o milho, incluindo espécies de milho silvestres.

[0015] Como aqui utilizado, "tampão" refere-se a uma solução tamponada que resiste a alterações no pH pela ação dos seus componentes conjugados ácido-base. Os tampões podem opcionalmente compreender um sal tal como MgCl2, MnCl2, ou coisa parecida. Os tampões também podem opcionalmente compreender outros constituintes para melhorar a eficiência da transcrição ou amplificação reversa.

[0016] O termo "introgressão de reprodução" refere-se ao movimento de um gene ou genes através de cruzamento sexual, geralmente por pólen, a partir de uma planta que é destinada a ser a doadora para a formação de sementes.

[0017] O termo "alelo" refere-se a uma forma alternativa de um gene, por meio do qual dois genes podem diferir nas sequências de DNA. Tais diferenças podem resultar de pelo menos uma mutação (por exemplo, deleção, inserção e/ou substituição) na sequência de ácido nucléico. Os alelos podem resultar em mRNAs modificados ou polipeptídeos cuja estrutura ou função pode ou não ser modificada. Qualquer gene dado pode ter nenhuma, uma ou muitas formas alélicas. Cada um desses tipos de alterações pode ocorrer isoladamente, ou em combinação com os outros, uma ou mais vezes em uma determinada sequência.

[0018] O termo "zigosidade" refere-se à semelhança de alelos de um gene ou traço em um organismo (por exemplo, uma planta). Se ambos os alelos forem iguais, o organismo é homozigoto com relação ao alelo. Se os dois alelos forem diferentes, o organismo é heterozigoto para o gene ou traço. Se um alelo não estiver presente, o organismo é hemizigoto. Se ambos os alelos não estão presentes, o organismo é nulizigoto.

[0019] O termo "rótulo" quando aqui utilizado refere-se a um composto ou composição detectável que é conjugado direta ou indiretamente à uma sonda para gerar uma sonda "rotulada". O rótulo pode ser detectável por si mesmo (por exemplo, rótulos de radioisótopo ou rótulos fluorescentes) ou, no caso de um rótulo enzimático, pode catalisar a alteração química de um composto ou composição de substrato que é detectável (por exemplo, avidina- biotina).

[0020] O termo "oligonucleotídeo" refere-se a um ácido nucléico de filamento único incluindo pelo menos entre dois e cerca de 100 nucleotídeos naturais ou modificados, ou uma mistura destes. O oligonucleotídeo pode ser derivado de um ácido nucléico natural ou produzido PEla síntese química ou enzimática.

[0021] "Polinucleotídeo" ou "ácido nucleico", como aqui utilizados de modo trocável, referem-se aos polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos modificados ou bases, e/ou seus análogos ou qualquer substrato que possa ser incorporado em um polímero através da DNA ou RNA polimerase, ou por uma reação sintética. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos. Se presente, a modificação na estrutura de nucleotídeo pode ser transmitida antes ou após a montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser ainda modificado após a síntese, tal como por conjugação com um rótulo.

[0022] "Polipeptídeo" refere-se a um peptídeo ou proteína que contém dois ou mais aminoácidos ligados por ligações de peptídeo, e inclui peptídeos, oligômeros, proteínas, e outros mais. Os polipeptídeos podem conter naturais, modificados, ou aminoácidos sintéticos. Os polipeptídeos também podem ser modificados naturalmente, tais como por processamento pós-translacional, ou quimicamente, tal como a amidação, acilação, reticulação, e outros mais.

[0023] "Reação da cadeia da polimerase" ou "PCR" refere-se a um procedimento ou técnica em que quantidades diminutas de ácido nucléico, RNA e/ou DNA são amplificadas como descrito na Patente U.S. No 4.683.195 emitida em 28 de Julho de 1987. Em geral, a informação da sequência das extremidades da região de interesse ou além necessita estar disponível, de tal modo que os iniciadores de oligonucleotídeo possam ser projetados; estes iniciadores serão idênticos ou semelhantes na sequência dos filamentos opostos do modelo a ser amplificado. Os nucleotídeos de terminal 5' dos dois iniciadores podem coincidir com as extremidades do material amplificado. A PCR pode ser utilizada para amplificar as sequências específicas de RNA, as sequências específicas de DNA a partir do DNA genômico total, e cDNA transcrito a partir do RNA celular total, sequências de bacteriófago ou plasmídeo, etc. Ver de uma forma geral Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989).

[0024] O termo "iniciador" refere-se a um oligonucleotídeo capaz de atuar como um ponto de iniciação da síntese ao longo de um filamento complementar quando as condições forem adequadas para a síntese de um produto de extensão do iniciador. As condições de sintetização incluem a presença de quatro diferentes trifosfatos de desoxirribonucleotídeo e pelo menos um agente indutor da polimerização tal como a transcriptase reversa ou DNA polimerase. Estes estão presentes em um tampão adequado, que pode incluir os constituintes que são co-fatores ou que afetam as condições tais como o pH e outros mais em a várias temperaturas adequadas. Um iniciador é preferivelmente uma sequência de filamento único, tal que a eficiência de amplificação é otimizada, mas as sequências de filamento duplo podem ser utilizadas.

[0025] O termo "sonda" refere-se a um oligonucleotídeo que hibridiza com uma sequência alvo. No procedimento de ensaio TaqMan® ou estilo TaqMan®, a sonda hibridiza com uma parte do alvo situado entre o sítio de anelamento dos dois iniciadores. Uma sonda pode ainda incluir um rótulo detectável, por exemplo, um fluoróforo (Texas-Red®, isotiocianato de fluoresceína, etc.,). O rótulo detectável pode ser covalentemente ligado diretamente ao oligonucleotídeo da sonda, por exemplo, localizado na extremidade 5' da sonda ou na extremidade 3' da sonda. Uma sonda incluindo uma fluoróforo também pode incluir ainda um extintor, por exemplo, Black Hole Quencher™, Iowa Black™, etc. Uma sonda inclui cerca de oito nucleotídeos, cerca de dez nucleotídeos, cerca de quinze nucleotídeos, cerca de vinte nucleotídeos, cerca de trinta nucleotídeos, cerca de quarenta nucleotídeos, ou cerca de cinqüenta nucleotídeos. Em algumas modalidades, uma sonda inclui de cerca de oito nucleotídeos a cerca de quinze nucleotídeos.

[0026] Os termos "especificamente hibridizável" e "especificamente complementar" são termos que indicam um grau suficiente de complementaridade tal que a ligação estável e específica ocorre entre a molécula de ácido nucléico e o DNA alvos. Uma molécula de ácido nucléico não necessita ser 100 % complementar à sua sequência alvo para ser especificamente hibridizável. Uma molécula de ácido nucléico é especificamente hibridizável quando existe um grau suficiente de complementaridade para evitar a ligação não específica do ácido nucléico nas sequências não alvos sob condições onde a ligação específica é desejável, por exemplo, sob condições rigorosas de hibridação. As condições de hibridação que resultam em graus particulares de severidade irão variar dependendo da natureza do método de hibridação de escolha e da composição e comprimento das sequências de ácido nucléico de hibridização. Geralmente, a temperatura de hibridização e a força iônica (especialmente a concentração de Na+ e/ou MgA) do tampão de hibridação irá determinar a severidade de hibridação, embora os tempos de lavagem também influenciam a severidade. Os cálculos relativos às condições de hibridação requeridos para alcançar graus particulares de severidade são conhecidos daqueles de habilidade prática na técnica, e são debatidos, por exemplo, em Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11; e Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985. Outras instruções e orientações detalhadas no que diz respeito à hibridização de ácidos nucléicos podem ser encontradas, por exemplo, em Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biolofiy- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993; e Ausubel et ah, Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley- Interscience, NY, 1995.

[0027] O termo "extinção" refere-se a uma diminuição na fluorescência de um rótulo detectável fluorescente provocada pela transferência de energia associada com um componente extintor, independentemente do mecanismo.

[0028] O termo "mistura de reação" ou "mistura de reação PCR" ou "mistura principal" refere-se a uma solução aquosa dos constituintes em uma reação PCR ou RT-PCR, que pode ser constante através de diferentes reações. Uma mistura de reação de RT-PCR exemplar inclui tampão, uma mistura de trifosfatos de desoxirribonucleosídeo, transcriptase reversa, iniciadores, sondas, e DNA polimerase. Geralmente, o RNA ou DNA modelo é a variável em uma reação PCR ou RT-PCR.

