BR102017019923A2

BR102017019923A2 - Método de detecção e introgressão do alelo superior do gene zmmate1 em plantas de milho, visando o aumento da tolerância ao alumínio

Info

Publication number: BR102017019923A2
Application number: BR102017019923-1A
Authority: BR
Inventors: Claudia Teixeira Guimarães; Jurandir Vieira De Magalhães; Beatriz De Almeida Barros
Original assignee: Embrapa-Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuaria
Priority date: 2017-09-18
Filing date: 2017-09-18
Publication date: 2019-04-16

Abstract

método de detecção e introgressão do alelo superior do gene zmmate1 em plantas de milho, visando o aumento da tolerância ao alumínio. a presente invenção apresenta método de aumento da tolerância ao alumínio em lantas de milho via introgressão assistida do alelo superior do gene zmmate1, utilizando um marcador alelo-específico, que também identifica novas fontes do referido alelo em outros germoplasmas, para aplicação na agricultura. o marcador da presente invenção foi desenvolvido com base em um polimorfismo de nucleotídeo único, que diferencia o alelo que possui alta expressão daquele que possuiu baixa expressão. a identificação do alelo superior é baseada na técnica de pcr competitivo alelo-específico, que utiliza iniciadores (primers) marcados com fluorescências que são quantificadas após a reação de pcr de forma rápida e precisa.

Description

MÉTODO DE DETECÇÃO E INTROGRESSÃO DO ALELO SUPERIOR DO GENE ZmMATEl EM PLANTAS DE MILHO, VISANDO O AUMENTO DA TOLERÂNCIA AO ALUMÍNIO.

CAMPO DA INVENÇÃO [1] A presente invenção se refere à promoção do aumento da tolerância ao alumínio em plantas de milho via introgressão assistida do alelo superior do gene ZmMATEl, utilizando um marcador alelo-específico, que também identifica novas fontes do referido alelo em outros germoplasmas, para aplicação na agricultura.

DESCRIÇÃO DO ESTADO DA TÉCNICA [2] O milho é o cereal mais produzido no mundo contribuindo significativamente para alimentação animal e como base alimentar humana em vários países (Awika, 2011). A toxicidade causada por alumínio (Al) é o maior fator limitante para a produção agrícola em solos ácidos que representam cerca de 50% das terras potencialmente agricultáveis no mundo (von Uexküll & Mutert, 1995). Devido à acidez desses solos, o Al está presente na forma de cátion trivalente (Al ) que é altamente tóxica às raízes, inibindo o crescimento radicular (Kochian et al., 2015). Os danos causados ao sistema radicular restringem o volume de solo explorado, resultando em prejuízos na absorção de nutrientes e de água do solo (Kochian, 1995; Kochian et al., 2004) e, consequentemente, na produção agrícola.

[3] O mecanismo fisiológico de tolerância ao Al melhor caracterizado é o de exclusão, que impede o Al³⁺ tóxico de atravessar a membrana plasmática e penetrar no simplasto. Esse mecanismo é controlado principalmente por duas famílias de genes que codificam transportadores de membrana, responsáveis pela exudação de ácidos orgânicos no ápice radicular de genótipos tolerantes. Os genes da família ALMT (Aluminum-ActivatedMalate Transporter) codificam transportadores de malato, sendo primeiramente caracterizado em trigo (Sasaki et al., 2004) e posteriormente em várias espécies como Arabidopsis (AtALMT1; Hoekenga et al., 2006), centeio (ScALMT1; Collins et al., 2008) e soja (GmALMT1; Liang et al., 2013). O gene SbMATE foi o primeiro membro da família MATE (multidrug and toxic compound exudation) que codifica transportador de citrato, que confere tolerância ao Al em sorgo (Magalhaes et al., 2007). Ortólogos desse gene foram

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2/9 caracterizados em Arabidopsis (AtMATE; Liu et al., 2009), trigo (TaMATEl; Ryan et al., 2009), milho (ZmMATEl; Maron et al., 2010) e arroz (OsFRDL4; Yokosho et al., 2011). Os ácidos orgânicos liberados na rizosfera formam compostos estáveis e não tóxicos com os íons Al impedindo que eles causem toxicidade às raízes.

