CN116179746A - 一种鉴定梨早期糖积累量的kasp分子标记的引物组及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴定梨早期糖积累量的KASP分子标记的引物组及应用，属于分子标记辅助育种技术领域，利用梨基因组的两个SNP位点分别开发了两组KASP分子标记qTang1和qTang2，其中，qTang1分子标记的引物组具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；qTang2分子标记的引物组具有如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示的核苷酸序列。本发明中的分子标记引物组可用于筛选7月初高糖早熟的砂梨品种，提高育种效率，促进了梨种植业的发展。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种鉴定梨早期糖积累量的KASP分子标记的引物组及应用。
背景技术
根据梨栽培的地域分布，江浙沪地区主要种植早熟砂梨。早熟梨育种的关键在于果实中总糖的快速积累，一般认为7月底之前果实中可溶性固形物达到12°Brix为早熟。早熟梨相对晚熟梨能更快的积累糖分，达到成熟标准，同时糖含量高的品种更受消费者欢迎。在早熟梨育种过程中培育更早积累糖分的品种尤为重要。梨的童期很长，一般为5年，小苗期确定杂交后代果实的糖能否快速积累非常重要。目前关于鉴定7月初梨果实早期糖积累高低的KASP分子标记还未见报道。相关标记的开发有利于分子标记辅助选择目标性状，可显著提高育种效率，缩短育种周期，促进了梨种植业的发展，具有显著的社会价值和应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定梨早期糖积累量的KASP分子标记，为解决梨早期糖积累量高低的鉴定问题，达到显著提高育种效率，缩短育种周期。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于鉴定梨早期糖积累量的KASP分子标记的引物组，该分子标记包含qTang1和qTang2两个分子标记；
其中，qTang1分子标记的引物组具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
qTang2分子标记的引物组具有如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种鉴定梨早期糖积累量的方法，包含如下步骤：
1)采集待测梨样品的幼嫩叶片，提取基因组DNA；
2)以待测梨样品的DNA为模板，利用上述的qTang1分子标记的引物组、qTang2分子标记的引物组分别进行PCR扩增；
3)检测PCR扩增产物的荧光值，其中，由qTang1分子标记的引物组扩增的PCR产物中，仅有FAM荧光值或FAM和HEX混合型荧光值代表早期糖积累量高的基因型，产物仅有HEX荧光值代表早期糖积累量低的基因型；由qTang2分子标记的引物组扩增的PCR产物中，有FAM荧光值或FAM和HEX混合型荧光值代表早期糖积累量低的基因型，产物仅有HEX荧光值时代表早期糖积累量高的基因型。
优选地，上述鉴定梨早期糖积累量的方法中，步骤2)中的PCR扩增，其扩增体系总体积为10μL，包括1μL的浓度为10ng/μL的DNA模板、5μL的2X MasterMix、2μL的引物组合物、2μL的双蒸水。
其中，qTang1分子标记的引物组包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物qTang1-FAM，如SEQ ID NO.2所示的正向引物qTang1-HEX和如SEQ ID NO.3所示的反向引物qTang1-R；
qTang2分子标记的引物组包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的正向引物qTang2-F，如SEQ ID NO.5所示的反向引物qTang2-FAM和如SEQ IDNO.6所示反向引物qTang2-HEX；
qTang1的引物组合物为0.5μL的qTang1-FAM、0.5μL的qTang1-HEX和1μL的qTang1-R；qTang2的引物组合物为1μL的qTang2-F、0.5μL的qTang2-FAM和0.5μL的qTang2-HEX，其中，所有的引物浓度均为10mM。
优选地，上述鉴定梨早期糖积累量的方法中，步骤2)中的PCR扩增，其程序为两步法降落PCR，包括94℃预变性15min；94℃变性20s、61℃延伸60s，每个循环延伸温度下降0.6℃，共10个循环；94℃变性20s，55℃延伸60s，共26个循环。
本发明还提供了一种鉴定梨早期糖积累量的试剂盒，该试剂盒包含上述KASP分子标记的引物组。
本发明提供的的KASP分子标记的引物组可被用于梨的分子标记辅助育种中，包含鉴定梨早期糖积累量的高低。
本发明的鉴定梨早期糖积累量的KASP分子标记的引物组，解决了梨早期糖积累量高低的鉴定问题，具有以下优点：
本发明首次提出了用于鉴定梨早期糖积累量高低的KASP分子标记，可快捷地获得与梨果实糖快速积累相关联的SNP位点的基因型。与传统的田间自然观察相比，可以在梨杂交后代小苗期筛选出7月初高糖早熟的后代，可以减少后期定值的费用。操作便捷，为梨果实糖快速积累定向育种奠定基础，加快育种进程。
附图说明
图1为本发明中2个SNP位点的QTL定位遗传图谱。
