BR102014005635B1 - Método para identificação de pelo menos um determinante de resistência à phytophthora em uma planta de soja - Google Patents

Abstract

MARCADORES DE SOJA LIGADOS À RESISTÊNCIA À PHYTOPHTHORA. Esta descoberta diz respeito a composições e a métodos para identificação do fenótipo resistente à phytophthora em soja. Em algumas modalidades, a descoberta diz respeito a métodos para realizar reprodução assistida por marcadores e seleção de plantas carregando um ou mais determinantes de resistência à phytophthora em soja. Em algumas modalidades, a descoberta diz respeito a métodos para detectar resistência à phytophthora em soja através do uso de uma reação de amplificação.

Description

[001] Este requerimento reivindica o benefício do Requerimento de Patente Provisória dos Estados Unidos No. 61/777.575 o qual foi depositado junto ao Escritório de Patentes e Marcas dos Estados Unidos (N.T.: U.S. Patent and Trademark Office) em 12 de março de 2013, cuja descrição completa é por este incorporada por meio de referência em sua totalidade.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SUBMETIDA ELETRONICAMENTE

[002] A cópia oficial da listagem de sequências é submetida ele tronicamente através da EFS-Web como uma listagem de sequências em formato ASCII com um arquivo denominado "Marcadores Ligados à Phytophthora", criado em 11 de dezembro de 2012, e tendo um tamanho de 29.172 bytes e é depositado simultaneamente com a especificação. A listagem de sequências contida neste documento em formato ASCII é parte da especificação e é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência em sua totalidade.

CAMPO DA DESCOBERTA

[003] A presente descoberta refere-se à resistência a doenças em plantas. Em algumas modalidades, a descoberta refere-se à resistência à phytophthora em soja. Em modalidades particulares, a descoberta refere-se a composições e a métodos para identificação de um traço de resistência à phytophthora em um organismo. Exemplos incluem marcadores moleculares que são firmemente ligados a traços de resistência à phytophthora e testes de detecção de amplificação que podem detectar os marcadores moleculares que são firmemente ligados a traços de resistência à phytophthora. Modalidades adicionais referem-se a composições e a métodos para introduzir um traço de resistência à phytophthora em um organismo hospedeiro, por exemplo, usando marcadores moleculares firmemente ligados à resistência à phytophthora.

ANTECEDENTES

[004] A soja, Glycine max, é uma das principais colheitas econô micas cultivadas no mundo inteiro como uma fonte primária de proteína e óleo vegetal. A crescente demanda de dietas de baixo teor de colesterol e alto teor de fibras tem aumentado a importância da soja como um alimento. Atualmente foram introduzidas mais de 10.000 variedades de soja nos Estados Unidos, das quais um número limitado forma a base genética de linhagens desenvolvidas a partir de programas de hibridização e de seleção. Johnson and Bernard, The Soybean, Norman Ed., Academic Press, N.Y., pp. 1-73, 1963.

[005] Phytophthora é uma doença altamente destrutiva em soja, e somente fica atrás do nematódeo do cisto da soja em provocar danos às colheitas de soja. Esta doença provoca uma perda de produção anual de 300 milhões de dólares (US) na América do Norte (Wrather, J. A., and S. R. Koenning, (2006) Estimates of disease effects on soybean yields in the United States 2003 to 2005. J Nematol 38: 173180), e ocorre na maioria das áreas de cultivo de soja em muitos países diferentes. Phytophthora sojae, é um patógeno oomiceto, transmitido pelo solo, e pode causar podridão da raiz e do caule (PRR) de Phytophthora, pré- e pós-emergência de tombamento, amarelecimento e murchamento de folhas inferiores, e a morte de plantas de soja. Foram identificadas mais de cinquenta e cinco raças de P. sojae (Slamin- koet al., (2010) Multi-year evaluation of commercial soybean lines for resistance to Phytophthora sojae. Plant Disease 94). O desenvolvi-mento de resistência da linhagem de soja é um dos métodos primários para controlar esta doença. Os traços Rps1-c (50%), Rps1-k (40%), e Rps1-a (10%) são os genes mais comumente usados que são intro- gredidos no germoplasma de modo a proporcionar proteção contra P. sojae (Slaminko et al., 2010).

[006] Marcadores que são ligados ao traço de resistência à phytophthora, Rps1-k, incluem RFLPs, SSRs e SNPs. Os marcadores identificados nesta descoberta podem ser usados para genotipagem de resistência à phytophthora em suporte a um programa de reprodução. O uso dos marcadores presentemente revelados para realizar genotipagem de resistência à phytophthora em suporte a um programa de reprodução proporciona: economia de custo e de tempo; seleção precoce da progênie desejada; e comercialização mais precisa e rápida de variedades de soja resistentes à phytophthora.

BREVE SUMÁRIO DA DESCOBERTA

[007] Marcadores moleculares que são ligados a um fenótipo de resistência à phytophthora podem ser usados para facilitar a seleção assistida por marcadores para o traço de resistência à phytophthora em soja. Seleção assistida por marcadores proporciona significativas vantagens com respeito a tempo, custo, e mão de obra, em comparação com fenotipagem de resistência à phytophthora. Surpreendentemente, é revelado aqui, neste requerimento de patente, que entre 115 marcadores de SNPs identificados como estando dentro de ou próximos às regiões de QTL de resistência à doença por phytophthora no genoma da soja que foram polimórficos nos genótipos parentais, somente 10 foram ligados ao traço de resistência à phytophthora. Estes 10 marcadores de SNP oferecem utilidade superior em seleção assis-tida por marcadores de variedades de sojas resistentes à phytophtho- ra.

[008] São descritos como modalidades aqui, neste requerimento de patente, marcadores moleculares de ácido nucleico que são ligados a (por exemplo, ligados; firmemente ligados; ou extrema e firmemente ligados) um fenótipo de resistência à phytophthora. Em modalidades particulares, os marcadores moleculares podem ser marcadores de SNPs. Além disso são descritos aqui, neste requerimento de patente, métodos de utilização de marcadores moleculares de ácido nucleico que são ligados a um fenótipo de resistência à phytophthora, por exemplo e sem limitação, para identificar plantas com um fenótipo de resistência à phytophthora; para introduzir um fenótipo de resistência à phytophthora em novos genótipos de plantas (por exemplo, através de reprodução assistida por marcadores ou transformação genética); e para cultivar plantas que são prováveis de ter um fenótipo de resistência à phytophthora.

[009] Em uma modalidade, estão meios para introduzir um fenó- tipo de resistência à phytophthora em soja e meios para identificação de plantas tendo um fenótipo de resistência à phytophthora. Em algumas modalidades, um meio para introduzir um fenótipo de resistência à phytophthora em soja pode ser um marcador que é ligado (por exemplo, ligado; firmemente ligado; ou extremamente firmemente ligado) a um fenótipo de resistência à phytophthora. Em algumas modalidades, um meio para identificação de plantas tendo um fenótipo de resistência à phytophthora pode ser uma sonda que especificamente hibridiza a um marcador que é ligado (por exemplo, ligado; firmemente ligado; ou extremamente firmemente ligado) a um fenótipo de resistência à phytophthora.

[0010] Em uma modalidade, são proporcionados métodos de iden tificar uma planta de soja que apresenta resistência à infestação por phytophthora, compreendendo detectar no germoplasma da planta de soja pelo menos um alelo de um lócus de marcador. O lócus de marcador está localizado dentro de um intervalo cromossômico compreendendo e flanqueado por NCSB_000559 e NCSB_000582; e pelo menos um alelo está associado com resistência à phytophthora. O ló- cus de marcador pode ser selecionado entre qualquer um dos seguintes loci de marcadores NCSB_000559, Gmax7x198_656813, SNP18196, NCSB_000575, Gmax7x259_44054, SNP18188, Gmax7x259_98606, BARC_064351_18628, BARC_064351_18631, e NCSB_000582, bem como qualquer outro marcador que é ligado a estes marcadores. O lócus de marcador pode ser encontrado sobre o cromossoma 3, dentro do intervalo compreendendo e flanqueado por NCSB_000559 e NCSB_000582, e compreende pelo menos um alelo que é associado com resistência à phytophthora. Plantas de soja identificadas por este método também são de interesse.

[0011] Em outra modalidade, são proporcionados métodos para identificação de plantas de soja com resistência à infestação por phytophthora por detecção de um haplótipo no germoplasma da planta de soja. O haplótipo compreende alelos em um ou mais loci de marcadores, em que o um ou mais loci de marcadores são encontrados sobre o cromossoma 3 dentro do intervalo compreendendo e, flanqueado por, PZE- NCSB_000559 e NCSB_000582. O haplótipo compreende alelos em um ou mais loci de marcadores, em que o um ou mais loci de marcadores são encontrados sobre o cromossoma 3 e são selecionados entre o grupo consistindo em: NCSB_000559, Gmax7x198_656813, SNP18196, NCSB_000575, Gmax7x259_44054, SNP18188, Gmax7x259_98606, BARC_064351_18628, BARC_064351_18631, e NCSB_000582. O haplótipo está associado com resistência à phytophthora.

[0012] Em uma modalidade adicional, são proporcionados méto dos de seleção de plantas com resistência à infestação por phytophthora. Em um aspecto, é obtida uma primeira planta de soja que tem pelo menos um alelo de um lócus de marcador, em que o ale- lo está associado com resistência à phytophthora. O lócus de marcador pode ser encontrado sobre o cromossoma 3, dentro do intervalo compreendendo e flanqueado por NCSB_000559 e NCSB_000582. A primeira planta de soja pode ser cruzada com uma segunda planta de soja, e a progênie resultante do cruzamento pode ser avaliada para o alelo da primeira planta de soja. As plantas da progênie que possuem o alelo da primeira planta de soja podem ser selecionadas como tendo resistência à phytophthora. As plantas de soja selecionadas por este método também são de interesse.

[0013] Também são descritos aqui, neste requerimento de paten te, plantas e materiais de plantas que são derivados de plantas tendo um fenótipo de resistência à phytophthora conforme identificado usando os marcadores moleculares descritos aqui, neste requerimento de patente. Portanto, são descritas plantas de soja que são produzidas por seleção assistida por marcadores usando um ou mais marcadores moleculares que são ligados a um fenótipo de resistência à phytophthora.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0014] A FIG. 1 ilustra a estratégia de desenvolvimento de marca dores de SNPs específicos para Rps1-k.

[0015] A FIG. 2 inclui um exemplo dos resultados de um gráfico de distribuição de um teste KASPAR™ que foi classificado com base em Unidades de Fluorescência Relativa (RFU).

[0016] A FIG. 3 inclui o mapa físico de marcadores de SNPs poli- mórficos identificados sobre o cromossoma 3. BARC_064351_18628 foi localizado a grosso modo no mesmo lócus que BARC_064351_18631. A Figura 3 adicionalmente ilustra um intervalo cromossômico. Este intervalo, localizado sobre o cromossoma 3, compreende e é flanqueado por PZE- NCSB_000559 e NCSB_000582. Um subintervalo do intervalo cromossômico NCSB_000559 e NCSB_000582 é NCSB_000575 e Gmax7x259_44054.

