BR112015015057B1 - Método de identificação de planta de soja - Google Patents
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Abstract
MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE PLANTA DE SOJA. Vários métodos e várias composições são fornecidos para identificar e/ou selecionar plantas de soja ou plasma germinativo de soja com resistência ou resistência aprimorada ao nematódeo de cisto de soja. Em certas modalidades, o método compreende detectar pelo menos um locus marcador que está associado com a resistência ao nematódeo de cisto de soja. Em outras modalidades, o método adicionalmente compreende detectar pelo menos um perfil marcador ou haplótipo marcador associado com a resistência ao nematódeo de cisto de soja. Em modalidades adicionais, o método compreende cruzar uma planta de soja selecionada com uma segunda planta de soja. São adicionalmente fornecidos marcadores, iniciadores, sondas e kits úteis para identificar e/ou selecionar plantas de soja ou plasma germinativo de soja com resistência ou resistência aprimorada ao nematódeo de cisto de soja.
Description
[0001] Esta invenção refere-se aos métodos de identificar e/ou de selecionar plasma germinativo ou plantas de soja que apresentam resistência ou resistência aprimorada ao Nematódeo de Cisto de soja.
[0002] A cópia oficial da listagem de sequências é submetida simultaneamente com o relatório descritivo como um arquivo de texto via EFS-Web, em conformidade com o American Standard Code for Information Interchange (ASCII), com um nome de arquivo de 430267seqlist.txt, uma data de criação de 21 de fevereiro de 2013 e um tamanho de 229 KB. A listagem de sequência depositada via EFS-Web faz parte do relatório descritivo e é por meio desta incorporada em sua totalidade por referência da presente invenção.
[0003] A soja ( Glycine max L. Merr.) é uma importante cultura agrícola comercial e mercadoria de investimento na América do Norte e em outros lugares. O óleo de soja é um dos óleos comestíveis mais amplamente usados, e os grãos de soja são usados em todo o mundo tanto para a produção de ração animal como para a alimentação humana. Adicionalmente, a utilização de soja está expandindo-se para aplicações industrial, manufatureira e farmacêutica.
[0004] O nematódeo de cisto de soja (SCN, “Soybean Cyst Nematode”) é uma peste parasítica que tem ameaçado a produção de soja nos EUA durante mais que cinquenta anos. A resistência ao nematódeo de cisto de soja é um atributo economicamente importante porque a infecção pode substancialmente reduzir os rendimentos. A caracterização molecular de resistência ao nematódeo de cisto de soja teria implicações importantes para o aprimoramento do cultivar soja.
[0005] Existe uma necessidade de plantas de soja com resistência aprimorada ao nematódeo de cisto de soja e de métodos para identificar e selecionar tais plantas.
[0006] Vários métodos e várias composições são fornecidos para identificar e/ou selecionar plantas de soja ou plasma germinativo de soja com resistência ou resistência aprimorada ao nematódeo de cisto de soja. Em certas modalidades, o método compreende detectar pelo menos um locus marcador que está associado com a resistência ao nematódeo de cisto de soja. Em outras modalidades, o método adicionalmente compreende detectar pelo menos um perfil marcador ou haplótipo marcador associado com a resistência ao nematódeo de cisto de soja. Em modalidades adicionais, o método compreende cruzar uma planta de soja selecionada com uma segunda planta de soja. São adicionalmente fornecidos marcadores, iniciadores, sondas e kits úteis para identificar e/ou selecionar plantas de soja ou plasma germinativo de soja com resistência ou resistência aprimorada ao nematódeo de cisto de soja.
[0007] As Figuras 1 A-D fornecem um mapa genético de loci em grupo de ligação A2.
[0008] Antes de descrever a presente invenção em detalhes, é para ser entendido que esta invenção não é limitada às modalidades específicas, que podem, obviamente, variar. Deve-se compreender também que a terminologia usada no presente documento é para o propósito de somente descrever as modalidades específicas e não se destina a ser limitadora.
[0009] Determinadas definições usadas no relatório descritivo e reivindicações são fornecidas abaixo. Com a finalidade de fornecer um entendimento claro e consistente do relatório descritivo e reivindicações, que incluem o escopo para ser determinado tais termos, são fornecidas as seguintes definições:
[0010] Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexadas, os termos no singular e as formas singulares “um”, “uma”, “o” e “a”, por exemplo, incluem as referências no plural, exceto se o contexto determinar claramente em contrário. Dessa forma, por exemplo, a referência à “planta”, “a planta” ou “uma planta” inclui também uma pluralidade de plantas; também, dependendo do contexto, o uso do termo “planta” pode também incluir a progênie geneticamente similar ou idêntica daquela planta; o uso do termo “um ácido nucleico” inclui, opcionalmente, como uma questão prática, muitas cópias dessa molécula de ácido nucleico; de modo similar, o termo “sonda” abrange, opcionalmente, (e tipicamente) muitas moléculas de sonda similares ou idênticas.
[0011] Adicionalmente, para uso na presente invenção, “que compreende” ou “compreendendo” deve ser interpretado como especificamente na presença de características, números inteiros, etapas, ou componentes declarados, ou grupos dos mesmos. Portanto, por exemplo, um kit que compreende um par de iniciadores de oligonucleotídeo pode ter dois ou mais pares de iniciadores de oligonucleotídeo. Adicionalmente, o termo “que compreende” destina-se a incluir exemplos abrangidos pelos termos “consistindo essencialmente em”, e “consistindo em”. De modo similar, o termo “consistindo essencialmente em” destina- se a incluir exemplos abrangidos pelo termo “consistindo em”.
[0012] “Agronômico”, “atributos agronômicos”, e “desempenho agronômico” referem-se aos atributos (e elementos genéticos subjacentes) de uma dada variedade de planta que contribuem para a produtividade durante o curso de uma época de plantio. Atributos agronômicos individuais incluem vigor de emergência, vigor vegetativo, tolerância ao estresse, resistência ou tolerância à doença, resistência ou tolerância a inseto, resistência a herbicida, ramificação, floração, conjunto de sementes, tamanho de semente, densidade de semente, acamamento, resistência à debulha e similares.
[0013] “Alelo” refere-se a qualquer um dentre um ou mais formas alternativas de uma sequência genética. Em um organismo ou célula diploide, os dois alelos de uma determinada sequência ocupam tipicamente loci correspondentes em um par de cromossomos homólogos. Em relação a um marcador de SNP, alelo refere-se à base de nucleotídeo específico presente naquele locus de SNP naquela planta individual.
[0014] O termo “amplificar”, no contexto de amplificação de ácido nucleico, é qualquer processo pelo qual cópias adicionais de um ácido nucleico selecionado (ou uma forma transcrita do mesmo) são produzidas. Um “amplicon” é um ácido nucleico amplificado, por exemplo, um ácido nucleico que é produzido pela amplificação de ácido nucleico-molde por meio de qualquer método de amplificação disponível.
[0015] Uma “linhagem ancestral” é uma linhagem progenitora usada como uma fonte de genes, por exemplo, para o desenvolvimento de linhagens de elite.
[0016] Uma “população de ancestral” é um grupo de ancestrais que têm contribuído para o volume da variação genética que foi usada para desenvolver linhagens de elite.
[0017] O “retrocruzamento” é um processo no qual um cultivador melhorista cruza uma variedade de progênie novamente com um dos genótipos parentais uma ou mais vezes.
[0018] O termo “segmento de cromossomo” designa uma amplitude linear contígua de DNA genômico que reside em planta em um único cromossomo. “intervalo de cromossomo” refere-se a um segmento de cromossomo definido pelo flanqueamento específico de loci marcadores.
[0019] “Cultivar” e “variedade” são usados de maneira sinônima e referem-se a um grupo de plantas dentro de uma espécie (por exemplo, Glycine max) que compartilham determinados atributos genéticos que separam as mesmas de outras possíveis variedades dentro dessa espécie. Os cultivares de soja são linhagens endogâmicas produzidas após várias gerações de autopolinizações. As partes individuais dentro de um cultivar de soja são homogêneas, quase geneticamente idênticas, com a maioria dos loci no estado de homozigoto.
[0020] Uma “linhagem de elite” é uma linhagem agronomicamente superior que tem resultado de muitos ciclos de melhoramento genético e seleção para desempenho agronômico superior. Numerosas linhagens de elite estão disponíveis e são conhecidas por aqueles versados na técnica de melhoramento genético de soja.
[0021] Uma “população de elite” é uma variedade de linhagens ou indivíduos de elite que podem ser usados para representar o estado da técnica em termos de genótipos agronomicamente superiores de uma determinada espécie de cultura, tal como soja.
[0022] Uma “cepa de soja exótica” ou um “plasma germinativo de soja exótica” é uma cepa ou um plasma germinativo derivada (derivado) a partir de soja que não pertence a uma cepa ou linhagem de soja de elite disponível de plasma germinativo. No contexto de um cruzamento entre duas cepas ou plantas de soja de plasma germinativo, um plasma germinativo exótico não está intimamente relacionado por descendência ao plasma germinativo de elite com o qual o mesmo é cruzado. Mais comumente, o plasma germinativo exótico não é derivado de qualquer linhagem de elite de soja, mas é, de preferência, selecionado para introduzir elementos genéticos inovadores (tipicamente alelos inovadores) em um programa de melhoramento genético.
[0023] Um “mapa genético” é uma descrição de uma associação genética ou de relações de ligação dentre loci em um ou mais cromossomos (ou grupos de ligação) dentro de uma determinada espécie, de modo geral representado sob uma forma diagramática ou tabular.
[0024] “Genótipo” é uma descrição do estado alélico em um ou mais loci.
[0025] “Plasma germinativo” refere-se ao material genético que compreende a base física das qualidades hereditárias de um organismo. Para uso na presente invenção, o plasma germinativo inclui grãos e tecido vivo a partir dos quais novas plantas podem crescer; ou, outra parte de planta, tal como folha, caule, pólen ou células, que podem ser cultivados em uma planta inteira. Os recursos de plasma germinativo fornecem fontes de características genéticas usadas por cultivadores melhoristas de plantas para aprimorar os cultivares comerciais.
[0026] Um indivíduo é “homozigótico” se o indivíduo tiver somente um tipo de alelo em um determinado locus (por exemplo, um indivíduo diploide tem uma cópia do mesmo alelo em um locus para cada um dos dois cromossomos homólogos). Um indivíduo é “heterozigótico” se mais do que um tipo de alelo estiver presente em um determinado locus (por exemplo, um indivíduo diploide com uma cópia cada de dois alelos diferentes). O termo “homogeneidade” indica que os membros de um grupo têm o mesmo genótipo em um ou mais loci específicos. Ao contrário, O termo “heterogeneidade” é usado para indicar que os indivíduos dentro do grupo se diferem em genótipo em um ou mais loci específicos.
[0027] “Introgressão” significa a entrada ou introdução de um gene, QTL, haplótipo, perfil marcador, atributo, ou locus de atributo do genoma de uma planta no genoma de outra planta.
[0028] Os termos “marcação” ou “marcação detectável” referem-se a uma molécula capaz de detecção. Uma marcação detectável também pode incluir uma combinação de um repórter e um inativador, tal como são utilizados em sondas FRET ou sondas TaqMan™. O termo “repórter” refere-se a uma substância ou uma parte da mesma que é capaz de exibir um sinal detectável, tal sinal pode ser suprimido por um inativador. O sinal detectável do repórter é, por exemplo, fluorescente na faixa detectável. O termo “inativador” refere-se a uma substância ou parte da mesma que é capaz de suprimir, reduzir, inibir, etc., o sinal detectável produzido pelo repórter. Conforme aqui usados, os termos “inativação” e “transferência de energia fluorescente” referem-se ao processo por meio do qual, quando um repórter e um inativador estão em estreita proximidade, e o repórter é excitado por uma fonte de energia, uma porção substancial da energia do estado excitado transfere-se de modo não radioativo para o inativador onde ela quer se dissipa de modo não radioativo quer é emitida em um comprimento de onda de emissão diferente daquele do repórter.
[0029] Uma “linhagem” ou “cepa” é um grupo de indivíduos de descendência idêntica que são geralmente endogâmicos até certo ponto e que são geralmente homozigóticos e homogêneos na maioria dos loci (isogênicos ou quase isogênicos). Uma “sublinhagem” refere-se a um subconjunto endogâmico de descendentes que são geneticamente diferentes dos outros subconjuntos similarmente endogâmicos descendentes do mesmo progenitor. Tradicionalmente, uma sublinhagem foi derivada por endogamia da semente a partir de uma planta de soja individual selecionada na geração F3 a F5 até os loci segregantes residuais serem “fixados” ou homozigóticos através da maioria dps ou todos os loci. Variedades (ou linhagens) de soja comerciais são tipicamente produzidas por agregação (“formação de volume”) da progênie autopolinizada de uma planta F3 a F5 única a partir de um cruzamento controlado entre 2 pais geneticamente diferentes. Embora a variedade pareça tipicamente uniforme, a variedade de autopolinização derivada a partir da planta selecionada eventualmente (por exemplo, F8) se torna uma mistura de plantas homozigóticas que podem variar em genótipo em qualquer locus que era heterozigótico na planta F3 a F5 originalmente selecionada. As sublinhagens à base de marcador que se diferem umas das outras, com base no polimorfismo qualitativo no nível de DNA em um ou mais loci marcadores específicos, são derivadas pela genotipagem de uma amostra de grão derivada a partir de progênie autopolinizada individual derivada de uma planta F3 a F5 selecionada. A amostra de grão pode ser genotipada diretamente como grão, ou como tecido de planta cultivado a partir de tal amostra de grão. Opcionalmente, as sementes que compartilham um genótipo comum no locus (ou loci) específico(s) são (aumentadas em volume) fornecendo uma sublinhagem que é geneticamente homogênea em loci identificados importantes para um atributo de interesse (por exemplo, produtividade, tolerância, etc.).
[0030] “Ligação” refere-se à tendência dos alelos para segregarem juntos mais frequentemente que suposto por acaso se a transmissão deles fosse independente. Tipicamente, a ligação refere-se aos alelos no mesmo cromossomo. A recombinação genética ocorre com uma frequência aleatória presumida em relação a todo o genoma. Os mapas genéticos são construídos por medição da frequência de recombinação entre pares de atributos ou marcadores, quanto menor a frequência de recombinação, e maior o grau de ligação.
[0031] “Desequilíbrio de ligação” é uma associação não aleatória de alelos em dois ou mais loci e pode ocorrer entre marcadores não ligados. É baseado nas frequências de alelos dentro de uma população e é influenciada por, mas não dependente da, ligação.
[0032] “Grupo de ligação” (LG) refere-se aos atributos ou marcadores que, em geral, segregam conjuntamente. Um grupo de ligação corresponde geralmente a uma região cromossômica que contém material genético que codifica as características ou marcadores.
[0033] “Locus” é um segmento definido de DNA.
[0034] Uma “localização no mapa” ou “posição no mapa” é uma localização atribuída em um mapa genético relativa aos marcadores genéticos ligados onde um marcador especificado pode ser encontrado dentro de uma determinada espécie. As posições no mapa são de modo geral fornecidas em centimorgans (cM), exceto onde indicado em contrário, as posições genéticas fornecidas são baseadas no Mapa Consenso de Glycine max (“Glycine max Consensus Map”) versão 4.0 conforme fornecido por Hyten et al. (2010) Crop Sci 50:960-968. Uma “posição física” ou “localização física” ou “localização física no mapa” é a posição, tipicamente em bases de nucleotídeos, de um nucleotídeo específico, como um nucleotídeo SNP, em um cromossomo. Exceto onde indicado em contrário, a posição física dentro do genoma de soja fornecido é baseada na sequência de genoma Glyma 1.0 descrita em Schmutz et al. (2010) Nature 463:178-183, disponível junto ao site da web Phytozome (phytozome-dot-net/soybean).
[0035] “Mapeamento” é o processo de definir a associação e as relações de loci mediante o uso de marcadores genéticos, segregação de populações para os marcadores, princípios genéticos padrão de frequência de recombinação.
[0036] “Marcador” ou “marcador molecular” ou “locus marcador” é um termo usado para denotar um ácido nucleico ou uma sequência de aminoácidos que é suficientemente peculiar para caracterizar um locus específico no genoma. Qualquer atributo polimórfico detectável pode ser usado como um marcador desde que ele seja herdado diferencialmente e apresente desequilíbrio de ligação com um atributo fenotípico de interesse.
[0037] “Seleção assistida por marcador” refere-se ao processo de selecionar um atributo desejado ou atributos desejados em uma planta ou plantas detectando-se um ou mais ácidos nucleicos a partir da planta, em que o ácido nucleico é ligado ao atributo desejado e, então, selecionando-se a planta ou plasma germinativo que possui aqueles um ou mais ácidos nucleicos.
[0038] “Haplótipo” refere-se a uma combinação de alelos específicos presentes dentro de um genoma da planta específica em dois ou mais loci marcadores ligados, por exemplo, em dois ou mais loci em um grupo de ligação específico. Por exemplo, em um exemplo, dois loci marcadores específicos em LG-A2 são usados para definir um haplótipo para uma planta específica. Em ainda outros exemplos, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais loci marcadores ligados são usados para definir um haplótipo para uma planta específica.
[0039] Conforme aqui usado, um “perfil marcador” significa uma combinação de alelos específicos presentes dentro de um genoma de planta específica em dois ou mais loci marcadores que não estão ligados, por exemplo dois ou mais loci em dois ou mais grupos de ligação diferentes ou dois ou mais cromossomos diferentes. Por exemplo, em um exemplo, uma combinação específica de loci marcadores ou uma combinação específica de haplótipos define o perfil marcador de uma planta específica.
[0040] O termo “planta” inclui a referência a uma planta total imatura ou madura, que inclui uma planta da qual a semente, o grão ou as anteras foram removidas (removidos). A semente ou embrião que produzirá a planta também é considerada como planta.