Gene Rf4

[0029] O uso do gene restaurador da fertilidade (Rf) com a esterilidade masculina citoplásmica foi mostrado de simplificar os programas de produção de sementes e reduzir os custos totais através da eliminação total da remoção do pendão manualmente e por máquina. O gene de restauração Rf4 para o citoplasma do tipo CMS-C foi anteriormente mapeado. O gene candidato Rf4-bHLH foi identificado, que codificou um fator de transcrição basic-Helix-Loop- Helix (bHLH). Um fragmento de DNA do genoma de 3,2 kb foi clonado que continha toda a região de codificação do gene Rf4-bHLH acrescido de um 5' UTR/promotor de 1,1 kb e um 3' UTR/terminador de 0,75 kb de uma linhagem de CMS-C (não restaurador), linhagem congênita (não CMS) e três linhagens restauradoras. Com base nas alterações de nucleotídeos dentro do gene Rf4 entre as linhagens restauradoras e não restauradoras, um ensaio da PCR TaqMan® de estágio final foi desenvolvido para o teste de zigosidade do Rf4. O ensaio foi validado com uma população de mapeamento F2 que continha 500 indivíduos. Este ensaio permite uma triagem em grande escala de germoplasma de milho em programas de reprodução para o gene de restauração Rf4 em um formato de alto rendimento. O desenvolvimento deste ensaio torna muito mais fácil e mais barato utilizar o sistema CMS-C/Rf4 para a produção de semente de milho híbrido.

PCR quantitativa

[0030] A PCR quantitativa (qPCR) permite a quantificação automatizada do produto da reação para cada amostra por ciclo. OS produtos de instrumentação e software comumente utilizados executam os cálculos de quantificação automaticamente. A quantificação possui uma faixa dinâmica ampla de 107 vezes que é possível, mas geralmente, a faixa dinâmica está mais próxima de 2 a 3 logs. A tecnologia de instrumentação corrente, por exemplo, Cepheid's Smart Cycler®, permite a detecção e quantificação simultâneas de sinais fluorescentes em até quatro canais diferentes em tempo real. Além disso, a última geração de termocicladores é projetada para maximizar a excitação da tintura que fornece um meio mais preciso de detecção da fluorescência. Assim, múltiplos produtos de amplificação podem ser avaliados na mesma mistura de reação e quantificados com mais precisão ("PCR multiplex" que se refere à amplificação simultânea de vários alvos de interesse em uma reação mediante o uso de mais do que um par de iniciadores). Além disso, cada sítio de reação pode ser programado de forma independente, começando assim a reação independente de outras reações. Assim, as amostras podem ser avaliadas quando necessário e não têm que aguardar a conclusão de uma reação programada já em andamento. Portanto, esta nova tecnologia agora leva em conta a detecção e quantificação de múltiplos alvos em uma única amostra em tempo real.

[0031] Existem diferentes sistemas de sonda para a qPCR (por exemplo, Molecular Beacons (Sigma-Genosys, Inc., The Woodlands, TX), Scorpions® (DxS Ltd., Manchester, UK), SYBR® Green (Molecular Probes, Eugene, OR), e TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA). Estes sistemas empregam rótulos fluorescentes onde a instrumentação detecta a fluorescência e o software interpreta os níveis de fluorescência.

[0032] TaqMan® utiliza a Forster Resonance Energy Transfer (FRET) mediante o acoplamento de um rótulo fluorescente com um componente extintor. Um rótulo fluorescente está covalentemente ligado à extremidade 5' de uma sonda de oligonucleotídeo, enquanto que a extremidade 3' possui uma componente extintor ligado. Estas sondas de oligonucleotídeo são específicas do sítio para hibridizar com o produto amplificado. De preferência, as sondas de oligonucleotídeo são concebidas para hibridizar em uma região central do produto amplificado. Para os ensaios de TaqMan®, a atividade de 5'-nuclease da DNA polimerase cliva a sonda de durante o ciclo de replicação. Devido à clivagem da sonda, o componente extintor não está mais acoplado ao rótulo de fluorescência e não pode extinguir a fluorescência. A fluorescência assim representa a replicação do DNA.

Quantificação dos resultados da PCR

[0033] Curva padrão. Os ácidos nucléicos podem ser utilizados para estabelecer uma curva padrão. Estes métodos são bem conhecidos e incluem controles internos, DNA de filamento duplo, um cDNA que expressa um gene alvo, ou um DNA de filamento único gerado in vitro. Os métodos podem variar de acordo com o ácido nucléico selecionado para servir como o padrão para estabelecer uma curva padrão.

[0034] Ciclo Comparativo Limiar. O método de ciclo limiar (Ct) comparativo, também conhecido como o método 2-ΔΔCt, também é utilizada para quantificar os níveis de DNA. O método Ct compara uma reação de teste com uma amostra de controle ou calibrador. Os valores do Ct tanto da amostra de controle/calibrador quanto da amostra de teste são normalizados. Em uma modalidade da invenção, os valores do Ct foram normalizados para um corte arbitrário, 20 a 22. Em outra modalidade, os valores do Ct foram normalizados para dentro do valor de 1 Ct de um controle negativo (uma amostra sem inibição). Isto leva em conta a sensibilidade do ensaio e faixa dinâmica apropriada.

[0035] O método de Ct também pode ser descrito pela fórmula de ΔΔCt; ΔΔCt = ΔCtamostra de teste — Δctamostra de reference. As eficiências de amplificação da amostra de teste e da amostra de referência devem estar ao redor de das mesmas com relação à fórmula para operar. As eficiências de amplificação podem ser determinadas através de uma comparação das amostras com a diluição modelo. A eficiência de amplificação é ao redor da mesma quando um gráfico de diluição de cDNA versus ΔCt se aproxima de zero.

Ensaio de Zigosidade de Estágio Final

[0036] Um ensaio de PCR de estágio final para testar a zigosidade de Rf4 de uma maneira de alto rendimento foi desenvolvido. Este ensaio permite a triagem em grande escala e alto rendimento dos germoplasmas de milho com o gene restauração Rf4. Este ensaio também irá aumentar a escala de uso de um sistema de CMS-C/Rf4 para a produção de semente de milho híbrido.

[0037] Em uma modalidade, um método para a determinação da zigosidade do gene Rf4 em uma planta de milho inclui um ensaio de PCR. Um tal ensaio de PCR pode ser quantitativo e/ou em tempo real e/ou em um formato multiplex. Em uma modalidade, um método emprega sondas de estilo TaqMan® (sondas duplamente rotuladas para a fluorescência após a atividade de exonuclease 5'^3'). Em uma modalidade, um método emprega sondas de estilo TaqMan® e oligonucleotídeos que seletivamente hibridam com o gene Rf4. Em uma modalidade, as sondas de gene Rf4 podem ser acopladas a um rótulo detectável (por exemplo, 6-carboxifluoresceína) na extremidade 5' do oligonucleotídeo. Em uma modalidade, o oligonucleotídeo também pode ser acoplado a um componente extintor na extremidade 3'. Um exemplo de uma componente extintor para as sondas de gene Rf4 é o Black Hole Quencher™ (Biosearch Technologies, Novato, CA). A instrumentação adequada irá desse modo detectar a fluorescência produzida a partir da clivagem da sonda de oligonucleotídeo pela atividade de nuclease da polimerase de DNA durante a replicação. O software de análise depois determina a quantidade do produto de amplificação com base nos dados de fluorescência.

[0038] Em uma modalidade, um método para a determinação da zigosidade de um gene Rf4 em uma planta de milho inclui a) a realização de um primeiro ensaio de PCR utilizando uma primeira sonda, um primeiro iniciador direto, e um primeiro iniciador reverso em uma amostra de polinucleotídeo de uma planta de milho; b) a execução de um segundo ensaio de PCR utilizando uma segunda sonda, um segundo iniciador direto, e um segundo iniciador reverso na amostra de polinucleotídeo de uma planta de milho; c) a quantificação das primeira e segunda sondas; e d) a comparação das primeira e segunda sondas quantificadas para determinar a zigosidade. Em uma modalidade, as sondas são detectavelmente rotuladas. Em uma modalidade, os iniciadores e as sondas são específicos para o gene Rf4 em uma planta de milho. Em uma modalidade, um iniciador direto específico para o gene Rf4 compreende a SEQ ID NO: 1, 11 ou 15. Em uma modalidade, um iniciador reverso específico para o gene Rf4 compreende a SEQ ID NO: 2, 14 ou 18. Em uma modalidade, uma sonda específica para o gene Rf4 compreende a SEQ ID NO: 4, 13 ou 17.

[0039] Em uma modalidade, um método de ensaio de PCR pode incluir o carregamento de uma mistura de reação de PCR em um tubo de ensaio de PCR, em que a mistura de reação de PCR comprende uma polimerase com atividade de nuclease 5' a 3', desoxinucleotídeos, um tampão, um primeiro e um segundo iniciador direto, um primeiro e um segundo iniciador reverso, uma primeira e uma segunda sonda, e uma amostra de polinucleotídeo, e em que a primeira sonda e a segunda sonda compreendem tinturas fluorescentes, com espectros de excitação/emissão distinguíveis; e a execução de uma etapa de amplificação sob condições de amplificação de tal modo que a atividade de nuclease 5' a 3' da polimerase cliva a primeira e a segunda sondas, liberando assim as tinturas fluorescentes compreendendo espectros de excitação/emissão distinguíveis.