[0017] A FIG. 4 descreve um gráfico de distribuição, baseado em Unidades de Fluorescência Relativa (RFU), do teste específico para Rps1-k TAQMAN™ desenvolvido a partir do marcador de SNP, BARC_064351_18631.

DESCRIÇÃO DETALHADA I. Visão Geral de várias modalidades

[0018] Modalidades particulares incluem dez marcadores de SNPs exemplares (NCSB_000559, Gmax7x198_656813, SNP18196, NCSB_000575, Gmax7x259_44054, SNP18188, Gmax7x259_98606, BARC_064351_18628, BARC_064351_18631, e NCSB_000582) que mostram cossegregação com o traço de resistência à phytophthora, Rps1-k, nas linhagens de soja testadas.

[0019] Marcadores que cossegregam com resistência à phytophthora são ligados a este traço, e portanto podem ser úteis na seleção e na reprodução assistidas por marcadores. Além disso é revelada aqui, neste requerimento de patente, uma estratégia usada para identificar os marcadores de SNPs exemplares ligados a resistência à phytophthora. Além disso, é revelado aqui, neste requerimento de patente, um teste de detecção de amplificação que pode detectar os marcadores de SNPs exemplares. São proporcionadas as posições de mapa físico destes marcadores de SNPs exemplares no genoma da Glycine max. Usando os marcadores de SNPs exemplares descritos aqui, neste requerimento de patente, foi desenvolvido um teste de amplificação à base de fret específico usando o sistema de genotipagem de SNPs por PCR Alelo-Específico Competitivo da KBiosciences (KBiosciences Competitive Allele-Specific PCR genotyping system) (KASPAR™) e o teste de sonda de hidrólise TAQMAN™ para identificar de modo rápido e preciso plantas carregando o traço de resistência à phytophthora. Enquanto modalidades da descoberta são descritas com referência aos marcadores de SNPs exemplares ligados à resistência à phytophthora, as pessoas versadas na técnica reconhecerão que marcadores equivalentes adicionais podem ser identificados usando as técnicas descritas aqui, neste requerimento de patente. Marcadores de SNPs ligados à resistência à phytophthora podem ser usados, por exemplo, em genotipagem de phytophthora para selecionar plantas resistentes à phytophthora a partir de populações de reprodução de soja.

[0020] Infestação por phytophthora pode ser causada por uma ou mais diferentes cepas de Phytophthora spp. A resistência para esta doença pode ser proporcionada por diferentes genes resistentes localizados sobre diferentes grupos de ligação. Vide, por exemplo, a Tabela 1.

[0021] A estratégia descrita aqui, neste requerimento de patente, é usada para identificar marcadores em outros grupos de ligação desconhecidos que são ligados a resistência à phytophthora. Portanto, são proporcionados métodos para identificação de semelhantes marcadores e um método de amplificação para detectar os marcadores em tecido de planta. A estratégia geral também é usada para mapear outros traços de interesse. A estratégia é mais eficiente do que estratégias de mapeamento tradicionais e pode ser particularmente útil em programas de reprodução molecular. Tabela 1: Fontes de resistência à phytophthora reportadas na literatu ra.

II. Termos

[0022] População de mapeamento: Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "população de mapeamento" pode referir-se a uma população de plantas usadas para mapeamento genético. Populações de mapeamento são tipicamente obtidas a partir de cruzamentos controlados de genótipos parentais. Decisões sobre a seleção de plantas-mãe e o projeto de acasalamento para o desenvolvimento de uma população de mapeamento, e o tipo de marcadores usados, dependem do gene a ser mapeado, da disponibilidade de marcadores, e do mapa molecular. As plantas-mãe dentro de uma população de mapeamento devem ter variação suficiente para o um ou mais traços de interesse tanto no nível de sequência de ácido nucleico quanto de fenótipo. A variação da sequência de ácido nucleico das plantas-mãe é usada para traçar eventos de recombinação nas plantas da população de mapeamento. A disponibilidade de marcadores poli- mórficos informativos é dependente da quantidade de variação das sequências de ácido nucleico.

[0023] Retrocruzamento: Métodos de retrocruzamento podem ser usados para introduzir uma sequência de ácido nucleico em plantas. A técnica de retrocruzamento tem sido amplamente usada por décadas para introduzir novos traços em plantas. Jensen, N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988. Em um típico protocolo de retrocruzamento, a variedade original de interesse (planta-mãe recorrente) é cruzada com uma segunda variedade (planta-mãe não recorrente) que carrega um gene de interesse a ser transferido. A pro- gênie resultante deste cruzada é então cruzada de novo com a planta- mãe recorrente, e o processo é repetido até ser obtida uma planta em que essencialmente todas as características morfológicas e fisiológica desejadas da planta recorrente são recuperadas na planta convertida, além do gene transferido a partir da planta-mãe não recorrente.

[0024] O termo "alelo" refere-se a uma de duas ou mais sequên cias de nucleotídeos diferentes que ocorrem em um lócus específico.

[0025] Um "amplicon" é ácido nucleico amplificado, por exemplo, um ácido nucleico que é produzido por amplificação de um ácido nu- cleico modelo por qualquer método de amplificação disponível (por exemplo, PCR, LCR, transcrição ou semelhante).

[0026] O termo "amplificação" no contexto de amplificação de áci do nucleico é qualquer processo por meio do qual são produzidas cópias adicionais de um ácido nucleico selecionado para uma forma transcrita do mesmo. Métodos de amplificação típicos incluem vários métodos de replicação à base de polimerase, incluindo a reação de cadeia polimerase (PCR), métodos mediados por ligase tais como a reação de cadeia ligase (LCR) e métodos de amplificação à base de polimerase de RNA (por exemplo, por transcrição).

[0027] O termo "montagens" se aplica a cromossomas artificiais bacterianos (BACs) e a suas tendências a se unirem para formar trechos contíguos de DNA. Um cromossoma artificial bacteriano "se une" a um contig com base em alinhamento de sequência, se o BAC for se- quenciado, ou através do alinhamento da impressão digital deste BAC com as impressões digitais de outros BACs. As montagens podem ser encontradas usando o website Phytozome, o qual está disponível publicamente na Internet.

[0028] Um "haplótipo" é o genótipo de um indivíduo em uma plura lidade de loci genéticos, isto é, uma combinação de alelos. Tipicamente, os loci genéticos descritos por um haplótipo são ligados fisicamente e geneticamente, isto é, sobre o mesmo segmento de cromossoma. O termo "haplótipo" pode se referir a sequência, polimorfismos em um lócus em particular, tal como um único lócus de marcador, ou polimorfismos de sequência em múltiplos loci ao longo de um segmento cro- mossômico em um dado genoma. O precedente também pode ser referido como "haplótipos marcadores" ou "alelos marcadores", enquanto que o último pode ser referido como "haplótipos de longo alcance".

[0029] Um alelo é "associado com" um traço quando é ligado a este e quando a presença do alelo é um indicador de que o traço desejado ou forma de traço ocorrerá em uma planta compreendendo o alelo.

[0030] Sistema de genotipagem de SNPs por PCR Alelo- Específico Competitivo da KBiosciences (KASPAR™, KBiosciences Competitive Allele-Specific PCR SNP genotyping system): KASPAR™ é um sistema fluorescente homogêneo disponível comercialmente para determinação dos genótipos de SNPs (KBiosciences Ltd., Hoddes- don, Reino Unido). Um teste KASPAR™ compreende uma "mistura de teste" SNP-específico, a qual contém três iniciadores não etiquetados, e uma "mistura da reação," a qual contém todos os outros componentes requeridos; por exemplo, um sistema de comunicação fluorescente universal. Além destas misturas, o utilizador proporciona, entre outros, uma leitora de placas com capacidade de FRET, uma ou mais placas de microtítulo, e amostras de DNA que contêm cerca de 5 ng/L de DNA.

[0031] Intervalo cromossômico: Um intervalo cromossômico desig na um trecho linear contíguo de DNA genômico que está presente na planta sobre um único cromossoma. Os elementos genéticos ou genes localizados sobre um único intervalo cromossômico são fisicamente ligados. O tamanho de um intervalo cromossômico não é particularmente limitado. Em alguns aspectos, os elementos genéticos localizados dentro de um único intervalo cromossômico são geneticamente ligados, tipicamente com uma distância de recombinação genética de, por exemplo, menos de ou igual a 20 cM, ou alternativamente, menos de ou igual a 10 cM. Isto é, dois elementos genéticos dentro de um único intervalo cromossômico sofrem recombinação em uma frequência de menos de ou igual a 20% ou 10%.

[0032] O termo "intervalo cromossômico" designa qualquer um e todos os intervalos definidos por qualquer um dos marcadores estipulados desta invenção. É proporcionado um intervalo cromossômico que se correlaciona com resistência à phytophthora. Este intervalo, localizado sobre o cromossoma 3, compreende e é flanqueado por PZE- NCSB_000559 e NCSB_000582. Um subintervalo do intervalo cromossômico NCSB_000559 e NCSB_000582 é NCSB_000575 e Gmax7x259_44054.

[0033] Um típico teste KASPAR™ compreende as etapas de: pro jeto de iniciadores alelo-específicos; preparação da mistura da reação incluindo os iniciadores alelo-específicos; mistura a mistura da reação com amostras de DNA em uma placa de microtítulo; termociclagem; leitura da placa em uma leitora de placa fluorescente; e plotagem e classificação dos dados fluorescentes. Dados de cada amostra são plotados juntos em um gráfico 2-D, onde os eixos x e y correspondem a excitação do fluoróforo. Amostras tendo o mesmo cluster de genóti- po de SNP junto sobre o gráfico (isto é, A/A; A/a; e a/a). Mais informação técnica sobre o sistema KASPAR™, incluindo um guia de solu- ções para problemas comuns, é obtenível na KBiosciences Ltd. (por exemplo, o KASPAR SNP Genotyping System Reagent Manual).

[0034] O teste de sonda de hidrólise TAQMAN™ é outro sistema fluorescente homogêneo disponível comercialmente para determinação dos genótipos de SNPs (Roche Technologies, Indianapolis, IN). Uma reação TAQMAN™ se baseia na atividade de 5' a 3' exonuclease da Taq polimerase para clivar uma sonda de oligonucelotídeo de FRET durante hibridização da sonda a uma sequência alvo complementar. A sonda de oligonucelotídeo duplamente etiquetada é projetada para sobrepor o marcador molecular de SNP. A sonda duplamente etiquetada contém tanto um fluoróforo quanto um supressor (quencher). A liberação do fluoróforo e a resultante separação do fluoróforo do supressor permite que o fluoróforo libere um sinal fluorescente. O sinal fluorescente indica a presença da sequência de inserto flanque- ante / de transgene devido à amplificação e à hibridização com sucesso.

[0035] Conforme em outros métodos de PCR em tempo real, o si nal de fluorescência resultante permite medições quantitativas da acumulação do produto durante os estágios exponenciais da reação de PCR. O teste TAQMAN™ compreende uma mistura de teste, a qual contém dois iniciadores não etiquetados e uma sonda duplo- etiquetada, e todos os outros componentes requeridos. Além destas misturas, o utilizador proporciona, entre outros, uma leitora de placas com capacidade de FRET, uma ou mais placas de microtítulo e amostras de DNA.