[0041] “Partes de planta” significa qualquer porção ou peça de uma planta, incluindo folhas, caules, botões, raízes, pontas de raízes, anteras, semente, grão, embrião, pólen, óvulos, flores, cotilédones, hipocótilos, vagens, flores, brotos, hastes (pedúnculos), tecidos, culturas de tecidos, células e similares.
[0042] “Polimorfismo” refere-se a uma mudança ou diferença entre dois ácidos nucleicos relacionados. Um “polimorfismo de nucleotídeo” refere-se a um nucleotídeo que é diferente em uma sequência quando comparada a uma sequência relacionada, quando os dois ácidos nucleicos são alinhados para correspondência máxima.
[0043] “Polinucleotídeo”, “sequência de polinucleotídeo”, “ácido nucleico”, “molécula de ácido nucleico”, “sequência de ácido nucleico”, “fragmento de ácido nucleico”, e “oligonucleotídeo” são usados aqui de forma intercambiável para indicar um polímero de nucleotídeos que é de fita única ou de fitas múltiplas, que opcionalmente contém bases nucleotídicas de DNA ou de RNA sintéticas, não naturais, ou alteradas. Um polinucleotídeo de DNA pode compreender uma ou mais fitas de cDNA, DNA genômico, DNA sintético, ou misturas dos mesmos.
[0044] “Iniciador” refere-se a um oligonucleotídeo que é capaz de atuar como um ponto de iniciação de síntese de ácido nucleico ou replicação de ácido nucleico ao longo de uma fita complementar quando posto sob condições nas quais a síntese de uma fita complementar é catalisada por uma polimerase. Tipicamente, os iniciadores têm cerca de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento, mas as sequências mais longas ou mais curtas podem ser utilizadas. Os iniciadores podem ser fornecidos sob forma de fita dupla, apesar de a forma de fita única ser tipicamente mais usada. Um iniciador contém, ainda, uma marcação detectável, por exemplo, uma marcação de extremidade 5’.
[0045] “Sonda” refere-se a um oligonucleotídeo que é complementar (embora não necessariamente totalmente complementar) a um polinucleotídeo de interesse e forma uma estrutura dúplex por hibridização com pelo menos uma fita do polinucleotídeo de interesse. Tipicamente, as sondas são oligonucleotídeos com de 10 a 50 nucleotídeos de comprimento, mas sequências mais longas ou mais curtas podem ser empregadas. Uma sonda pode conter, adicionalmente, uma marcação detectável.
[0046] “Loci de atributo quantitativo” ou “QTL” referem-se aos elementos genéticos que controlam um atributo quantitativo.
[0047] “Frequência de recombinação” é a frequência de um cruzamento em relação ao evento (recombinação) entre dois loci genéticos. A frequência de recombinação pode ser observada seguindo-se a segregação de marcadores e/ou atributos durante a meiose.
[0048] “Resistência e “resistência aprimorada” são usadas aqui de forma intercambiável e referem-se a qualquer tipo de aumento em resistência ou tolerância, ou qualquer tipo de decréscimo em suscetibilidade. Uma “planta resistente” ou “variedade de planta resistente” não precisa possuir resistência absoluta ou completa. Em vez disso, uma “planta resistente”, “variedade de planta resistente”, ou uma planta ou variedade de planta com “resistência aprimorada” terá um nível de resistência ou tolerância que é maior que aquela de uma planta ou variedade suscetível comparável.
[0049] “Autocruzamento” ou “autopolinização” ou “autogamia” é um processo mediante o qual um cultivador melhorista cruza uma planta com ela mesma; por exemplo, um híbrido de segunda geração F2 com si mesmo para produzir progênie designada F2:3.
[0050] “SNP” ou “polimorfismo de nucleotídeo único” refere-se a uma variação de sequência que ocorre quando um único nucleotídeo (A, T, C ou G) na sequência do genoma é alterado ou variável. Os “marcadores de SNP” existem quando os SNPs são mapeados nos sítios no genoma de soja.
[0051] O termo “produtividade” refere-se à produtividade por unidade de área de um produto de planta específica de valor comercial. Por exemplo, a produtividade de soja é comumente medida em bushels de grão por acre ou toneladas métricas de grão por hectare por período. A produtividade é afetada tanto por fatores genéticos como ambientais.
[0052] Conforme aqui usado, um polinucleotídeo ou polipeptídeo “isolado” ou “purificado”, ou sua porção biologicamente ativa, está substancial ou essencialmente isento (isenta) de componentes que normalmente acompanham ou interagem com o polinucleotídeo ou polipeptídeo como encontrado em seu ambiente de ocorrência natural. Tipicamente, um polinucleotídeo “isolado” está isento de sequências (sob uma forma ótima, de sequências que codificam proteínas) que naturalmente flanqueiam o polinucleotídeo (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do polinucleotídeo) no DNA genômico do organismo do qual o polinucleotídeo é derivado. Por exemplo, o polinucleotídeo isolado pode conter menor que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1 kb de sequência de nucleotídeos que naturalmente flanqueia o polinucleotídeo em DNA genômico da célula da qual o polinucleotídeo é derivado. Um polipeptídeo que está substancialmente isento de material celular inclui preparações de polipeptídeos que têm menos que cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, ou 1% (em peso seco) de proteína contaminante, meios de cultura ou outros componentes químicos.
[0053] Técnicas de clonagem molecular e de DNA recombinante padrão aqui usadas são bem conhecidas na técnica e são descritas mais completamente em Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (mais adiante neste documento “Sambrook”).
[0054] São fornecidos métodos para identificar e/ou selecionar planta de soja ou plasma germinativo de soja que apresenta resistência ou resistência aprimorada ao nematódeo de cisto de soja. O método compreende detectar na planta de soja ou no plasma germinativo de soja, ou em uma sua parte, pelo menos um locus marcador associado com a resistência ao nematódeo de cisto de soja. Também são fornecidos polinucleotídeos isolados e kits para uso em identificação e/ou detecção de uma planta de soja ou um plasma germinativo de soja que apresenta resistência ou resistência aprimorada ao nematódeo de cisto de soja, e plantas de soja, células de soja, e/ou grãos de soja que compreendem ao menos um locus marcador que confere resistência aprimorada ao nematódeo de cisto de soja.
[0055] Aqui fornecidos, os loci marcadores associados com a resistência ao nematódeo de cisto de soja foram identificados e mapeados no locus rhg4 (resistência ao Heterodera glycines 4) no grupo de ligação A2 no cromossomo 8. Exemplos de linhagens de soja que, conforme conhecido, compreendem o locus de resistência rhg4 incluem, por exemplo, Peking e PI437654.
[0056] Estas descobertas têm implicações importantes para a produção de soja, porque marcadores identificadores que podem ser usados para a seleção de resistência ao nematódeo de cisto de soja aceleração muito o desenvolvimento de resistência ao nematódeo de cisto de soja em cultivares de elite.
[0057] São fornecidos loci marcadores, haplótipos e perfis marcadores associados com a resistência ao nematódeo de cisto de soja. São adicionalmente fornecidos loci genômicos que estão associados com a resistência da soja ao nematódeo de cisto de soja.
[0058] Em certas modalidades, são identificados plantas de soja ou plasma germinativo de soja que têm pelo menos um alelo, locus marcador, haplótipo ou perfil marcador favorável que positivamente se correlaciona com a resistência ou resistência aprimorada ao nematódeo de cisto de soja. Entretanto, em outras modalidades, é útil para propósitos de exclusão durante o melhoramento genético a identificação de alelos, loci marcadores, haplótipos, ou perfis marcadores que negativamente se correlacionam com a resistência, por exemplo, para eliminar tais plantas ou plasma germinativo dos ciclos subsequentes de melhoramento genético.
[0059] Em uma modalidade, os loci marcadores úteis para identificar uma primeira planta de soja ou um primeiro plasma germinativo de soja que apresenta resistência ou resistência aprimorada ao nematódeo de cisto de soja estão associados com o locus rhg4 no grupo de ligação A2 no cromossomo 8. Em uma outra modalidade, o locus marcador compreende: (a) S07160-1ou um marcador estreitamente ligado no grupo de ligação A2; ou (b) Gm08:8300131, Gm08:8257778, Gm08:8257785, Gm08:8258163, Gm08:8258688, Gm08:8258742, Gm08:8259928, Gm08:8260451, Gm08:8260590, Gm08:8261480, Gm08:8261684, Gm08:8262165, Gm08:8263213, Gm08:8263250, Gm08:8263611, Gm08:8264149, Gm08:8265227, Gm08:8265364, Gm08:8265614, Gm08:8266183, Gm08:8266185, Gm08:8266263, Gm08:8266350, Gm08:8266386, Gm08:8266473, Gm08:8266888, Gm08:8267085, Gm08:8267166, Gm08:8267721, Gm08:8267826, Gm08:8268336, Gm08:8268861, Gm08:8269148, Gm08:8269785, Gm08:8270037, Gm08:8270562, Gm08:8270652, Gm08:8271540, Gm08:8271591, Gm08:8271649, Gm08:8271672, Gm08:8271955, Gm08:8273257, Gm08:8273355, Gm08:8273979, Gm08:8275766, Gm08:8275780, Gm08:8275959, Gm08:8276701, Gm08:8276849, Gm08:8276913, Gm08:8277162, Gm08:8277227, Gm08:8277248, Gm08:8277381, Gm08:8277383, Gm08:8277542, Gm08:8277625, Gm08:8277643, Gm08:8277876, Gm08:8277880, Gm08:8277969, Gm08:8278001, Gm08:8278167, Gm08:8278274, Gm08:8278434, Gm08:8279165, Gm08:8279230, Gm08:8279854, Gm08:8280901, Gm08:8280937, Gm08:8281564, Gm08:8282902, Gm08:8284027, Gm08:8286864, Gm08:8287265, Gm08:8287278, Gm08:8287453, Gm08:8287459, Gm08:8288039, Gm08:8288141, Gm08:8288200, Gm08:8288470, Gm08:8288831, Gm08:8289392, Gm08:8290740, Gm08:8291682, Gm08:8292207, Gm08:8297064, Gm08:8299433, Gm08:8299672, Gm08:8301839, Gm08:8302134, Gm08:8303450, Gm08:8305237, Gm08:8305348, Gm08:8305905, Gm08:8306090, Gm08:8306141, Gm08:8306210, Gm08:8306492, Gm08:8306627, Gm08:8307172, Gm08:8307665, Gm08:8308019, Gm08:8308891, Gm08:8308917, Gm08:8309316, Gm08:8309423, Gm08:8309837, Gm08:8310383, Gm08:8310464, Gm08:8310503, Gm08:8310663, Gm08:8311631, Gm08:8311906, Gm08:8312536, Gm08:8312819, Gm08:8313273, Gm08:8313923, Gm08:8314010, Gm08:8314025, Gm08:8314208, Gm08:8314292, Gm08:8314295, Gm08:8314513, Gm08:8314736, Gm08:8314791, Gm08:8314860, Gm08:8315543, Gm08:8315644, Gm08:8316113, Gm08:8316689, Gm08:8316899, Gm08:8317852, Gm08:8317861, Gm08:8318033, Gm08:8319087, Gm08:8319642, Gm08:8319647, Gm08:8320068, Gm08:8321253, Gm08:8321649, Gm08:8323937, Gm08:8324341, Gm08:8325127, Gm08:8325214, Gm08:8326696, Gm08:8326877, Gm08:8328633, Gm08:8330929, Gm08:8331132, Gm08:8331181, Gm08:8331408, Gm08:8331827, Gm08:8332651, Gm08:8332685, Gm08:8332957, Gm08:8343167, Gm08:8345187, Gm08:8345720, Gm08:8346030, Gm08:8346050, Gm08:8346352, Gm08:8346726, Gm08:8347799, Gm08:8348022, Gm08:8348028, Gm08:8349925, Gm08:8350122, Gm08:8350277, Gm08:8351061, Gm08:8351503, Gm08:8352313, Gm08:8352743, Gm08:8353341, Gm08:8355175, Gm08:8360133, Gm08:8363193, Gm08:8363888, Gm08:8364195 ou um marcador estreitamente ligado ao mesmo.
[0060] Em certas modalidades, são investigados múltiplos loci marcadores que coletivamente compõem um haplótipo de resistência ao nematódeo de cisto de soja de interesse. Por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais dos vários loci marcadores aqui fornecidos podem compreender um haplótipo de resistência ao nematódeo de cisto de soja. Em algumas modalidades, o haplótipo compreende: (a) dois ou mais loci marcadores associados com o locus Rhg4 no grupo de ligação A2; ou (b) dois ou mais loci marcadores que compreendem S07160-1, Gm08:8300131, Gm08:8257778, Gm08:8257785, Gm08:8258163, Gm08:8258688, Gm08:8258742, Gm08:8259928, Gm08:8260451, Gm08:8260590, Gm08:8261480, Gm08:8261684, Gm08:8262165, Gm08:8263213, Gm08:8263250, Gm08:8263611, Gm08:8264149, Gm08:8265227, Gm08:8265364, Gm08:8265614, Gm08:8266183, Gm08:8266185, Gm08:8266263, Gm08:8266350, Gm08:8266386, Gm08:8266473, Gm08:8266888, Gm08:8267085, Gm08:8267166, Gm08:8267721, Gm08:8267826, Gm08:8268336, Gm08:8268861, Gm08:8269148, Gm08:8269785, Gm08:8270037, Gm08:8270562, Gm08:8270652, Gm08:8271540, Gm08:8271591, Gm08:8271649, Gm08:8271672, Gm08:8271955, Gm08:8273257, Gm08:8273355, Gm08:8273979, Gm08:8275766, Gm08:8275780, Gm08:8275959, Gm08:8276701, Gm08:8276849, Gm08:8276913, Gm08:8277162, Gm08:8277227, Gm08:8277248, Gm08:8277381, Gm08:8277383, Gm08:8277542, Gm08:8277625, Gm08:8277643, Gm08:8277876, Gm08:8277880, Gm08:8277969, Gm08:8278001, Gm08:8278167, Gm08:8278274, Gm08:8278434, Gm08:8279165, Gm08:8279230, Gm08:8279854, Gm08:8280901, Gm08:8280937, Gm08:8281564, Gm08:8282902, Gm08:8284027, Gm08:8286864, Gm08:8287265, Gm08:8287278, Gm08:8287453, Gm08:8287459, Gm08:8288039, Gm08:8288141, Gm08:8288200, Gm08:8288470, Gm08:8288831, Gm08:8289392, Gm08:8290740, Gm08:8291682, Gm08:8292207, Gm08:8297064, Gm08:8299433, Gm08:8299672, Gm08:8301839, Gm08:8302134, Gm08:8303450, Gm08:8305237, Gm08:8305348, Gm08:8305905, Gm08:8306090, Gm08:8306141, Gm08:8306210, Gm08:8306492, Gm08:8306627, Gm08:8307172, Gm08:8307665, Gm08:8308019, Gm08:8308891, Gm08:8308917, Gm08:8309316, Gm08:8309423, Gm08:8309837, Gm08:8310383, Gm08:8310464, Gm08:8310503, Gm08:8310663, Gm08:8311631, Gm08:8311906, Gm08:8312536, Gm08:8312819, Gm08:8313273, Gm08:8313923, Gm08:8314010, Gm08:8314025, Gm08:8314208, Gm08:8314292, Gm08:8314295, Gm08:8314513, Gm08:8314736, Gm08:8314791, Gm08:8314860, Gm08:8315543, Gm08:8315644, Gm08:8316113, Gm08:8316689, Gm08:8316899, Gm08:8317852, Gm08:8317861, Gm08:8318033, Gm08:8319087, Gm08:8319642, Gm08:8319647, Gm08:8320068, Gm08:8321253, Gm08:8321649, Gm08:8323937, Gm08:8324341, Gm08:8325127, Gm08:8325214, Gm08:8326696, Gm08:8326877, Gm08:8328633, Gm08:8330929, Gm08:8331132, Gm08:8331181, Gm08:8331408, Gm08:8331827, Gm08:8332651, Gm08:8332685, Gm08:8332957, Gm08:8343167, Gm08:8345187, Gm08:8345720, Gm08:8346030, Gm08:8346050, Gm08:8346352, Gm08:8346726, Gm08:8347799, Gm08:8348022, Gm08:8348028, Gm08:8349925, Gm08:8350122, Gm08:8350277, Gm08:8351061, Gm08:8351503, Gm08:8352313, Gm08:8352743, Gm08:8353341, Gm08:8355175, Gm08:8360133, Gm08:8363193, Gm08:8363888, Gm08:8364195 ou um marcador estreitamente ligado aos mesmos.
[0061] Em uma modalidade, o método para identificação de uma primeira planta de soja ou um primeiro plasma germinativo de soja que apresenta resistência ou resistência aprimorada ao nematódeo de cisto de soja compreende detectar no genoma da primeira planta de soja ou no genoma do primeiro plasma germinativo de soja pelo menos um haplótipo que está associado com a resistência, em que pelo menos um haplótipo compreende pelo menos dois dos vários loci marcadores aqui fornecidos.
