CN117305496A - 玉米甜味相关snp位点及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了玉米甜味相关SNP位点并进行了应用开发，基于选定SNP位点的基因信息开发分子标记，在分子育种早期检测玉米植株基因组内甜度相关SNP的基因型，由此进行玉米品种的选育；所述甜度相关SNP包括ZmSNP_chr3.13位点和/或ZmSNP_chr3.16位点；所述ZmSNP_chr3.13位点的核苷酸种类为C或T；所述ZmSNP_chr3.16位点的核苷酸种类为G或A。本发明能够通过新玉米甜味基因位点的开发以提高玉米高甜品种的选育效率。

Description

玉米甜味相关SNP位点及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及玉米甜味相关SNP位点及其应用。
背景技术
玉米(Zea mays)是全球产量最大的作物，也是我国产量最大的粮食品种。甜玉米是玉米的一个品种，有丰富的营养、甜、鲜、脆、嫩的特色而深受各阶层消费者青睐，具有减肥、降血压降血脂、增加记忆力、明目等功效。因此，选育甜味玉米是玉米育种的重要方向。
通过分子标记辅助选择技术进行育种是提高玉米育种效率的有效途径，通过利用分子标记在植物发育初期在基因水平对植株进行定向选择，弥补了传统育种中出现的诸多弊端(尹祥佳,李晶,王雅琳,等.SNP标记在玉米分子育种中的应用[J].中国种业,2021(4):4.)。目前，玉米甜味基因研究较少，如Shrunken2(索海翠.甜玉米甜度基因shrunken2序列分析及分子标记研究[D].中山大学,2016.)。
由此可见，开发新的玉米甜味基因既为深入研究玉米甜味机理提供理论基础，又为高甜玉米品种选育提供了技术支撑，是当下亟需研究的一个重要技术课题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是开发新的玉米甜味相关SNP位点并探索其在玉米育种当中的应用。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
一种试剂盒，该试剂盒中至少包含玉米基因组模板DNA，dNTP，缓冲液，尤其包含用于检测/区分玉米甜度相关单核苷酸多态性位点ZmSNP_chr3.13的基因型的引物。
作为本发明的一种优选技术方案，所述玉米甜度相关单核苷酸多态性位点ZmSNP_chr3.13对应于序列表中SEQ ID No.1的第101位核苷酸，其碱基为C或T；当所述ZmSNP_chr3.13位点的基因型为C/C纯合时，相较其他基因型玉米具有更高的甜度。
作为本发明的一种优选技术方案，所述引物包含：具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的前引物1、具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的前引物2、具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的后引物。
上述试剂盒的用途，在玉米育种早期基于分子标记辅助选择MAS技术用于辅助区分和/或辅助鉴定待测玉米的甜度和/或待测玉米的甜味物质含量。
一种试剂盒，该试剂盒中至少包含玉米基因组模板DNA，dNTP，缓冲液，尤其包含用于检测/区分玉米甜度相关单核苷酸多态性位点ZmSNP_chr3.16的基因型的引物。
作为本发明的一种优选技术方案，所述玉米甜度相关单核苷酸多态性位点ZmSNP_chr3.16对应于序列表中SEQ ID No.2的第101位核苷酸，其碱基为G或A；当所述ZmSNP_chr3.13位点的基因型为G/G纯合时，相较其他基因型玉米具有更高的甜度。
作为本发明的一种优选技术方案，所述引物包含：具有SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的前引物1、具有SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的前引物2、具有SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的后引物。
上述试剂盒的用途，在玉米育种早期基于分子标记辅助选择MAS技术用于辅助区分和/或辅助鉴定待测玉米的甜度和/或待测玉米的甜味物质含量。
控制玉米中甜味物质含量和/或控制玉米甜度的分子育种方法，基于选定SNP位点的基因信息开发分子标记，在分子育种早期检测玉米植株基因组内甜度相关SNP的基因型，由此进行玉米品种的选育；所述甜度相关SNP包括ZmSNP_chr3.13位点和/或ZmSNP_chr3.16位点；所述ZmSNP_chr3.13位点的核苷酸种类为C或T，为序列表中SEQ ID No.1的第101位核苷酸；所述ZmSNP_chr3.16位点的核苷酸种类为G或A，为序列表中SEQ ID No.2的第101位核苷酸；当所述ZmSNP_chr3.13位点的基因型为C/C纯合时，和/或所述ZmSNP_chr3.13位点的基因型为G/G纯合时，相较其他基因型玉米具有更高的甜度。