[0040] Em outra modalidade, um método de ensaio da PCR para determinar a zigosidade do gene Rf4 inclui o carregamento de uma mistura de reação PCR em um tubo de ensaio de PCR, em que a mistura de reação PCR compreende uma polimerase com atividade de nuclease 5' a 3', desoxinucleotídeos, um tampão, um primeiro e/ou um segundo iniciador direto, um primeiro e/ou um segundo iniciador reverso, uma primeira e/ou uma segunda sonda, e uma amostra de polinucleotídeo; e a execução de uma etapa de amplificação sob condições tais que a atividade de nuclease 5' a 3' da polimerase cliva a primeira ou segunda sonda, liberando assim as tinturas fluorescentes compreendendo espectros de excitação/emissão distinguíveis.

[0041] Em algumas modalidades, um rótulo compreende uma tintura fluorescente (por exemplo, uma tintura de rodamina (por exemplo, R6G, R110, TAMRA, ROX, etc.), uma tintura de fluoresceína (por exemplo, JOE, VIC, TET, HEX, FAM, etc.), uma tintura de halofluoresceína, uma tintura de cianina (por exemplo, CY3, CY3.5, CY5, Cy5.5, etc.), uma tintura Bodipy® (por exemplo, FL, 530/550, TR, TMR, etc.), uma tintura Alexa Fluor® (por exemplo, 488, 532, 546, 568, 594, 555, 653, 647, 660, 680, etc.), uma tintura de diclororrodamina, uma tintura de transferência de energia (por exemplo, tinturas Bigdye® v 1, tinturas Bigdye® v 2, tinturas Bigdye® v 3, etc.), tinturas Lucifer (por exemplo, Lucifer yellow, etc,), Cascade Blue®, Oregon Green®, e outros mais. As tinturas fluorescentes pode ser distinguidas e medidas durante a amplificação através de seus espectros emitidos de excitação e/ou emissão.

[0042] Exemplos de extintores incluem, mas não são limitados a estes, Black Hole Quencher™ 1 (BHQ1; Biosearch Technologies, Novato, CA), Iowa Black™ (Integrated DNA Technologies), Dabcyl, QSY-7, AbsoluteQuencher, Eclipse®, e extintor Minor Groove Binder (MGB) (Nanogen Inc., San Diego, CA).

EXEMPLOS

[0043] Devido à importância prática da esterilidade masculina citoplásmica e restauração da fertilidade do pólen na produção de sementes híbridas de milho e a necessidade de determinar a função de restauração das linhagens acabadas no circuito do germoplasma, um ensaio de zigosidade com base na TaqMan® PCR de estágio final de alto rendimento foi desenvolvido para detectar e testar o estado de zigosidade no lócus do gene Rf4 eficiente e especificamente.

Materiais e métodos

[0044] Material genético das plantas. Nove linhagens congênitas de milho foram utilizadas para desenvolver um ensaio de zigosidade TaqMan® de estágio final, incluindo três linhagens de restauração da fertilidade de Rf4, três linhagens de não restauração para o tipo CMS C, duas linhagens do tipo CMS C, e uma linhagem não restauradora e não CMS-C. Sementes e/ou tecidos foliares foram experimentados com relação à extração de DNA genômico. Depois que o DNA genômico foi extraído, o DNA de uma linhagem de restauração da fertilidade de Rf4 foi misturado em partes iguais com o DNA de uma linhagem do tipo CMS C de não restauração.

[0045] Uma população de mapeamento F2 a partir do cruzamento de uma linhagem de restauração da fertilidade de Rf4 foi misturada em partes iguais com o DNA a partir de uma linhagem do tipo CMS C de não restauração resultou na produção com 500 linhagens de plantas individuais. As amostras deste cruzamento foram utilizadas para validar o ensaio de zigosidade TaqMan® de estágio final. Essa população foi criada no viveiro de inverno no México no final de 2009. Os tecidos foliares foram experimentados com relação à extração de DNA.

[0046] Extração do DNA a partir de sementes. Alicate de ponta como agulha foram utilizados para puxar o embrião para fora de um grão de milho e colocado em um tubo de amostra de 1,2 ml (8 sementes de cada linhagem). Os alicates foram limpos entre as sementes. Um glóbulo de liga de tungstênio (diâmetro de ~1/8 de polegada) foi adicionado a cada tubo. Utilizando um kit de isolamento de DNA Qiagen™, 350 μl de solução de trabalho a 65 °C AP1 contendo 1 μl de RNase e 1 μl de Reagent DX foi adicionado a cada tubo. Depois cada tubo foi tampado e labutado em 1.500 golpes por minuto em um SPEX 2000 Geno/Grinder® (SPEX SamplePrep LLC, Metuchen, NJ). Subseqüentemente, cada tubo foi girado durante 10 segundos a 1500 rpm para remover o líquido das tampas. As tampas foram removidas, e 114 μl de AP2 foram adicionados. Os tubos foram tampados de novamente e agitados à mão durante 15 segundos. As amostras foram incubadas durante 10 minutos a -20 °C. As amostras foram centrifugadas a 6000 rpm durante 5 minutos. Depois cada tubo foi destampado e 360 μl de sobrenadante foram transferidos para tubos contendo 540 μl de AP3/E (200 provas de etanol já adicionado ao AP3/E). Os tubos foram tapados e agitados à mão durante 15 segundos. Depois os tubos foram centrifugados durante 10 segundos a 1500 rpm para remover o líquido das tampas. 900 μl foram transferidos para uma placa de filtro DNeasy® (Qiagen, Valencia, CA). As placas de filtro foram centrifugadas em um S-Block durante 4 minutos a 6000 rpm. O fluxo principal foi despejado para fora do S- Block e 800 μl de AW (tampão de lavagem - 200 provas de etanol já adicionado ao AW) foram adicionados a cada reservatório da placa de filtro. As placas de filtro foram centrifugadas em um S-Block durante 4 minutos a 6000 rpm. 200 μl de 200 provas de etanol foram adicionados a cada reservatório e centrifugados no S-Block durante 1 minuto. As placas de filtro foram colocadas sobre um S-Block seco e limpo e centrifugadas durante 15 minutos para secar os filtros. As placas de filtro foram então colocadas em uma prateleira limpa de tubos na orientação correta. 100 μl de AE foram adicionados em cada reservatórios duas vezes. De cada vez, o AE foi incubado durante 1 minuto na temperatura ambiente e centrifugado durante 2 minutos a 6000 rpm. As placas de filtro foram removidas e os tubos tampados que continham DNA. O DNA extraído foi armazenado a 4 °C.

[0047] Extração de DNA da folha. Punções de folha (8/planta) foram coletadas de uma muda de um mês de idade, e o DNA foi extraído utilizando um Biocel® 1800 (Agilent Inc., Santa Clara, CA). Especificamente, um glóbulo de liga de tungstênio (diâmetro de ~1/8 de polegada) foi adicionado a cada tubo. Depois 300 μl de RLT Lysis Buffer foram adicionados a cada tubo. Os tubos foram tampados e labutados durante 6 minutos em 1500 golpes por minuto em um SPEX 2000 Geno/Grinder® (SPEX SamplePrep LLC). Depois as amostras foram centrifugadas em 6000 rpm durante 5 minutos. Os tubos foram destampados.

[0048] As seguintes etapas foram então executadas utilizando um Biocel® 1800. 200 μl de sobrenadante foram transferidos para uma placa de ensaio de fundo redondo de reservatório quadrado de 1,1 ml contendo 10 μl de MagAttract® Suspension G Bead (Qiagen) e incubados durante 2 minutos. Cada reservatório foi agitado a 1200 rpm durante 40 segundos e depois incubado durante 2 minutos. As placas de ensaio foram colocadas em uma prateleira de magneto e os glóbulos foram deixados separar-se durante 40 segundos. O sobrenadante foi então removido. O primeiro tempo de lavagem, 190 μl de tampão de lavagem RPW (pré-misturado RNase® e isopropanol para RPW) foram adicionados e agitados a 1200 rpm durante 40 segundos. A placa de ensaio foi novamente colocada em uma prateleira de magneto e os glóbulos foram deixados separar-se durante 20 segundos. O sobrenadante foi removido. O segundo tempo de lavagem, 190 μl de tampão de lavagem de etanol a 100 % foram adicionados e agitados a 1200 rpm durante 40 segundos. A placa de ensaio foi novamente colocada em uma prateleira de magneto, e os glóbulos foram deixados separar-se durante 20 segundos. O terceiro tempo de lavagem, 190 μl de tampão de lavagem de etanol a 100 % foram adicionados e agitados a 1200 rpm durante 40 segundos. As placas de ensaio foram colocadas em uma prateleira de magneto e os glóbulos foram deixados separar-se durante 20 segundos. O sobrenadante foi removido, e a placa incubada durante 5 minutos na temperatura ambiente. 100 μl de tampão de eluição AE foram adicionados e agitados durante 2 minutos. As placas de ensaio foram colocadas em uma prateleira de magneto e os glóbulos foram deixados separar-se durante 30 segundos. O sobrenadante foi transferido para placas lacradas limpas e o DNA foi armazenado a 4 °C. O DNA foi quantificado mediante o uso de PicoGreen® (Molecular Probes Inc., Eugene, OR) e normalizado para 10 ng/μl para outra aplicação.