[4] O gene ZmMATEl codifica um transportador de membrana da família MATE (multi-drug and toxic compound extrusion), cuja alta expressão induzida pelo Al no ápice radicular de genótipos de milho foi associada com um aumento na tolerância do Al em milho (Maron et al. 2010). Esse gene foi co-localizado com o QTL de tolerância ao Al em milho mapeado no cromossomo 6 e denominado qALT6 (Maron et al., 2010; Guimaraes et al., 2014). Assim, esse gene foi caracterizado como homólogo funcional ao SbMATE, gene responsável pela tolerância ao Al em sorgo (Magalhaes et al., 2007). A alta expressão do ZmMATEl no ápice radicular de linhagens de milho mais tolerantes ao Al foi associada com a presença de três cópias em tandem desse gene, sendo considerado como o alelo que confere tolerância ao Al presente na linhagem Cateto Al237 (Maron et al., 2013).

[5] A introgressão do alelo superior do gene ZmMATEl é de grande importância em programas de melhoramento de milho uma vez que o alelo é raro na espécie e existe grande expectativa de aumento na estabilidade de produção de grãos em solos ácidos em função do aumento da tolerância ao Al. A seleção de marcadores polimórficos flanqueando o gene de interesse é um processo lento, trabalhoso e oneroso, sendo necessária a definição de pares de marcadores polimórficos para cada par de linhagens doadora e receptora. A principal limitação para a introgressão desse alelo era a ausência no estado da técnica de um marcador molecular de fácil utilização em larga escala e aplicável a diferentes backgrounds genéticos. Assim, o marcador alelo específico, alvo do presente requerimento, apresenta-se como uma metodologia precisa, simples e de baixo custo, capaz de identificar o alelo superior do ZmMATEl, agilizando e aumentando a eficiência da introgressão assistida e da busca por novas fontes desse alelo. A introgressão do alelo superior do gene ZmMATEl, utilizando o método de seleção assistida com o marcador molecular desenvolvido na presente invenção, possibilitará a obtenção de linhagens de milho mais tolerantes ao alumínio e, consequentemente mais adaptadas a condições adversas impostas pelos solos ácidos.

[6] Além da introgressão assistida por marcadores, outras metodologias podem ser utilizadas para identificar genótipos com níveis superiores de tolerância ao Al e que

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3/9 apresentem o alelo superior do ZmMATEl. Dentre elas, podemos citar a quantificação da inibição do crescimento da raiz seminal em solução nutritiva sob níveis tóxicos de Al e da expressão do gene ZmMATEl no ápice radicular na presença do Al. A inibição do crescimento radicular na presença do Al tóxico é uma análise fenotípica demorada, que envolve várias etapas incluindo a germinação das sementes, transferência das plântulas para solução nutritiva e medição do comprimento da raiz em pelo menos duas fases do desenvolvimento das plântulas. A quantificação da expressão gênica requer etapas complexas e de alto custo como a extração de RNA, síntese de cDNA e quantificação do transcrito. Assim, ambas as técnicas são de difícil implementação em programas de melhoramento uma vez que são de difícil automatização e causam danos às plântulas selecionadas, necessitando de um cuidado extra no transplantio das mesmas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [7] A presente invenção se refere ao método de aumento da tolerância ao alumínio em plantas de milho por meio da introgressão do alelo superior do gene ZmMATEl utilizando a seleção assistida por marcadores. O marcador da presente invenção foi desenvolvido com base em um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP, do inglês Single Nucleotide Polymorphism) localizado na região promotora do gene ZmMATEl, que diferencia o alelo que possui alta expressão daquele que possuiu baixa expressão. A identificação do alelo superior é baseada na técnica de PCR competitivo alelo-específico, que utiliza iniciadores (primers) marcados com fluorescências que são quantificadas após a reação em cadeia da polimerase (PCR) de forma rápida e precisa. A introgressão do alelo superior do gene ZmMATEl é de grande importância em programas de melhoramento de milho uma vez que o alelo é raro na espécie e existe grande expectativa de aumento na estabilidade de produção de grãos em solos ácidos. A principal limitação para a introgressão desse alelo era a ausência no estado da técnica de um marcador molecular de fácil utilização em larga escala e aplicável a diferentes backgrounds genéticos. A introgressão do alelo superior do gene ZmMATEl, utilizando o método de seleção assistida com o marcador molecular desenvolvido na presente invenção, possibilitará a obtenção de linhagens de milho mais tolerantes ao alumínio e, consequentemente mais adaptadas a condições adversas impostas pelos solos ácidos.