[0062] Em certas modalidades, dois ou mais loci marcadores ou haplótipos podem coletivamente compor um perfil marcador. O perfil marcador pode compreender quaisquer dois ou mais loci marcadores que compreendem: (a) loci marcadores que compreendem S07160-1 no grupo de ligação A2, ou um marcador estreitamente ligado; (b) loci marcadores que compreendem Gm08:8300131, Gm08:8257778, Gm08:8257785, Gm08:8258163, Gm08:8258688, Gm08:8258742, Gm08:8259928, Gm08:8260451, Gm08:8260590, Gm08:8261480, Gm08:8261684, Gm08:8262165, Gm08:8263213, Gm08:8263250, Gm08:8263611, Gm08:8264149, Gm08:8265227, Gm08:8265364, Gm08:8265614, Gm08:8266183, Gm08:8266185, Gm08:8266263, Gm08:8266350, Gm08:8266386, Gm08:8266473, Gm08:8266888, Gm08:8267085, Gm08:8267166, Gm08:8267721, Gm08:8267826, Gm08:8268336, Gm08:8268861, Gm08:8269148, Gm08:8269785, Gm08:8270037, Gm08:8270562, Gm08:8270652, Gm08:8271540, Gm08:8271591, Gm08:8271649, Gm08:8271672, Gm08:8271955, Gm08:8273257, Gm08:8273355, Gm08:8273979, Gm08:8275766, Gm08:8275780, Gm08:8275959, Gm08:8276701, Gm08:8276849, Gm08:8276913, Gm08:8277162, Gm08:8277227, Gm08:8277248, Gm08:8277381, Gm08:8277383, Gm08:8277542, Gm08:8277625, Gm08:8277643, Gm08:8277876, Gm08:8277880, Gm08:8277969, Gm08:8278001, Gm08:8278167, Gm08:8278274, Gm08:8278434, Gm08:8279165, Gm08:8279230, Gm08:8279854, Gm08:8280901, Gm08:8280937, Gm08:8281564, Gm08:8282902, Gm08:8284027, Gm08:8286864, Gm08:8287265, Gm08:8287278, Gm08:8287453, Gm08:8287459, Gm08:8288039, Gm08:8288141, Gm08:8288200, Gm08:8288470, Gm08:8288831, Gm08:8289392, Gm08:8290740, Gm08:8291682, Gm08:8292207, Gm08:8297064, Gm08:8299433, Gm08:8299672, Gm08:8301839, Gm08:8302134, Gm08:8303450, Gm08:8305237, Gm08:8305348, Gm08:8305905, Gm08:8306090, Gm08:8306141, Gm08:8306210, Gm08:8306492, Gm08:8306627, Gm08:8307172, Gm08:8307665, Gm08:8308019, Gm08:8308891, Gm08:8308917, Gm08:8309316, Gm08:8309423, Gm08:8309837, Gm08:8310383, Gm08:8310464, Gm08:8310503, Gm08:8310663, Gm08:8311631, Gm08:8311906, Gm08:8312536, Gm08:8312819, Gm08:8313273, Gm08:8313923, Gm08:8314010, Gm08:8314025, Gm08:8314208, Gm08:8314292, Gm08:8314295, Gm08:8314513, Gm08:8314736, Gm08:8314791, Gm08:8314860, Gm08:8315543, Gm08:8315644, Gm08:8316113, Gm08:8316689, Gm08:8316899, Gm08:8317852, Gm08:8317861, Gm08:8318033, Gm08:8319087, Gm08:8319642, Gm08:8319647, Gm08:8320068, Gm08:8321253, Gm08:8321649, Gm08:8323937, m08:8324341, Gm08:8325127, Gm08:8325214, Gm08:8326696, Gm08:8326877, Gm08:8328633, Gm08:8330929, Gm08:8331132, Gm08:8331181, Gm08:8331408, Gm08:8331827, Gm08:8332651, Gm08:8332685, Gm08:8332957, Gm08:8343167, Gm08:8345187, Gm08:8345720, Gm08:8346030, Gm08:8346050, Gm08:8346352, Gm08:8346726, Gm08:8347799, Gm08:8348022, Gm08:8348028, Gm08:8349925, Gm08:8350122, Gm08:8350277, Gm08:8351061, Gm08:8351503, Gm08:8352313, Gm08:8352743, Gm08:8353341, Gm08:8355175, Gm08:8360133, Gm08:8363193, Gm08:8363888, Gm08:8364195 ou um marcador estreitamente ligado aos mesmos; (c) quaisquer loci marcadores associados com o locus rhg4 no grupo de ligação A2; (d) quaisquer loci marcadores associados com o locus rhg1 no grupo de ligação G, ou um marcador estreitamente ligado; (e) quaisquer loci marcadores associados com o locus rhg2 no grupo de ligação M; e/ou (f) quaisquer loci marcadores associados com a resistência ao nematódeo de cisto de soja.
[0063] Quaisquer dos loci marcadores em quaisquer dos loci genômicos aqui revelados podem ser combinados no perfil marcador. Por exemplo, o perfil marcador pode compreender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais loci marcadores ou haplótipos associados com a resistência ao nematódeo de cisto de soja.
[0064] Em uma modalidade, um método para identificação de uma primeira planta de soja ou um primeiro plasma germinativo de soja que apresenta resistência ou resistência aprimorada ao nematódeo de cisto de soja compreende detectar no genoma da primeira planta de soja ou no genoma do primeiro plasma germinativo de soja pelo menos um perfil marcador que está associado com a resistência, em que o pelo menos um perfil marcador compreende o locus marcador aqui fornecido.
[0065] Não apenas podem-se detectar os vários marcadores aqui fornecidos, é reconhecido que se puderam detectar quaisquer marcadores que estão estreitamente ligados aos vários marcadores aqui discutidos. Exemplos não limitadores de marcadores estreitamente ligados no grupo de ligação A2 são fornecidos nas Figuras 1 A-D.
[0066] Adicionalmente aos marcadores discutidos no presente documento, as informações referentes aos marcadores de soja úteis podem ser encontradas, por exemplo, no site web de Soybase da USDA, disponível em www.soybase.org. Um elemento versado na técnica irá reconhecer que a identificação de alelos marcadores favoráveis podem ser específica ao plasma germinativo. A determinação de quais alelos marcadores se correlacionam com a resistência (ou suscetibilidade) é determinada para o plasma germinativo específico sob estudo. Um elemento versado na técnica também irá reconhecer que os métodos para identificar os alelos favoráveis são de rotina e bem conhecidos na técnica e, adicionalmente, que a identificação e o uso de tais alelos favoráveis está bem dentro do escopo da invenção.
[0067] São fornecidos vários métodos para identificar plantas de soja e/ou plasma germinativo de plantas de soja com resistência ou resistência aprimorada ao nematódeo de cisto de soja. Em uma modalidade, o método para identificação compreende detectar pelo menos um locus marcador associado com a resistência ao nematódeo de cisto de soja. O termo “associado com” com respeito a uma relação entre um locus marcador e um fenótipo refere-se a uma dependência estatisticamente significativa de frequência de marcador com respeito a uma escala quantitativa ou graduação qualitativa do fenótipo. Dessa forma, um alelo de um marcador está associado com um atributo de interesse quando o alelo do locus marcador e os fenótipos de atributo são encontrados juntos na progênie de um organismo mais frequentemente que se os genótipos de marcador e os fenótipos de atributo fossem separadamente segregados.
[0068] Qualquer combinação dos loci marcadores aqui fornecidos podem ser usada nos métodos para identificar uma planta de soja ou um plasma germinativo de soja que apresenta resistência ou resistência aprimorada ao nematódeo de cisto de soja. Qualquer um locus marcador ou qualquer combinação dos marcadores aqui apresentados, e qualquer marcador estreitamente ligado podem ser usados para auxiliar na identificação e na seleção de plantas de soja ou plasma germinativo de soja com resistência ou resistência aprimorada ao nematódeo de cisto de soja.
[0069] Em uma modalidade, é fornecido um método para identificação de uma primeira planta de soja ou um primeiro plasma germinativo de soja que apresenta resistência ou resistência aprimorada ao nematódeo de cisto de soja. O método compreende determinar no genoma da primeira planta de soja ou do primeiro plasma germinativo de soja pelo menos um locus marcador que está associado com a resistência. Em um tal método, o pelo menos um locus marcador: (a) pode compreender o locus marcador S07160-1 no grupo de ligação A2, ou um marcador estreitamente ligado; (b) pode compreender os loci marcadores Gm08:8300131, Gm08:8257778, Gm08:8257785, Gm08:8258163, Gm08:8258688, Gm08:8258742, Gm08:8259928, Gm08:8260451, Gm08:8260590, Gm08:8261480, Gm08:8261684, Gm08:8262165, Gm08:8263213, Gm08:8263250, Gm08:8263611, Gm08:8264149, Gm08:8265227, Gm08:8265364, Gm08:8265614, Gm08:8266183, Gm08:8266185, Gm08:8266263, Gm08:8266350, Gm08:8266386, Gm08:8266473, Gm08:8266888, Gm08:8267085, Gm08:8267166, Gm08:8267721, Gm08:8267826, Gm08:8268336, Gm08:8268861, Gm08:8269148, Gm08:8269785, Gm08:8270037, Gm08:8270562, Gm08:8270652, Gm08:8271540, Gm08:8271591, Gm08:8271649, Gm08:8271672, Gm08:8271955, Gm08:8273257, Gm08:8273355, Gm08:8273979, Gm08:8275766, Gm08:8275780, Gm08:8275959, Gm08:8276701, Gm08:8276849, Gm08:8276913, Gm08:8277162, Gm08:8277227, Gm08:8277248, Gm08:8277381, Gm08:8277383, Gm08:8277542, Gm08:8277625, Gm08:8277643, Gm08:8277876, Gm08:8277880, Gm08:8277969, Gm08:8278001, Gm08:8278167, Gm08:8278274, Gm08:8278434, Gm08:8279165, Gm08:8279230, Gm08:8279854, Gm08:8280901, Gm08:8280937, Gm08:8281564, Gm08:8282902, Gm08:8284027, Gm08:8286864, Gm08:8287265, Gm08:8287278, Gm08:8287453, Gm08:8287459, Gm08:8288039, Gm08:8288141, Gm08:8288200, Gm08:8288470, Gm08:8288831, Gm08:8289392, Gm08:8290740, Gm08:8291682, Gm08:8292207, Gm08:8297064, Gm08:8299433, Gm08:8299672, Gm08:8301839, Gm08:8302134, Gm08:8303450, Gm08:8305237, Gm08:8305348, Gm08:8305905, Gm08:8306090, Gm08:8306141, Gm08:8306210, Gm08:8306492, Gm08:8306627, Gm08:8307172, Gm08:8307665, Gm08:8308019, Gm08:8308891, Gm08:8308917, Gm08:8309316, Gm08:8309423, Gm08:8309837, Gm08:8310383, Gm08:8310464, Gm08:8310503, Gm08:8310663, Gm08:8311631, Gm08:8311906, Gm08:8312536, Gm08:8312819, Gm08:8313273, Gm08:8313923, Gm08:8314010, Gm08:8314025, Gm08:8314208, Gm08:8314292, Gm08:8314295, Gm08:8314513, Gm08:8314736, Gm08:8314791, Gm08:8314860, Gm08:8315543, Gm08:8315644, Gm08:8316113, Gm08:8316689, Gm08:8316899, Gm08:8317852, Gm08:8317861, Gm08:8318033, Gm08:8319087, Gm08:8319642, Gm08:8319647, Gm08:8320068, Gm08:8321253, Gm08:8321649, Gm08:8323937, Gm08:8324341, Gm08:8325127, Gm08:8325214, Gm08:8326696, Gm08:8326877, Gm08:8328633, Gm08:8330929, Gm08:8331132, Gm08:8331181, Gm08:8331408, Gm08:8331827, Gm08:8332651, Gm08:8332685, Gm08:8332957, Gm08:8343167, Gm08:8345187, Gm08:8345720, Gm08:8346030, Gm08:8346050, Gm08:8346352, Gm08:8346726, Gm08:8347799, Gm08:8348022, Gm08:8348028, Gm08:8349925, Gm08:8350122, Gm08:8350277, Gm08:8351061, Gm08:8351503, Gm08:8352313, Gm08:8352743, Gm08:8353341, Gm08:8355175, Gm08:8360133, Gm08:8363193, Gm08:8363888, Gm08:8364195 ou um marcador estreitamente ligado aos mesmos; ou (c) pode ser qualquer marcador associado com o locus rhg4 no grupo de ligação A2.
[0070] Em outras modalidades, dois ou mais loci marcadores são detectados no método. Em uma modalidade específica, o plasma germinativo é uma variedade de soja.
[0071] Em outras modalidades, o método compreende adicionalmente cruzar a primeira planta de soja ou o primeiro plasma germinativo de soja com uma segunda planta de soja ou um segundo plasma germinativo de soja. Em uma outra modalidade do método, a segunda planta de soja ou o segundo plasma germinativo de soja compreende uma cepa de soja exótica ou uma cepa de soja de elite.
[0072] Em modalidades específicas, a primeira planta de soja ou o primeiro plasma germinativo de soja compreende uma variedade de soja. Qualquer linhagem de soja conhecida na técnica ou aqui revelada pode ser usada. Exemplos não limitadores de variedades de soja e seus alelos de resistência ao nematódeo de cisto de soja associados abrangidos pelos métodos aqui fornecidos incluem, por exemplo, Peking e PI437654.
[0073] Em uma outra modalidade, o método de detecção compreende amplificar pelo menos um locus marcador e detectar o amplicon marcador amplificado resultante. Em um tal método, amplificar compreende (a) misturar um iniciador de amplificação ou um par de iniciadores de amplificação para cada locus marcador sendo amplificado com um ácido nucleico isolado da primeira planta de soja ou do primeiro plasma germinativo de soja de tal modo que o iniciador ou par de iniciadores seja complementar ou parcialmente complementar a uma variante ou a um fragmento do locus genômico que compreende o locus marcador e é capaz de iniciar a polimerização de DNA por uma DNA-polimerase com o uso de ácidos nucleicos de soja como um molde; e (b) estender o iniciador ou par de iniciadores em uma reação de polimerização de DNA que compreende uma DNA-polimerase e um ácido nucleico- molde para gerar pelo menos um amplicon. Em um tal método, o iniciador ou par de iniciadores pode compreender uma variante ou um fragmento de um ou mais dos loci genômicos aqui fornecidos.
[0074] Em uma modalidade, o método envolve amplificar uma variante ou um fragmento de um ou mais polinucleotídeos que que compreendem as SEQ ID NOS: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 , 39, 40, 41, 42, 43 , 44, 45, 46, 47, 48 , 49, 50, 51, 52, 53 , 54, 55, 56, 57, 58 , 59, 60, 61, 62, 63 , 64, 65, 66, 67, 68 , 69, 70, 71, 72, 73 , 74, 75, 76, 77, 78 , 79, 80, 81, 82, 83 , 84, 85, 86, 87, 88 , 89, 90, 91, 92, 93 , 94, 95, 96, 97, 98 , 99, 100, 101 , 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380 ou suas variantes ou seus fragmentos.
[0075] Em uma modalidade, o iniciador ou par de iniciadores pode compreender uma variante ou um fragmento de um ou mais polinucleotídeos que compreendem as SEQ ID NOS: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380 ou seus complementos.
[0076] Em modalidades específicas, o iniciador ou par de iniciadores compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende as SEQ ID NOS : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou suas variantes ou seus fragmentos.
[0077] Em uma modalidade específica, o par de iniciadores compreende a SEQ ID NO:1 e a SEQ ID NO:2.
[0078] Em uma outra modalidade, o método adicionalmente compreende fornecer um ou mais sondas de ácido nucleico marcadas adequadas para a detecção de cada locus marcador sendo amplificado. Em um tal método, a sonda de ácido nucleico marcada pode compreender uma sequência que compreende uma variante ou um fragmento de um ou mais dos loci genômicos aqui fornecidos. Em uma modalidade, a sonda de ácido nucleico marcada pode compreender uma sequência que compreende uma variante ou um fragmento de um ou mais polinucleotídeos que compreendem as SEQ ID NOS: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380 ou seus complementos.
[0079] Em modalidades específicas, a sonda de ácido nucleico marcada compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende as SEQ ID NOS : 9, 10 ou suas variantes ou seus fragmentos.
[0080] Exemplos não limitadores de iniciadores, sondas, loci genômicos e amplicons que podem ser usados (usadas) nos métodos e nas composições aqui fornecidos (fornecidas) são resumidos nas Tabelas 1, 2, 3A, 3B e 4, respectivamente. Tabela 1: Exemplos não limitadores de sequências de iniciadores.
R= Resistente; S= Suscetível Tabela 2: Exemplos não limitadores de sequências de sondas. 
* Sonda 1 detecta o alelo suscetível. ** Sonda 2 detecta o alelo resistente. Tabela 3A: Exemplos não limitadores de loci genômicos que compreendem os vários loci marcadores aqui fornecidos. 
Tabela 3B: Exemplos não limitadores de loci genômicos que compreendem os vários loci marcadores aqui fornecidos. 
R= Resistente; S= Suscetível * Liu et al. (2012). “A soybean cyst nematode resistance gene points to a new mechanism of plant resistance to pathogens”. Nature 492: 256-260. Tabela 4: Exemplos não limitadores de amplicons que compreendem vários loci marcadores aqui fornecidos. 
[0081] Em uma outra modalidade, o método de detectar compreende sequenciamento de DNA de pelo menos um dos loci marcadores aqui fornecidos. Conforme aqui usado, “sequenciamento” refere-se aos métodos de sequenciamento para determinar a ordem de nucleotídeos em uma molécula de DNA. Qualquer método de sequenciamento de DNA conhecido na técnica pode ser usado nos métodos aqui fornecidos. Exemplos não limitadores de métodos de sequenciamento de DNA úteis nos métodos aqui fornecidos incluem as tecnologias de Sequenciamento de Nova Geração (“Next Generation Sequencing”, NGS), por exemplo, conforme descritas em Egan, A.N, et al. (2012) American Journal of Botany 99(2):175-185; métodos de genotipagem por sequenciamento (“genotyping by sequencing”, GBS), por exemplo, conforme descritos em Elshire, R.J., et al. (2011) PLoS ONE 6(5):e19379; genotipagem por Sonda com Inversão Molecular (“Molecular Inversion Probe”, MIP), conforme descrita, por exemplo, em Hardenbol, P., et al. (2003) Nature Biotechnology 21(6):673- 678; ou genotipagem de alta velocidade pelo ressequenciamento do genoma inteiro, conforme descrita, por exemplo, em Huang, X et al., (2009) Genome Research 19:1068-1076. Cada uma das referências acima é aqui incorporada em sua totalidade a título de referência.