引物对组合，包括由SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5组成的引物对，和/或由SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8组成的引物对；两组引物对单独或组合用于玉米甜度相关SNP基因型的检测或辅助检测，或者用于玉米甜度表型的鉴定或辅助鉴定。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明通过新玉米甜味基因位点的开发以提高玉米高甜品种的选育效率。本发明利用玉米甜味差异材料制备定位群体，挖掘与甜味相关的基因位点，该位点可用于商业化玉米甜味分子育种；例如基于分子标记辅助选择MAS技术，可在育种早期进行分子标记辅助选择，淘汰甜味低的玉米单株，降低育种成本，加快高甜玉米品种选育的进程。
附图说明
图1为定位群体的全基因组标记QTLs连锁图谱。
图2为分型良好的SNP引物图；图中，a)为ZmSNP_chr3.13引物，b)为ZmSNP_chr3.16引物。
图3为位点ZmSNP_chr3.13和ZmSNP_chr3.16的测序结果与参考序列比对图；图中，a)为ZmSNP_chr3.13位点的序列比对图，b)为ZmSNP_chr3.16位点的序列比对图。
图4为Zh88N41_F2群体的KASP引物分型图；图中，a)为ZmSNP_chr3.13引物，b)为ZmSNP_chr3.16引物。
具体实施方式
以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。应当理解，当在本申请说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。还应当理解，在本申请说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。
如在本申请说明书和所附权利要求书中所使用的那样，术语“如果”可以依据上下文被解释为“当...时”或“一旦”或“响应于确定”或“响应于检测到”。类似地，短语“如果确定”或“如果检测到[所描述条件或事件]”可以依据上下文被解释为意指“一旦确定”或“响应于确定”或“一旦检测到[所描述条件或事件]”或“响应于检测到[所描述条件或事件]”。另外，在本申请说明书和所附权利要求书的描述中，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。在本申请说明书中描述的参考“一个实施例”或“一些实施例”等意味着在本申请的一个或多个实施例中包括结合该实施例描述的特定特征、结构或特点。由此，在本说明书中的不同之处出现的语句“在一个实施例中”、“在一些实施例中”、“在其他一些实施例中”、“在另外一些实施例中”等不是必然都参考相同的实施例，而是意味着“一个或多个但不是所有的实施例”，除非是以其他方式另外特别强调。术语“包括”、“包含”、“具有”及它们的变形都意味着“包括但不限于”，除非是以其他方式另外特别强调。
实施例1、玉米不同材料的甜度鉴定和基因定位群体的制备
为获取不同甜度的玉米材料，首先对8份玉米品种材料进行田间种植，每个品种作3个小区重复，每个小区种植8行，常规栽培和管理，种植工作在田间试验基地开展。对8份玉米品种材料进行籽粒含糖量检测，检测方法如下：用榨汁机分别榨出每个植株玉米籽粒的汁液于准备好的干净且干燥的培养皿中，再用移液器吸取50μL，用手持测糖仪(PAL-1)测定含糖量。为了降低测糖仪的测定误差，每次每个植株籽粒汁液重复测定3次，取其平均值作为该植株的茎秆汁液含糖量。甜度的判断阈值如下：含糖量为0-6％为普甜，6％-10％为中甜，10％以上为高甜。8份测试材料的籽粒含糖量检测结果结果见表1。
表1.八份测试玉米品种的籽粒含糖量数据
材料名称 含糖量(％) 甜度 材料名称 含糖量(％) 甜度
闽双色6号 15.39 高甜 普甜8914 8.73 中甜
隆创310 3.62 普甜 沃玉3号 4.31 普甜
美玉8号 14.87 高甜 农大372 5.46 普甜
和育187 4.13 普甜 郑58 4.43 普甜
为制备基因定位群体，以美玉8号为父本，郑58为母本进行杂交，获得一个包含358个单株的杂交群体。经连续自交至F2代，获得F2代定位群体。种植与杂交工作在田间试验基地开展，常规栽培和管理。
实施例2、连锁基因位点定位和分子标记开发与优化
为获得与玉米甜味连锁的基因位点，对上述F2代定位群体进行田间种植和籽粒含糖量检测，田间种植工作在田间试验基地开展，籽粒含糖量检测方法参照实施例1。然后，利用实验室自研的216对玉米背景遗传标记对358份单株进行DNA提取和基因型检测。DNA提取和基因型检测方法如下：
1)DNA提取：采用常规CTAB法从玉米叶片中提取基因组DNA；
2)KASP反应测试选择Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测
1.6μL PCRArrayTape平台检测反应体系包括：含基因组DNA50 ng/μL 0.8μL，引物混液0.03μL(优选引物混液配比：正向引物Primer X、PrimerY 100pmol·L-1各12μL，反向引物Primer R 100pmol·L-1 30μL,ddH2O 46μL，使用其他合理的引物混液配比也可以达到相同的检测目的)，LGC公司2×KASP Mix(StdRox)0.8μL，根据ArrayTape平台仪器操作手册，编写样品表，运行程序，读取数据。