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DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [8] Figura 1. A) Aumento da tolerância ao Al com base no crescimento líquido relativo da raiz, nas linhagens isogênicas (NIL05, NIL13 e NIL19) em relação à L53. B) Expressão do ZmMATEl induzida pelo Al no ápice radicular das linhagens isogênicas, comparáveis ao padrão de expressão em Cateto A1237.

[9] Figura 2. Desenvolvimento do sistema radicular das linhagens isogênicas (NIL05 e NIL13) e da L53 em sistema de rizobox contendo uma camada superficial de 15 cm com solo de Cerrado corrigido e uma camada sub-superficial de solo contendo 30% de saturação de Al.

[10] Figura 3. Produção de grãos de 12 híbridos de milho com o alelo superior do gene ZmMATEl (Híbridos +ZmMATET) em comparação com quatro híbridos isogênicos sem o alelo de interesse (Híbridos -ZmMATEl). O cultivo foi realizado em solo corrigido (0% Al) e não corrigido (50% Al) sob irrigação plena (irrigado) e com déficit hídrico na fase de enchimento de grãos (estresse hídrico).

DESCRIÇÃO DO ANEXO [11] Anexo I. Resultado da genotipagem das linhagens de milho com o marcador aleloespecífico. Pontos azuis representam as plantas com o alelo C:C, os pontos verdes representam as plantas heterozigotas (C:T) e os pontos vermelhos, as plantas homozigotas para o alelo TT, que representa o alelo superior do ZmMATEl.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [12] Na presente invenção inúmeros termos serão utilizados e por isso serão mais bem definidos a seguir.

[13] Alelo superior - forma alélica do gene que confere tolerância ao Al via altos níveis de expressão do ZmMATEl no ápice radicular.

[14] Introgressão - Introdução de uma região genômica ou gene por meio de um cruzamento entre a linhagem doadora do alelo superior e uma linhagem recorrente, seguido de ciclos de retrocruzamentos com a linhagem recorrente, visando introduzir o alelo superior da linhagem doadora com o máximo do genoma da linhagem recorrente.

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5/9 [15] Linhagens isogênicas - pares de linhagens contendo o mesmo background genético, diferindo entre elas apenas quanto ao gene/alelo de interesse. Linhagens obtidas por meio de retrocruzamentos.

[16] Polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) - diferentes nucleotídeos presentes em uma mesma posição genômica entre diferentes genótipos.

[17] PCR - reação em cadeia da polimerase. O objetivo dessa reação é amplificar um fragmento de DNA específico utilizando pares de iniciadores, oligonucleotídeos ou primers com sequências complementares ao fragmento alvo.

[18] Reação em cadeia da polimerase alelo-específica competitiva - tradução da sigla KASP^tm , que em inglês significa Kompelilive Allele Specific PCR.

[19] KASP™ - KASP é uma técnica para genotipagem SNP que se baseia na amplificação específica do alelo utilizando oligonucleotídeos repórteres marcados com fluorescência. Cada ensaio envolve três primers, sendo dois primers específicos para cada um dos alelos e um primer comum. Os dois primers específicos possuem sequências na extremidade 3' complementares a cada um dos alelos do SNP e uma extremidade 5' com sequência complementar a dois oligonucleotídeos repórteres marcados, cada um deles com um fluoróforo diferente. Os oligonucleotídeos repórteres estão presentes no KASP Mastermix, que são incorporados aos fragmentos de DNA amplificados durante a reação de PCR. Os produtos fluorescentes resultantes podem ser detectados usando um leitor de placas ou um instrumento de PCR em tempo real.