[0082] Uma variante ativa de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1-380 pode compreender um polinucleotídeo que tem pelo menos 75%, 80% 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com as SEQ ID NOs: 1-380 desde que ele seja capaz de amplificar e/ou detectar o locus marcador de interesse. O termo “fragmento” é concebido para significar uma porção do polinucleotídeo. Um fragmento ou uma porção pode compreender pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NOS: 1-380 desde que ele seja capaz de amplificar e/ou detectar o locus marcador de interesse.
[0083] Exceto onde especificado em contrário, os valores de identidade/similaridade de sequência fornecidos no presente documento referem-se ao valor obtido com o uso de GAP Version 10 com a utilização dos seguintes parâmetros: porcentagem de identidade e porcentagem de similaridade para uma sequência de nucleotídeos usando Peso de Lacuna (GAP) de 50 e Peso de Comprimento de 3, e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp; ou qualquer programa equivalente ao mesmo. O termo “programa equivalente” é concebido para significar qualquer programa de comparação de sequências que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento que tem correspondências (“matches”) de resíduos de nucleotídeos idênticos e uma identidade de sequência percentual idêntica quando comparado com o alinhamento gerado por GAP Version 10.
[0084] Atributos ou marcadores são considerados ligados se eles cossegregam. Uma probabilidade de 1/100 de recombinação por geração é definida como uma distância no mapa de 1,0 centiMorgan (1,0 cM). Os elementos genéticos ou genes localizados em um único segmento de cromossomo estão fisicamente ligados. Dois loci podem estar localizados em estreita proximidade de tal modo que a recombinação entre pares de cromossomos homólogos não ocorre entre os dois loci durante a meiose com frequência alta, por exemplo, de tal maneira que os loci ligados cossegregam pelo menos cerca de 90% do tempo, por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,75%, ou mais do tempo. Os elementos genéticos localizados dentro de um segmento de cromossomo também estão geneticamente ligados, tipicamente dentro de uma distância de recombinação genética menor que ou igual a 50 centimorgans (cM), por exemplo, cerca de 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1, 0,75, 0,5, ou 0,25 cM ou menor. Ou seja, dois elementos genéticos dentro de um segmento de cromossomo único experimentam recombinação durante a meiose um com o outro em uma frequência menor ou igual a cerca de 50%, por exemplo, cerca de 49%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, ou 0,25% ou menor. Os marcadores estreitamente ligados apresentam uma frequência de cruzamento com um determinado marcador de cerca de 10% ou menor (o determinado marcador está dentro de cerca de 10 cM de um marcador estreitamente ligado). Em modalidades específicas, um marcador estreitamente ligado está dentro de 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM ou 1 cM de qualquer determinado marcador aqui revelado. Em outras modalidades, um marcador associado com um dos marcadores aqui revelados pode estar dentro de 75 Kb, 60 Kb, 50 Kb, 40 Kb, 30 Kb, 20 K, 10 Kb, 5 Kb ou menos do marcador revelado.
[0085] Em outros termos, os loci estreitamente ligados cossegregam pelo menos cerca de 90% do tempo. A ligação genética conforme avaliada pela frequência de recombinação é influenciada pela estrutura da cromatina da região que compreende os loci. Tipicamente, é suposto que a região tem uma estrutura de eucromatina durante as avaliações iniciais. Entretanto, algumas regiões, tais como as regiões mais próximas dos centrossomos, têm uma estrutura de heterocromatina. Sem informação adicional, a distância física predita entre as posições no mapa genético é baseada na suposição de que a região é eucromática, entretanto, se a região compreender heterocromatina, os marcadores podem estar fisicamente mais juntos. No que diz respeito à posição física em um cromossomo, os marcadores estreitamente ligados podem estar separados, por exemplo, por cerca de 1 megabase (Mb; 1 milhão de nucleotídeos), cerca de 500 quilobases (Kb; 1000 nucleotídeos), cerca de 400 Kb, cerca de 300 Kb, cerca de 200 Kb, cerca de 100 Kb, cerca de 50 Kb, cerca de 25 Kb, cerca de 10 Kb, cerca de 5 Kb, cerca de 2 Kb, cerca de 1 Kb, cerca de 500 nucleotídeos, cerca de 250 nucleotídeos, ou menos.
[0086] Quando se refere à relação entre dois elementos genéticos, como um elemento genético contribuindo para resistência e um marcador proximal, a ligação em fase de “acoplamento” indica o estado no qual o alelo “favorável” no locus de resistência está associado fisicamente na mesma fita de cromossomo como o alelo “favorável” do respectivo locus marcador ligado. Na fase de acoplamento, ambos os alelos favoráveis são herdados juntos pela progênie que herdou aquela fita de cromossomo. Em ligação em fase de “repulsão”, o alelo “favorável” no locus de interesse (por exemplo, um QTL para resistência) é fisicamente ligado a um alelo “desfavorável” no locus marcador proximal, e os dois alelos “favoráveis” não são herdados juntos r (isto é, os dois loci estão “defasados” um em relação ao outro).
[0087] Os marcadores são usados para definir um locus específico no genoma de soja. Cada marcador é, portanto, um indicador de um segmento específico de DNA, que tem uma sequência de nucleotídeos exclusiva. As posições no mapa fornecem uma medição das posições relativas de marcadores específicos uns em relação aos outros. Quando uma característica é estipulada como ligada a um determinado marcador, deve-se compreender que o segmento de DNA real, cuja sequência afeta a característica, geralmente co-segrega com o marcador. A localização definitiva e mais precisa de uma característica pode ser obtida se os marcadores forem definidos em ambos os lados da característica. Mediante a medição da aparência do(s) marcador(es) e progênie de cruzamentos, a existência do atributo pode ser detectada por testes moleculares relativamente simples sem avaliar realmente a aparência do próprio atributo, que pode ser difícil e demorada devido ao fato de que a avaliação real do atributo exige o crescimento de plantas para um estágio e/ou sob condições ambientais em que o atributo pode ser expressado. Os marcadores moleculares têm sido amplamente usados para determinar a composição genética em sojas.
[0088] Os genótipos favoráveis associados com pelo menos um atributo de interesse podem ser identificados por uma ou mais metodologias. Em alguns exemplos são usados um ou mais marcadores, incluindo mas não se limitando a AFLPs, RFLPs, ASH, SSRs, SNPs, indels, sondas padlock (cadeado), sondas com inversão molecular, microarranjos, sequenciamento, e similares. Em alguns métodos, um ácido nucleico alvo é amplificado para hibridização com uma sonda. Em outros casos, o ácido nucleico alvo não é amplificado antes da hibridização, como métodos que usam sondas com inversão molecular (consulte, por exemplo Hardenbol et al. (2003) Nat Biotech 21:673-678). Em alguns exemplos, o genótipo relacionado com um atributo específico é monitorado, enquanto que em outros exemplos, pode ser utilizada uma avaliação ampla do genoma que inclui mas não se limita a um ou mais dentre painéis de marcadores, triagens de biblioteca, estudos de associação, microarranjos, chips de gene, estudos de expressão, ou sequenciamento como ressequenciamento de genoma inteiro e genotipagem por sequenciamento (GBS). Em alguns exemplos, não é necessária nenhuma sonda específica a alvo, por exemplo pelo uso de tecnologias de sequenciamento, que incluem mas não se limitam a, métodos de sequenciamento de nova geração (consulte, por exemplo, Metzker (2010) Nat Rev Genet 11:31-46; e, Egan et al. (2012) Am J Bot 99:175-185) como sequenciamento por síntese (por exemplo, Roche 454 Pyrosequencing, Illumina Genome Analyzer, e Ion Torrent PGM ou Proton Systems), sequenciamento por ligação (por exemplo, SOLiD da Applied Biosystems, e Polnator System da Azco Biotech), e sequenciamento de molécula única (“single molecule sequencing” (SMS), ou sequenciamento de terceira geração) que eliminam a amplificação de molde (por exemplo, Helicos System, e PacBio RS System da Pacific BioSciences). Outras tecnologias incluem sistemas de sequenciamento opcionais (por exemplo, Starlight da Life Technologies), e sequenciamento nanopore (por exemplo, GridION da Oxford Nanopore Technologies). Cada uma destas tecnologias podem acopladas a uma ou mais estratégias de enriquecimento para genomas organelares ou nucleares com o propósito de reduzir a complexidade do genoma sob investigação via PCR, hibridização, enzima de restrição (consulte, por exemplo, Elshire et al. (2011) PLoS ONE 6:e19379), e métodos de expressão. Em alguns exemplos, não e necessária nenhuma sequência de genoma de referência com o objetivo de completar a análise.
[0089] É fornecido o uso de seleção assistida por marcador (MAS) para selecionar uma planta de soja ou um plasma germinativo de soja que tem um determinado locus marcador, haplótipo ou perfil marcador. Por exemplo, em determinados exemplos uma planta de soja ou um plasma germinativo de soja que possui determinado locus marcador ou haplótipo favorável predeterminado será selecionada (selecionado) via MAS. Em certos outros exemplos, uma planta de soja ou plasma germinativo de soja que possui um certo perfil de marcador favorável predeterminado será selecionada (selecionado) via MAS.
[0090] Com o uso de MAS, plantas de soja ou plasma germinativo de soja podem ser selecionadas (pode ser selecionado) para marcadores ou alelos marcadores que positivamente se correlacionam com a resistência ao nematódeo de cisto de soja, sem realmente cultivar soja e medir a resistência (ou, ao contrário, plantas de soja podem ser selecionadas de novo se possuírem marcadores que negativamente se correlacionam com a resistência). MAS é uma ferramenta potente para selecionar fenótipos desejados e para a introgressão de atributos desejados em cultivares de soja (por exemplo, introgressão de atributos desejados em linhagens de elite). MAS é facilmente adaptada a métodos de análise molecular de alta velocidade que podem selecionar rapidamente grandes números de material genético de planta ou plasma germinativo para os marcadores de interesse e tem um custo muito mais baixo do que o aumento e observação de plantas para características visíveis.
[0091] Em algumas modalidades, os marcadores moleculares ou loci marcadores são detectados com o uso de um método de detecção baseado em amplificação adequado. Nesses tipos de métodos, os iniciadores de ácido nucleico são tipicamente hibridizados para as regiões conservadas que flanqueiam a região de marcador polimórfico. Em determinados métodos, as sondas de ácido nucleico que se ligam à região amplificada também são empregadas. Em geral, os métodos sintéticos para fazer oligonucleotídeos, que incluem iniciadores e sondas, são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, os oligonucleotídeos podem ser sintetizados quimicamente de acordo com o método de triéster de fosforamidita em fase sólida descrito por Beaucage e Caruthers (1981) Tetrahedron Letts 22:1859-1862, por exemplo, com o uso um sintetizador automatizado comercialmente disponível, por exemplo, conforme descrito em Needham- VanDevanter, et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:6159-6168. Os oligonucleotídeos, que incluem oligonucleotídeos modificados, também podem ser solicitados a partir de uma variedade de fontes comerciais conhecidas pelos versados na técnica.
[0092] Será observado que os iniciadores e sondas adequadas a serem usadas podem ser projetadas com o uso de qualquer método adequado. Não é tencionado que a invenção se limite a qualquer iniciador particular, par de iniciadores ou sonda. Por exemplo, os iniciadores podem ser projetados com o uso de qualquer programa de computador adequado, tal como LASERGENE® ou Primer3.
[0093] Não pretende-se que os iniciadores sejam limitados à geração de um amplicon de qualquer tamanho específico. Por exemplo, os iniciadores usados para amplificar os marcadores de loci e alelos no presente documento não se limitam a amplificar toda a região do locus relevante. Em algumas modalidades, a amplificação de marcador produz u amplicon de pelo menos 20 nucleotídeos de comprimento, ou alternativamente, de pelo menos 50 nucleotídeos de comprimento, ou alternativamente, de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, ou alternativamente, de pelo menos 200 nucleotídeos de comprimento.
[0094] Exemplos não limitadores de polinucleotídeos iniciadores úteis para detectar os loci marcadores aqui fornecidos são fornecidos na Tabela 1 e incluem, por exemplo, as SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou suas variantes ou seus fragmentos.
[0095] PCR, RT-PCR, e LCR são amplamente usados como métodos de detecção de amplificação e amplificação-detecção para amplificar ácidos nucleicos de interesse (por exemplo, aqueles que compreendem loci marcadores), facilitando a detecção dos marcadores. Os detalhes referentes ao uso desses e outros métodos de amplificação são bem conhecidos na técnica e podem ser encontrado em qualquer um dentre uma variedade de textos padrão. Detalhes sobre estas técnicas também podem ser encontrados em numerosas revistas e referências de patentes, como Mullis, et al. (1987) Patente US n° 4.683.202; Arnheim & Levinson (October 1, 1990) C&EN 36-47; Kwoh, et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86:1173; Guatelli, et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA87:1874; Lomell, et al., (1989) J. Clin. Chem. 35:1826; Landegren, et al., (1988) Science 241:1077-1080; Van Brunt, (1990) Biotechnology 8:291-294; Wu e Wallace, (1989) Gene 4:560; Barringer, et al., (1990) Gene 89:117, e Sooknanan e Malek, (1995) Biotechnology 13:563-564.
[0096] Tais técnicas de amplificação de ácido nucleico podem ser aplicadas para amplificar e/ou detectar ácidos nucleicos de interesse, tais como os ácidos nucleicos que compreendem marcadores de loci. Os iniciadores de amplificação para amplificar loci marcadores úteis e sondas adequadas para detectar loci marcadores úteis ou para genotipar alelos de SNP são fornecidos. Por exemplo, iniciadores exemplificadores e sondas exemplificadoras são fornecidos (fornecidas) em SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e nas Tabelas 1 e 2, e os loci genômicos que compreendem os vários loci marcadores aqui fornecidos são fornecidos nas SEQ ID NOS: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25 , 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32, 33, 34, 35 , 36, 37, 38, 39, 40 , 41, 42, 43, 44, 45 , 46, 47, 48, 49, 50 , 51, 52, 53, 54, 55 , 56, 57, 58, 59, 60 , 61, 62, 63, 64, 65 , 66, 67, 68, 69, 70 , 71, 72, 73, 74, 75 , 76, 77, 78, 79, 80 , 81, 82, 83, 84, 85 , 86, 87, 88, 89, 90 , 91, 92, 93, 94, 95 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380 e nas Tabelas 3A e 3B. Exemplos não limitadores de sequências de amplicon que compreendem os loci marcadores aqui fornecidos são fornecidos nas SEQ ID NOS: 11, 12 e na Tabela 4.
[0097] Contudo, o versado na técnica irá reconhecer imediatamente que outras sequências de sonda e iniciador também poderiam ser usadas. Por exemplo, iniciadores em qualquer um dos lados dos dados iniciadores podem ser usado no lugar dos dados iniciadores, desde que os iniciadores possam amplificar uma região que inclui o alelo a ser detectado, como podem iniciadores e sondas ser direcionadas para outros loci marcadores de SNP. Adicionalmente, será entendido que a sonda precisa a ser usada para detecção pode variar, por exemplo, qualquer sonda que pode identificar a região de um amplicon marcador a ser detectado pode ser substituída por aqueles exemplos aqui fornecidos. Adicionalmente, a configuração dos iniciadores de amplificação e sondas de detecção pode, logicamente, variar. Dessa forma, as composições e métodos não se limitam aos iniciadores e sondas especificamente referidos no presente documento.
[0098] Em determinados exemplos, as sondas possuirão um marcador detectável. Qualquer marcador adequado pode ser usado com uma sonda. Os marcadores detectáveis adequados para o uso com sondas de ácido nucleico incluem, por exemplo, qualquer composição detectável por meio espectroscópico, radioisotópico, fotoquímico, bioquímico, imunoquímico, elétrico, óptico ou químico. Os marcadores úteis incluem biotina para coloração com conjugado de estreptavidina marcado, glóbulos magnéticos, corantes fluorescentes, radiomarcação, enzimas e marcadores colorimétricos. Outros marcadores incluem ligantes, que se ligam a anticorpos marcados com fluoróforos, agentes quimioluminescentes e enzimas. Uma sonda também pode constituir iniciadores de PCR radiomarcados que são usados para gerar um amplicon radiomarcado. As estratégias de marcação para marcar ácidos nucleicos e as estratégias de detecção correspondentes podem ser encontradas, por exemplo, em Haugland (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Sixth Edition por Molecular Probes, Inc. (Eugene OR); ou Haugland (2001) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Eighth Edition por Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR, EUA).
[0099] Os marcadores detectáveis podem também incluir pares de repórter-inativador, como são utilizados em sondas Molecular Beacon e TaqManTM. O repórter pode ser um corante orgânico fluorescente modificado com um grupo de ligação adequado para a fixação ao oligonucleotídeo, tal como ao carbono de terminal 3' ou carbono terminal 5'. O inativador (quencher) pode ser também um corante orgânico, que pode, ou não, ser fluorescente, dependendo da modalidade. Geralmente, se o silenciador for fluorescente ou simplesmente libera a energia transferida a partir do repórter por decaimento não radiativo, a faixa de absorção do silenciador deveria sobrepor pelo menos substancialmente a faixa de emissão fluorescente do repórter para otimizar o inativador. Os inativadores não fluorescentes ou inativadores escuros funcionam tipicamente pela absorção de energia a partir de repórteres excitados, mas não liberam a energia de forma radiativa.