[0036] Ligados, firmemente ligados e extrema e firmemente liga dos: Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, ligação entre genes ou marcadores pode se referir ao fenômeno no qual genes ou marcadores sobre um cromossoma apresentam uma probabilidade mensurável de serem transmitidos juntos para indivíduos na geração seguinte. Quanto mais próximos dois genes ou marcadores estão um do outro, mais próxima a (1) é esta probabilidade. Portanto, o termo "ligado" pode se referir a um ou mais genes ou marcadores que são passados junto com um gene com uma probabilidade maior do que 0,5 (a qual é esperada a partir de sortimento independente onde marcadores / genes estão localizados sobre diferentes cromossomas). Quando a presença de um gene contribui para um fenótipo em uma planta, pode-se dizer que marcadores que são ligados ao gene são ligados ao fenótipo. Deste modo, o termo "ligado" pode se referir a uma relação entre um marcador e um gene, ou entre um marcador e um fenótipo.

[0037] Como a proximidade de dois genes ou marcadores sobre um cromossoma está diretamente relacionada com a probabilidade de que os genes ou marcadores serão passados juntos para indivíduos na geração seguinte, o termo "ligado" também pode se referir aqui, neste requerimento de patente, a um ou mais genes ou marcadores que estão localizados dentro de cerca de 2,0 Mb um do outro sobre o mesmo cromossoma. Deste modo, dois genes ou marcadores "ligados" podem ser separados por cerca de 2,1 Mb; 2,00 Mb; cerca de 1,95 Mb; cerca de 1,90 Mb; cerca de 1,85 Mb; cerca de 1,80 Mb; cerca de 1,75 Mb; cerca de 1,70 Mb; cerca de 1,65 Mb; cerca de 1,60 Mb; cerca de 1,55 Mb; cerca de 1,50 Mb; cerca de 1,45 Mb; cerca de 1,40 Mb; cerca de 1,35 Mb; cerca de 1,30 Mb; cerca de 1,25 Mb; cerca de 1,20 Mb; cerca de 1,15 Mb; cerca de 1,10 Mb; cerca de 1,05 Mb; cerca de 1,00 Mb; cerca de 0,95 Mb; cerca de 0,90 Mb; cerca de 0,85 Mb; cerca de 0,80 Mb; cerca de 0,75 Mb; cerca de 0,70 Mb; cerca de 0,65 Mb; cerca de 0,60 Mb; cerca de 0,55 Mb; cerca de 0,50 Mb; cerca de 0,45 Mb; cerca de 0,40 Mb; cerca de 0,35 Mb; cerca de 0,30 Mb; cerca de 0,25 Mb; cerca de 0,20 Mb; cerca de 0,15 Mb; cerca de 0,10 Mb; cerca de 0,05 Mb; cerca de 0,025 Mb; e cerca de 0,01 Mb. Exemplos em particular de marcadores que são "ligados" ao fenótipo de phytophthora em soja incluem sequências de nucleotídeos sobre o cromossoma 3 (grupo de ligação N) do genoma da soja.

[0038] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "firmemente ligado" pode se referir a um ou mais genes ou marcadores que estão localizados dentro de cerca de 0,5 Mb um do outro sobre o mesmo cromossoma. Deste modo, dois genes ou marcadores "firmemente ligados" podem ser separados por cerca de 0,6 Mb; cerca de 0,55 Mb; 0,5 Mb; cerca de 0,45 Mb; cerca de 0,4 Mb; cerca de 0,35 Mb; cerca de 0,3 Mb; cerca de 0,25 Mb; cerca de 0,2 Mb; cerca de 0,15 Mb; cerca de 0,1 Mb; e cerca de 0,05 Mb.

[0039] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "extremamente firmemente ligado" pode se referir a um ou mais genes ou marcadores que estão localizados dentro de cerca de 100 kb um do outro sobre o mesmo cromossoma. Deste modo, dois genes ou marcadores "extrema e firmemente ligados" podem ser separados por cerca de 125 kb; cerca de 120 kb; cerca de 115 kb; cerca de 110 kb; cerca de 105 kb; 100 kb; cerca de 95 kb; cerca de 90 kb; cerca de 85 kb; cerca de 80 kb; cerca de 75 kb; cerca de 70 kb; cerca de 65 kb; cerca de 60 kb; cerca de 55 kb; cerca de 50 kb; cerca de 45 kb; cerca de 40 kb; cerca de 35 kb; cerca de 30 kb; cerca de 25 kb; cerca de 20 kb; cerca de 15 kb; cerca de 10 kb; cerca de 5 kb; e cerca de 1 kb.

[0040] Em vista do precedente, será reconhecido que marcadores ligados a um gene ou fenótipo em particular incluem os marcadores que são firmemente ligados, e os marcadores que são extremamente firmemente ligados, ao gene ou fenótipo. Marcadores genéticos do fe- nótipo de phytophthora ligados, firmemente ligados, e extremamente firmemente podem ser úteis em programas de reprodução assistida por marcadores para identificar variedades de soja resistentes à phytophthora, e para reproduzir este traço em outras variedades de soja de modo a conferir resistência à phytophthora.

[0041] Lócus: Conforme usado aqui, neste requerimento de paten te, o termo "lócus" refere-se a uma posição sobre o genoma que corresponde a uma característica mensurável (por exemplo, um traço). Um lócus de SNP é definido por uma sonda que hibridiza a DNA contido dentro do lócus.

[0042] Marcador: Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, um marcador refere-se a uma sequência de nucleotídeos ou gene que pode ser usada para identificar plantas tendo um alelo em particular. Um marcador pode ser descrito como uma variação em um dado lócus genômico. Um marcador genético pode ser uma sequência de DNA curta, tal como uma sequência em torno de uma única alteração de par de bases (polimorfismo de único nucleotídeo, ou "SNP"), ou uma sequência de DNA longa, por exemplo, uma microssatélite / repetição de sequência simples ("SSR"). Um "alelo marcador" refere-se à versão do marcador que está presente em um indivíduo em particular.

[0043] O termo marcador conforme usado aqui, neste requerimen to de patente, pode se referir a um segmento clonado de DNA cro- mossômico de soja, e pode se referir também ou alternativamente a uma molécula de DNA que é complementar a um segmento clonado de DNA cromossômico de soja.

[0044] Em algumas modalidades, a presença de um marcador em uma planta pode ser detectada através da utilização de uma sonda de ácido nucleico. Uma sonda pode ser uma molécula de DNA ou uma molécula de RNA. Sondas de RNA podem ser sintetizadas por meios conhecidos na técnica, por exemplo, usando um modelo de molécula de DNA. Uma sonda pode conter todas ou uma porção da sequência de nucleotídeos do marcador e sequência de nucleotídeos contíguos adicional, do genoma da planta. Isto é referido aqui, neste requerimento de patente, como uma "sonda contígua." A sequência de nucleotí- deos contíguos adicional é referida como "a montante" ou "a jusante" do marcador original, dependendo de se a sequência de nucleotídeos contíguos do cromossoma da planta está sobre o lado 5' ou sobre o lado 3' do marcador original, conforme entendido convencionalmente. Conforme é reconhecido pelas pessoas com conhecimento regula da técnica, o processo de obter sequência de nucleotídeos contíguos adicional para inclusão em um marcador pode ser repetido quase indefinidamente (limitado somente pela extensão do cromossoma), deste modo identificando marcadores adicionais ao longo do cromossoma. Todos os marcadores descritos acima podem ser usados em algumas modalidades da presente descoberta.

[0045] Uma sequência de sonda de oligonucleotídeo pode ser preparada sinteticamente ou por clonagem. Vetores de clonagem adequados são de conhecimento geral das pessoas versadas na técnica. Uma sonda de oligonucleotídeo pode ser etiquetada ou não etiquetada. Existem uma ampla variedade de técnicas para marcação de moléculas de ácido nucleico, incluindo, por exemplo e sem limitação: ra- diomarcação por translação de entalhe (nick translation); priming aleatório; tailing com desoxitransferase terminal; ou semelhantes, onde os nucleotídeos empregados são marcados, por exemplo, com P32 radioativo. Outras etiquetas as quais podem ser usadas incluem, por exemplo e sem limitação: Fluoróforos (por exemplo, FAM e VIC); enzimas; substratos enzimáticos; cofatores enzimáticos; inibidores de enzimas; e semelhantes. Alternativamente, a utilização de uma etiqueta que proporciona um sinal detectável, por si só ou em combinação com outros agentes reativos, pode ser substituída por ligantes aos quais receptores ligam, em que os receptores são etiquetados (por exemplo, pelas etiquetas indicadas acima) de modo a proporcionar sinais detectáveis, quer por si próprios, ou em combinação com outros reagentes. Vide, por exemplo, Leary et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4045-9.

[0046] Uma sonda pode conter uma sequência de nucleotídeos que não é contígua à sequência do marcador original; esta sonda é referida aqui, neste requerimento de patente, como uma "sonda não contígua". A sequência da sonda não contígua está localizada suficientemente próxima à sequência do original marcador sobre o genoma de modo que a sonda não contígua é geneticamente ligada ao mesmo gene ou traço (por exemplo, resistência à phytophthora). Por exemplo, em algumas modalidades, uma sonda não contígua está localizada dentro de 500 kb; 450 kb; 400 kb; 350 kb; 300 kb; 250 kb; 200 kb; 150 kb; 125 kb; 100 kb; 0,9 kb; 0,8 kb; 0,7 kb; 0,6 kb; 0,5 kb; 0,4 kb; 0,3 kb; 0,2 kb; ou 0,1 kb do marcador original sobre o genoma da soja.

[0047] Uma sonda pode ser uma cópia exata de um marcador a ser detectado. Uma sonda também pode ser uma molécula de ácido nucleico compreendendo, ou consistindo em, uma sequência de nu- cleotídeos a qual é substancialmente idêntica a um segmento clonado do DNA cromossômico do organismo do sujeito (por exemplo, soja). Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "substancialmente idêntica" pode referir-se a sequências de nucleotídeos que são mais de 85% idênticas. Por exemplo, uma sequência de nu- cleotídeos substancialmente idêntica pode ser 85,5%; 86%; 87%; 88%; 89%; 90%; 91%; 92%; 93%; 94%; 95%; 96%; 97%; 98%; 99% ou 99,5% idêntica à sequência de referência.

[0048] Uma sonda também pode ser uma molécula de ácido nu- cleico que é "especificamente hibridizável" ou "especificamente complementar" a uma cópia exata do marcador a ser detectado ("alvo de DNA"). "Especificamente hibridizável" e "especificamente complementar" são termos que indicam um grau de complementaridade suficiente de tal modo que ocorre ligação estável e específica entre a molécula de ácido nucleico e o alvo de DNA. Uma molécula de ácido nucleico não precisa ser 100% complementar a sua sequência alvo para ser especificamente hibridizável. Uma molécula de ácido nucleico é especificamente hibridizável quando existe um grau de complementaridade suficiente de modo a evitar ligação inespecífica do ácido nucleico a sequências não alvo sob condições em que é desejável ligação específica, por exemplo, sob rigorosas condições de hibridização.