[20] CAPS - sigla derivada do inglês Cleaved Amplified Polymorphic Sequence, que é uma técnica que revela polimorfismos de sequência com base reação em cadeia da polimerase utilizando primers que flanqueiam um ou mais sítios de restrição seguido de digestão do produto de PCR com a enzima de restrição apropriada.

[21] A presente invenção apresenta um método de detecção da presença do alelo superior do gene ZmMATEl (SEQ ID N°01) em plantas de milho caracterizado por compreender a análise de polimorfismo de Nucleotídeo Único (SNP). De acordo com a presente invenção, a análise de polimorfismo de nucleotídeo único compreende técnicas selecionadas do grupo consistindo de: reação em cadeia da polimerase utilizando combinações de primers não marcados, reação em cadeia da polimerase em tempo real utilizando primers e sondas marcadas, CAPS, espectrometria de massa, sequenciamento de DNA e reação em cadeia da polimerase alelo-específica competitiva.

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6/9 [22] Preferencialmente, a análise de polimorfísmo de nucleotídeo único utilizada na invenção é baseada na técnica de polimerase alelo-específica competitiva. Ainda mais preferencialmente a técnica de polimerase alelo-específica competitiva utilizada é a KASP™ (Kompetitive Allele Specific PCR).

[23] Na presente invenção a técnica KASP™ compreende o uso dos iniciadores (primers) SEQ ID N°03, SEQ ID N°04 (específicos) e SEQ ID N°05 (comum) em sua reação em cadeia da polimerase.

[24] O alelo superior do gene ZmMATEl, detectado de acordo com o método da presente invenção, está localizado na região promotora (SEQ ID N°02) do gene ZmMATEl. Mais especificamente, o alelo superior do gene ZmMATEl da presente invenção corresponde a um polimorfismo de substituição do nucleotídeo C pelo nucleotídeo T na posição 2.499 bp antes do códon de iniciação do gene ZmMATEl (SEQ ID N°01).

[25] Adicionalmente a invenção se refere ao método de aumento de tolerância ao alumínio em plantas de milho através da introgressão do alelo superior do gene ZmMATEl (SEQ ID N°01). O referido alelo superior do gene ZmMATEl (SEQ ID N°01) da invenção está localizado na região promotora (SEQ ID N°02) do gene ZmMATEl, e corresponde a um polimorfismo de substituição do nucleotídeo C pelo nucleotídeo T na posição 2.499 bp antes do códon de iniciação do gene ZmMATEl (SEQ ID N°01). Em uma concretização preferencial da invenção, o método de aumento da tolerância em plantas de milho compreende a transformação de plantas ou partes de plantas de milho através de uma ou mais técnicas selecionadas do grupo consistindo de: bombardeamento de microprojétil; métodos de transformação mediados por Agrobacterium.

[26] A presente invenção também se refere ao método de aumento de tolerância ao alumínio em plantas de milho que compreende as seguintes etapas: a) Obtenção de ácidos nucleicos de plantas de milho; b) Análise de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP); c) Seleção de plantas de milho com tolerância ao alumínio aumentada baseada na presença do alelo superior associado ao gene ZmMATEl; d) introgressão de alelo superior associado ao gene ZmMATEl de plantas de milho tolerantes para plantas selecionadas.

[27] A obtenção de ácidos nucleicos de plantas de milho, conforme a etapa A do referido método, compreende uma ou mais técnicas de extração de DNA selecionadas dentre: CTAB, NaOH, isopropanol, kits comerciais e uso direto de fragmentos foliares em reações em cadeia da polimerase (PCR).

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7/9 [28] A análise de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), conforme a etapa B do referido método, compreende técnicas selecionadas do grupo consistindo de: reação em cadeia da polimerase utilizando combinações de primers não marcados, reação em cadeia da polimerase em tempo real utilizando primers e sondas marcadas, CAPS, espectrometria de massa, sequenciamento de DNA e a reação em cadeia da polimerase alelo-específica competitiva. Em uma concretização preferencial a técnica utilizada para análise de polimorfismo de nucleotídeo único é a reação em cadeia da polimerase alelo-específica competitiva. Preferencialmente a técnica de reação da polimerase alelo-específica competitiva utilizada é KASP™ (Kompetitive Allele Specific PCR). Adicionalmente, a técnica KASP™ compreende o uso dos iniciadores (primers) SEQ ID N°03, SEQ ID N°04 e SEQ ID N°05.