[0100] A seleção de pares de repórter-silenciador adequados para sondas particulares pode ser realizada de acordo com as técnicas conhecidas. inativadores (quencher) fluorescentes e escuros e suas propriedades ópticas relevantes a partir das quais os pares de repórter-inativador (quencher) exemplificadores podem ser selecionados são mencionados e descritos, por exemplo, em Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2a. ed., Academic Press, New York, EUA, 1971, o conteúdo da mesma está aqui incorporado, a título de referência. Exemplos de repórteres e inativadores (quencher) de modificação para ligação covalente através de grupos reativos comuns que podem ser adicionados a um oligonucleotídeo na presente invenção podem ser encontrados, por exemplo, em Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes of Eugene, Oreg., EUA, 1992, o conteúdo da mesma está aqui incorporado, a título de referência.
[0101] Em certos exemplos, pares de repórter-inativador (quencher) são selecionados de corantes de xanteno incluindo corantes de rodamina e fluoresceínas. Muitas formas adequadas desses compostos estão disponíveis comercialmente com substituintes nos grupos fenila, os quais podem ser usados como o sítio para ligação ou como a funcionalidade de ligação para a fixação a um oligonucleotídeo. Outro grupo útil de compostos fluorescentes para o uso como repórteres são as naftilaminas, que têm um grupo amino na posição alfa ou beta. Entre tais compostos de naftilamino estão incluídos 1-dimetilaminonaftil- 5-sulfonato, 1-anilino-8-naftaleno-sulfonato e 2-p-touidinil-6- naftaleno-sulfonato. Outros corantes incluem 3-fenil-7- isocianato-cumarina; acridinas, tais como 9- isotiocianatoacridina; N-(p-(2-benzoxazolil)fenil)maleimida; benzoxadiazóis; estilbenos; pirenos e similares. Em determinados outros exemplos, os repórteres e inativadores são selecionados a partir de corantes de fluoresceína e rodamina. Esses corantes e metodologias de ligação adequadas para a fixação aos oligonucleotídeos são bem conhecidos na técnica.
[0102] Exemplos adequados de repórteres podem ser selecionados dentre corantes como verde SYBR, 5-carboxifluoresceína (5-FAM™ disponível junto à Applied Biosystems de Foster City, Calif., EUA), 6-carboxifluoresceína (6-FAM), tetracloro-6- carboxifluoresceína (TET), 2,7-dimetoxi-4,5-dicloro-6- carboxifluoresceína, hexacloro-6-carboxifluoresceína (HEX), 6- carboxi-2',4,7,7'-tetraclorofluoresceína (6-TET™ disponível junto à Applied Biosystems), carboxi-X-rodamina (ROX), 6- carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína (6-JOE™ disponível junto à Applied Biosystems), produtos de corante VIC™ disponíveis junto à Molecular Probes, Inc., produtos de corante NED™ disponíveis junto à Applied Biosystems, e similares. Exemplos adequados de inativadores (quencher) podem ser selecionados de 6-carboxi-tetrametil-rodamina, ácido 4-(4- dimetil aminofenilazo)benzoico (DABYL), tetrametilrodamina (TAMRA), BHQ-0™, BHQ-1™, BHQ-2™, e BHQ-3™, cada um dos quais está disponível junto à Biosearch Technologies, Inc. de Novato, Califórnia, EUA, QSY-7™, QSY-9™, QSY-21™ e QSY-35™, cada um dos quais está disponível junto à Molecular Probes, Inc. e similares.
[0103] Em um aspecto, a PCR em tempo real ou LCR é executada nas misturas de amplificação descritas no presente documento, por exemplo, com o uso de faróis moleculares ou sondas TaqMan™. Um farol molecular (MB) é um oligonucleotídeo que, sob condições de hibridização adequadas, auto-hibridiza para formar uma estrutura em haste-e-alça. O MB tem uma marcação e um inativador nas terminações do oligonucleotídeo; dessa forma, sob condições que permitam a hibridização intramolecular, a marcação é tipicamente silenciada (ou pelo menos alterada em sua fluorescência) pelo inativador. Sob condições em que o MB não exibe hibridização intramolecular (por exemplo, quando ligada a um ácido nucleico alvo, tal como a uma região de um amplicon durante a amplificação), a marcação de MB não é inativada. Os detalhes referentes aos métodos padrão de preparar e utilizar MBs estão bem estabelecidos na literatura e os MBs estão disponíveis junto a uma série de fontes comerciais de reagentes. Consulte também, por exemplo, Leone, et al., (1995) “Molecular beacon probes combined with amplification by NASBA enable homogenous real-time detection of RNA”, Nucleic Acids Res. 26:2150-2155; Tyagi e Kramer, (1996) “Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization”, Nature Biotechnology 14:303-308; Blok e Kramer, (1997) “Amplifiable hybridization probes containing a molecular switch”, Mol Cell Probes 11:187-194; Hsuih. et al., (1997) “Novel, ligation-dependent PCR assay for detection of hepatitis C in serum”, J Clin Microbiol 34:501-507; Kostrikis, et al., (1998) “Molecular beacons: spectral genotyping of human alleles”, Science 279:1228-1229; Sokol, et al., (1998) “Real time detection of DNA:RNA hybridization in living cells”, Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 95:11538-11543; Tyagi, et al., (1998) “Multicolor molecular beacons for allele discrimination”, Nature Biotechnology 16:49-53; Bonnet, et al., (1999) “Thermodynamic basis of the chemical specificity of structured DNA probes”, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:6171-6176; Fang, et al. (1999) “Designing a novel molecular beacon for surface-immobilized DNA hybridization studies”, J. Am. Chem. Soc. 121:2921-2922; Marras, et al., (1999) “Multiplex detection of single-nucleotide variation using molecular beacons”, Genet. Anal. Biomol. Eng. 14:151-156; e Vet, et al ., (1999) “Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons”, Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 96:6394-6399. Detalhes adicionais relacionados à construção e ao uso de MB são encontrados na literatura de patente, por exemplo, patentes US n°s 5.925.517; 6.150.097; e 6.037.130.
[0104] Outro método de detecção em tempo real é o método de detecção por 5’-exonuclease, também chamado de o ensaio TaqMan™, conforme apresentado nas patentes US n°s 5.804.375; 5.538.848; 5.487.972; e 5.210.015, cada uma das quais é por meio desta aqui incorporada em suas totalidades a título de referência. No ensaio TaqMan™, uma sonda modificada, com tipicamente 10 a 25 ácidos nucleicos de comprimento, é utilizada durante a PCR que se liga de modo intermediário a ou entre os dois membros do par de iniciadores de amplificação. A sonda modificada possui um repórter e um inativador e é projetada para gerar um sinal detectável para indicar que a mesma tem hibridizado com a sequência de ácidos nucleicos alvo durante a PCR. Desde que tanto o repórter quanto o inativador estejam na sonda, o inativador impede que o repórter emita um sinal detectável. Contudo, à medida que a polimerase estende o iniciador durante a amplificação, a atividade intrínseca de nuclease de 5' para 3' da polimerase degrada a sonda, separando o repórter do inativador, e possibilitando que o sinal detectável seja emitido. Em geral, a quantidade de sinal detectável gerado durante o ciclo de amplificação é proporcional à quantidade de produto gerado em cada ciclo.
[0105] É bem conhecido que a eficiência de inativação é uma forte função da proximidade do repórter e do inativador, isto é, à medida que as duas moléculas tornam-se mais próximas, a eficiência de inativação aumenta. Visto que o inativador é fortemente dependente da proximidade física entre o repórter e o inativador (quencher), o repórter e o inativador (quencher) são, de preferência, fixados à sonda em poucos nucleotídeos um do outro, habitualmente em 30 nucleotídeos um do outro, com mais preferência com uma separação de cerca de 6 a 16 nucleotídeos. Tipicamente, essa separação é alcançada pela fixação de um membro de um par de repórter-inativador à extremidade 5' da sonda e o outro membro a um nucleotídeo cerca de 6 a 16 nucleotídeos afastado, em alguns casos, na extremidade 3’ da sonda.
[0106] As sondas de detecção separadas também podem ser omitidas em métodos de amplificação/detecção, por exemplo, mediante a execução de uma reação de amplificação em tempo real que detecta a formação de produto pela modificação do iniciador de amplificação relevante sob a incorporação em um produto, incorporação de nucleotídeos marcados em um amplicon ou pelo monitoramento de alterações em propriedades de rotação molecular de amplicons, se comparados com os precursores não amplificados (por exemplo, por polarização de fluorescência).
[0107] Adicionalmente, será constatado que a amplificação não é um requisito para a detecção de marcador—por exemplo, pode-se detectar diretamente o DNA genômico não amplificado simplesmente através da realização de uma transferência de Southern (“Southern blot”) em uma amostra de DNA genômico. Os procedimentos para realizar transferência de Southern (“Southern blotting”), amplificação por exemplo, (PCR, LCR, ou similares), e muitos outros métodos de detecção de ácido nucleico estão bem estabelecidos e são ensinados, por exemplo, em Sambrook, et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3d ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, EUA, 2000 (“Sambrook”); Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., Current Protocols, um empreendimento conjunto entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (suplementado durante 2002) (“Ausubel”)) e PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis, et al., eds) Academic Press Inc. San Diego, CA, EUA (1990) (Innis). Detalhes adicionais referentes à detecção de ácidos nucleicos em plantas, também podem ser encontrados, por exemplo, emPlant Molecular Biology (1993) Croy (ed.) BIOS Scientific Publishers, Inc.
[0108] Outras técnicas para detectar SNPs também podem ser empregadas, como hibridização alelo-específica (ASH). A tecnologia de ASH tem por base o anelamento estável de uma sonda de oligonucleotídeo de fita única e curta a um ácido nucleico alvo de fita única totalmente complementar. A detecção é através de uma marcação isotópica ou não isotópica fixada à sonda. Para cada polimorfismo, duas ou mais sondas de ASH diferentes são projetadas para ter sequências de DNA idênticas, exceto nos nucleotídeos polimórficos. Cada sonda terá homologia exata com uma sequência de alelos, de modo que a faixa de sondas possa se distinguir entre todas as sequências de alelos alternativas conhecidas. Cada sonda é hibridizada com o DNA alvo. Com o projeto de sonda e condições de hibridização adequadas, uma incompatibilidade de base única entre a sonda e o DNA alvo irá impedir a hibridização.
[0109] Os ensaios de amplificação em tempo real, incluindo ensaios MB ou TaqMan™, são especialmente úteis para detecção de alelos de SNP. Em tais casos, as sondas são tipicamente projetadas para se ligarem à região do amplicon que inclui o locus de SNP, com uma sonda específica de alelo sendo projetada para cada alelo de SNP possível. Por exemplo, se houver dois alelos de SNP conhecidos para um locus de SNP particular, “A” ou “C”, então, uma sonda é projetada com um “A” na posição de SNP, enquanto que uma sonda separada é projetada com um “C” na posição de SNP. Embora as sondas sejam tipicamente idênticas umas à outras além da posição de SNP, isso não é necessário. Por exemplo, as duas sondas específicas de alelo poderiam ser deslocadas a montante ou a jusante uma em relação a outra por uma ou mais bases. Contudo, se as sondas não forem de outro modo idênticas, as mesmas deveriam ser projetadas de tal modo que se liguem com eficiências aproximadamente iguais, o qual pode ser realizado pelo projeto sob um conjunto estrito de parâmetros que restringem as propriedades químicas das sondas. Adicionalmente, uma marcação detectável diferente, por exemplo, um par de repórter-inativador diferente, é tipicamente utilizada em cada sonda específica a alelo diferente para permitir a detecção diferencial de cada sonda. Em certos exemplos, cada sonda específica a alelo para um certo locus de SNP tem 11 a 20 nucleotídeos de comprimento, duplamente marcada com um inativador de fluorescência na extremidade 3’ e o fluoróforo quer 6-FAM (6-carboxifluoresceína) quer VIC (4,7,2'- tricloro-7‘-fenil-6—carboxifluoresceína) na extremidade 5’.
[0110] Para realizar a detecção de alelo de SNP, uma reação PCR em tempo real pode ser conduzida com o uso de iniciadores que amplificam a região que inclui o locus SNP, por exemplo as sequências listadas nas Tabelas 3A e 3B, a reação sendo realizada na presença de todas as sondas específicas a alelo para o determinado locus SNP. Então, ao detectar o sinal para cada marcador detectável utilizado e determinar quais marcadores detectáveis demostraram um sinal aumentado, pode-se fazer uma determinação de quais sondas específicas a alelo ligaram-se ao amplicon e, dessa forma, quais alelos de SNP o amplicon possuiu. Por exemplo, quando as sondas marcadas com 6- FAM e VIC são empregadas, os comprimentos de onda de emissão distintos de 6-FAM (518 nm) e VIC (554 nm) podem ser capturados. Uma amostra que é homozigótica para um alelo terá fluorescência somente a partir do respectivo fluoróforo de 6- FAM ou VIC, enquanto que uma amostra que é heterozigótica no locus analisado terá tanto fluorescência de 6-FAM como de VIC.
[0111] Os sistemas de detecção KASPar® e Illumina® são exemplos adicionais de sistemas de detecção de marcador disponíveis comercialmente. KASPar® é um sistema de genotipagem fluorescente que utiliza hibridização específica a alelo e uma forma peculiar de PCR específica a alelo (extensão de iniciador) com o propósito de identificar marcadores genéticos (por exemplo um locus SNP específico associado com a resistência ao nematódeo de cisto de soja). Os sistemas de detecção Illumina® utilizam tecnologia similar em um formato de plataforma fixa. A plataforma fixa utiliza uma placa física que pode ser criada com até 384 marcadores. O sistema Illumina® é criado com um único conjunto de marcadores que não pode ser alterado e utiliza corantes para indicar detecção de marcador.
[0112] Estes sistemas e métodos representam uma ampla variedade de métodos de detecção disponíveis que podem ser utilizados para detectar marcadores associados com a resistência ou resistência aprimorada ao nematódeo de cisto de soja, mas qualquer outro método adequado também poderia ser usado.
[0113] É fornecida a introgressão de resistência ao nematódeo de cisto de soja em plasma germinativo de soja não resistente ou menos resistente. Qualquer método para introgredir um ou mais loci marcadores em plantas de soja conhecido por um versado na técnica pode ser usado. Tipicamente, são fornecidos um primeiro plasma germinativo de soja que contém resistência ao nematódeo de cisto de soja derivada de um locus marcador, haplótipo ou perfil marcador específico e um segundo plasma germinativo de soja que está isento de tal resistência derivada do locus marcador, haplótipo ou perfil marcador. O primeiro plasma germinativo de soja pode ser cruzado com o segundo plasma germinativo de soja para produzir plasma germinativo de soja de progênie. Estes plasmas germinativos de progênie são triados para determinar a presença de resistência ao nematódeo de cisto de soja derivada do locus marcador, haplótipo ou perfil marcador, e a progênie que apresenta teste positivo para a presença de resistência derivada do locus marcador, haplótipo ou perfil marcador é selecionada como sendo o plasma germinativo de soja para dentro do qual foi introgredido o locus marcador, haplótipo ou perfil marcador. Os métodos para a execução de tal triagem são bem conhecidos na técnica e qualquer método adequado pode ser usado.
[0114] Uma aplicação de MAS é usada para os marcadores de resistência, haplótipos de resistência ou perfis marcadores de resistência para aumentar a eficiência de um esforço de introgressão ou de retrocruzamento almejado para introduzir um atributo de resistência em um genótipo residual desejado (de rendimento tipicamente alto). Em retrocruzamento assistido por marcador de marcadores específicos a partir de uma fonte doadora, por exemplo, com um genótipo residual de elite, um indivíduo seleciona entre a progênie de retrocruzamento para o atributo da fonte doadora e, então, usa o retrocruzamento repetido com a linhagem de elite para reconstituir o máximo de genótipo residual de elite possível.
[0115] Dessa forma, os marcadores e métodos podem ser utilizados para guiar a seleção assistida por marcador ou o melhoramento genético assistido por marcador de variedades de soja com o complemento (conjunto) desejado de formas alélicas de segmentos de cromossomo associados com desempenho agronômico superior (resistência, juntamente com quaisquer outros marcadores disponíveis para rendimento, tolerância à doença, etc.). Qualquer um dos loci marcadores, alelos marcadores, haplótipos, ou perfis marcadores revelados pode ser introduzido dentro de uma linhagem de soja via introgressão, por melhoramento genético tradicional (ou introduzido via transformação, ou ambos) para produzir uma planta de soja com desempenho agronômico superior. O número de alelos associados à resistência que pode ser introduzido ou estar presente em uma planta de soja varia de 1 até o número de alelos aqui apresentados, cada um destes números inteiros estando aqui incorporados como se fossem explicitamente referidos.
[0116] Os marcadores e métodos aqui fornecidos também podem ser utilizados para guiar a seleção assistida por marcador ou o melhoramento genético assistido por marcador de variedades de soja que compreendem outros marcadores ou alelos de resistência ao nematódeo de cisto de soja para criar uma pilha molecular (“molecular stack”) para a resistência ao nematódeo de cisto de soja. Por exemplo, qualquer um dos loci marcadores aqui fornecidos pode ser introduzido dentro de uma linhagem de soja que tem um ou mais dentre os loci rhg1, rhg2, rhg3 ou rhg5 de resistência ao nematódeo de cisto de soja. Em uma modalidade, quaisquer um ou mais dos loci marcadores aqui fornecidos podem ser empilhados com o locus rhg1. Em uma outra modalidade, quaisquer um ou mais dos loci marcadores aqui fornecidos podem ser empilhados com o locus rhg2. Em uma outra modalidade, quaisquer um ou mais dos loci marcadores aqui fornecidos podem ser empilhados com os loci rhg1 e rhg2.