[0049] As condições de hibridização resultando em graus particu lares de estringência vão variar dependendo da natureza do método de hibridização de escolha e da composição e da extensão das se-quências de ácido nucleico hibridizantes. De modo geral, a temperatura de hibridização e a força iônica (especialmente a concentração de Na+ e/ou de Mg++) do tampão de hibridização vão determinar a estrin- gência da hibridização, embora os tempos de lavagem também influenciem a estringência. Cálculos relativos às condições de hibridização requeridas para obter graus particulares de estringência são de conhecimento das pessoas versadas na técnica, e são discutidos, por exemplo, em Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 e 11; e Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985. Instrução detalhada adicional e orientação com respeito à hibridização de ácidos nu- cleicos podem ser encontradas, por exemplo, em Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," em Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993; e Ausubelet al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995.

[0050] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "condições estringentes" englobam condições sob as quais somente ocorrerá hibridização se houver menos de 50% de incompatibilidade entre a molécula de hibridização e o alvo de DNA. "Condições estrin- gentes" incluem níveis particulares adicionais de estringência. Deste modo, conforme usado aqui, neste requerimento de patente, condições de "moderada estringência" são condições sob as quais moléculas com mais de 50% de incompatibilidade de sequência não hibridiza- rão; condições de "alta estringência" são condições sob as quais sequências com mais de 20% de incompatibilidade não hibridizarão; e condições de "muito alta estringência" são condições sob as quais sequências com mais de 10% de incompatibilidade não hibridizarão.

[0051] Seguem-se condições de hibridização típicas, não limitan- tes.

[0052] Muito Alta Estringência (detecta sequências que comparti lham pelo menos 90% de identidade de sequência): Hibridização em 5x tampão SSC a 65 °C por 16 horas; lavagem duas vezes em 2x tampão SSC em temperatura ambiente por 15 minutos cada; e lava-gem duas vezes em 0,5x tampão SSC a 65 °C por 20 minutos cada.

[0053] Alta Estringência (detecta sequências que compartilham pelo menos 80% de identidade de sequência): Hibridização em 5x a 6x tampão SSC a 65 a 70 °C por 16 a 20 horas; lavagem duas vezes em 2x tampão SSC em temperatura ambiente por 5 a 20 minutos cada; e lavagem duas vezes em 1x tampão SSC a 55 a 70 °C por 30 minutos cada.

[0054] Moderada Estringência (detecta sequências que comparti lham pelo menos 50% de identidade de sequência): Hibridização em 6x tampão SSC em temperatura ambiente até 55 °C por 16 a 20 horas; lavagem pelo menos duas vezes em 2x a 3x tampão SSC em temperatura ambiente até 55 °C por 20 a 30 minutos cada.

[0055] Com respeito a todas as sondas discutidas acima, a sonda pode compreender sequências de ácido nucleico adicionais, por exemplo, promotores; sinais de transcrição; e/ou sequências de vetores. Qualquer uma das sondas discutidas acima podem ser usadas para definir marcadores adicionais que são firmemente ligados a um gene envolvido em resistência à phytophthora, e marcadores identificados deste modo podem ser equivalentes a marcadores exemplares nomeados na presente descoberta, e portanto estão dentro do escopo da descoberta.

[0056] Reprodução assistida por marcadores: Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "reprodução assistida por marcadores" pode se referir a uma abordagem para reprodução diretamente para um ou mais traços complexos (por exemplo, resistência à phytophthora). Na prática corrente, os criadores de plantas tentam identificar traços facilmente detectáveis, tais como a cor das flores, o aspecto da casca das sementes, ou variantes de isozimas que são ligadas a um traço agronomicamente desejável. Os criadores de planta então seguem o traço agronômico na segregação, reproduzindo populações seguindo a segregação do traço facilmente detectável. No entanto, existem poucas destas relações de ligação disponíveis para utilização em reprodução de plantas.

[0057] Reprodução assistida por marcadores proporciona um pro cesso eficaz em termos de tempo e de custo para aprimoramento de variedades de plantas. Vários exemplos da aplicação de reprodução assistida por marcadores envolvem o uso de marcadores de isozimas. Vide, por exemplo, Tanksley e Orton, eds. (1983) Isozymes in Plant Breeding and Genetics, Amsterdam: Elsevier. Um exemplo é um marcador de isozima associado com um gene para resistência a uma praga por nematódeos em tomate. A resistência, controlada por um gene designado Mi, está localizada sobre o cromossoma 6 do tomate e é muito firmemente ligada a Aps1, uma isozima fosfatase ácida. A utilização do marcador de isozima Aps1 para selecionar indiretamente para o gene Mi proporcionou as vantagens de que a segregação em uma população pode ser determinada inequivocamente com técnicas ele- troforéticas de rotina; o marcador de isozima pode ser marcado em tecido de plântula, eliminando a necessidade de manter as plantas até a maturitade; e a codominância dos alelos marcadores de isozima possibilita a discriminação entre homozigotos e heterozigotos. Vide, por exemplo, Rick (1983) em Tanksley and Orton, supra.

[0058] Lócus de traço quantitativo: Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "Lócus de traço quantitativo" (QTL, Quantitative trait locus) pode se referir a trechos de DNA que foram identificados como provavelmente sequências de DNA (por exemplo, genes, sequências não codificantes, e/ou sequências intergênicas) que constituem a base de um traço quantitativo, ou fenótipo, que varia em grau, e podem ser atribuídos às interações entre duas ou mais sequências de DNA (por exemplo, genes, sequências não codificantes, e/ou sequências intergênicas) ou seu produto de expressão e seu meio ambiente. Loci de traços quantitativos (QTLs) podem ser identificados molecularmente para ajudar a mapear regiões do genoma que contêm sequências envolvidas na especificação de um traço quantitativo.

[0059] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "intervalo de QTL" pode se referir a trechos de DNA que são ligados aos genes que constituem a base do traço de QTL. Um intervalo de QTL é tipicamente, mas não necessariamente, maior do que o próprio QTL. Um intervalo de QTL pode conter trechos de DNA que são 5' e/ou 3' com respeito ao QTL.

[0060] Identidade de sequência: O termo "identidade de sequên cia" ou "identidade," conforme usado aqui, neste requerimento de patente, no contexto de duas sequências de ácido nucleico ou de poli- peptídeo, pode se referir aos resíduos nas duas sequências que são os mesmos quando alinhadas para máxima correspondência sobre uma janela de comparação especificada.

[0061] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "percentagem de identidade de sequência" pode se referir ao valor determinado comparando duas sequências alinhadas otimamente (por exemplo, sequências de ácido nucleico) sobre uma janela de comparação, em que a porção da sequência na janela de comparação pode compreender adições ou eliminações (isto é, gaps) em comparação com a sequência de referência (a qual não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas sequências. A percentagem é calculada determinando o número de posições nas quais o resíduo aminoácido ou nucleotídeo idêntico ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100 para produzir a percentagem de identidade de sequência.

[0062] Métodos para o alinhamento de sequências para compara ção são de conhecimento geral na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos, por exemplo, em: Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins e Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpetet al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. Uma análise detalhada de métodos de alinhamento de sequências e cálculos de homologia pode ser encontrada, por exemplo, em Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:40310.

[0063] A ferramenta de pesquisa de alinhamento local básico (BLAST™ (Basic Local Alignment Search Tool); Altschul et al. (1990)) do NCBI (National Center for Biotechnology Information dos Estados Unidos) está disponível a partir de várias fontes, incluindo o National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD), e na Internet, para utilização em conexão com vários programas de análise de sequência. Uma descrição de como determinar a identidade de sequência usando este programa está disponível na Internet na seção de ajuda "help" para BLAST™. Para comparações de sequências de ácido nucleico, a função "Blast 2 sequences" ("sequências Blast 2") do programa BLAST™ (Blastn) pode ser empregada usando a matriz BLO- SUM62 predefinida (default) ajustada para parâmetros predefinidos (default). Sequências de ácido nucleico com ainda maior similaridade com as sequências de referência vão apresentar percentagem de identidade crescente quando avaliadas por este método.

[0064] Polimorfismo de único nucleotídeo: Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "polimorfismo de único nucleo- tídeo" (SNP) pode se referir a uma variação de sequência de DNA que ocorre quando um único nucleotídeo no genoma (ou outra sequência compartilhada) difere entre membros de uma espécie ou cromossomas pareados em um indivíduo. Dentro de uma população, SNPs podem ser atribuídos uma frequência de alelo inferior que é a menor frequência de alelo em um lócus que é observado em uma população em particular. Esta é simplesmente a menor das duas frequências de alelo para polimorfismos de único nucleotídeo. Espera-se que diferentes populações apresentem pelo menos frequências de alelo ligeiramente diferentes. Populações particulares podem apresentar frequências de alelo significativamente diferentes. Em alguns exemplos, marcadores ligados à resistência à phytophthora são marcadores de SNPs.

[0065] SNPs podem ser abrangidos por sequências codificantes de genes, regiões não codificantes de genes, ou nas regiões intergêni- cas entre genes. SNPs dentro de uma sequência codificante não necessariamente vão alterar a sequência de aminoácidos da proteína que é produzida, devido a degeneração do código genéticos. Um SNP no qual ambas as formas levam à mesma sequência de polipeptídeo é denominado "sinônimo" (algumas vezes denominado uma mutação silenciosa). No caso de ser produzida uma sequência de polipeptídeo diferente, são denominadas "não sinônimas" . Uma alteração denominada não sinônima pode ser ou missenso ou não senso, onde uma alteração missenso resulta em um aminoácido diferente, e uma alteração não senso resulta em um códon de parada (stop codon) prematuro. SNPs que não estão em regiões codificantes de proteína ainda podem ter consequências para emenda de genes (gene splicing), ligação de fator de transcrição, ou a sequência de RNA não codificante. SNPs são geralmente bialélicos e, portanto, facilmente analisados em plantas e animais. Sachidanandam (2001) Nature 409:928-33.

[0066] Traço ou fenótipo: Os termos "traço" e "fenótipo" são usa dos de modo intercambiável aqui, neste requerimento de patente. Para os fins da presente descoberta, um traço de particular interesse é resistência à phytophthora.

111. Identificação, à base de QTL, de marcadores ligados a um traço de interesse A. Visão geral

[0067] Em algumas modalidades, um traço (por exemplo, resistên cia à phytophthora) é mapeado usando uma estratégia que é diferente das abordagens de mapeamento tradicionais. Por exemplo, um traço pode ser mapeado de acordo com uma estratégia que, por questões de conveniência, pode ser descrita como compreendendo 4 etapas. Em uma primeira etapa, podem ser determinadas regiões alvo de intervalo de QTL que correspondem a um traço (por exemplo, Rps1-k) a ser mapeado. Em uma segunda etapa, podem ser selecionados marcadores (por exemplo, marcadores de SNP) os quais estão localizados dentro de ou próximos a intervalos de QTLs determinados do genoma alvo (por exemplo, o genoma da soja). Em uma terceira etapa, podem ser projetados iniciadores específicos que facilitam a genotipagem de sujeitos individuais com respeito a marcadores selecioandos. Em exemplos particulares, iniciadores específicos são projetados para utilização em um teste de genotipagem KASPAR™ ou TAQMAN™ em linhagens de soja resistentes e suscetíveis a phytophthora. Em uma quarta etapa, podem ser triadas populações que apresentam segregação para o traço usando os iniciadores específicos para identificar os marcadores que são ligados ao traço. Vide, por exemplo, a Fig. 1.