[29] A seleção de plantas de milho com tolerância ao alumínio aumentada, conforme etapa C do referido método, é baseada na presença do alelo superior associado ao gene ZmMATEl (SEQ ID N°01), localizado na região promotora (SEQ ID N°02) do gene ZmMATEl, que corresponde a um polimorfismo de substituição do nucleotídeo C pelo nucleotídeo T na posição 2.499 bp antes do códon de iniciação do gene ZmMATEl (SEQ ID N°01).

[30] A introgressão de alelo superior associado ao gene ZmMATEl de plantas de milho tolerantes para plantas selecionadas, conforme a etapa D do referido método, compreende a introgressão do alelo superior do gene ZmMATEl (SEQ ID N°01) em plantas de milho, na região promotora (SEQ ID N°02) do gene ZmMATEl. O referido alelo superior da invenção corresponde a um polimorfismo de substituição do nucleotídeo C pelo nucleotídeo T na posição 2.499 bp antes do códon de iniciação do gene ZmMATEl (SEQ ID N°01).

EXEMPLOS [31] Exemplo 1: Detecção do alelo superior do gene ZmMATEl.

[32] A detecção do alelo superior do gene ZmMATEl foi realizada de acordo com as seguintes etapas:

[33] A) Extração do DNA genômico a partir de discos folhares utilizando o reagente CTAB conforme descrito por Saghai-Maroof et al. (1984).

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8/9 [34] B) Realização da reação em cadeia da polimerase utilizando 30 ng de DNA genômico, 3 pL de Kasp Master Mix e 0,084 pL de Kasp Assay Mix contendo os primers SEQ ID N° 03, SEQ ID N° 04 e SEQ ID N° 05. O primer SEQ ID N° 03 possui sequência 3' complementar ao alelo C e sequência 5' complementar ao oligonucleotídeo repórter marcado com fluorescência 6-FAM. O primer SEQ ID N° 04 possui sequência 3' complementar ao alelo T e sequência 5' complementar ao oligonucleotídeo repórter marcado com fluorescência HEX. O primer SEQ ID N° 05 é comum e é marcado com fluorescência ROX. Os ciclos de amplificação foram: 94°C durante 15 minutos, seguidos de 10 ciclos a 94°C durante 20 segundos, 61 °C durante 1 minuto reduzindo 0,6 °C por ciclo, seguido de 26 ciclos adicionais de 94 °C durante 20 segundos e 55 °C durante 1 minuto.

[35] C) A detecção dos fragmentos amplificados foi realizada a partir da quantificação da intensidade das fluorescências por meio do leitor de microplacas FLUOstar Omega Filter-based multi-mode microplate reader (BMG Labtech, Ortenberg, Alemanha) utilizando ROX para a normalização do sinal. As intensidades das fluorescências foram interpretadas pelo programa KlusterCaller 1.1 (LGC Genomics, Teddington, Inglaterra) e apresentadas conforme Anexo I, no qual os pontos azuis representam as plantas com o alelo C:C, os pontos verdes representam as plantas heterozigotas (C:T) e os pontos vermelhos, as plantas homozigotas para o alelo TT, que representa o alelo superior do ZmMATEl. O marcador proposto para a identificação do alelo superior do gene ZmMATEl é uma técnica simples, rápida e automatizável, gerando dados genotípicos codominantes e confiáveis em diferentes backgrounds genéticos. Adicionalmente, o marcador é codominante, possibilitando a diferenciação do homozigoto dominante em relação ao heterozigoto. Assim, o marcador proposto apresenta todas as características desejáveis para a sua ampla utilização em programas de retrocruzamento assistido por marcadores.