[0049] Projeto e validação do ensaio de TaqMan® PCR. Primer Express® 3.0 (Perkin-Elmer Corp., Foster City, CA) foi utilizado para conceber os iniciadores e sondas de ensaio TaqMan® (Tabela 1). As seqüências de DNA das linhagens de restauração de Rf4, das linhagens CMS-C, da linhagem não CMS-C e da linhagem de milho B73 foram utilizadas. Os iniciadores CMSCF e CMSCR foram projetados tanto para Rf4 quanto para CMS-C/não restaurador. As sondas RCMSC e WCMSC foram Rf4 específico em dois nucleotídeos (TT) e CMS-C/não restaurador específico em dois nucleotídeos (AC), respectivamente. Tabela 1. Sequências dos iniciadores e sondas MGB para o ensaio de zigosidade específica do Rf4:

[0050] Os iniciadores e sondas com tinturas FAM ou VIC e Minor Grove Binding Non Fluorescence Quencher I (MGBFQ) foram sintetizados pela Applied Biosystems (Foster City, CA), e foram dissolvidos em tampão de Tris-EDTA 1x na concentração de 100 μM. As misturas principais da expressão do gene TaqMan® (Applied Biosystems; e Catalog # 4370048) foram utilizadas para todas as reações PCR.

[0051] As reações PCR em tempo real com 10 μl de volume foram configuradas de acordo com a Tabela 2 utilizando a placa de 384 reservatórios no 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) começando com 50 °C durante 2 minutos, seguido da desnaturação a 95 °C durante 10 minutos, seguido por 50 ciclos de 95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 minuto. Os sinais de fluorescência foram registrados no final de cada ciclo. Tabela 2. Componentes da PCR em Tempo Real

[0052] Ensaios da PCR TaqMan® de estágio final em 10 μl de volume também foram configurados de acordo com a Tabela 2 utilizando placas de 384 reservatórios. ABI GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) foi utilizado para amplificação que começa com 50 °C durante 2 minutos, depois a desnaturação a 95 °C durante 15 minutos, seguido por 40 ciclos de 92 °C durante 15 segundos e 60 °C durante 1 minuto. Os produtos da PCR foram medidos utilizando Synergy Gen5 Microplate Reader (BioTek, Winooski, VT) and Kraken KLIMS System (KBioscience, England). As configurações do instrumento de comprimentos de onda recomendados para a leitura dos resultados da PCR são listadas na Tabela 3. Tabela 3. Configurações do instrumento com comprimentos de onda recomendados para a leitura dos produtos da PCR:

[0053] Análise de dados. Para a PCR em tempo real, o SDS RQ Manager Software executou as análises de dados de quantificação relativa gerados pelo Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System. Este software apresenta os dados do gráfico de amplificação em um gráfico logarítmico do sinal repórter normalizado com correção do valor básico vs. número de ciclos. O gráfico apresenta a curva de amplificação para cada célula selecionada dentro da grade de placa.

[0054] Após a conclusão da PCR TaqMan® de estágio final e leitura de fluorescência, os dados brutos de intensidade de fluorescência diretamente da leitora de placas foram analisados no sistema KLIMS. Um gráfico com RFU (unidade de fluorescência relativa) de FAM como eixo x e VIC como eixo y foi gerado. As determinações da zigosidade foram feitas com base na separação de agromarados em uma visão cluster.