B. Marcadores ligados a um traço de interesse e a identificação dos mesmos Determinação de regiões alvo do intervalo QTL e identificação de marcadores.

[0068] QTLs podem ser determinados por qualquer técnica dispo nível para as pessoas versadas na técnica. Por exemplo, as posições físicas de um QTL que corresponde a um traço de interesse em particular podem ser inicialmente determinadas por referência à localização de genes que se sabe que contribuem para o traço em particular. Em algumas modalidades, genes de resistência à phytophthora podem ser identificados sobre diferentes regiões do cromossoma 3. Em algumas modalidades, os QTLs inicialmente identificados são agrupados ou divididos em uma lista de QTLs menos complicada ou extensiva que pode ser limites no genoma que são os mesmos ou diferentes dos limites dos QTLs inicialmente identificados.

[0069] Em algumas modalidades, pode ser selecionada uma regi ão de DNA que é provável que contenha marcadores que são ligados ao traço do QTL. Esta região pode ser referida como um intervalo de QTL. Por exemplo, um intervalo de QTL pode ser uma região de DNA que inclui o QTL e DNA genômico adicional que está próximo ao QTL em uma ou outra, ou em ambas as direções 5' e 3'. Em algumas mo- dalidades, um intervalo de QTL pode ter cerca de 4 Mb; cerca de 3,5 Mb; cerca de 3 Mb; cerca de 2,5 Mb; cerca de 2 Mb; cerca de 1,5 Mb; 1 Mb; 0,5 Mb; ou cerca de 0,25 Mb.

[0070] Em modalidades particulares, o genoma alvo pode ser pes quisado para identificar marcadores que estão fisicamente localizados em, próximos, ou entre os QTLs e intervalos de QTLs. Se um mapa de referência contendo a localização de marcadores conhecidos estiver disponível para o genoma alvo, o mapa de referência pode ser usado para identificar marcadores. Sequências de ácido nucleico do genoma alvo também podem ser pesquisadas, por exemplo, por software tal como BLAST™. Em algumas modalidades, podem ser identificados marcadores de SNPs. Em algumas modalidades, podem ser identificados marcadores que estão fisicamente localizados em, próximos, ou entre QTLs e intervalos de QTLs do genoma da soja que correspondem ao traço de resistência à phytophthora. Em exemplos particulares, marcadores de SNPs identificados que estão fisicamente localizados em, próximos, ou entre QTLs e intervalos de QTLs do genoma da soja que correspondem ao traço de resistência à phytophthora podem ser selecionados entre o grupo consistindo dos marcadores identificados como sendo ligados a resistência à phytophthora e listados na Tabela 4A.

[0071] Em outras modalidades, marcadores particulares podem ser selecionados entre os marcadores identificados que estão fisicamente localizados em, próximos, ou entre QTLs e intervalos de QTLs que correspondem a um traço de interesse, cujos marcadores são po- limórficos entre as linhagens parentais a partir das quais uma população de mapeamento será gerada. O polimorfismo de um dado marcador entre as linhagens parentais está diretamente relacionado com a capacidade para rastrear eventos de recombinação em uma população de mapeamento produzida a partir das linhagens parentais.

[0072] Em exemplos particulares, marcadores polimórficos entre linhagens de soja parentais são selecionados para triagem de populações de mapeamento de resistência à phytophthora para determinar quais, se for o caso, dos marcadores polimórficos estão ligados ao traço de resistência à phytophthora. Os marcadores referidos podem segregar de modo a que um alelo do marcador de SNP apareça exclusivamente em indivíduos resistentes à phytophthora, e o outro alelo do marcador de SNP apareça exclusivamente em indivíduos suscetíveis à phytophthora. Populações de mapeamento podem ser geradas cruzando uma variedade que é resistente à phytophthora com outra variedade que é suscetível à phytophthora. Em modalidades, uma população de mapeamento pode compreender cerca de 10, cerca de 20, cerca de 30, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 95, cerca de 100, cerca de 150, cerca de 200, cerca de 250, cerca de 300, cerca de 350, cerca de 400, cerca de 450, cerca de 500, ou mais indivíduos. Em algumas modalidades, o germoplasma de soja resistente à phytophthora pode ser cruzado com um ou mais germoplasmas suscetíveis à phytophthora de modo a criar populações de mapeamento.

[0073] Em algumas modalidades, os marcadores polimórficos po dem ser polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs) ligados a ou dentro do gene ou do QTL correspondente ao traço de resistência à phytophthora de interesse. Estes marcadores de SNPs podem ser detectados por sequenciamento através da região contendo o gene ou QTL usando quaisquer métodos de sequenciamento de DNA conhecidos na técnica, incluindo mas não limitados a sequenciamento de Sanger ou metodologias de sequenciamento de alta produtividade ("Next Generation") que permitem leituras de sequências curtas ou longas através da região de interesse. Em semelhantes modalidades, onde genotipagem por sequenciamento é usada para a detecção de marcadores de SNPs, iniciadores correspondentes às sequências flanqueantes da região contendo os SNPs no gene ou QTL de interesse podem ser usados para as químicas de sequenciamento de modo a sequenciar através da região de interesse. Em semelhantes modalidades, quando diferentes genótipos são usados para sequenciamento através da região de interesse para a detecção de SNPs exemplificados aqui, neste requerimento de patente, podem ser identificados outros SNPs além dos SNPs exemplificados aqui, neste requerimento de patente. Em semelhantges modalidades, os SNPs exemplificados aqui, neste requerimento de patente, por si próprios (SNPs individuais) ou em combinação com outros SNPs ligados a sequências exemplificadas (haplótipos) podem ser utilizados para diferenciar genótipos para seleção assistida por marcadores de plantas para o traço de resis-tência à phytophthora de interesse.

Desenho de iniciadores e triagem de ligação.

[0074] Iniciadores ou sondas de oligonucleotídeos podem ser pro jetados para detectar especificamente marcadores que estão fisica-mente localizados em, próximo, ou entre QTLs e intervalos de QTLs que correspondem a um traço de interesse. Em geral, pode ser projetada uma sonda de oligonucleotídeo ou iniciador que especificamente hibridiza a somente um alelo de um marcador. Em algumas modalidades, dois conjuntos de sondas de oligonucleotídeos e iniciadores são projetados para detectar um marcador de SNP, de tal modo que cada um especificamente hibridiza ao alelo de SNP ao qual a outra sonda e iniciador não hibridiza especificamente. Conforme é entendido pelas pessoas versadas na técnica, a extensão ou composição da sonda de oligonucleotídeo e iniciadores para um marcador em particular pode ser variada de acordo com princípios estabelecidos sem tornar a sonda inespecífica para um alelo do marcador.

[0075] Em algumas modalidades, as sondas de oligonucleotídeos podem ser iniciadores. Em modalidades específicas, os iniciadores podem ser projetados para detectar marcadores em um teste de geno- tipagem KASPAR™. Em modalidades particulares, os iniciadores podem ser projetados para detectar marcadores ligados ao fenótipo de resistência à phytophthora em soja usando um teste de genotipagem KASPAR™. Nestas modalidades e em modalidades adicionais, o sistema de detecção pode proporcionar um formato conveniente e de alta produtividade para genotipagem de indivíduos em uma população de mapeamento, o qual pode facilitar muito a identificação de indivíduos carregando um gene ou traço em particular, e também pode facilitar muito a implementação ou execução de um programa de seleção as-sistida por marcadores.

[0076] Em modalidades específicas, as sondas de oligonucleotí- deos podem ser iniciadores projetados para detectar marcadores em um teste de fenotipagem TAQMAN®. Este método utiliza iniciadores específicos para o marcador intimamente ligados ao gene de resistência à phytophthora e sondas marcadas com fluorescente contendo um polimorfismo de único nucleotídeo (SNP). A sonda de SNP associada com resistência é etiquetada com um corante fluorescente tal como FAM ao passo que a sonda associada com suscetibilidade é etiquetada com um corante fluorescente diferente tal como VIC. Os dados são analisados como a presença ou ausência de um sinal de corante fluorescente. O sistema de detecção pode proporcionar um formato conveniente e de alta produtividade tal como multiplexação para genotipa- gem de indivíduos em uma população de mapeamento, o qual pode facilitar muito a identificação de indivíduos carregando um gene ou traço em particular, e também pode facilitar muito a implementação ou execução de um programa de seleção assistida por marcadores.

[0077] Marcadores adicionais podem ser identificados como equi valentes a qualquer um dos marcadores exemplares nomeados aqui, neste requerimento de patente, por exemplo, por determinação da fre-quência de recombinação entre o marcador exemplar e um marcador adicional. As determinações referidas podem utilizar um método de contrastes ortogonais com base no método de Mather (1931), The Measurement of Linkage in Heredity, Methuen & Co., Londres, seguido por um teste de probabilidade máxima de determinar uma frequência de recombinação. Allard (1956) Hilgardia 24:235-78. Se o valor da fre-quência de recombinação for de menos de ou igual a 0,10 (isto é, 10%), então o marcador adicional é considerado equivalente ao marcador exemplar em particular para os fins de utilização nos métodos presentemente revelados.

[0078] Marcadores que são ligados a qualquer um e a todos os genes de resistência à phytophthora podem ser identificados em modalidades da descoberta. Adicionalmente, marcadores que controlam qualquer um e todos os loci que contribuem para resistência de todas as raças de phytophthora podem ser identificados em modalidades da descoberta.

[0079] Um meio para proporcionar resistência à phytophthora em soja pode ser um alelo marcador de SNP, cuja detecção do alelo marcador de SNP em plantas de soja proporciona pelo menos uma forte indicação de que a planta compreendendo a sequência de ácido nu- cleico tem o fenótipo de resistência à phytophthora. Em alguns exemplos, um meio para proporcionar resistência à phytophthora em soja é um marcador selecionado entre o grupo consistindo dos marcadores descritos como sendo ligados a resistência à phytophthora listados na Tabela 4A. Em exemplos particulares, um meio para proporcionar resistência à phytophthora em soja é um marcador selecionado entre o grupo consistindo em NCSB_000559, Gmax7x198_656813, SNP18196, NCSB_000575, Gmax7x259_44054, SNP18188, Gmax7x259_98606, BARC_064351_18628, BARC_064351_18631, e NCSB_000582.