[36] Exemplo 2: Introgressão do alelo superior do gene ZmMATEl [37] A introgressão assistida do ZmMATEl foi realizada utilizando Cateto A1237 como a linhagem doadora do alelo superior e a linhagem L53, sensível ao Al, como recorrente. Foram selecionados dois marcadores microssatélites flanqueando o loco qALT6 e, consequentemente o gene ZmMATEl. Esses marcadores foram localizados próximos ao gene de interesse e foram genotipados entre as linhagens doadora e receptora para a

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9/9 seleção daqueles polimórficos. Após três ciclos de retrocruzamento foram obtidas as linhagens isogênicas, com 97% do genoma da L53 e contendo o alelo superior do gene ZmMATEl derivado da Cateto Al237, que foram denominadas NIL05, NIL13 e NIL19. As linhagens isogênicas dobraram a tolerância ao Al em solução nutritiva em comparação com a L53 (Figura 1A) e apresentaram altos níveis de expressão do ZmMATEl no ápice radicular após 6 horas de tratamento com Al (Figura 1B). Tais resultados comprovam que a introgressão do ZmMATEl aumenta a tolerância ao Al, mediado pela alta expressão do gene alvo induzida pelo Al no ápice radicular.

[38] As linhagens isogênicas apresentaram crescimento radicular na camada subsuperficial do solo contendo 30% de saturação de Al, ao passo que as raízes da L53 foram mantidas na camada de solo corrigido (Figura 2), indicando um grande potencial da introgressão assistida desse gene para aumentar o volume de solo explorado pelas raízes nas camadas sub-superficiais dos solos ácidos.

[39] Para avaliar a produtividade desses materiais, as linhagens isogênicas e a L53 foram cruzadas com quatro linhagens elites de milho gerando 12 híbridos com o alelo superior do gene ZmMATEl e 4 híbridos sem o alelo. Os híbridos foram cultivados por dois anos em solo de Cerrado corrigido e não corrigido contendo 0% e 50% de saturação de Al de 0 a 20 cm de profundidade, respectivamente. Na camada subsuperficial de 20 a 40 cm, os solos apresentaram 15 e 60% de saturação de Al. No primeiro ano, o experimento foi irrigado em todo o ciclo e no segundo ano, o experimento sofreu um estresse hídrico na fase de enchimento de grãos. Nas condições ideais de solo corrigido e irrigado, os híbridos apresentaram uma produção média de 9400 kg/ha com um ganho de 2% para os híbridos com o alelo (Figura 3). Nas condições de estresse hídrico e na presença do Al tóxico no solo, os híbridos com o alelo de interesse apresentaram um ganho em produtividade de aproximadamente 20% em relação aos híbridos sem o alelo, equivalendo a 1300 - 1400 kg/ha (Figura 3). Quando os dois estresses foram combinados, o ganho de produtividade dos híbridos com o alelo superior foi de 48% (2140 kg/ha). Tais resultados indicam que o alelo do ZmMATEl que confere tolerância ao Al confere ganhos significativos na produção de híbridos de milho sob condições de estresse sem prejuízos para a produção de grãos em condições ideais. Com base nos dados apresentados, existe uma grande possibilidade que a introgressão desse alelo em diferentes germoplasmas elites aumente a tolerância do milho a estresses múltiplos.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de detecção da presença do alelo superior do gene ZmMATEl (SEQ ID N°01) em plantas de milho caracterizado por compreender a análise de polimorfismo de Nucleotídeo Único (SNP).
2. Método de acordo com a reivindicação 01 caracterizado por a análise de polimorfismo de nucleotídeo único compreender técnicas selecionadas do grupo consistindo de: reação em cadeia da polimerase utilizando combinações de primers não marcados, reação em cadeia da polimerase em tempo real utilizando primers e sondas marcadas, CAPS, espectrometria de massa, sequenciamento de DNA e reação em cadeia da polimerase alelo-específica competitiva.
3. Método de acordo com a reivindicação 02 caracterizado por a técnica ser a reação em cadeia da polimerase alelo-específica competitiva.
4. Método de acordo com a reivindicação 03 caracterizado por a técnica de polimerase alelo-específica competitiva ser KASP™ (Kompetitive Allele Specific PCR).
5. Método de acordo com a reivindicação 04 caracterizado por a técnica KASP™ compreender o uso dos iniciadores (primers) SEQ ID N°03, SEQ ID N°04 e SEQ ID N°05.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 01 a 05 caracterizado por o alelo superior do gene ZmMATEl (SEQ ID N°01) estar localizado na região promotora (SEQ ID N°02) do gene ZmMATEl.
7. Método de acordo com a reivindicação 06 caracterizado por o alelo superior corresponder a um polimorfismo de substituição do nucleotídeo C pelo nucleotídeo T na posição 2.499 bp antes do códon de iniciação do gene ZmMATEl (SEQ ID N°01).
8. Método de aumento de tolerância ao alumínio em plantas de milho caracterizado por compreender a introgressão do alelo superior do gene ZmMATEl (SEQ ID N°01) em plantas de milho.
9. Método de acordo com a reivindicação 8 caracterizado por o alelo superior do gene ZmMATEl (SEQ ID N°01) estar localizado na região promotora (SEQ ID N°02) do gene ZmMATEl.
10. Método de acordo com a reivindicação 9 caracterizado por o alelo superior corresponder a um polimorfismo de substituição do nucleotídeo C pelo nucleotídeo T na posição 2.499 bp antes do códon de iniciação do gene ZmMATEl (SEQ ID N°01).