[0117] Isto também fornece um método de produzir uma planta de soja de progênie e estas plantas de soja de progênie, per se. O método compreende cruzar uma primeira planta de soja parental com uma segunda planta de soja e cultivar a planta de soja fêmea sob condições de crescimento de planta para produzir a progênie de planta de soja. Os métodos de cruzamento e cultivo de plantas de soja estão dentro da capacidade dos versados na técnica. Tal progênie de planta de soja pode ser ensaiada para verificar alelos associados com resistência e, assim, a progênie desejada selecionada. Tais grãos ou plantas de progênie podem estar disponíveis comercialmente para a produção de soja, usados (usadas) para alimento, processados (processadas) para se obter um constituinte desejado da soja, ou adicionalmente utilizados (utilizadas) em ciclos subsequentes de melhoramento genético. Pelo menos uma de a primeira ou segunda plantas de soja é uma planta de soja que compreende pelo menos um dos loci marcadores ou perfis marcadores, de tal modo que a progênie é capaz de herdar o locus marcador ou perfil marcador.
[0118] Com frequência, um método é aplicado a pelo menos uma planta de soja relacionada tal como das linhagens progenitoras ou descendentes na genealogia de plantas de soja em questão de modo que a herança da resistência desejada possa ser traçada. O número de gerações separando as plantas de soja sendo submetidas aos métodos aqui fornecidos de modo geral será de 1 a 20, comumente 1 a 5, e tipicamente 1, 2, ou 3 gerações de separação, e muito frequentemente uma planta de soja descendente ou parental direta da planta de soja será submetida ao método (isto é, 1 geração de separação).
[0119] A diversidade genética é importante para ganho genético de longo prazo em qualquer programa de melhoramento genético. Com diversidade limitada, o ganho genético será finalmente estabilizado quando todos os alelos favoráveis tiverem sido fixos dentro da população de elite. Um objetivo consiste em incorporar a diversidade em um conjunto (acervo) de elite sem perder o ganho genético que já foi obtido e com o investimento mínimo possível. A MAS fornece uma indicação de quais regiões genômicas e quais alelos favoráveis a partir dos ancestrais originais têm sido selecionados e conservados ao longo do tempo, facilitando os esforços para incorporar a variação favorável de fontes de plasma germinativo exóticas (progenitores que não estão relacionados ao conjunto (acervo) de genes de elite) com a esperança de encontrar alelos favoráveis que não existem atualmente no conjunto (acervo) de genes de elite.
[0120] Por exemplo, os marcadores, haplótipos, iniciadores, sondas e perfis de marcador podem ser usados para MAS em cruzamentos que envolvem linhagens de soja de elite x exóticas submetendo-se à progênie de segregação a MAS para manter alelos de produtividade principal, juntamente com os alelos marcadores de resistência da presente invenção.
[0121] Como uma alternativa para os métodos de melhoramento genético padrão para introduzir as características de interesse em soja (por exemplo, introgressão), as abordagens transgênicas também podem ser usadas para criar plantas transgênicas com as atributos desejados. Nestes métodos, ácidos nucleicos exógenos que codificam locus marcador, perfil marcador ou haplótipo desejado são introduzidos dentro de plantas ou plasma germinativo alvo. Por exemplo, um ácido nucleico que codifica um atributo de resistência é clonado, por exemplo, através de clonagem posicional, e introduzido em uma planta ou plasma germinativo alvo.
[0122] Produtores de plantas experientes podem reconhecer plantas de soja resistentes no campo, e podem selecionar os indivíduos ou populações resistentes para propósitos de melhoramento ou para propagação. Nesse contexto, o criador da planta reconhece plantas de soja “resistentes” e “não resistentes” ou “susceptíveis”. Entretanto, a resistência das plantas é um espectro fenotípico que consiste em extremos em resistência e suscetibilidade, bem como uma série de fenótipos de resistência intermediária. Avaliação destes fenótipos intermediários com o uso de ensaios reproduzíveis é valiosa para os cientistas que almejam identificar os loci genéticos que conferem resistência, conduzir seleção assistida por marcador de populações resistentes, e usar técnicas de introgressão para produzir um atributo de resistência dentro de uma linhagem de soja de elite, por exemplo.
[0123] O termo “resistência aprimorada” é concebido para significar que as plantas mostram um decréscimo nos sintomas da doença que são o resultado da exposição da planta ao nematódeo de cisto de soja. Ou seja, a lesão causada pelo nematódeo de cisto de soja é evitada, ou alternativamente, os sintomas da doença causados pelo nematódeo de cisto de soja são minimizados ou reduzidos. Dessa forma, a resistência aprimorada ao nematódeo de cisto de soja pode resultar em redução dos sintomas da doença em pelo menos cerca de 2% a pelo menos cerca de 6%, pelo menos cerca de 5% a cerca de 50%, pelo menos cerca de 10% a cerca de 60%, pelo menos cerca de 30% a cerca de 70%, pelo menos cerca de 40% a cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 50% a cerca de 90% ou mais. Consequentemente, os métodos aqui fornecidos podem ser utilizados para proteger plantas contra o nematódeo de cisto de soja.
[0124] Triagem e seleção de plantas de soja resistentes ao nematódeo de cisto de soja podem ser realizadas, pela exposição das plantas ao nematódeo de cisto de soja e seleção daquelas plantas que mostram resistência ao nematódeo de cisto de soja. Podem ser usados vários ensaios para medir a resistência ou resistência aprimorada ao nematódeo de cisto de soja. Por exemplo, resistência ao nematódeo de cisto de soja pode ser determinada por observações visuais após a exposição da planta a uma raça específica de nematódeo de cisto de soja, como raça 1, 2, 3, 5 ou 14. Faixas de pontuações de 1 a 9 indicam observações visuais de resistência em comparação com outros genótipos no teste. Uma pontuação de 1 indica que os nematódeos de cisto de soja são capazes de infectar a planta e causar perda de rendimento, enquanto que uma pontuação de 9 indica resistência ao nematódeo de cisto de soja. Pontuações preliminares são relatadas como dígitos duplos, por exemplo, ‘55’ indica uma pontuação preliminar de 5 na escala de 1 a 9.
[0125] Exemplos não limitadores de triagem fenotípica de resistência ao nematódeo de cisto de soja são descritos em detalhe abaixo.
[0126] Populações múltiplas de Heterodera glycines são mantidas e aumentadas em plantas hospedeiras. Estas populações são usadas para identificar, purificar, e caracterizar as variedades de soja de elite para resistência ao nematódeo de cisto de soja. As seguintes raças de nematódeo de cisto de soja são mantidas: Raça 1 (Tipo HG 2.5), Raça 2 (Tipo HG 1.2.5.7), Raça 3 (Tipo HG 0 ou Tipo HG 7), Raça 5 (Tipo HG 2.5.7), e Raça 14 (Tipo HG 1.3.6.7).
[0127] Ovos ou juvenis de segundo estádio (J2) são usados para inocular plantas hospedeiras para aumentar a população deles. A infestação por nematódeo de cisto de soja exige um mínimo de 35 dias antes de os cistos alcançarem a maturidade e poderem ser usados para inocular experimentos de soja. Inoculante de ovos- cistos/J2 é colhido através de uma série de lavagens, triturações, e peneiramentos. As peneiras são usadas progredindo dos tamanhos maiores para menores, terminando com uma peneira de n° 500 (25 μm).
[0128] As plantas de soja são crescidas em cones. Cones são recipientes longos de aproximadamente 30 centímetros (12 polegadas) de comprimento e 3,8 centímetros (1,5 polegadas) de diâmetro no topo (por exemplo, Ray Leach Cone-tainers™). O cone é projetado para facilmente remover a massa de raízes. Três a sete dias após o plantio, um canal de inóculo é feito no cone que contém a linhagem experimental por perfuração de um orifício de 10 centímetros (4 polegadas) com uma ponta de pipeta de 10 ml. Um ml de inóculo é dispensado para dentro do canal. As plantas são regadas manualmente no decorrer da duração do teste, com a regadura sendo moderadamente suave durante os primeiros 3-5 dias até que J2 infecte as raízes.
[0129] As plantas são pontuadas aproximadamente 28-35 dias após a inoculação quando a reprodução de cistos em plantas suscetíveis selecionadas é suficientemente elevada. As plantas são removidas de seus cones e o solo é removido das raízes por imersão cuidadosa das raízes dentro de um balde de água. As plantas são triadas para identificar resistência nativa a uma ou mais das cinco raças de nematódeo de cisto de soja inoculadas com o uso de uma combinação de três métodos (1) pontuação 9-6-1; (2) contagem total visual; e/ou (3) pontuação por contagem em microscópio dependendo do estágio da linhagem quando triada. Em geral, as linhagens iniciais no ciclo de desenvolvimento (R1-R2) são triadas pelo método visual 9-6-1, e as linhagens que têm progredido para as fases de desenvolvimento posteriores (R3-R5) são triadas pelo(s) método(s) de contagem total visual e/ou de contagem em microscópio.
[0130] Um método de fenotipagem típico é uma avaliação visual das raízes. As plantas suscetíveis selecionadas são primeiro avaliadas para o desenvolvimento de cistos no sistema de raízes. Estas contagens são registradas e as médias são calculadas durante todo o experimento para determinar a média de plantas suscetíveis selecionadas (SUS). As raízes das plantas de teste são então pontuadas com base em uma comparação com a média das plantas suscetíveis selecionadas como segue: 9 = 0-15% da média de plantas suscetíveis selecionadas 6 = 16-40% da média de plantas suscetíveis selecionadas 1 = >41% da média de plantas suscetíveis selecionadas
[0131]Contagens visuais: Neste método, as plantas selecionadas conhecidas são contadas e registradas no total. Os cistos observados nas plantas de teste são contados para comparação com as pontuações de plantas suscetíveis selecionadas. As contagens de cistos são convertidas em pontuações de 1-9 com base no Índice de Fêmeas (FI, “female index”). O índice de fêmeas (FI) é a porcentagem do número de cistos fêmeas produzidos em cada linhagem experimental dividido pelo número produzido em uma planta de soja suscetível selecionada padrão, então o resultado é multiplicado por 100. Um FI baixo (<10) meios que a população de nematódeos de cisto de soja não é capaz de se reproduzir bem na linhagem de teste, um FI alto significa que a população de nematódeos de cisto de soja é capaz de se reproduzir bem na linhagem de teste.
[0132]Contagens em microscópio: As contagens de cistos para os ensaios de nematódeo de cisto de soja para as plantas selecionadas e a linhagem experimental são determinadas por remoção dos cistos das raízes por lavagem e contagem do número de cistos sob o microscópio.
[0133] A cerca de 28-35 dias após a inoculação, as raízes dos controles de plantas suscetíveis selecionadas são examinadas para cistos amarelos para avaliar se se começa o processo de avaliação do teste. As linhagens experimentais são comparadas com as plantas selecionadas padrão. Quando níveis adequados de cistos são detectados nas variedades de plantas selecionadas, as plantas das linhagens de teste são removidas dos cones uma de cada vez. O solo é então removido das raízes por imersão cuidadosa das raízes dentro de um balde de água. O tecido de raízes é posicionado sobre uma peneira de poros de 850 micrometros (n° 20) empilhada sobre uma peneira de poros de 250 micrometros (n° 60) e borrifado com um jato de água para remover os cistos das raízes. Os cistos coletados são enxaguados da peneira n° 60 para dentro de um recipiente rotulado com o uso de não mais que 30 ml de água adicional.
[0134] Quando todas as amostras são coletadas, cada amostra é contada com o uso de uma placa de contagem quadriculada sob um microscópio estéreo. O número de cistos contados é registrado para cada amostra. As contagens de cistos nas plantas de teste são convertidas para a escala de pontuação de 1-9 com base no índice de fêmeas (FI) descrito acima.
[0135] As seguintes plantas selecionadas exemplificadoras para o teste de nematódeo de cisto de soja, fornecidas na Tabela 5, podem ser plantadas e usadas para monitorar o desenvolvimento de cistos: Tabela 5: Plantas selecionadas exemplificadoras para o teste de nematódeo de cisto de soja.
RES = Resistente; SUS = Suscetível; e, MR = Moderadamente Resistente
[0136] Em alguns exemplos, são fornecidos um kit ou um sistema automatizado para detectar loci marcadores, haplótipos, e perfis marcadores, e/ou correlacionar os loci marcadores, haplótipos, e perfis marcadores com um fenótipo desejado (por exemplo, resistência ao nematódeo de cisto de soja). Conforme aqui usado, “kit” refere-se a um conjunto de reagentes para o propósito de realizar os vários métodos de detectar e/ou identificar da presente invenção, mais particularmente, para a identificação e/ou a detecção de uma planta de soja ou plasma germinativo de soja que tem resistência aprimorada ao nematódeo de cisto de soja.
[0137] Em uma modalidade, é fornecido um kit para detectar ou selecionar pelo menos uma planta de soja ou um plasma germinativo de soja com resistência ou resistência aprimorada ao nematódeo de cisto de soja. Um tal kit compreende (a) iniciadores ou sondas para detectar um ou mais loci marcadores associados com a resistência ao nematódeo de cisto de soja, em que pelo menos um dos iniciadores e pelo menos uma das sondas no kit é capaz de detectar um locus marcador, em que o locus marcador está associado com o locus rhg4 no grupo de ligação A2; e (b) instruções para usar os iniciadores ou as sondas para detectar os um ou mais loci marcadores e correlacionar os loci marcadores detectados com a predita resistência ao nematódeo de cisto de soja.
[0138] Em uma modalidade específica, os iniciadores e as sondas do kit são capazes de detectar um locus marcador que compreende: (a) S07160-1 ou um marcador estreitamente ligado ao mesmo no grupo de ligação A2; ou (ii) um locus marcador que compreende Gm08:8300131, Gm08:8257778, Gm08:8257785, Gm08:8258163, Gm08:8258688, Gm08:8258742, Gm08:8259928, Gm08:8260451, Gm08:8260590, Gm08:8261480, Gm08:8261684, Gm08:8262165, Gm08:8263213, Gm08:8263250, Gm08:8263611, Gm08:8264149, Gm08:8265227, Gm08:8265364, Gm08:8265614, Gm08:8266183, Gm08:8266185, Gm08:8266263, Gm08:8266350, Gm08:8266386, Gm08:8266473, Gm08:8266888, Gm08:8267085, Gm08:8267166, Gm08:8267721, Gm08:8267826, Gm08:8268336, Gm08:8268861, Gm08:8269148, Gm08:8269785, Gm08:8270037, Gm08:8270562, Gm08:8270652, Gm08:8271540, Gm08:8271591, Gm08:8271649, Gm08:8271672, Gm08:8271955, Gm08:8273257, Gm08:8273355, Gm08:8273979, Gm08:8275766, Gm08:8275780, Gm08:8275959, Gm08:8276701, Gm08:8276849, Gm08:8276913, Gm08:8277162, Gm08:8277227, Gm08:8277248, Gm08:8277381, Gm08:8277383, Gm08:8277542, Gm08:8277625, Gm08:8277643, Gm08:8277876, Gm08:8277880, Gm08:8277969, Gm08:8278001, Gm08:8278167, Gm08:8278274, Gm08:8278434, Gm08:8279165, Gm08:8279230, Gm08:8279854, Gm08:8280901, Gm08:8280937, Gm08:8281564, Gm08:8282902, Gm08:8284027, Gm08:8286864, Gm08:8287265, Gm08:8287278, Gm08:8287453, Gm08:8287459, Gm08:8288039, Gm08:8288141, Gm08:8288200, Gm08:8288470, Gm08:8288831, Gm08:8289392, Gm08:8290740, Gm08:8291682, Gm08:8292207, Gm08:8297064, Gm08:8299433, Gm08:8299672, Gm08:8301839, Gm08:8302134, Gm08:8303450, Gm08:8305237, Gm08:8305348, Gm08:8305905, Gm08:8306090, Gm08:8306141, Gm08:8306210, Gm08:8306492, Gm08:8306627, Gm08:8307172, Gm08:8307665, Gm08:8308019, Gm08:8308891, Gm08:8308917, Gm08:8309316, Gm08:8309423, Gm08:8309837, Gm08:8310383, Gm08:8310464, Gm08:8310503, Gm08:8310663, Gm08:8311631, Gm08:8311906, Gm08:8312536, Gm08:8312819, Gm08:8313273, Gm08:8313923, Gm08:8314010, Gm08:8314025, Gm08:8314208, Gm08:8314292, Gm08:8314295, Gm08:8314513, Gm08:8314736, Gm08:8314791, Gm08:8314860, Gm08:8315543, Gm08:8315644, Gm08:8316113, Gm08:8316689, Gm08:8316899, Gm08:8317852, Gm08:8317861, Gm08:8318033, Gm08:8319087, Gm08:8319642, Gm08:8319647, Gm08:8320068, Gm08:8321253, Gm08:8321649, Gm08:8323937, Gm08:8324341, Gm08:8325127, Gm08:8325214, Gm08:8326696, Gm08:8326877, Gm08:8328633, Gm08:8330929, Gm08:8331132, Gm08:8331181, Gm08:8331408, Gm08:8331827, Gm08:8332651, Gm08:8332685, Gm08:8332957, Gm08:8343167, Gm08:8345187, Gm08:8345720, Gm08:8346030, Gm08:8346050, Gm08:8346352, Gm08:8346726, Gm08:8347799, Gm08:8348022, Gm08:8348028, Gm08:8349925, Gm08:8350122, Gm08:8350277, Gm08:8351061, Gm08:8351503, Gm08:8352313, Gm08:8352743, Gm08:8353341, Gm08:8355175, Gm08:8360133, Gm08:8363193, Gm08:8363888, Gm08:8364195 ou um marcador estreitamente ligado ao mesmo.