[0080] Um meio para identificação de plantas de soja tendo o fenó- tipo de resistência à phytophthora pode ser uma molécula que apre-senta um sinal detectável quando adicionada a uma amostra obtida a partir de uma planta de soja tendo o genótipo de resistência à phytophthora, mas cujo meio não apresenta um sinal detectável quando adicionado a uma amostra obtida a partir de uma planta de soja que não tem o fenótipo de resistência à phytophthora. Hibridização específica de ácido nucleico é um sinal detectável, e uma sonda de ácido nucleico que especificamente hibridiza a um alelo marcador de SNP que é ligado ao fenótipo de resistência à phytophthora pode ser, portanto, um meio para identificação de plantas de soja tendo o fenótipo de resistência à phytophthora. Em alguns exemplos, um meio para identificação de plantas de soja tendo o fenótipo de resistência à phytophthora é uma sonda que especificamente hibridiza a um marcador que é ligado ao fenótipo de resistência à phytophthora.

B. Métodos de utilização de marcadores ligados a um traço de interesse

[0081] Métodos de utilização de marcadores moleculares de ácido nucleico que são ligados a um traço de interesse (por exemplo, resistência à phytophthora em soja) para identificar plantas tendo o traço de interesse podem resultar em uma economia de custo para os criadores de plantas e produtores, porque estes métodos podem eliminar a necessidade de determinar o fenótipo de plantas individuais produzidas durante o desenvolvimento (por exemplo, cruzando variedades de plantas de soja tendo resistência à phytophthora com variedades de plantas vulneráveis).

[0082] Em modalidades particulares, marcadores ligados à resis tência à phytophthora em soja podem ser usados para transferir um ou mais segmentos de DNA que contêm um ou mais determinantes de resistência à phytophthora. Em modalidades particulares, os marcadores podem ser selecionados entre um grupo de marcadores compreendendo os marcadores listados na Tabela 4A e marcadores que são seus equivalentes. Em algumas modalidades, um marcador pode ser selecionado entre o grupo consistindo em NCSB_000559, Gmax7x198_656813, SNP18196, NCSB_000575, Gmax7x259_44054, SNP18188, Gmax7x259_98606, BARC_064351_18628, BARC_064351_18631, e NCSB_000582. Em algumas modalidades, um método para utilização de marcadores ligados à resistência à phytophthora em soja para transferir um ou mais segmentos de DNA que contêm um ou mais determinantes de resistência à phytophthora pode compreender analisar o DNA genômico de duas plantas parentais com sondas que são especificamente hibridizáveis a marcadores ligados ao fenótipo de resistência à phytophthora; cruzamento sexual dos genótipos das duas plantas parentais para obter uma população da progênie, e analisar a progênie para a presença dos marcadores ligados ao fenótipo de resistência à phytophthora; retrocruzamento da progênie que contém os marcadores ligados ao fenótipo de resistência à phytophthora com o genótipo receptor para produzir uma primeira população de retrocruzamento, e em seguida continuar com um pro-grama de retrocruzamento até ser obtida uma progênie final que compreende qualquer um ou mais traços desejados exibidos pelo genótipo parental e o fenótipo de resistência à phytophthora. Em modalidades particulares, a progênie individual obtida em cada etapa de cruzamento e retrocruzamento são selecionadas por análise de marcador de phytophthora em cada geração. Em algumas modalidades, a análise do DNA genômico das duas plantas parentais com sondas que são especificamente hibridizáveis a marcadores ligados ao fenótipo de resistência à phytophthora revela que uma das plantas parentais compreende menos dos marcadores ligados aos quais as sondas hibridi- zam especificamente, ou nenhum dos marcadores ligados aos quais as sondas hibridizam especificamente. Em algumas modalidades, a progênie individual obtida em cada cruzamento e/ou retrocruzamento é selecionada pela variação de sequência de plantas individuais.

[0083] Em algumas modalidades, marcadores ligados ao fenótipo de resistência à phytophthora podem ser usados para introduzir um ou mais determinantes de resistência à phytophthora em uma planta (por exemplo, soja) por transformação genética. Em modalidades particulares, os marcadores podem ser selecionados entre um grupo de marcadores compreendendo os marcadores listados na Tabela 4A e marcadores que são seus equivalentes. Em algumas modalidades, um método para introduzir um ou mais determinantes de resistência à phytophthora em uma planta por recombinação genética pode compreender analisar o DNA genômico de uma planta (por exemplo, soja) com sondas que são especificamente hibridizáveis a marcadores ligados ao fenótipo de resistência à phytophthora para identificar um ou mais determinantes de resistência à phytophthora na planta; isolar um segmento do DNA genômico da planta compreendendo os marcadores ligados ao fenótipo de resistência à phytophthora, por exemplo, extraindo o DNA genômico e digerindo o DNA genômico com uma ou mais enzimas endonuclease de restrição; opcionalmente amplificar o segmento de DNA isolado; introduzir o segmento de DNA isolado em uma célula ou tecido de uma planta hospedeira; e analisar o DNA da planta hospedeira com sondas que são especificamente hibridizáveis a marcadores ligados ao fenótipo de resistência à phytophthora para identificar o um ou mais determinantes de resistência à phytophthora na planta hospedeira. Em modalidades particulares, o segmento de DNA isolado pode ser introduzido na planta hospedeira de tal modo que é integrado de modo estável no genoma da planta hospedeira.

[0084] Em algumas modalidades, marcadores que são ligados ao fenótipo de resistência à phytophthora podem ser usados para introduzir um ou mais determinantes de resistência à phytophthora em outros organismos, por exemplo, plantas. Em modalidades particulares, os marcadores podem ser selecionados entre um grupo de marcadores listados na Tabela 4A e marcadores que são seus equivalentes. Em algumas modalidades, um método para introduzir um ou mais determi-nantes de resistência à phytophthora em um organismo diferente de soja pode compreender analisar o DNA genômico de uma planta (por exemplo, uma planta de soja) com sondas que são especificamente hibridizáveis a marcadores ligados ao fenótipo de resistência à phytophthora para identificar um ou mais determinantes de resistência à phytophthora na planta; isolar um segmento do DNA genômico da planta compreendendo o um ou mais determinantes de resistência à phytophthora, por exemplo, extraindo o DNA genômico e digerindo o DNA genômico com uma ou mais enzimas endonuclease de restrição; opcionalmente amplificar o segmento de DNA isolado; introduzir o segmento de DNA isolado em um organismo diferente de soja; e analisar o DNA do organismo difrente de soja com sondas que são especi-ficamente hibridizáveis a marcadores ligados ao fenótipo de resistência à phytophthora para identificar o um ou mais determinantes de resistência à phytophthora no organismo. Em outras modalidades, o segmento de DNA isolado pode ser introduzido no organismo de tal modo que é integrado de modo estável no genoma do organismo.

[0085] Em algumas modalidades, marcadores que são ligados ao fenótipo de resistência à phytophthora podem ser usados para identificar uma planta com um ou mais determinantes de resistência à phytophthora. Em algumas modalidades, a planta pode ser uma planta de soja. Em modalidades particulares, moléculas de ácido nucleico (por exemplo, mRNA ou DNA genômico) podem ser extraídas a partir de uma planta. As moléculas de ácido nucleico extraídas podem ser então contatadas com uma ou mais sondas que são especificamente hibridizáveis a marcadores ligados ao fenótipo de resistência à phytophthora. Hibridização específica da uma ou mais sondas às moléculas de ácido nucleico extraídas é indicativa da presença de um ou mais determinantes de resistência à phytophthora na planta.

[0086] Em algumas modalidades, marcadores que são ligados a múltiplos determinantes de resistência à phytophthora podem ser usados simultaneamente. Em outras modalidades, podem ser usados marcadores que são ligados a somente um determinante de resistência à phytophthora. Em exemplos específicos, marcadores que são ligados a resistência à phytophthora com respeito a uma ou mais espécies de Phytophthora em particular podem ser usados simultaneamente Por exemplo, uma pluralidade de marcadores que são ligados à resistência à phytophthora com respeito a diferentes raças de Phytophthora spp. podem ser usados simultaneamente.

[0087] Os exemplos que se seguem são proporcionados para ilus trar algumas características e/ou modalidades particulares. Estes exemplos não devem ser considerados como limitando a descoberta às características ou modalidades particulares descritas.

EXEMPLOS Exemplo 1: Estratégia de Desenvolvimento de Marcadores

[0088] Foi desenvolvida a seguinte estratégia para identificar no vos marcadores de SNPs firmemente ligados a Rps1-k. Sequências de nucleotídeos as quais codificam as duas proteínas de doença Rps1-k, proteínas de resistência a doença do tipo NBS-LRR Rps1-k-1 e Rps1- k-2, foram identificadas no GenBank (No de Acesso: EU450800) com base na descoberta de Gao H. e Bhattacharyya M. K. (2008) O lócus de resistência Phytophthora em soja Rps1-k engloba genes semelhantes à repetição rica em leucina de ligação de nucleotídeo de espiral espiralada e sequências repetitivas. Gao and Bhattacharyya (2008) BMC Plant Biol 8:29. A sequência de cromossoma artificial bacteriano (BAC) foi dividida em 37 fragmentos de cerca de 5 kB e cada fragmento foi BLASTed contra o banco de dados genômicos de soja localizado no website da Phytozome (www.phytozome.com) para identificar sua localização física no genoma da soja. Assim que a localização física de Rps1-k foi identificada, foi selecionado um conjunto de marcadores de polimorfismo de único nucleotídeo (SNP) na região do banco de dados genômicos de soja. Testes de genotipagem de KBioscience Competitive Allele-Specific PCR (KASPAR™) foram desenvolvidos para os SNPs na região e foram triados contra um painel de plantas de soja que incluiu linhagens resistentes e suscetíveis a Rps1-k, Rps1-a, e Rps1-c. Comparando os dados de genotipagem do KASPAR™ com o fenótipo conhecido das plantas do painel, foi possível identificar os marcadores de SNP polimórficos entre linhagens resistentes e linhagens suscetíveis a Rps1-k, Rps1-a, Rps1-c. Validação adicional destes marcadores de SNPs polimórficos selecionados com populações de mapeamento permitiu a identificação de novos marcadores não descritos previamente, que foram firmemente ligados com Rps1-k, e que são úteis para seleção assistida por marcador de soja (MAS) para resistência à phytophthora. Um diagrama esquemático desta estratégia é esboçado na Figura 1.

Exemplo 2: Material Vegetal

[0089] Seis plantas-mãe de mapeamento de 18 linhagens de in trodução de planta (PI) foram incluídas no painel de triagem de marcadores. O painel incluiu linhagens resistentes e suscetíveis a Rps1-k, Rps1-a, e Rps1-c que estão listadas na Tabela 2. Tabela 2: Linhagens de soja usadas na triagem do marcador de SNP Rps 1-k inicial. A coluna "Traço" indica quais linhagens foram suscetíveis ou resistentes à phytophthora, e identifica o traço (Rps 1-k, Rps 1-c e Rps 1-a) associado com as linhagens resistentes à phytophthora.

[0090] Foram desenvolvidas três populações de mapeamento para utilização. A primeira população incluiu 127 linhagens F2:3 de um cruzamento entre 75357-71 (suscetível) e 75448 (resistente a Rps1-k). A segunda população consistiu de 204 linhagens F2:3 de um cruzamento entre 20430-74 (resistente a Rps1-k) e 20130-77 (resistente a Rps1-c). A terceira população incluiu 125 linhagens F2:3 de um cruzamento entre 20281 (resistente a Rps1-c) e 75477 (suscetível).