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11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10 caracterizado por o aumento de tolerância ao alumínio em plantas de milho compreender transformação de plantas ou partes de plantas de milho através de uma ou mais técnicas selecionadas do grupo consistindo de: bombardeamento de microprojétil; métodos de transformação mediados por Agrobacterium.
12. Método de aumento de tolerância ao alumínio em plantas de milho caracterizado por compreender as etapas: a) Obtenção de ácidos nucleicos de plantas de milho; b) Análise de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP); c) Seleção de plantas de milho com tolerância ao alumínio aumentada baseada na presença do alelo superior associado ao gene ZmMATEl; d) introgressão de alelo superior associado ao gene ZmMATEl de plantas de milho tolerantes para plantas selecionadas.
13. Método de acordo com a reivindicação 12 caracterizado por a etapa A compreender uma ou mais técnicas de extração de DNA selecionadas do grupo consistindo de CTAB, NaOH, isopropanol, kits comerciais e uso direto de fragmentos foliares em reações em cadeia da polimerase (PCR).
14. Método de acordo com a reivindicação 12 caracterizado por na etapa B a análise de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) compreender técnicas selecionadas do grupo consistindo de: reação em cadeia da polimerase utilizando combinações de primers não marcados, reação em cadeia da polimerase em tempo real utilizando primers e sondas marcadas, PCR-RFLP, espectrometria de massa, sequenciamento de DNA e a reação em cadeia da polimerase alelo-específica competitiva.
15. Método de acordo com a reivindicação 14 caracterizado por a técnica ser a reação em cadeia da polimerase alelo-específica competitiva.
16. Método de acordo com a reivindicação 15 caracterizado por a técnica de reação em cadeia da polimerase alelo-específica competitiva ser KASP™ (Kompetitive Allele Specific PCR).
17. Método de acordo com a reivindicação 16 caracterizado por a técnica KASP™ compreender o uso dos iniciadores (primers) SEQ ID N°03, SEQ ID N°04 e SEQ ID N°05.
18. Método de acordo com a reivindicação 12 caracterizado por na etapa C, o alelo superior do gene ZmMATEl (SEQ ID N°01) estar localizado na região promotora (SEQ ID N°02) do gene ZmMATEl.

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19. Método de acordo com a reivindicação 18 caracterizado por o alelo superior corresponder a um polimorfismo de substituição do nucleotídeo C pelo nucleotídeo T na posição 2.499 bp antes do códon de iniciação do gene ZmMATEl (SEQ ID N°01).
20. Método de acordo com a reivindicação 12 caracterizado por a etapa D compreender a introgressão do alelo superior do gene ZmMATEl (SEQ ID N°01) em plantas de milho.
21. Método de acordo com a reivindicação 20 caracterizado por o alelo superior do gene ZmMATEl (SEQ ID N°01) estar localizado na região promotora (SEQ ID N°02) do gene ZmMATEl.
22. Método de acordo com a reivindicação 21 caracterizado por o alelo superior corresponder a um polimorfismo de substituição do nucleotídeo C pelo nucleotídeo T na posição 2.499 bp antes do códon de iniciação do gene ZmMATEl (SEQ ID N°01).