其中，2×KASP Mix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真Taq酶，dNTP，Mg2+等组成，荧光探针A的核苷酸序列为：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，5’末端连接一个VIC荧光基团；荧光探针B的核苷酸序列为：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(SEQID NO.9)，其5’端连接一个FAM荧光基团；淬灭探针A的核苷酸序列为：5’-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3’(SEQ ID NO.10)，其3’端连接一个淬灭基团BHQ；淬灭探针B的核苷酸序列为：5’-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3’(SEQ ID NO.11)，其3’端连接一个淬灭基团BHQ。扩增程序：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55-62℃(优选55℃)退火60s，设置40个循环。
经籽粒含糖量检测分析，358个F2群体单株中，81株为高甜度单株，191株为中甜度单株，86株为低甜度单株。经卡方测验，群体分离比符合1:2:1，利用Windows QTLcartographer对甜度性状的表型值与基因型进行基因定位。采用复合区间作图法进行全基因组扫描，窗口大小设置为10cM，模型选择Model 6(The standardmodel)进行正反向回归运算。在P＝0.05水平下，经1000次置换检验(Permutation Test)确定控制甜度性状位点的LOD值阈值为10.73(图1)。经分析，筛选出2个基因位点，分别为ZmSNP_chr3.13和ZmSNP_chr3.16，表明上述位点与玉米甜味基因遗传连锁度高，可以用于玉米甜味基因检测。
对位点ZmSNP_chr3.13和ZmSNP_chr3.16进行连锁度分析，两位点为高度连锁位点，认为是控制玉米甜度的主效位点。为更好地应用基因位点ZmSNP_chr3.13和ZmSNP_chr3.16进行甜味玉米选育，对该位点分子标记进行优化。方法如下：从NCBI数据库(Reference genome Zm-B73-REFERENCE-NAM-5.0)下载ZmSNP_chr3.13和ZmSNP_chr3.16基因位点的侧翼序列，并利用Primer5.0软件设计引物，利用Douglas平台检测(图2)。所述用于检测玉米甜味基因位点ZmSNP_chr3.13和ZmSNP_chr3.16的SNP标记引物具体如下：
ZmSNP_chr3.13引物信息：
ZmSNP_chr3.13-F1：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCAGGACATATTTTTCAAACAAC-3’(SEQ ID No.3)
ZmSNP_chr3.13-F2：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCAGGACATATTTTTCAAACAAT-3’(SEQ ID No.4)
ZmSNP_chr3.13-R：5’-GCAAACATGCATAGGCATATCA-3’(SEQ ID No.5)
ZmSNP_chr3.16引物信息：
ZmSNP_chr3.16-F1：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGACTCATGCAACCAACCATCG-3’(SEQ ID No.6)
ZmSNP_chr3.16-F2：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGACTCATGCAACCAACCATCA-3’(SEQ ID No.7)
ZmSNP_chr3.16-R：5’-ATAGCAAAGGCCAAGGGCAAAATTG-3’(SEQ ID No.8)
为确认核酸组合物的特异性，将PCR的扩增产物进行克隆测序，克隆测序委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行。将测序结果与玉米参考基因组(Reference genomeZm-B73-REFERENCE-NAM-5.0)对比(图3)，对比结果显示两个引物探针组合的扩增产物确实为玉米位点ZmSNP_chr3.13和ZmSNP_chr3.16的片段，符合预期。
实施例3、玉米甜味SNP在分子标记辅助选择甜味玉米植株中的应用
为检测本发明ZmSNP_chr3.13和ZmSNP_chr3.16位点的实用性，利用不同甜度材料闽双色6号与郑58杂交获得F1群体，通过F1天然自交产生F2分离群体136株。对分离群体进行SNP标记检测和含糖量检测(表2)，标记检测和籽粒含糖量检测实施方法参考实施例1(图4)。对位点ZmSNP_chr3.13和ZmSNP_chr3.16的数据进行连锁度分析，两位点连锁强度达到100％，表明两位点可以互相验证，开发为双重位点体系可提高结果的准确性。对籽粒含糖量数据与基因型数据进行一致性分析，ZmSNP_chr3.13位点基因型为C/C或ZmSNP_chr3.16位点基因型为G/G植株共有32株，其中含糖量检测结果为高甜的单株为28株，高甜单株筛选效率为87.5％。结果表明，同时使用位点ZmSNP_chr3.13和ZmSNP_chr3.16进行高甜单株筛选的效率高且结果稳定，同时也表明基因位点ZmSNP_chr3.13和ZmSNP_chr3.16在玉米高甜植株筛选中具有较高的实用性。