Exemplo 3: Extração de DNA e Preparação de Amostra

[0091] Oito discos de folha por planta de soja foram colhidos no estágio de segundo nó. O DNA foi extraído usando o método de extração de DNA MAGATTRACT™ (Qiagen, Valencia, CA) usando o sistema de isolamento de DNA BIOCEL 1800™ (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). O DNA foi quantificado usando o espectrofotômetro NANODROP 8000™ (ThermoScientific, Rockford, IL) seguindo as instruções do fabricante. DNA de cada uma das 10 progênies F3 foi reunido junto por linhagem F2:3. As amostras de DNA reunido foram diluídas até 1 a 5 nanogramas/ microlitro (ng/μl) para genotipagem.

Exemplo 4: Fenotipagem de Phytophthora

[0092] Para cada uma das linhagens F2:3, 10 sementes foram culti vadas em uma estufa. Os cotilédones das plantas de soja foram infectados por Phytophthora sojae, raça 4. As plantas infectadas foram observadas e foi registrado o número de plantas as quais sobreviveram versus plantas as quais foram suscetíveis à infestação. Se todas as 10 plantas tiverem sobrevivido, o fenótipo F2 foi definido como 'r', indicando resistência a Rps1-k homóloga. Se todas as 10 plantas tiverem morrido depois de infestação, o fenótipo F2 foi definido como 's', indicando homólogo suscetível a Rps1-k . Se as 10 plantas tiverem produzido uma população mista a qual era constituída de algumas plantas vivas e algumas plantas suscetíveis, o fenótipo F2 foi definido como 'h', o qual indicou que as plantas eram segregantes para resistência a Rps1-k.

Exemplo 5: O sistema de genotipatem de PCR Alelo-Específico Competitivo da KBioscience (KASPAR™)

[0093] O sistema de genotipagem KASPAR™ consiste em dois componentes: (1) o teste SNP específico (uma combinação de três iniciadores não etiquetados), e (2) a mistura de reação universal Reaction Mix, a qual contém todos os outros componentes requeridos inclu- indo o sistema de notificação fluorescente universal e uma Taq polime- rase especialmente desenvolvida. Os três iniciadores, alelo-específico 1 (A1), alelo-específico 2 (A2), e comum (C1), ou reverso, (Tabela 4) foram designados usando o algoritmo de design de teste do gerente do fluxo de trabalho, Kraken (KBiosciences, Hoddesdon, Hertfordshire, Reino Unido).

[0094] Foi produzida uma Mistura de Teste dos três iniciadores, consistindo em 12 micromolares (μM) cada de A1 e A2 e 30 μM de C1. A Mistura da Reação universal foi diluída até 1X e uma quantidade adicional de MgCl2 foi acrescentada de modo a que a concentração final de MgCl2 da Mistura da Reação em concentração de 1X fosse de 1,8 milimolar (mM). DNA foi dispensado em placas de PCR de 384 cavidades em uma concentração de 1 a 5 ng/μl por cavidade e foi secado para baixo nas placas em um forno a 65° C por 1 hora e 15 minutos. A Mistura de Teste e a Mistura da Reação universal foram combinadas em uma proporção de 1:54 e 4 μl foi dispensado nas placas de DNA usando um robô manipulador de líquido, de modo a que a quan-tidade final da Mistura de Teste na placa fosse de 0,07 μl e que a quantidade final da Mistura da Reação diluída fosse de 3,93 μl. Máquinas GENEAMP PCR SYSTEM 9700™ (Applied Biosystems, Foster City, CA) foram usadas para termociclagem com as condições que se seguem: 94°C por 15 minutos, 20 ciclos de 94°C por 10 segundos, 57°C por 5 segundos, 72°C por 10 segundos; 22 ciclos de 94°C por 10 segundos, 57°C por 20 segundos, 72°C por 40 segundos. Depois da termociclagem ter sido completada, as intensidades fluorescentes ale- lo-específicas foram lidas usando um Espectrofluorômetro PHERAS- TAR® (BMG LabTech, Cary, NC) em temperatura ambiente e os dados foram carregados no sistema Kraken para análise.

Exemplo 6: Análise de Dados de Genotipagem

[0095] A reação KASPAR™ incorpora o uso dos fluoróforos FAM e VIC nos iniciadores A1 e A2 os quais foram respectivamente designados para ligar genótipos suscetíveis e resistentes para cada marcador de SNP. O corante de referência passivo ROX também foi incorporado na reação para normalizar variações no sinal dos fluoróforos causados por diferenças no volume de líquido de cavidade para cavidade. Usando Kraken, os resultados das reações KASPAR™ para cada amostra foram plotados nos eixos x e y de um gráfico. Os eixos x foram plota- dos com amostras que resultaram em reações as quais produziram fluorescência de FAM e os eixos y foram plotados com amostras que resultaram em reações as quais produziram fluorescência de VIC. Os diferentes genótipos resistentes e suscetíveis foram determinados de acordo com a localização de cada um dos clusters de amostra (Figura 2).

[0096] Um total de 115 testes KASPAR™ independentes foram desenvolvidos para detectar SNPs que foram identificados na região de 1,7 a 4,9 par megabase (Mbp) sobre o cromossoma 3 (Tabela 3). Os 115 testes KASPAR™ resultantes foram em seguida triados sobre o painel de linhagens de soja descritas na Tabela 2. Os resultados desta triagem através dos testes KASPAR™ resultaram na identificação de 24 novos marcadores. Os novos marcadores de SNPs estão listados em texto sombreado e em negrito na Tabela 3. Em seguida, os 24 marcadores foram usados para triar a\s 3 populações de mapeamento as quais foram descritas no Exemplo 2. Tabela 3: Lista dos 115 marcadores de SNP triados sobre o painel de triagem de marcadores.

Exemplo 7: Mapeamento e Análise Estatística

[0097] Teste Qui-quadrado de Pearson foi usado para analisar a associação entre os 24 marcadores de SNPs descritos na Tabela 2 e o fenótipo de resistência a Rps1-k. JMP® 9.0 (SAS, Cary, NC) foi usado para toda a análise Qui-quadrada. Em consequência da análise esta-tística dos dados das 3 populações de mapeamento, 10 dos 24 mar-cadores foram determinados como sendo firmemente ligados com re-sistência à phytophthora Rps1-k-específica e produziram p-valores de menos de 0,0001. Estes 10 marcadores firmemente ligados são mos-trados na Tabela 4A e as sequências de iniciador de teste KASPAR™ são descritas na Tabela 4B. Todos os 10 marcadores eram polimórfi- cos na população de mapeamento de linhagens de soja Rps1-k x Rps1-c e 5 eram polimórficos na população de linhagem de soja Rps1- k. A proporção de segregação de amostras (AA:AB:BB) na população de mapeamento Rps1-k x Rps1-c foi a grosso modo de 1:2:1 para os 10 SNPs. Os dados do teste de associação Qui-quadrado são mostrados na Tabela 5 para a população de mapeamento Rps1-k x Rps1-c e na Tabela 6 para a população de mapeamento Rps1-k.

[0098] Existem várias explicações para os baixos valores R2 mos trados nas Tabelas 5 e 6. O um ou mais genes Rps1-k são uma classe de genes R altamente aglomerados codificando proteínas de repetição ricas em leucina de sítio de ligação de nucleotídeos de espiral espira- lada (coiled coil) (CC-NBS-LRR) (Gao et al. 2005). Estima-se que o genoma da soja contenha cerca de 38 cópias de sequências de gene Rps1-k similares, a maioria das quais são aglomerados em aproxima-damente 600 kb de DNA contíguo da região Rps1-k (Bhattacharyya et al. 2005). É difícil a identificação de sequências de nucleotídeos únicas e específicas para projetar iniciadores e sondas a partir de um tal alto número de cópias genéticas dentro desta família genética. A falta de marcadores gene-específicos prontamente identificáveis pode explicar os baixos valores de R2.

[0099] Além disso, é possível que a resistência a Rps1-k seja cau sada por outros QTLs de Rps além do gene Rps1-k. Resistência parcial a phytophthora que não é gene-específica tem sido reportada em muitas publicações (Burnham et al. 2003; Ferro et al. 2006; Li et al. 2010; Ranathunge et al. 2008; Tucker et al. 2010). Atualmente, o processo de fenotipagem não pode separar resistência parcial de resistência gene-específica. A complexidade fenotípica desta doença e as múltiplas cópias de sequências genéticas altamente similares tornam o desenvolvimento de marcadores mais ardiloso e extremamente difícil.

[00100] JOINMAP® 4.0 (Van Ooijen, 2006) foi usado para construir um grupo de ligação (LG) para confirmar que os marcadores eram mapeados com o traço fenotípico de phytophthora juntos sobre LG N do cromossoma 3. Análise de QTL foi realizada usando JMP® Genomics 5.0 (SAS, Cary, NC). Análise de QTL confirmou que todos os SNPs polimórficos foram mapeados juntos com resistência fenotípica a Rps1-k sobre o mesmo grupo de ligação (Figura 3). Tabela 4: Sumário dos 10 marcadores de SNPs que são usados para identificação de linhagens de soja resistentes à phytophthora e suas sequências de iniciadores KASPAR™.

Tabela 5: Os testes de associação dos 10 genótipos de SNPs com os fenótipos resistentes a Rps 1-k na população de mapeamento Rps 1-k x Rps 1-c (p <0,0001).

Tabela 6: Os testes de associação dos 5 genótipos de SNPs polimórficos identificados com os fenótipos resistentes a Rps1-k na população de mapeamento Rps 1-k (p <0,0001).

[00101] A descoberta dos dez marcadores de SNPs que são firme- mente ligados com traço de resistência à phytophthora em soja, Rps1- k, proporciona reagentes os quais podem ser utilizados para o mape- amento de resistência à phytophthora em linhagens de soja. Os dez marcadores de SNPs foram identificados entre 115 marcadores de SNPs usando uma plataforma de genotipagem KASPAR™. Os dez marcadores de SNPs que foram identificados foram isolados e podem ser agora utilizados para triar populações de soja para resistência à phytophthora, e a zigosidade de plantas de soja para o QTL da phytophthora. Todos os dez dos marcadores de SNPs foram mapeados sobre o cromossoma 3 para o grupo de ligação N. Os dez marcadores de SNPs compreendem um fragmento cromossômico contíguo o qual contém QTL para resistência à phytophthora. O fragmento cro- mossômico contíguo abrange um fragmento compreendendo par de bases 2.904.738 a 4.547a450 sobre o cromossoma 3 conforme é ilustrado na Figura 3.

Exemplo 8: Material Vegetal e Extração de DNA

[00102] O teste de Rps1-k TAQMAN™ foi validado usando uma po-pulação de reprodução de soja, consistindo em 359 linhagens que eram segregantes para resistência a Rps1-k. DNA genômico das linhagens de soja foi isolado a partir de 1 disco de folha por amostra usando o kit de extração de DNA MAGATTRACT™ (Qiagen, Valencia, CA) seguindo as instruções do fabricante.