Resultados e Debate

[0055] Sequência de Rf4 de CMS-C do Milho. As sequências do gene Rf4 de alta qualidade foram obtidas por meio da clonagem e sequenciamento de seis linhagens (três linhagens de restauração de Rf4: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 9; uma linhagem de CMS-C: SEQ ID NO: 6; uma linhagem não CMS-C: SEQ ID NO: 7; e a linhagem B73: SEQ ID NO: 5). As sequências foram analisadas e alinhadas utilizando Sequencher® 4.8 (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI). O alinhamento da sequência genômica Rf4-bHLH é descrito abaixo. SEQ ID NO:5 (1) GGCAAGCTAATGGGGTACATATGGAAGGAGGAAACCAAGTCGATCGTCGTCGTAGCATGTCGGTGTGG GTACTACACTACACACACATATACATGGGCAA SEQ ID NO:6 (1) GGCAAGCTAATGGGGTACATATGGAAGGAGGAAACCAAGTCGATCGTCGTCGTAGCATGTCGGTGTGG GTACTACACTACACACACATATACATGGGCAA SEQ ID NO:7 (1) GGCAAGCTAATGGGGTACATATGGAAGGAGGAAACCAAGTCGATCGTCGTCGTAGCATGTCGGTGTGG GTACTACACTACACACACATATACATGGGCAA SEQ ID NO:8 (1) GGCAAGCTAATGGGGTACATATGGAAGGAGGAAACCAAGTCGATCGTCGTCGTAGCATGTCGGTGTGG GTACTACACTACACACACATATACATGGGCAA SEQ ID NO:9 (1) GGCAAGCTAATGGGGTACATATGGAAGGAGGAAACCAAGTCGATCGTCGTCGTAGCATGTCGGTGTGG GTACTACACTACACACACATATACATGGGCAA SEQ ID NO:10 (1) GGCAAGCTAATGGGGTACATATGGAAGGAGGAAACCAAGTCGATCGTCGTCGTAGCATGTCGGTGTGG GTACTACACTACACACACATATACATGGGCAA (101) CGCAAGGCCACCTTTCTGAATCCTGCATGAGCGTGTACCACTAGAATTGTCAGTGTGTGCGGTGTATG GCAGGTTTTTGGTTCGGCAAGTGGGGCCCTCC (101) CGCAAGGCCACCTTTCTGAATCCTGCATGAGCGTGTACCACTAGAATTGTCAGTGTGTGCGGTGTATG GCAGGTTTTTGGTTCGGCAAGTGGGGCCCTCC (101) CGCAAGGCCACCTTTCTGAATCCTGCATGAGCGTGTACCACTAGAATTGTCAGTGTGTGCGGTGTATG GCAGGTTTTTGGTTCGGCAAGTGGGGCCCTCC (101) CGCAAGGCCACCTTTCTGAATCCTGCATGAGCGTGTACCACTAGAATTGTCAGTGTGTGCGGTGTATG GCAGGTTTTTGGTTCGGCAAGTGGGGCCCTCC (101) CGCAAGGCCACCTTTCTGAATCCTGCATGAGCGTGTACCACTAGAATTGTCAGTGTGTGCGGTGTATG GCAGGTTTTTGGTTCGGCAAGTGGGGCCCTCC (101) CGCAAGGCCACCTTTCTGAATCCTGCATGAGCGTGTACCACTAGAATTGTCAGTGTGTGCGGTGTATG GCAGGTTTTTGGTTCGGCAAGTGGGGCCCTCC (201) GGGGAGGAATCTCAGTAACAAACCGCTCTTCTGAAAAGGTCAGCCATCCCCGGTCCGGTCCGGTGATG TCGTCGCTGTCGCTCTGCTAGCTTGCTGCCGA (201) GGGGAGGAATCTCAGTAACAAACCGCTCTTCTGAAAAGGTCAGCCATCCCCGGTCCGGTCCGGTGATG TCGTCGCTGTCGCTCTGCTAGCTTGCTGCCGA (201) GGGGAGGAATCTCAGTAACAAACCGCTCTTCTGAAAAGGTCAGCCATCCCCGGTCCGGTCCGGTGATG TCGTCGCTGTCGCTCTGCTAGCTTGCTGCCGA (201) GGGGAGGAATCTCAGTAACAAACCGCTCTTCTGAAAAGGTCAGCCATCCCCGGTCCGGTCCGGTGATG TCGTCGCTGTCGCTCTGCTAGCTTGCTGCCGA (201) GGGGAGGAATCTCAGTAACAAACCGCTCTTCTGAAAAGGTCAGCCATCCCCGGTCCGGTCCGGTGATG TCGTCGCTGTCGCTCTGCTAGCTTGCTGCCGA (201) GGGGAGGAATCTCAGTAACAAACCGCTCTTCTGAAAAGGTCAGCCATCCCCGGTCCGGTCCGGTGATG 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DAS-CMS23(-/A) (1500) --- TACATGCCCGGGGGGCACTTTGAGACCTCCCCGCCGCCGCCACGCGCCACCGGCCGCGGCAGGAAGCG GGGCAGGGCGCTGGGCGGCGGCTTCCATG (1500) --- TACATGCCCGGGGGGCACTTTGAGACCTCCCCGCCGCCGCCACGCGCCACCGGCCGCGGCAGGAAGCG GGGCAGGGCGCTGGGCGGCGGCTTCCATG (1489) --- TACATGCCCGGGGGGCACTTTGAGACCTCCCCGCCGCCGCCACGCGCCACCGGCCGCGGCAGGAAGCG GGGCAGGGCGCTGGGCGGCGGCTTCCATG (1501) GCCTACATGCCCGGGGGGCACTTTGAGACCTCCCCGCCGCCGCCACGCGCCACCGGCCGCGGCAGGAA GCGGGGCAGGGCGCTGGGCGGCGGCTTCCATG (1501) GCCTACATGCCCGGGGGGCACTTTGAGACCTCCCCGCCGCCGCCACGCGCCACCGGCCGCGGCAGGAA GCGGGGCAGGGCGCTGGGCGGCGGCTTCCATG (1501) GCCTACATGCCCGGGGGGCACTTTGAGACCTCCCCGCCGCCGCCACGCGCCACCGGCCGCGGCAGGAA GCGGGGCAGGGCGCTGGGCGGCGGCTTCCATG DAS-CMS35(Y/F) DAS-CMS24 DAS-CMS25 (1598) CTGTGCTGGCCAACGGCGTCGAGAAGAAGGAGAAGCAGCGCCGGCTGCGGCTCACCGAGAAGTACACC GCCCTCATGCACCTCATACCCAACGTTACAAA (1598) CTGTGCTGGCCAACGGCGTCGAGAAGAAGGAGAAGCAGCGCCGGCTGCGGCTCACCGAGAAGTACACC GCCCTCATGCACCTCATACCCAACGTTACAAA (1587) CTGTGCTGGCCAACGGCGTCGAGAAGAAGGAGAAGCAGCGCCGGCTGCGGCTCACCGAGAAGTACACC GCCCTCATGCACCTCATACCCAACGTTACAAA (1601) CTGTGCTGGCCAACGGCGTCGAGAAGAAGGAGAAGCAGCGCCGGCTGCGGCTCACCGAGAAGTTTACG GCCCTCATGCACCTCATACCCAACGTTACGAA (1601) CTGTGCTGGCCAACGGCGTCGAGAAGAAGGAGAAGCAGCGCCGGCTGCGGCTCACCGAGAAGTTTACG GCCCTCATGCACCTCATACCCAACGTTACGAA (1601) CTGTGCTGGCCAACGGCGTCGAGAAGAAGGAGAAGCAGCGCCGGCTGCGGCTCACCGAGAAGTTTACG GCCCTCATGCACCTCATACCCAACGTTACGAA DAS-CMS26 (1698) GGTCGTAC-------------------CAAATCCTCCTCTTATGTTCGTC--- CATCGTTTCAAATTAAGTTAAAAAATTAATTCACGGTTCTTGTTGTT (1698) GGTCGTAC-------------------CAAATCCTCCTCTTATGTTCGTC--- CATCGTTTCAAATTAAGTTAAAAAATTAATTCACGGTTCTTGTTGTT (1687) GGTCGTAC-------------------CAAATCCTCCTCTTATGTTCGTC--- CATCGTTTGAAATTAAGTTAAAAAATTAATTCACGGTTCTTGTTGTT (1701) GGTCGTACGGCGTACTTGCGCGCGGACCAAATCCTCCTCTTATGTTCGTCGTCCATCGTCTCAAATTA A-------------TTCACGGTTCTTGTTGTT (1701) GGTCGTACGGCGTACTTGCGCGCGGACCAAATCCTCCTCTTATGTTCGTCGTCCATCGTCTCAAATTA A-------------TTCACGGTTCTTGTTGTT (1701) GGTCGTACGGCGTACTTGCGCGCGGACCAAATCCTCCTCTTATGTTCGTCGTCCATCGTCTCAAATTA A-------------TTCACGGTTCTTGTTGTT DAS-CMS27 (1776) --- TATTTTTTGCGCACTGCAGACTGATAGGGCGACGGTGATCTCGGACGCGATCGAGTACATCCAGGAGC TGGGGAGGACGGTGGAGGAGCTGACGCTG (1776) --- TATTTTTTGCGCACTGCAGACTGATAGGGCGACGGTGATCTCGGACGCGATCGAGTACATCCAGGAGC TGGGGAGGACGGTGGAGGAGCTGACGCTG (1765) --- TATTTTTTGCGCACTGCAGACTGATAGGGCGACGGTGATCTCGGACGCGATCGAGTACATCCAGGAGC TGGGGAGGACGGTGGAGGAGCTGACGCTG (1788) GTTTATTTTTTGCGCACTGCAGACTGATAGGGCGACGGTGATCTCGGACGCGATCGAGTACATCCAGG AGCTGGGGAGGACGGTGGAGGAGCTGACGCTG (1788) GTTTATTTTTTGCGCACTGCAGACTGATAGGGCGACGGTGATCTCGGACGCGATCGAGTACATCCAGG AGCTGGGGAGGACGGTGGAGGAGCTGACGCTG (1788) GTTTATTTTTTGCGCACTGCAGACTGATAGGGCGACGGTGATCTCGGACGCGATCGAGTACATCCAGG AGCTGGGGAGGACGGTGGAGGAGCTGACGCTG (1873) CTGGTGGAGAAGAAGCGGCGCCGGAGGGAGCTGCAGGGGGACGTCGTGGACGCGGCGCCGGCTGCGGT GGTTGCTGCCGCCGGTGAGGCGGAGAGCTCGG (1873) CTGGTGGAGAAGAAGCGGCGCCGGAGGGAGCTGCAGGGGGACGTCGTGGACGCGGCGCCGGCTGCGGT GGTTGCTGCCGCCGGTGAGGCGGAGAGCTCGG (1862) CTGGTGGAGAAGAAGCGGCGCCGGAGGGAGCTGCAGGGGGACGTCGTGGACGCGGCGCCGGCTGCGGT GGTTGCTGCCGCCGGTGAGGCGGAGAGCTCGG (1888) CTGGTGGAGAAGAAGCGGCGCCGGAGGGAGCTGCAGGGGGACGTCGTGGACGCGGCGCCGGCTGCGGT GGTTGCTGCCGCCGGTGAGGCGGAGAGCTCGG (1888) CTGGTGGAGAAGAAGCGGCGCCGGAGGGAGCTGCAGGGGGACGTCGTGGACGCGGCGCCGGCTGCGGT GGTTGCTGCCGCCGGTGAGGCGGAGAGCTCGG (1888) CTGGTGGAGAAGAAGCGGCGCCGGAGGGAGCTGCAGGGGGACGTCGTGGACGCGGCGCCGGCTGCGGT GGTTGCTGCCGCCGGTGAGGCGGAGAGCTCGG DAS-CMS28(P/L) (1973) AGGGCGAGGTGGCTCCTCCGCCGCCGGCCGTGCCGCGGCAGCCGATCCGGAGCACGTACATCCAGCGG CGGAGCAAGGACACGTCCGTGGACGTGCGGAT (1973) AGGGCGAGGTGGCTCCTCCGCCGCCGGCCGTGCCGCGGCAGCCGATCCGGAGCACGTACATCCAGCGG CGGAGCAAGGACACGTCCGTGGACGTGCGGAT (1962) AGGGCGAGGTGGCTCCTCCGCCGCCGGCCGTGCCGCGGCAGCCGATCCGGAGCACGTACATCCAGCGG CGGAGCAAGGACACGTCCGTGGACGTGCGGAT (1988) AGGGCGAGGTGGCTCCTCCGCCGCTGGCCGTGCCGCGGCAGCCGATCCGGAGCACGTACATCCAGCGG CGGAGCAAGGACACGTCCGTGGACGTGCGGAT (1988) AGGGCGAGGTGGCTCCTCCGCCGCTGGCCGTGCCGCGGCAGCCGATCCGGAGCACGTACATCCAGCGG CGGAGCAAGGACACGTCCGTGGACGTGCGGAT (1988) AGGGCGAGGTGGCTCCTCCGCCGCTGGCCGTGCCGCGGCAGCCGATCCGGAGCACGTACATCCAGCGG CGGAGCAAGGACACGTCCGTGGACGTGCGGAT DAS-CMS29 (2073) CGTGGAGGAGGACGTGAACATCAAGCTCACCAAGCGCCGGCGCGACGGGTGCCTCGCAGCCGCGTCGC GCGCGCTGGATGACCTCCGCCTTGACCTCGTC (2073) CGTGGAGGAGGACGTGAACATCAAGCTCACCAAGCGCCGGCGCGACGGGTGCCTCGCAGCCGCGTCGC GCGCGCTGGATGACCTCCGCCTTGACCTCGTC (2062) CGTGGAGGAGGACGTGAACATCAAGCTCACCAAGCGCCGGCGCGACGGGTGCCTCGCAGCCGCGTCGC GCGCGCTGGATGACCTCCGCCTTGACCTCGTC (2088) CGTGGAGGAGGACGTGAACATCAAGCTCACCAAGCGCCGGCGCGACGGGTGCCTCGCAGCCGCGTCGC GCGCGCTGGACGACCTCCGCCTTGACCTCGTC (2088) CGTGGAGGAGGACGTGAACATCAAGCTCACCAAGCGCCGGCGCGACGGGTGCCTCGCAGCCGCGTCGC GCGCGCTGGACGACCTCCGCCTTGACCTCGTC (2088) CGTGGAGGAGGACGTGAACATCAAGCTCACCAAGCGCCGGCGCGACGGGTGCCTCGCAGCCGCGTCGC