表2.群体的籽粒含糖量表型数据与基因型信息
注：；‘*’表示无检测信号。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述或记载的部分，可以参见其它实施例的相关描述。
综合上述实施例可见，本发明开发了2个新的玉米甜味基因位点ZmSNP_chr3.13和ZmSNP_chr3.16，开发出相应的SNP分子标记进行基因快速分型鉴定，应用于玉米分子育种；同时上述位点的表型选择效率较高，可快速、精准的检测玉米的甜味基因；并且检测过程简单、高效、安全，无气溶胶污染以及溴化乙锭等有毒物的使用，可在育种早期进行分子标记辅助选择，淘汰甜度较低的玉米单株，提高选育效率，加快高甜玉米品种的选育进程。
以上所述实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种试剂盒，该试剂盒中至少包含玉米基因组模板DNA，dNTP，缓冲液，尤其包含用于检测/区分玉米甜度相关单核苷酸多态性位点ZmSNP_chr3.13的基因型的引物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述玉米甜度相关单核苷酸多态性位点ZmSNP_chr3.13对应于序列表中SEQ ID No.1的第101位核苷酸，其碱基为C或T；当所述ZmSNP_chr3.13位点的基因型为C/C纯合时，相较其他基因型玉米具有更高的甜度。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述引物包含：具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的前引物1、具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的前引物2、具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的后引物。
4.权利要求1或2或3所述的试剂盒的用途，其特征在于：在玉米育种早期基于分子标记辅助选择MAS技术用于辅助区分和/或辅助鉴定待测玉米的甜度和/或待测玉米的甜味物质含量。
5.一种试剂盒，该试剂盒中至少包含玉米基因组模板DNA，dNTP，缓冲液，尤其包含用于检测/区分玉米甜度相关单核苷酸多态性位点ZmSNP_chr3.16的基因型的引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述玉米甜度相关单核苷酸多态性位点ZmSNP_chr3.16对应于序列表中SEQ ID No.2的第101位核苷酸，其碱基为G或A；当所述ZmSNP_chr3.13位点的基因型为G/G纯合时，相较其他基因型玉米具有更高的甜度。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述引物包含：具有SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的前引物1、具有SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的前引物2、具有SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的后引物。
8.权利要求5或6或7所述的试剂盒的用途，其特征在于：在玉米育种早期基于分子标记辅助选择MAS技术用于辅助区分和/或辅助鉴定待测玉米的甜度和/或待测玉米的甜味物质含量。
9.控制玉米中甜味物质含量和/或控制玉米甜度的分子育种方法，其特征在于：基于选定SNP位点的基因信息开发分子标记，在分子育种早期检测玉米植株基因组内甜度相关SNP的基因型，由此进行玉米品种的选育；所述甜度相关SNP包括ZmSNP_chr3.13位点和/或ZmSNP_chr3.16位点；所述ZmSNP_chr3.13位点的核苷酸种类为C或T，为序列表中SEQ IDNo.1的第101位核苷酸；所述ZmSNP_chr3.16位点的核苷酸种类为G或A，为序列表中SEQ IDNo.2的第101位核苷酸；当所述ZmSNP_chr3.13位点的基因型为C/C纯合时，和/或所述ZmSNP_chr3.13位点的基因型为G/G纯合时，相较其他基因型玉米具有更高的甜度。
10.引物对组合，包括由SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5组成的引物对，和/或由SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8组成的引物对；两组引物对单独或组合用于玉米甜度相关SNP基因型的检测或辅助检测，或者用于玉米甜度表型的鉴定或辅助鉴定。
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