[0139] Dessa forma, um kit ou sistema típico pode incluir um conjunto de sondas marcadoras ou iniciadores configuradas (configurados) para detectar pelo menos um alelo favorável de um ou mais loci marcadores associados com a resistência ao nematódeo de cisto de soja, por exemplo um locus marcador, haplótipo ou perfil marcador favorável. Estas sondas ou estes iniciadores podem ser configuradas (configurados), por exemplo, para detectar os loci marcadores anotados nas tabelas e nos exemplos da presente invenção, por exemplo, com o uso de qualquer formato de detecção de alelo disponível, como detecção com base em arranjo em fase líquida ou sólida, detecção de amostra com base em microfluídica, etc. Os sistemas e kits podem adicionalmente incluir materiais de embalagem para embalar as sondas, os iniciadores, ou instruções, controles como reações de amplificação de controle que incluem sondas, iniciadores ou ácidos nucleicos-molde para amplificações, marcadores de tamanho molecular, ou similares.
[0140] Um sistema típico também pode incluir um detector que é configurado para detectar uma ou mais saídas de sinal a partir do conjunto de sondas ou iniciadores marcadores, ou amplicon dos mesmos, identificando, assim, a presença ou ausência do alelo. Uma ampla variedade de aparelhos para detecção de sinal está disponível, incluindo tubos multiplicadores de fotografia, espectrofotômetros, matrizes CCD, detectores de escaneamento, fototubos e fotodiodos, estações de microscópios, galvo-escâneres, ferramentas para detecção de amplificação microfluídica de ácido nucleico e similares. A configuração precisa do detector irá depender, em parte, do tipo de marcação usada para detectar o alelo marcador, assim como a instrumentação que é obtida de forma mais conveniente para o usuário. Os detectores que detectam fluorescência, fosforescência, radioatividade, pH, carga, absorbância, luminescência, temperatura, magnetismo, ou similares, podem ser usados. Os exemplos de detector típicos incluem detectores de luz (por exemplo, fluorescência) detectores de radioatividade. Por exemplo, a detecção de uma emissão de luz (por exemplo, uma emissão de fluorescência) ou outra marcação de sonda é indicativo da presença ou ausência de um alelo marcador. A detecção fluorescente é geralmente usada para a detecção de ácidos nucleicos amplificados (contudo, as operações a montante e/ou a jusante também podem ser executadas em amplicons, o qual pode envolver outros métodos de detecção). Em geral, o detector detecta uma ou mais emissão de marcação (por exemplo, luz) a partir de uma marcação de sonda, o qual é indicativo da presença ou ausência de um alelo marcador. O(s) detector(es) opcionalmente monitora um ou uma pluralidade de sinais a partir de uma reação de amplificação. Por exemplo, o detector pode monitorar sinais ópticos que correspondem aos resultados do ensaio de amplificação “em tempo real”.
[0141] As instruções do sistema ou kit que descrevem como usar o sistema ou kit ou que correlacionam a presença ou ausência do alelo favorável à resistência prevista também são fornecidas. Por exemplo, as instruções podem incluir pelo menos uma tabela de pesquisa que inclui uma correlação entre a presença ou ausência dos alelos, haplótipos, ou perfis marcadores favoráveis e a resistência predita. A forma precisa das instruções pode variar dependendo dos componentes do sistema, por exemplo, podem estar presentes como programa de computador de sistema em uma ou mais unidades integradas do sistema (por exemplo, um microprocessador, computador ou meio legível por computador), ou podem estar presentes em uma ou mais unidades (por exemplo, computadores ou meios legíveis por computador) acopladas de maneira operável ao detector. Conforme observado, em um exemplo típico, as instruções do sistema incluem pelo menos uma tabela de pesquisa que inclui uma correlação entre a presença ou ausência dos alelos favoráveis e a resistência predita. As instruções também incluem tipicamente instruções que fornecem uma interface de usuário com o sistema, por exemplo, para permitir ao usuário visualizar resultados de uma análise da amostra e para a entrada de parâmetros no sistema.
[0142] Os polinucleotídeos isolados que compreendem as sequências de ácido nucleico dos iniciadores e das sondas aqui fornecidas também são aqui abrangidos. Em uma modalidade, o polinucleotídeo isolado compreende um polinucleotídeo capaz de detectar um locus marcador do genoma de soja que compreende: (a) S07160-1, ou um marcador estreitamente ligado ao mesmo no grupo de ligação A2; ou (b) Gm08:8300131, Gm08:8257778, Gm08:8257785, Gm08:8258163, Gm08:8258688, Gm08:8258742, Gm08:8259928, Gm08:8260451, Gm08:8260590, Gm08:8261480, Gm08:8261684, Gm08:8262165, Gm08:8263213, Gm08:8263250, Gm08:8263611, Gm08:8264149, Gm08:8265227, Gm08:8265364, Gm08:8265614, Gm08:8266183, Gm08:8266185, Gm08:8266263, Gm08:8266350, Gm08:8266386, Gm08:8266473, Gm08:8266888, Gm08:8267085, Gm08:8267166, Gm08:8267721, Gm08:8267826, Gm08:8268336, Gm08:8268861, Gm08:8269148, Gm08:8269785, Gm08:8270037, Gm08:8270562, Gm08:8270652, Gm08:8271540, Gm08:8271591, Gm08:8271649, Gm08:8271672, Gm08:8271955, Gm08:8273257, Gm08:8273355, Gm08:8273979, Gm08:8275766, Gm08:8275780, Gm08:8275959, Gm08:8276701, Gm08:8276849, Gm08:8276913, Gm08:8277162, Gm08:8277227, Gm08:8277248, Gm08:8277381, Gm08:8277383, Gm08:8277542, Gm08:8277625, Gm08:8277643, Gm08:8277876, Gm08:8277880, Gm08:8277969, Gm08:8278001, Gm08:8278167, Gm08:8278274, Gm08:8278434, Gm08:8279165, Gm08:8279230, Gm08:8279854, Gm08:8280901, Gm08:8280937, Gm08:8281564, Gm08:8282902, Gm08:8284027, Gm08:8286864, Gm08:8287265, Gm08:8287278, Gm08:8287453, Gm08:8287459, Gm08:8288039, Gm08:8288141, Gm08:8288200, Gm08:8288470, Gm08:8288831, Gm08:8289392, Gm08:8290740, Gm08:8291682, Gm08:8292207, Gm08:8297064, Gm08:8299433, Gm08:8299672, Gm08:8301839, Gm08:8302134, Gm08:8303450, Gm08:8305237, Gm08:8305348, Gm08:8305905, Gm08:8306090, Gm08:8306141, Gm08:8306210, Gm08:8306492, Gm08:8306627, Gm08:8307172, Gm08:8307665, Gm08:8308019, Gm08:8308891, Gm08:8308917, Gm08:8309316, Gm08:8309423, Gm08:8309837, Gm08:8310383, Gm08:8310464, Gm08:8310503, Gm08:8310663, Gm08:8311631, Gm08:8311906, Gm08:8312536, Gm08:8312819, Gm08:8313273, Gm08:8313923, Gm08:8314010, Gm08:8314025, Gm08:8314208, Gm08:8314292, Gm08:8314295, Gm08:8314513, Gm08:8314736, Gm08:8314791, Gm08:8314860, Gm08:8315543, Gm08:8315644, Gm08:8316113, Gm08:8316689, Gm08:8316899, Gm08:8317852, Gm08:8317861, Gm08:8318033, Gm08:8319087, Gm08:8319642, Gm08:8319647, Gm08:8320068, Gm08:8321253, Gm08:8321649, Gm08:8323937, Gm08:8324341, Gm08:8325127, Gm08:8325214, Gm08:8326696, Gm08:8326877, Gm08:8328633, Gm08:8330929, Gm08:8331132, Gm08:8331181, Gm08:8331408, Gm08:8331827, Gm08:8332651, Gm08:8332685, Gm08:8332957, Gm08:8343167, Gm08:8345187, Gm08:8345720, Gm08:8346030, Gm08:8346050, Gm08:8346352, Gm08:8346726, Gm08:8347799, Gm08:8348022, Gm08:8348028, Gm08:8349925, Gm08:8350122, Gm08:8350277, Gm08:8351061, Gm08:8351503, Gm08:8352313, Gm08:8352743, Gm08:8353341, Gm08:8355175, Gm08:8360133, Gm08:8363193, Gm08:8363888, Gm08:8364195 ou um marcador estreitamente ligado ao mesmo.
[0143] Em modalidades específicas, o polinucleotídeo isolado compreende: (a) um polinucleotídeo que compreende as SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; (c) um polinucleotídeo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com as SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; ou (d) um polinucleotídeo que compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.
[0144] Em certas modalidades, os ácidos nucleicos isolados são capazes de hibridizar sob condições estringentes com ácidos nucleicos de um cultivar de soja resistente ao nematódeo de cisto de soja, por exemplo com SNPs específicos que compreendem um locus marcador, haplótipo ou perfil marcador.
[0145] Conforme aqui usada, uma sequência substancialmente idêntica ou complementar é um polinucleotídeo que especificamente se hibridizará com o complemento da molécula de ácido nucleico à qual ela está sendo comparada sob condições de estringência alta. Um polinucleotídeo é chamado de “complementar” de outro polinucleotídeo se ele apresenta complementaridade. Conforme aqui usado, é dito que as moléculas apresentam “complementaridade completa” quando cada nucleotídeo de uma das moléculas de polinucleotídeo é complementar a um nucleotídeo da outra molécula. Duas moléculas são consideradas como sendo minimamente complementares” se elas podem hibridizar uma com a outra com estabilidade suficiente para permitir que as mesmas permaneçam aneladas uma com a outra sob condições ao menos de “baixa- estringência” convencionais. De modo similar, as moléculas são consideradas como sendo “complementares” se elas podem hibridizar uma com a outra com estabilidade suficiente para permitir que as mesmas permaneçam aneladas uma com a outra sob condições de “alta-estringência” convencionais.
[0146] As condições de estringência apropriadas que estimulam hibridização de DNA, por exemplo, cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) 6X a cerca de 45°C, seguida por uma lavagem com SSC 2X a 50°C, são conhecidas pelos versados na técnica ou podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Tipicamente, as condições estringentes para hibridização e detecção serão aquelas nas quais a concentração de sais é menor que concentração de cerca de 1,5 M de íon Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de íon Na (ou de outros sais) em pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, maiores que 50 nucleotídeos). Condições estringentes também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizadores, como formamida. Condições de baixa estringência exemplificadoras incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, NaCl 1 M, 1% de SDS (dodecilsulfato de sódio) a 37°C, e uma lavagem em SSC 1X a 2X (SSC 20X = NaCl 3,0 M /citrato trisódico 0,3 M) a 50 a 55°C. Condições de estringência moderada exemplificadoras incluem hibridização em 40 a 45% de formamida, 1,0 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C, e uma lavagem em 0,5X a 1X SSC a uma temperatura de 55 a 60°C. As condições de estringência elevadas exemplificadoras incluem hibridização em 50% de formamida, NaCl 1 M, SDS 1% a 37°C e uma lavagem em SSC 0,1X a 60 a 65°C. Opcionalmente, tampões de lavagem podem compreender cerca de 0,1% a cerca de 1% de SDS. A duração da hibridização é geralmente menor que cerca de 24 horas, geralmente, de cerca de 4 a cerca de 12 horas. A duração do tempo de lavagem será pelo menos um período de tempo suficiente para atingir o equilíbrio.
[0147] Exemplos não limitadores dos métodos revelados e das composições reveladas na presente invenção são os seguintes: 1. Um método para identificação de uma primeira planta de soja ou um primeiro plasma germinativo de soja que apresenta resistência ou resistência aprimorada ao nematódeo de cisto de soja, o método compreendendo detectar no genoma da dita primeira planta de soja ou no genoma do dito primeiro plasma germinativo de soja pelo menos um locus marcador que está associado com a resistência, em que o pelo menos um locus marcador compreende (a) S07160-1 ou um marcador estreitamente ligado ao mesmo no grupo de ligação A2; ou (b) Gm08:8300131, Gm08:8257778, Gm08:8257785, Gm08:8258163, Gm08:8258688, Gm08:8258742, Gm08:8259928, Gm08:8260451, Gm08:8260590, Gm08:8261480, Gm08:8261684, Gm08:8262165, Gm08:8263213, Gm08:8263250, Gm08:8263611, Gm08:8264149, Gm08:8265227, Gm08:8265364, Gm08:8265614, Gm08:8266183, Gm08:8266185, Gm08:8266263, Gm08:8266350, Gm08:8266386, Gm08:8266473, Gm08:8266888, Gm08:8267085, Gm08:8267166, Gm08:8267721, Gm08:8267826, Gm08:8268336, Gm08:8268861, Gm08:8269148, Gm08:8269785, Gm08:8270037, Gm08:8270562, Gm08:8270652, Gm08:8271540, Gm08:8271591, Gm08:8271649, Gm08:8271672, Gm08:8271955, Gm08:8273257, Gm08:8273355, Gm08:8273979, Gm08:8275766, Gm08:8275780, Gm08:8275959, Gm08:8276701, Gm08:8276849, Gm08:8276913, Gm08:8277162, Gm08:8277227, Gm08:8277248, Gm08:8277381, Gm08:8277383, Gm08:8277542, Gm08:8277625, Gm08:8277643, Gm08:8277876, Gm08:8277880, Gm08:8277969, Gm08:8278001, Gm08:8278167, Gm08:8278274, Gm08:8278434, Gm08:8279165, Gm08:8279230, Gm08:8279854, Gm08:8280901, Gm08:8280937, Gm08:8281564, Gm08:8282902, Gm08:8284027, Gm08:8286864, Gm08:8287265, Gm08:8287278, Gm08:8287453, Gm08:8287459, Gm08:8288039, Gm08:8288141, Gm08:8288200, Gm08:8288470, Gm08:8288831, Gm08:8289392, Gm08:8290740, Gm08:8291682, Gm08:8292207, Gm08:8297064, Gm08:8299433, Gm08:8299672, Gm08:8301839, Gm08:8302134, Gm08:8303450, Gm08:8305237, Gm08:8305348, Gm08:8305905, Gm08:8306090, Gm08:8306141, Gm08:8306210, Gm08:8306492, Gm08:8306627, Gm08:8307172, Gm08:8307665, Gm08:8308019, Gm08:8308891, Gm08:8308917, Gm08:8309316, Gm08:8309423, Gm08:8309837, Gm08:8310383, Gm08:8310464, Gm08:8310503, Gm08:8310663, Gm08:8311631, Gm08:8311906, Gm08:8312536, Gm08:8312819, Gm08:8313273, Gm08:8313923, Gm08:8314010, Gm08:8314025, Gm08:8314208, Gm08:8314292, Gm08:8314295, Gm08:8314513, Gm08:8314736, Gm08:8314791, Gm08:8314860, Gm08:8315543, Gm08:8315644, Gm08:8316113, Gm08:8316689, Gm08:8316899, Gm08:8317852, Gm08:8317861, Gm08:8318033, Gm08:8319087, Gm08:8319642, Gm08:8319647, Gm08:8320068, Gm08:8321253, Gm08:8321649, Gm08:8323937, Gm08:8324341, Gm08:8325127, Gm08:8325214, Gm08:8326696, Gm08:8326877, Gm08:8328633, Gm08:8330929, Gm08:8331132, Gm08:8331181, Gm08:8331408, Gm08:8331827, Gm08:8332651, Gm08:8332685, Gm08:8332957, Gm08:8343167, Gm08:8345187, Gm08:8345720, Gm08:8346030, Gm08:8346050, Gm08:8346352, Gm08:8346726, Gm08:8347799, Gm08:8348022, Gm08:8348028, Gm08:8349925, Gm08:8350122, Gm08:8350277, Gm08:8351061, Gm08:8351503, Gm08:8352313, Gm08:8352743, Gm08:8353341, Gm08:8355175, Gm08:8360133, Gm08:8363193, Gm08:8363888, Gm08:8364195 ou um marcador estreitamente ligado ao mesmo. 2. O método da modalidade 1, em que pelo menos dois loci marcadores são detectados. 3. O método da modalidade 2, em que os pelo menos dois loci marcadores compreendem um haplótipo que está associado com a dita resistência. 4. O método da modalidade 1, em que o plasma germinativo é uma variedade de soja. 5. O método da modalidade 1, em que o método adicionalmente compreende selecionar a primeira planta de soja ou o primeiro plasma germinativo de soja ou uma sua progênie tendo o pelo menos um locus marcador. 6. O método da modalidade 5, adicionalmente compreende cruzar a primeira planta de soja selecionada ou o primeiro plasma germinativo de soja selecionado com uma segunda planta de soja ou um segundo plasma germinativo de soja. 7. O método da modalidade 6, em que a segunda planta de soja ou o segundo plasma germinativo de soja compreende uma cepa de soja exótica ou uma cepa de soja de elite. 8. O método da modalidade 1, em que a detecção compreende o sequenciamento de DNA de pelo menos um dos ditos loci marcadores. 9. O método da modalidade 1, em que a detecção compreende a amplificação de pelo menos um dos ditos loci marcadores e a detecção do amplicon marcador amplificado resultante. 10. O método da modalidade 9, em que a amplificação compreende: (a) misturar um iniciador de amplificação ou um par de iniciadores de amplificação para cada locus marcador sendo amplificado com um ácido nucleico isolado da primeira planta de soja ou do primeiro plasma germinativo de soja, em que o iniciador ou par de iniciadores é complementar ou parcialmente complementar a uma variante ou um fragmento do locus genômico compreendendo o locus marcador, e é capaz de iniciar a polimerização de DNA por uma DNA-polimerase com o uso do ácido nucleico de soja como um molde; e (b) estender o iniciador ou par de iniciadores em uma reação de polimerização de DNA que compreende uma DNA-polimerase e um ácido nucleico-molde para gerar pelo menos um amplicon. 