GCGCGCTGGACGACCTCCGCCTTGACCTCGTC (2173) CACCTCTCCGGCGGCAAGATCGGTGACTGTCAAATCTACATGTTCAACACCAAGGTACATACGAATAC GATACGTAGCCATTGATCGATCTGTAATTCTG (2173) CACCTCTCCGGCGGCAAGATCGGTGACTGTCAAATCTACATGTTCAACACCAAGGTACATACGAATAC GATACGTAGCCATTGATCGATCTGTAATTCTG (2162) CACCTCTCCGGCGGCAAGATCGGTGACTGTCAAATCTACATGTTCAACACCAAGGTACATACGAATAC GATACGTAGCCATTGATCGATCTGTAATTCTG (2188) CACCTCTCCGGCGGCAAGATCGGTGACTGTCAAATCTACATGTTCAACACCAAGGTACATACGAATAC GATACGTAGCCATTGATCGATCTGTAATTCTG (2188) CACCTCTCCGGCGGCAAGATCGGTGACTGTCAAATCTACATGTTCAACACCAAGGTACATACGAATAC GATACGTAGCCATTGATCGATCTGTAATTCTG (2188) CACCTCTCCGGCGGCAAGATCGGTGACTGTCAAATCTACATGTTCAACACCAAGGTACATACGAATAC GATACGTAGCCATTGATCGATCTGTAATTCTG DAS-CMS30 (2273) TAGCCTGACGATT---------------CCGAGGTTTCTG-------------------- GTGCTAAAAAATGCATCTTTTTTTCTCAGATGACAATGCT (2273) TAGCCTGACGATT---------------CCGAGGTTTCTG-------------------- GTGCTAAAAAATGCATCTTTTTTTCTCAGATGACAATGCT (2262) TAGCCTGACGATT---------------CCGAGGTTTCTG-------------------- GTGCTAAAAAATGCATCTTTTTTTCTCAGATGACAATGCT (2288) TAGCCTGACGATTTCATGCATTACTTTTCCGAGGTTTCTGTGCTATACTACCTAACCTAGGTGCTAAA AAATGCACCTTTTTTTCTCAGATGACAATGCT (2288) TAGCCTGACGATTTCATGCATTACTTTTCCGAGGTTTCTGTGCTATACTACCTAACCTAGGTGCTAAA AAATGCACCTTTTTTTCTCAGATGACAATGCT (2288) TAGCCTGACGATTTCATGCATTACTTTTCCGAGGTTTCTGTGCTATACTACCTAACCTAGGTGCTAAA AAATGCACCTTTTTTTCTCAGATGACAATGCT INTERRUPÇÃO (2338) TTCTGTCTTTGTTCACCGCAGATTCACAAGGGGTCTTCAGTGTTTGCGAGTGCAGTGGCCGGTAGGCT GATGGAAGTGGTGGACGAGTACTAGGCTACCA (2338) TTCTGTCTTTGTTCACCGCAGATTCACAAGGGGTCTTCAGTGTTTGCGAGTGCAGTGGCCGGTAGGCT GATGGAAGTGGTGGACGAGTACTAGGCTACCA (2327) TTCTGTCTTTGTTCACCGCAGATTCACAAGGGGTCTTCAGTGTTTGCGAGTGCAGTGGCCGGTAGGCT GATGGAAGTGGTGGACGAGTACTAGGCTACCA (2388) TTCTGTCTTTGTTCACCGCAGATTCACAAGGGGTCTTCAGTGTTTGCGAGTGCAGTGGCCGGTAGGCT GATGGAAGTGGTGGACGAGTACTAGGCTACCA (2388) TTCTGTCTTTGTTCACCGCAGATTCACAAGGGGTCTTCAGTGTTTGCGAGTGCAGTGGCCGGTAGGCT GATGGAAGTGGTGGACGAGTACTAGGCTACCA (2388) TTCTGTCTTTGTTCACCGCAGATTCACAAGGGGTCTTCAGTGTTTGCGAGTGCAGTGGCCGGTAGGCT GATGGAAGTGGTGGACGAGTACTAGGCTACCA DAS-CMS31 (2438) TGCACTTGAATTTCTAGCTAGCTCTACGTACCGCGCTGCTATGAATCTAGCTATAGCGTTTCTTGGAT GAAAGACTAGTTAGTTGTTACCTTCTATCTTT (2438) TGCACTTGAATTTCTAGCTAGCTCTACGTACCGCGCTGCTATGAATCTAGCTATAGCGTTTCTTGGAT GAAAGACTAGTTAGTTGTTACCTTCTATCTTT (2427) TGCACTTGAATTTCTAGCTAGCTCTACGTACCGCGCTGCTATGAATCTAGCTATAGCGTTTCTTGGAT GAAAGACTAGTTAGTTGTTACCTTCTATCTTT (2488) TGCACTTGAATTTCTAGCTAGCTCTACGTACCGCGCTGCTATGAATCTAGCTATAGCGTTTCTTGGAT GAAAGAATAGTTAGTTGTTACCTTCTATCTTT (2488) TGCACTTGAATTTCTAGCTAGCTCTACGTACCGCGCTGCTATGAATCTAGCTATAGCGTTTCTTGGAT GAAAGAATAGTTAGTTGTTACCTTCTATCTTT (2488) TGCACTTGAATTTCTAGCTAGCTCTACGTACCGCGCTGCTATGAATCTAGCTATAGCGTTTCTTGGAT GAAAGAATAGTTAGTTGTTACCTTCTATCTTT (2538) GCTTCAATTAAATCCGCTTGCTCGTTACAGACTGAGTTTGTTTCTAAATGTCAAGGTTGTTTTGGTCA AATTGAATAAATTGGCACACTGGCCTGTGAGG (2538) GCTTCAATTAAATCCGCTTGCTCGTTACAGACTGAGTTTGTTTCTAAATGTCAAGGTTGTTTTGGTCA AATTGAATAAATTGGCACACTGGCCTGTGAGG (2527) GCTTCAATTAAATCCGCTTGCTCGTTACAGACTGAGTTTGTTTCTAAATGTCAAGGTTGTTTTGGTCA AATTGAATAAATTGGCACACTGGCCTGTGAGG (2588) GCTTCAATTAAATCCGCTTGCTCGTTACAGACTGAGTTTGTTTCTAAATGTCAAGGTTGTTTTGGTCA AATTGAATAAATTGGCACACTGGCCTGTGAGG (2588) GCTTCAATTAAATCCGCTTGCTCGTTACAGACTGAGTTTGTTTCTAAATGTCAAGGTTGTTTTGGTCA AATTGAATAAATTGGCACACTGGCCTGTGAGG (2588) GCTTCAATTAAATCCGCTTGCTCGTTACAGACTGAGTTTGTTTCTAAATGTCAAGGTTGTTTTGGTCA AATTGAATAAATTGGCACACTGGCCTGTGAGG DAS-CMS32 (2638) TTATTATATATATTTATGTGT- TTATTACTGGTCTATTAATTTGTCTTATTATTAATGTATTGCCTGTCAAGGAATAAATGGTATGATGA CCATATTTAT (2638) TTATTATATATATTTATGTGT- TTATTACTGGTCTATTAATTTGTCTTATTATTAATGTATTGCCTGTCAAGGAATAAATGGTATGATGA CCATATTTAT (2627) TTATTATATATATTTATGTGT- TTATTACTGGTCTATTAATTTGTCCTATTATTAATGTATTGCCTGTCAAGGAATAAATGATATGATGA CCATATTTAT (2688) TTATTATAT----TTATGTGTATTATTACTGGTCTATCAATTTGTCCTATTATT--- GTATTGCCTGTCAAGGAATAAATTGTATGATGATCATATTTAT (2688) TTATTATAT----TTATGTGTATTATTACTGGTCTATCAATTTGTCCTATTATT--- GTATTGCCTGTCAAGGAATAAATTGTATGATGATCATATTTAT (2688) TTATTATAT----TTATGTGTATTATTACTGGTCTATCAATTTGTCCTATTATT--- GTATTGCCTGTCAAGGAATAAATTGTATGATGATCATATTTAT DAS-CMS33 (2737) GCATAGATAGGATCGGATGAGTAGGTTCACTTGCTTGAGTTCACCGGTATAATTCCGG--- ----ATACATCTGGTTAGGTCATCCTTTGGTCAGCTGCC (2737) GCATAGATAGGATCGGATGAGTAGGTTCACTTGCTTGAGTTCACCGGTATAATTCCGG--- ----ATACATCTGGTTAGGTCATCCTTTGGTCAGCTGCC (2726) GCATAGATAGGA-----TGAGTAGGTTCACTTGCTTGAGTTCACCGGTATAATTCTGG--- ----ATACATCTGGTTAGGTCATCCTTTGGTCAGCTGCC (2781) GCATAGATAGGA----- TGAGTAGGTTCACTTGCTTGAGTTCACCGGTATAATTCTGGTTTCTGGATACATCTGGTTAGGTCAGC CTTTGGTCAGCTGCC (2781) GCATAGATAGGA----- TGAGTAGGTTCACTTGCTTGAGTTCACCGGTATAATTCTGGTTTCTGGATACATCTGGTTAGGTCAGC CTTTGGTCAGCTGCC (2781) GCATAGATAGGA----- TGAGTAGGTTCACTTGCTTGAGTTCACCGGTATAATTCTGGTTTCTGGATACATCTGGTTAGGTCAGC CTTTGGTCAGCTGCC (2830) CGCAAGCTTAACTCCGTGCGATATACAATATACAGATTTTATTATGGTTTTCCCCTGAACCTTCGTGA CTAACTATGTTATCATTTTTATAGCTTTATAG (2830) CGCAAGCTTAACTCCGTGCGATATACAATATACAGATTTTATTATGGTTTTCCCCTGAACCTTCGTGA CTAACTATGTTATCATTTTTATAGCTTTATAG (2814) CGCAA---------CGTGCGATATACAATATACATATTTTATTATGTTTTT---------- TTCGTGACTAACTATGTTATCATTTTTATAGCTTTATAG (2876) CGCAAGCTTAACTCCGTGCGATATACACTATACAAATTTTATTATGTTTTT---------- TTCGTGACTAACTATGTTATCATTTTTATAGCTTTATAG (2876) CGCAAGCTTAACTCCGTGCGATATACACTATACAAATTTTATTATGTTTTT---------- TTCGTGACTAACTATGTTATCATTTTTATAGCTTTATAG (2876) CGCAAGCTTAACTCCGTGCGATATACACTATACAAATTTTATTATGTTTTT---------- TTCGTGACTAACTATGTTATCATTTTTATAGCTTTATAG DAS-CMS34 (2930) TCTACAAACTGTTTTATACTCAGCTTGATAAGTACATTCTGGTTTGGACGATGG- TTTTTTTTTCTTGCAAAA-TGAATTTGTCTTCAGCCTTTACGACT (2930) TCTACAAACTGTTTTATACTCAGCTTGATAAGTACATTCTGGTTTGGACGATGG- TTTTTTTTTCTTGCAAAA-TGAATTTGTCTTCAGCCTTTACGACT (2895) TCTACAAACTGTTTTATACTCAGCTTGATAAGTACATTCTGGTTTGGACGAT TTTTTTTTCTTGCAAAAATGAATTTGTCTTCAGCCTTTACGACT (2966) TCTACAAACTGTTTTATACTCAGCTTGATAAGTACATTCTGGTTTGGACGATGGTTTTTTTTTTCTTG CAAAAATGAATTTGTCTTCAGCCTTTACGACT (2966) TCTACAAACTGTTTTATACTCAGCTTGATAAGTACATTCTGGTTTGGACGATGGTTTTTTTTTTCTTG CAAAAATGAATTTGTCTTCAGCCTTTACGACT (2966) TCTACAAACTGTTTTATACTCAGCTTGATAAGTACATTCTGGTTTGGACGATGGTTTTTTTTTTCTTG CAAAAATGAATTTGTCTTCAGCCTTTACGACT (3028) ACATACAGTTTAGTT---------------- TGTATTAATTGATACCGGAAGATCAGATTCGGACCACATATAAACAAGGAATATATAGCACGTACTCG C (3028) ACATACAGTTTAGTT---------------- TGTATTAATTGATACCGGAAGATCAGATTCGGACCACATATAAACAAGGAATATATAGCACGTACTCG C (2991) ACATACAGTTTAGTTCTTAGAGTATCTCATCTGTATTAATTGATACCGGAAGA--- GATTCGGGCCACATATAAACAAGGAATATATAGCACGTACTCGC (3066) ACATACAGTTTAGTT---------------- TGTATTAATTGATACCAGAAGATCAGATTCGGACCACATATAAACAAGGAATATATAGCACGTACTCG C (3066) ACATACAGTTTAGTT---------------- TGTATTAATTGATACCAGAAGATCAGATTCGGACCACATATAAACAAGGAATATATAGCACGTACTCG C (3066) ACATACAGTTTAGTT---------------- TGTATTAATTGATACCAGAAGATCAGATTCGGACCACATATAAACAAGGAATATATAGCACGTACTCG C (3112) TGAACCTTAAATATAGTCAGGAAAATAGAGGGTTAACTAAACCGATCCAGAAACCAATTACATTGATA TTGACTCTATTCTTCGTT (SEQ ID NO:5) (3112) TGAACCTTAAATATAGTCAGGAAAATAGAGGGTTAACTAAACCGATCCAGAAACCAATTACATTGATA TTGACTCTATTCTTCGTT (SEQ ID NO:6) (3088) TGAACCTTAAATATAGTCAGGAACATAGAGGGTTAACTAAACCGATCCAGAAACCAATTACATTGATA TTGACTCTATTCTTCGTT (SEQ ID NO:7) (3150) TGAACCTTAAATATAGTCAGGAACATAGAGGGTTAACTAAACCGATCCAGAAACCAATTACATTGATA TTGACTCTATTCTTCGTT (SEQ ID NO:8) (3150) TGAACCTTAAATATAGTCAGGAACATAGAGGGTTAACTAAACCGATCCAGAAACCAATTACATTGATA TTGACTCTATTCTTCGTT (SEQ ID NO:9)