Exemplo 9: Desenvolvimento do Teste de Desfecho TAQMAN™

[00103] O teste de desfecho TAQMAN™ foi desenvolvido para a detecção do lócus Rps1-k de resistência à phytophthora e se baseia na sequência de um marcador de Polimorfismo de Único Nucleotídeo (SNP) firmemente ligado. O marcador de SNP, BARC_064351_18631 (SEQ ID NO: 158), foi identificado como ligado ao lócus Rps1-k sobre o grupo de ligação N e caracteriza um SNP T:C. A presença do alelo T indica que as plantas de soja são suscetíveis a infestação por phytophthora, ao passo que a presença do alelo C indicam que as plantas de soja são resistentes a infestação por phytophthora. O teste de Rps1-k TAQMAN™ resultou na amplificação de um fragmento de 72 pb usando o iniciador direto comum, D-Sb-Rps1k-F, e o iniciador reverso comum, D-Sb-Rps1k-R. A sonda de oligonucleotídeo específica para o alelo resistente (D-Sb-Rps1k-FM) e a do alelo suscetível (D- Sb-Rps1k-VC) ligam ao amplicon entre os dois iniciadores e são etiquetadas com os corantes repórteres fluorescentes FAM e VIC, respectivamente, na extremidade 5' e MGBNFQ (menor sulco ligando supressor não fluorescente) como um supressor na extremidade 3'. Os produtos de PCR são medidos usando um espectrofluorômetro no final do programa de termociclagem. O genótipo é determinado pela presença ou ausência de fluorescência específica quer para o alelo resistente ou para o alelo suscetível. Iniciadores comuns e sondas alelo- específicas foram designados usando o serviço da Custom Design Applied Biosystem (Foster City, CA). As sequências de iniciadores e sondas estão listadas na Tabela 7. Tabela 7: Lista de iniciadores e sondas para teste de desfecho de Rps 1-k TAQMAN™.

Exemplo 10: Condições de PCR e Análise de PCR

[00104] Componentes para uma reação de TAQMAN™ contendo oligonucleotídeos específicos para sequência genômica Rps1-k são mostrados na Tabela 8. A mistura da reação de PCR foi preparada como uma mistura principal (Master Mix) contendo todos os compo- nentes com a exceção dos modelos de DNA. A mistura da reação de PCR foi dispensada em uma placa de 384 cavidades (Abgene, Ro-chester, NY). Modelos de DNA genômico e controles positivos e nega-tivos, mostrados na Tabela 9, foram em seguida incluídos em cavidades separadas da placa. As reações foram amplificadas em um sistema GENAMP PCR SYSTEM 9700™ (Applied Biosystems, Foster City, CA) sob as condições de ciclagem que se seguem: 1 ciclo a 50 °C por 2 minutos; 1 ciclo a 95°C por 10 minutos; e 35 ciclos a 95°C por 15 se-gundos e 60°C por 30 segundos. Depois do completamento das reações de PCR TAQMAN™ e de leitura de fluorescência, foi gerado um gráfico de distribuição.

Exemplo 11: Validação do Teste de Rps 1-k TAQMAN™

[00105] O teste TAQMAN™ foi validado usando uma população de reprodução de soja de 359 linhagens as quais eram segregantes para resistência à phytophthora (Figura 4). Amostras homozigóticas contendo o alelo suscetível a Rps1-k resultaram em leituras de Unidades de Fluorescência Relativa (RFU) do corante VIC somente. Estas amostras são mostradas no cluster superior esquerdo e têm um genó- tipo de T:T. Amostras heterozigóticas as quais contêm uma cópia do alelo suscetível a Rps1-k e uma segunda cópia do alelo resistente a Rps1-k são mostradas no cluster superior direito e têm um genótipo de T:C. Amostras homozigóticas contendo o alelo resistente a Rps1-k são mostradas no cluster inferior direito e têm um genótipo de C:C. Amostras que eram heterozigóticas ou homozigóticas para o alelo resistente a Rps1-k resultaram em leituras de Unidades de Fluorescência Relativa (RFU) para o corante FAM pelo menos 0,5 a 1 unidade maiores do que as do controle não modelo (NTC), o qual é mostrado no canto inferior esquerdo.

[00106] As chamadas genotípicas para a população foram comparadas com as do teste de PCR à base de gel alternativo e os escores fenotípicos os quais foram determinados a partir de suscetibilidade ou resistência à infestação por phytophthora. Os genótipos baseados no teste TAQMAN™ da população de reprodução corresponderam aos genótipos baseados no teste de PCR à base de gel alternativo (somente uma amostra das 354 linhagens apresentou uma discrepância entre o método de PCR à base de gel alternativo e o novo teste TAQMAN™). Tabela 8: Mistura de PCR para teste de Rps 1-k TAQMAN™

Tabela 9: Controles positivos e negativos para teste de Rps1-k.

[00107] O método de detecção TAQMAN® para resistência à phytophthora em soja foi testado contra 354 linhagens de soja as quais compreendem fenótipos resistentes à phytophthora e suscetíveis à phytophthora. O teste foi projetado com êxito para detectar especifi- camente o marcador de SNP de soja BARC_064351_18631 (SEQ ID NO: 158) o qual identifica plantas de soja que são resistentes à phytophthora. Os iniciadores e as sondas específicos do evento podem ser usados de modo eficaz para a detecção do marcador de SNP de soja BARC_064351_18631 (SEQ ID NO: 158) e estas condições e estes reagentes são aplicáveis para testes de zigosidade.

[00108] Finalmente, o técnico versado reconhecerá que o método TAQMAN® descrito nos exemplos precedentes é prontamente aplicável para a detecção dos outros marcadores de SNPs de soja, descritos dentro desta descoberta, os quais podem ser usados para a identificação de plantas de soja que são resistentes à resistência à phytophtho- ra. Por exemplo, os marcadores de SNPs da Tabela 4A proporcionam sequências que podem ser usadas para o desenho de iniciadores e sondas os quais podem ser especificamente usados para detectar o marcador de SNP através de um teste TAQMAN®. Além disso, as condições do teste TAQMAN® podem ser modificadas alterando os componentes reagentes, e modificando as temperaturas e as condições de amplificação. O técnico versado entenderá que os ensinamentos desta descoberta proporcionam orientação para projetar os testes TAQMAN® referidos para a detecção de quaisquer marcadores de SNPs revelados aqui, neste requerimento de patente. Por exemplo; os testes TAQMAN® para a detecção dos marcadores de SNPs de resistência à phytophthora de Gmax7x198_656813 (SEQ ID NO: 151), NCSB_000559 (SEQ ID NO: 150), SNP18196 (SEQ ID NO: 152), NCSB_000575 (SEQ ID NO: 153), Gmax7x259_44054 (SEQ ID NO: 154), SNP18188 (SEQ ID NO: 155), Gmax7x259_98606 (SEQ ID NO: 156), BARC_064351_18628 (SEQ ID NO: 157), e NCSB_000582 (SEQ ID NO: 159) estão dentro do âmbito da presente descoberta.

[00109] Apesar de aspectos desta invenção terem sido descritos em algumas modalidades, podem ser adicionalmente modificados den- tro do espírito e do escopo desta descoberta. Este requerimento, por-tanto, tem por objetivo cobrir quaisquer variações, utilizações, ou adaptações de modalidades da invenção usando seus princípios gerais. Além disso, este requerimento tem por objetivo cobrir os referidos desvios da presente descoberta conforme estejam dentro da prática conhecida ou habitual na técnica à qual estas modalidades dizem res-peito e os quais estejam dentro dos limites das reivindicações anexadas.

Claims (10)

1. Método para identificação de pelo menos um determinante de resistência à phytophthora em uma planta de soja, o método ca-racterizado pelo fato de que compreende: isolamento de moléculas de ácido nucleico compreendendo um ou mais marcadores de sequência de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) selecionados do grupo consistindo da: SEQ ID Nos 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 e 159 a partir de uma planta de soja; e, triagem das moléculas de ácido nucleico isoladas por geno- tipagem, TAQMAN ou reação em cadeia da polimerase alelo- específica competitiva para um marcador ligado ao fenótipo de resistência à phytophthora na planta de soja, em que o marcador é um ale- lo marcador de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) selecionado entre o grupo consistindo em T na posição 11 da SEQ ID NO: 29 (NCSB_000559); T na posição 11 da SEQ ID NO: 30 (Gmax7x198_656813); C na posição 11 da SEQ ID NO: 68 (SNP18196); C na posição 11 da SEQ ID NO: 60 (NCSB_000575); C na posição 11 da SEQ ID NO: 77 (Gmax7x259_44054); T na posição 11 da SEQ ID NO: 74 (SNP18188); A na posição 11 da SEQ ID NO: 72 (Gmax7x259_98606); G na posição 11 da SEQ ID NO: 64 (BARC_064351_18628); C na posição 11 da SEQ ID NO: 67 (BARC_064351_18631); e G na posição 11 da SEQ ID NO: 93 (NCSB_000582) e a presença do alelo marcador é indicativa de resis-tência à phytophthora na planta de soja.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o marcador ligado ao fenótipo de resistência à phytophthora na planta de soja está no grupo de ligação N da soja.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as moléculas de ácido nucleico isoladas são DNA ge- nômico.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a tria-gem das moléculas de ácido nucleico isoladas para um marcador ligado ao fenótipo de resistência à phytophthora na planta de soja é carac-terizado por usar reação de cadeia polimerase alelo-específica compe-titiva para identificar a presença ou ausência do alelo marcador de SNP.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que pelo menos um determinante de resistência à phytophthora na planta de soja é Rps1-k.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a tria-gem das moléculas de ácido nucleico isoladas para um marcador ligado ao fenótipo de resistência à phytophthora na planta de soja é carac-terizado por usar ensaio TAQMAN para identificar a presença ou au-sência do alelo marcador de SNP.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a tria-gem das moléculas de ácido nucleico isoladas é caracterizada por usar reação em cadeia da polimerase e um conjunto de oligonucleotídeos iniciadores e/ou sondas capazes de hibridizar especificamente com SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:153, SEQ ID NO:154, SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:156, SEQ ID NO:157, SEQ ID NO:158, ou SEQ ID NO:159.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que o con-junto de oligonucleotídeos e caracterizado por compreender um ou mais conjuntos de sequências selecionados dos conjuntos (a) a (k) a seguir: (a) SEQ ID Nos: 116, 117, e 118; (b) SEQ ID Nos: 119, 120, e 121; (c) SEQ ID Nos: 122, 123, e 124, (d) SEQ ID Nos: 125, 126, e 127, (e) 128, 129, e 130, (f) SEQ ID Nos: 131, 132, e 133; (g) SEQ ID Nos: 134, 135; e 136; (h) SEQ ID Nos: 137; 138 e 139; (i) SEQ ID Nos: 140, 141, e 142; e (k) SEQ ID Nos: 143, 144, e 145.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que a reação em cadeia da polimerase é caracterizada por usar pelo menos dois iniciadores e pelo menos uma sonda que são capazes de hibridizar es-pecificamente a SEQ ID NO: 158.

10. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que os iniciadores e as sondas compreendem iniciadores e sondas selecionados entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148 e SEQ ID NO: 149.

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