11. O método da modalidade 10, em que o dito método compreende amplificar uma variante ou um fragmento de um ou mais polinucleotídeos que compreendem as SEQ ID NOs : 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 , 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 , 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 , 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 , 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379 ou 380. 12. O método da modalidade 10, em que o dito iniciador ou par de iniciadores compreende uma variante ou um fragmento de um ou mais polinucleotídeos que compreendem as SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 , 102, 103, 104 , 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374 , 375, 376, 377, 378, 379, 380 ou seus complementos. 13. O método da modalidade 12, em que o dito iniciador ou par de iniciadores compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende as SEQ ID NOS : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou suas variantes ou seus fragmentos. 14. O método da modalidade 13, em que o dito par de iniciadores compreende a SEQ ID NO: 1 e a SEQ ID NO: 2. 15. O método da modalidade 10, em que o método adicionalmente compreende fornecer uma ou mais sondas de ácido nucleico marcadas adequadas para a detecção de cada locus marcador sendo amplificado. 16. O método da modalidade 15, em que a dita sonda de ácido nucleico marcada compreende uma sequência de ácido nucleico compreendendo uma variante ou um fragmento de um ou mais polinucleotídeos que compreendem as SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 380 ou seus complementos. 17. O método da modalidade 16, em que a sonda de ácido nucleico marcada compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende as SEQ ID NOS : 9 ou 10. 18. Um polinucleotídeo isolado capaz de detectar um locus marcador do genoma de soja compreendendo (a) S07160-1 ou um marcador estreitamente ligado ao mesmo no grupo de ligação A2; ou (b) Gm08:8300131, Gm08:8257778, Gm08:8257785, Gm08:8258163, Gm08:8258688, Gm08:8258742, Gm08:8259928, Gm08:8260451, Gm08:8258688, Gm08:8258742, Gm08:8259928, Gm08:8260451, Gm08:8260590, Gm08:8261480, Gm08:8261684, Gm08:8262165, Gm08:8263213, Gm08:8263250, Gm08:8263611, Gm08:8264149, Gm08:8265227, Gm08:8265364, Gm08:8265614, Gm08:8266183, Gm08:8266185, Gm08:8266263, Gm08:8266350, Gm08:8266386, Gm08:8266473, Gm08:8266888, Gm08:8267085, Gm08:8267166, Gm08:8267721, Gm08:8267826, Gm08:8268336, Gm08:8268861, Gm08:8269148, Gm08:8269785, Gm08:8270037, Gm08:8270562, Gm08:8270652, Gm08:8271540, Gm08:8271591, Gm08:8271649, Gm08:8271672, Gm08:8271955, Gm08:8273257, Gm08:8273355, Gm08:8273979, Gm08:8275766, Gm08:8275780, Gm08:8275959, Gm08:8276701, Gm08:8276849, Gm08:8276913, Gm08:8277162, Gm08:8277227, Gm08:8277248, Gm08:8277381, Gm08:8277383, Gm08:8277542, Gm08:8277625, Gm08:8277643, Gm08:8277876, Gm08:8277880, Gm08:8277969, Gm08:8278001, Gm08:8278167, Gm08:8278274, Gm08:8278434, Gm08:8279165, Gm08:8279230, Gm08:8279854, Gm08:8280901, Gm08:8280937, Gm08:8281564, Gm08:8282902, Gm08:8284027, Gm08:8286864, Gm08:8287265, Gm08:8287278, Gm08:8287453, Gm08:8287459, Gm08:8288039, Gm08:8288141, Gm08:8288200, Gm08:8288470, Gm08:8288831, Gm08:8289392, Gm08:8290740, Gm08:8291682, Gm08:8292207, Gm08:8297064, Gm08:8299433, Gm08:8299672, Gm08:8301839, Gm08:8302134, Gm08:8303450, Gm08:8305237, Gm08:8305348, Gm08:8305905, Gm08:8306090, Gm08:8306141, Gm08:8306210, Gm08:8306492, Gm08:8306627, Gm08:8307172, Gm08:8307665, Gm08:8308019, Gm08:8308891, Gm08:8308917, Gm08:8309316, Gm08:8309423, Gm08:8309837, Gm08:8310383, Gm08:8310464, Gm08:8310503, Gm08:8310663, Gm08:8311631, Gm08:8311906, Gm08:8312536, Gm08:8312819, Gm08:8313273, Gm08:8313923, Gm08:8314010, Gm08:8314025, Gm08:8314208, Gm08:8314292, Gm08:8314295, Gm08:8314513, Gm08:8314736, Gm08:8314791, Gm08:8314860, Gm08:8315543, Gm08:8315644, Gm08:8316113, Gm08:8316689, Gm08:8316899, Gm08:8317852, Gm08:8317861, Gm08:8318033, Gm08:8319087, Gm08:8319642, Gm08:8319647, Gm08:8320068, Gm08:8321253, Gm08:8321649, Gm08:8323937, Gm08:8324341, Gm08:8325127, Gm08:8325214, Gm08:8326696, Gm08:8326877, Gm08:8328633, Gm08:8330929, Gm08:8331132, Gm08:8331181, Gm08:8331408, Gm08:8331827, Gm08:8332651, Gm08:8332685, Gm08:8332957, Gm08:8343167, Gm08:8345187, Gm08:8345720, Gm08:8346030, Gm08:8346050, Gm08:8346352, Gm08:8346726, Gm08:8347799, Gm08:8348022, Gm08:8348028, Gm08:8349925, Gm08:8350122, Gm08:8350277, Gm08:8351061, Gm08:8351503, Gm08:8352313, Gm08:8352743, Gm08:8353341, Gm08:8355175, Gm08:8360133, Gm08:8363193, Gm08:8363888, Gm08:8364195 ou um marcador estreitamente ligado ao mesmo. Gm08:8353341, Gm08:8363888, mesmo. 19. O polinucleotídeo isolado de modalidade 18, em que o polinucleotídeo compreende: (a) um polinucleotídeo que compreende as SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8; (b) um polinucleotídeo que compreende as SEQ ID NOS: 9 ou 10; (c) um polinucleotídeo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com os polinucleotídeos apresentados nas partes (a) ou (b); ou (d) um polinucleotídeo que compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos dos polinucleotídeos apresentados nas partes (a) ou (b). 20. Um kit para detectar ou selecionar pelo menos uma planta de soja ou um plasma germinativo de soja com resistência ou resistência aprimorada ao nematódeo de cisto de soja, o kit compreendendo: a) iniciadores ou sondas para detectar um ou mais loci marcadores associados com a resistência ao nematódeo de cisto de soja, em que os iniciadores ou as sondas são capazes de detectar um locus marcador compreendendo (i) S07160-1 ou um marcador estreitamente ligado ao mesmo; ou (ii) Gm08:8300131, Gm08:8257778, Gm08:8257785, Gm08:8258163, Gm08:8258688, Gm08:8258742, Gm08:8259928, Gm08:8260451, Gm08:8260590, Gm08:8261480, Gm08:8261684, Gm08:8262165, Gm08:8263213, Gm08:8263250, Gm08:8263611, Gm08:8264149, Gm08:8265227, Gm08:8265364, Gm08:8265614, Gm08:8266183, Gm08:8266185, Gm08:8266263, Gm08:8266350, Gm08:8266386, Gm08:8266473, Gm08:8266888, Gm08:8267085, Gm08:8267166, Gm08:8267721, Gm08:8267826, Gm08:8268336, Gm08:8268861, Gm08:8269148, Gm08:8269785, Gm08:8270037, Gm08:8270562, Gm08:8270652, Gm08:8271540, Gm08:8271591, Gm08:8271649, Gm08:8271672, Gm08:8271955, Gm08:8273257, Gm08:8273355, Gm08:8273979, Gm08:8275766, Gm08:8275780, Gm08:8275959, Gm08:8276701, Gm08:8276849, Gm08:8276913, Gm08:8277162, Gm08:8277227, Gm08:8277248, Gm08:8277381, Gm08:8277383, Gm08:8277542, Gm08:8277625, Gm08:8277643, Gm08:8277876, Gm08:8277880, Gm08:8277969, Gm08:8278001, Gm08:8278167, Gm08:8278274, Gm08:8278434, Gm08:8279165, Gm08:8279230, Gm08:8279854, Gm08:8280901, Gm08:8280937, Gm08:8281564, Gm08:8282902, Gm08:8284027, Gm08:8286864, Gm08:8287265, Gm08:8287278, Gm08:8287453, Gm08:8287459, Gm08:8288039, Gm08:8288141, Gm08:8288200, Gm08:8288470, Gm08:8288831, Gm08:8289392, Gm08:8290740, Gm08:8291682, Gm08:8292207, Gm08:8297064, Gm08:8299433, Gm08:8299672, Gm08:8301839, Gm08:8302134, Gm08:8303450, Gm08:8305237, Gm08:8305348, Gm08:8305905, Gm08:8306090, Gm08:8306141, Gm08:8306210, Gm08:8306492, Gm08:8306627, Gm08:8307172, Gm08:8307665, Gm08:8308019, Gm08:8308891, Gm08:8308917, Gm08:8309316, Gm08:8309423, Gm08:8309837, Gm08:8310383, Gm08:8310464, Gm08:8310503, Gm08:8310663, Gm08:8311631, Gm08:8311906, Gm08:8312536, Gm08:8312819, Gm08:8313273, Gm08:8313923, Gm08:8314010, Gm08:8314025, Gm08:8314208, Gm08:8314292, Gm08:8314295, Gm08:8314513, Gm08:8314736, Gm08:8314791, Gm08:8314860, Gm08:8315543, Gm08:8315644, Gm08:8316113, Gm08:8316689, Gm08:8316899, Gm08:8317852, Gm08:8317861, Gm08:8318033, Gm08:8319087, Gm08:8319642, Gm08:8319647, Gm08:8320068, Gm08:8321253, Gm08:8321649, Gm08:8323937, Gm08:8324341, Gm08:8325127, Gm08:8325214, Gm08:8326696, Gm08:8326877, Gm08:8328633, Gm08:8330929, Gm08:8331132, Gm08:8331181, Gm08:8331408, Gm08:8331827, Gm08:8332651, Gm08:8332685, Gm08:8332957, Gm08:8343167, Gm08:8345187, Gm08:8345720, Gm08:8346030, Gm08:8346050, Gm08:8346352, Gm08:8346726, Gm08:8347799, Gm08:8348022, Gm08:8348028, Gm08:8349925, Gm08:8350122, Gm08:8350277, Gm08:8351061, Gm08:8351503, Gm08:8352313, Gm08:8352743, Gm08:8353341, Gm08:8355175, Gm08:8360133, Gm08:8363193, Gm08:8363888, Gm08:8364195 ou um marcador estreitamente ligado ao mesmo; e (b) instruções para usar os iniciadores ou as sondas para detectar os um ou mais loci marcadores e correlacionar os loci marcadores detectados com a predita resistência ao nematódeo de cisto de soja.
[0148] Os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar, mas não para limitar a invenção reivindicada. Entende-se que os exemplos e as modalidades aqui descritos são para propósitos ilustrativos apenas e as pessoas versadas na técnica reconhecerão vários reagentes ou parâmetros que podem ser alterados sem se afastar do espírito da invenção ou do escopo das reivindicações em anexo.
[0149] Um marcador de SNP para o locus Rhg4 (resistência ao nematódeo de cisto de soja) no grupo de ligação A2 foi desenvolvido para uso em triagem de genótipo de alta velocidade, são fornecidos este marcador, e também marcadores geneticamente modificados associados com este marcador. Os marcadores desta região são relevantes para as populações de melhoramento genético de elite e para facilitar a seleção de plantas de soja com resistência ao SCN no locus Rhg4 que se origina de PI437654 e Peking e também se agrupa com outros atributos assistidos por marcador, incluindo genes de rendimento.
[0150] S07160-1-Q1 foi desenvolvido e otimizado para métodos baseados em PCR de alta velocidade, como os ensaios Taqman™. A otimização envolveu a avaliação da amplificação, Res, Sus, e agrupamento heterozigótico, comprimento de iniciador, composição de iniciador e similares. O marcador diferencia entre o alelo resistente de PI437654 ou Peking (C) e um alelo suscetível de BSR101 (A). Os iniciadores e as sondas úteis para detectar o polimorfismo são resumidos abaixo nas Tabelas 6 e 7, respectivamente. Tabela 6: iniciadores
Tabela 7: Sondas 
[0151] O marcador foi validado em comparação com um painel de 31 linhagens de soja públicas ou patenteadas compreendendo 2 linhagens selecionadas resistentes, 27 linhagens suscetíveis, e 2 outras linhagens. Um resumo do marcador rhg4 é fornecido abaixo na Tabela 8. Mistura de amplificação exemplificadora
Tabela 8: Resumo de marcador rhg4. 
R= Resistente; S= Suscetível
[0152] O locus Rhg4, que condiciona resistência ao nematódeo de cisto de soja, foi clonado e descoberto que codifica uma serina-hidroximetilransferase (Liu et al. (2012). “A soybean cyst nematode resistance gene points to a new mechanism of plant resistance to pathogens”. Nature 492, 256-260). Duas substituições de bases não sinônimas que correlacionam-se estreitamente com a resistência ao SCN foram identificadas no alelo Rhg4 da fonte resistente Forrest (Liu et al. Nature, 2012). Com o uso de dados de genótipo de SNP obtidos do ressequenciamento de 385 linhagens de elite patenteadas Pioneer, foram identificados 181 SNPs que estão em alto desequilíbrio de ligação com as mutações descritas. Estes SNPs podem ser usados para uma variedade de esforços de melhoramento genético de planta, incluindo seleção assistida por marcador do locus Rhg4.
[0153] Desequilíbrio de ligação foi calculado com o uso de Haploview 4.2. 7810 loci SNP foram avaliados em 385 linhagens de elite. Um intervalo de ~1,2 mb ou 6,5 cM (Gm08:7800225-8999989 pb; 48,26-54,80 cM) abarcando as mutações em Rhg4 foi interrogado para seleção de SNP. Um r2 acima de ou igual a 0,8 é considerado alto para esta análise.
[0154] As configurações de Haploview foram configuradas como segue: Ignorar comparações de par-a-par: >100 kb; Corte de valor-p para equilíbrio de Hardy-Weinberg (“HW p-value cutoff”): 0,000; Porcentagem de genotipagem mínima (“Min genotype %”): 50; Número máximo de erros de herança mendeliana (“Max # mendel errors”): 1; Frequência de alelo menor mínima = 0,01.
[0155] Os 181 Rhg4 SNPs em desequilíbrio de ligação com as mutações descritas (Liu et al. Nature, 2012) são resumidos na Tabela 3B. Tabela 9: Resumo de SEQ ID NOs.
[0156] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados na especificação são indicativos do nível dos versados na técnica à qual pertence a invenção. Todas as publicações e pedidos de patentes estão aqui incorporados, a título de referência, na mesma extensão, como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado a título de referência.
[0157] Embora a invenção anteriormente mencionada tenha sido descrita em detalhes consideráveis por meio de ilustração e exemplos para os propósitos de clareza de entendimento, será evidente que certas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexas.
Claims (15)
1. Método de identificação de uma primeira planta de soja ou um primeiro plasma germinativo de soja que apresenta resistência ou resistência aprimorada ao nematódeo de cisto de soja, o método CARACTERIZADO pelo fato de compreender (a) detectar, utilizando técnicas de PCR, RT-PCR, LCR, sequenciamento de DNA ou de hibridização de DNA, no genoma da dita primeira planta de soja ou no genoma do dito primeiro plasma germinativo de soja um locus marcador que está associado com a resistência, em que o locus marcador compreende S07160-1 como contido na SEQ ID NO: 200; e (b) identificar uma planta de soja ou plasma germinativo de soja tendo o locus marcador como uma planta de soja ou plasma germinativo de soja tendo resistência ou resistência melhorada a nematódeo do cisto de soja.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que dois loci marcadores são detectados.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que os dois loci marcadores compreendem um haplótipo que está associado com a dita resistência.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o plasma germinativo é uma variedade de soja.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de compreender adicionalmente selecionar a primeira planta de soja ou o primeiro plasma germinativo de soja ou uma progênie do mesmo tendo o locus marcador.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a detecção compreende o sequenciamento de DNA de ditos loci marcadores.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a detecção compreende a amplificação dos ditos loci marcadores e a detecção do amplicon marcador amplificado resultante.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a amplificação compreende: a) misturar um iniciador de amplificação ou um par de iniciadores de amplificação para cada locus marcador sendo amplificado com um ácido nucleico isolado da primeira planta de soja ou do primeiro plasma germinativo de soja, em que o iniciador ou par de iniciadores é complementar ao locus genômico compreendendo o locus marcador, e é capaz de iniciar a polimerização de DNA por uma DNA-polimerase com o uso do ácido nucleico de soja como um molde; e b) estender o iniciador ou par de iniciadores em uma reação de polimerização de DNA compreendendo uma DNA- polimerase e um ácido nucleico-molde para gerar pelo menos um amplicon.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, o dito método CARACTERIZADO pelo fato de compreender amplificar a SEQ ID NO: 200.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito iniciador ou par de iniciadores compreende a SEQ ID NO 200.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito iniciador ou par de iniciadores compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende as SEQ ID NOS: 1 ou 2.
12. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito par de iniciadores compreende a SEQ ID NO: 1 e a SEQ ID NO: 2.
13. Método, de acordo com a reivindicação 8, o método CARACTERIZADO pelo fato de compreender adicionalmente fornecer uma ou mais sondas de ácido nucleico marcadas adequadas para detecção de cada locus marcador sendo amplificado.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita sonda de ácido nucleico marcada compreende uma sequência de ácido nucleico compreendendo a SEQ ID NO: 200.
15. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a sonda de ácido nucleico marcada compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende a SEQ ID NO: 10.
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