[0056] (3150) TGAACCTTAAATATAGTCAGGAACATAGAGGGTTAACTAAACCGATCCAGAAACCAATTACATTGATA TTGACTCTATTCTTCGTT (SEQ ID NO:10)

[0057] Os códons de começo e interrupção da translação e as posições para os marcadores DAS-CMS21 através de DAS-CMS35 dentro do gene são sublinhados e/ou rotulados.

[0058] Projeto e validação do ensaio específico do gene. Os alinhamentos das sequências de proteína Rf4-bHLH preditos indicaram que todas as três linhagens restauradoras tinham sequências de proteína idênticas e as linhagens não restauradoras eram idênticas (dados não mostrados). Houve quatro alterações de aminoácido entre as linhagens restauradoras e as linhagens não restauradoras: His (H103) a Asn (N103), inserção de Ala (A130), Pro (P266) a Leu (L267) e substituição Tyr (Y186) a Phe (F187) nas linhagens restauradoras. Em comparação com outros ortólogos de monocotilédones, a substituição de Phe (F187) no alelo restaurador de milho foi conservada, e as outras três alterações de aminoácido foram menos conservadas e foram localizadas em sítios variáveis (dados não mostrados). Esta substituição conservada foi utilizada para concepção do ensaio TaqMan® específico do gene. SEQ ID NO: 6 sequências iniciadoras para uma linhagem de CMS-C Iniciador direto 5’-CAACGGCGTCGAGAAGAAG-3’ (SEQ ID NO:11) VIC Repórter 5’-CTCGGCGTCGGCCGCGACGAAGAG-3’ (SEQ ID NO:12) Sonda de rf4(não restauradora)-MGB 5’-ACCGAGAAGTACACCGC-3’ (SEQ ID NO:13) Iniciador reverso 5’-ATTGCAACCCATACTCCACGTA-3’ (SEQ ID NO:14) SEQ ID NO: 8 sequências iniciadoras para uma linhagem de Rf4 Iniciador direto 5’-CAACGGCGTCGAGAAGAAG-3’ (SEQ ID NO:15) FAM Repórter 5’-TCGGCGTCGGCCGCGACGAAGAG-3’ (SEQ ID NO:16) Sonda específica de Rf4 (restauradora)-MGB 5’- CACCGAGAAGTTTACGGC-3’ (SEQ ID NO:17)

[0059] Iniciador reverso 5’-ATTGCAACCCATACTCCACGTA-3’ (SEQ ID NO:18)

[0060]

[0061] Três linhagens de restauração de Rf4 conhecidas e seis linhagens de não restauração foram utilizadas para o teste de ensaio. Uma amostra hemizigota foi preparada pela combinação de uma quantidade igual de DNA da linhagem de Rf4 com uma linhagem de CMS-C. A PCR em tempo real foi utilizada para testar a eficácia do ensaio. Os oligonucleotídeos específicos para o gene Rf4 e para a linhagem de CMS-C correspondente ou não restauradora foram combinados no mesmo ensaio. FAM foi utilizada para monitorar o amplicon de Rf4 das linhagens restauradoras e VIC da CMS-C não restaurador ou linhagens não restauradoras. A fase de amplificação exponencial foi observada a partir dos ciclos 23 a 35 tanto para as linhagens restauradoras de Rf4 quanto para a CMS-C não restauradora ou linhagens não restauradoras (Figs. 1A e 1B).

[0062] Validação da análise de zigosidade TaqMan® de estágio final. Uma população de mapeamento F2 CMS-C/ restauração com 500 indivíduos foi utilizada para validar o ensaio utilizando a PCR TaqMan® de estágio final em vez de utilizar a PCR TaqMan® em tempo real. As vantagens de TaqMan® de estágio final sobre a TaqMan® em tempo real incluem a sua facilidade de uso e alto rendimento. Para a PCR TaqMan® de estágio final, qualquer máquina de PCR regular que pode ajustar as placas de 96 ou 384 reservatórios acrescido de uma leitora de placas que pode ler FAM e VIC é suficiente para executar o ensaio.

[0063] Após a conclusão da PCR TaqMan® e leitura de fluorescência, os dados brutos da intensidade de fluorescência diretamente da leitora de placas foram analisados no sistema de KLIMS. Um gráfico com RFU (unidade de fluorescência relativa) de FAM como eixo x e VIC como eixo y foi gerado. As escalas de zigosidade foram feitas com baseadas na separação de aglomerados em uma visão cluster (Fig. 2). Visto que FAM foi utilizado para monitorizar a amplificação de Rf4 a partir das linhagens restauradoras e VIC para as linhagens não restauradoras/CMS-C, as amostras com fortes sinais de FAM e pouco ou nenhum VIC são homozigotas para o alelo Rf4; as amostras com fortes sinais de VIC e pouco ou nenhum FAM são linhagens não restauradoras/CMS-C (nulos); e amostras com fortes sinais tanto de FAM quanto de VIC são hemizigotas para o alelo Rf4.

[0064] Os dados genotípicos de F2 com base no ensaio da PCR TaqMan® de estágio final específico do gene Rf4 corresponderam completamente com os dados fenotípicos de campo, o que demonstra a eficácia e precisão do ensaio da PCR TaqMan® de estágio final para o teste de zigosidade de Rf4 de uma forma de alto rendimento. Este ensaio permite a triagem em grande escala e de alta produção de germoplasma de milho com o gene de restauração Rf4. Este ensaio também irá aumentar a escala de uso de um sistema de CMS-C/Rf4 para a produção de sementes de milho híbridas.

Claims (21)

1. Método de ensaio de PCR para determinação da zigosidade de um gene Rf4 em uma planta de milho, caracterizado pelo fato de que compreende: executar um primeiro ensaio de PCR utilizando uma primeira sonda, um primeiro iniciador senso, e um primeiro iniciador antissenso sobre um polinucleotídeo de uma amostra da planta de milho, em que o primeiro iniciador compreende SEQ ID NO:3; executar um segundo ensaio de PCR utilizando uma segunda sonda, um segundo iniciador senso, e um segundo iniciador antissenso na amostra de polinucleotídeo, em que o segundo iniciador compreende SEQ ID NO:4; quantificar a primeira e a segunda sondas; e, comparar a primeira e a segunda sondas quantificadas para determinar a zigosidade.

2. Método de ensaio de PCR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a PCR é a PCR em tempo real.

3. Método de ensaio de PCR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: o carregamento de uma mistura de reação de PCR em um tubo de ensaio de PCR; em que a mistura de reação de PCR compreende uma polimerase com atividade de nuclease 5’ a 3’, desoxinucleotídeos, um tampão, o primeiro e o segundo iniciador senso, o primeiro e o segundo iniciador antissenso, a primeira e a segunda sondas e a amostra de polinucleotídeo, e a primeira e a segunda sonda compreendendo fluoróforos com espectros distinguíveis de excitação/emissão; e a execução de uma etapa de amplificação sob as condições de amplificação tais que a atividade de nuclease 5’ a 3’ da polimerase cliva a primeira e a segunda sondas, como definidas na reivindicação 1, liberando assim os fluoróforos compreendendo espectros distinguíveis de excitação/emissão.

4. Método de ensaio de PCR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: o carregamento de uma mistura de reação de PCR em um tubo de ensaio de PCR, em que a mistura de reação de PCR compreende uma polimerase com atividade de nuclease 5’ a 3’, desoxinucleotídeos, um tampão, o primeiro ou o segundo iniciador senso, o primeiro ou o segundo iniciador antissenso, a primeira ou a segunda sonda e a amostra de polinucleotídeo; e a execução de uma etapa de amplificação sob condições tais que a atividade de nuclease 5’ a 3’ da polimerase cliva a primeira ou a segunda sonda, liberando assim os fluoróforos compreendendo espectros distinguíveis de excitação/emissão.

5. Método de ensaio de PCR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as primeira e segunda sondas são quantificadas através da medição dos espectros de excitação/emissão emitidos a partir dos fluoróforos, durante a amplificação.

6. Método de ensaio de PCR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a zigosidade é determinada mediante a comparação da primeira e segunda sondas quantificadas utilizando uma fórmula ΔΔCt.

7. Método de ensaio de PCR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro iniciador senso compreende a SEQ ID NO: 1.

8. Método de ensaio de PCR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro iniciador antissenso compreende a SEQ ID NO: 2.

9. Método de ensaio de PCR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sonda compreende um primeiro fluoróforo e um primeiro inibidor (quencher).

10. Método de ensaio de PCR, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o primeiro fluoróforo compreende um fluoróforo VIC ou um fluoróforo FAM.

11. Método de ensaio de PCR, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o inibidor (quencher) compreende um inibidor (quencher) MGB.

12. Método de ensaio de PCR, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a primeira sonda compreende FAM como o primeiro fluoróforo na extremidade 5’ da primeira sonda e MGB como o primeiro inibidor (quencher) da extremidade 3’ da primeira sonda.

13. Método de ensaio de PCR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a segunda sonda compreende um segundo fluoróforo e um segundo inibidor (quencher).

14. Método de ensaio de PCR, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o segundo fluoróforo compreende um fluoróforo FAM ou um fluoróforo VIC.

15. Método de ensaio de PCR, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o segundo inibidor (quencher) compreende um inibidor (quencher) MGB.

16. Método de ensaio de PCR, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a segunda sonda compreende VIC como o segundo fluoróforo na extremidade 5’ da segunda sonda, e MGB como o segundo inibidor (quencher) na extremidade 3’ da segunda sonda.

17. Método de ensaio de PCR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gene Rf4 compreende uma substituição de dinucleotídeo nas posições de nucleotídeo 1664-1665 como sequências genômicas de Rf4-bHLH indicadas acima (nas posições de aminoácido 186-187).

18. Método de ensaio de PCR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta de milho compreende uma substituição de dinucleotídeo em Rf4 nas posições de nucleotídeo 1664-1665 como sequências genômicas de Rf4-bHLH indicadas acima (nas posições de aminoácido 186-187).

19. Método de ensaio de PCR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta de milho é um germoplasma de milho.

20. Método de ensaio de PCR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta de milho compreende uma parte de planta, órgão de planta, semente de planta ou célula vegetal.

21. Método de ensaio de PCR, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a parte da planta é selecionada a partir do grupo que consiste em folhas, pólen, embriões, cotilédones, hipocótilos, células meristemáticas, raízes, pontas de raízes, anteras, flores, caules e vagens.

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