图2为本发明中两个分子标记所在位点的基因序列对比结果。
图3为本发明中采用qTang1和qTang2两个分子标记的引物组对不同品种的KASP检测结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验例1与梨早期糖积累量高低相关的KASP分子标记及其引物组的开发
1、构建梨早期糖积累量高的遗传群体
使用早熟高糖梨‘早生新水’和晚熟低糖梨‘秋水’进行杂交，获得120株F1代单株，定值于基地，5年后开花结果。
2、梨F1代果实糖含量测定
对120株F1代单株果实分别在2017和2018年的7月10日进行了糖含量测定，使用液相色谱仪对梨果实中4类糖(蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨醇)进行测定，计算总糖含量。
3、基于SLAF简化重测序构建遗传图谱并挖掘相关SLAF标记。
使用简化重测序对双亲和后代进行测序，利用SLAF标签对糖含量性状进行定位。根据LOD值大于3，成功定位到12号连锁群上的qTang1和6号连锁群上的qTang2分子标记与7月初果实糖含量关联，其QTL定位遗传图谱如图1所示，其中，图中的LG表示连锁群，图中的a为qTang1分子标记的遗传相对位置，图中的b为qTang2分子标记的遗传相对位置。qTang1分子标记的位点信息为T/C，位于翠冠梨参考基因组(国家生物信息中心，网址为https://ngdc.cncb.ac.cn/，基因组版本号为GWHBAOS00000000)GWHBAOS00000172片段上第2815897bp位置处；qTang2分子标记的位点信息为T/C，位于翠冠梨参考基因组GWHBAOS00000085片段上第22657647bp位置处，两个分子标记所在位点的基因序列对比结果如图2所示。其中，qTang1分子标记所对应的SNP位点，其T基因型代表7月初高糖基因型，C基因型代表7月初低糖基因型；qTang2分子标记所对应的SNP位点，其T基因型代表7月初低糖基因型，C基因型代表7月初高糖基因型，同时，两种基因型中的T基因型均为显性遗传，基因型及表型如下表1所示。
表1qTang1和qTang2不同基因型在7月初的糖含量
4、引物设计
根据引物设计原则，采用Primer5.0软件设计引物。qTang1分子标记，其引物组的的正向引物有2个，分别为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的qTang1-FAM和如SEQ ID NO.2所示qTang1-HEX，反向引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的qTang1-R。qTang2分子标记所对应的SNP位点，其区别引物设计在下游，因此它的正向引物只有1个，为核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示的qTang2-F，反向引物有2个，分别为核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的qTang2-FAM和如SEQ ID NO.6所示qTang2-HEX，具体序列如下所示：
上述序列如下所示(5’→3’)：
qTang1-FAM(SEQ ID NO.1)：
GCATTAGTGGCTCTTAATCCTTCATT；
qTang1-HEX(SEQ ID NO.2)：
GCATTAGTGGCTCTTAATCCTTCATC；
qTang1-R(SEQ ID NO.3)：
CTATCCACTAAACAAACAATATTAGTYGTT；
qTang2-F(SEQ ID NO.4)：
CGTCCCTTTAGAGGTCTTCAGC；
qTang2-FAM(SEQ ID NO.5)：
CATCTAGGCCCCATTCGACCTA；
qTang2-HEX(SEQ ID NO.6)：
CATCTAGGCCCCATTCGACCTG。
其中，序列3中的Y代表这个碱基为简并性碱基C/T。
5、梨基因组DNA的提取、扩增及检测
采用CTAB法提取：春季采集梨嫩叶组织500mg，包括‘早生新水’、‘秋水’、两者的F1杂交后代和一些江浙沪主栽品种。剪碎后放入2mL离心管中，加入研磨珠，液氮速冻后研磨机研磨，加入pH8.0的2％CTAB溶液800μL，加入16μL巯基乙醇，混匀后65℃水浴30分钟；加入0.8mL的氯仿/异戊醇(24:1)，混匀后于12000rpm离心1分钟，取上层水相至新的离心管。加入等体积的异丙醇和1/10体积浓度为3M的醋酸钠，室温静置1小时，离心后取沉淀，使用无水酒精清洗2次后烘干。使用100μL TE溶液进行溶解，即为DNA提取液。
PCR扩增：PCR扩增体系总体积为10μL，包括5μL的KASP-TF V4.0MasterMix，1μL的DNA模板(10ng/μL)，引物组合2μL(qTang1引物包含2个10mM正向引物各0.5μL，1个10mM反向引物为1μL；qTang2引物包含1个10mM正向引物为1μL，2个10mM反向引物各0.5μL)，双蒸水2μL；PCR扩增程序为两步法降落PCR：包括94℃预变性15min；94℃变性20s、61℃延伸60s，每个循环延伸温度下降0.6℃，共10个循环；94℃变性20s，55℃延伸60s，共26个循环。
荧光检测：使用罗氏LightCycler480荧光定量仪器对PCR产物中FAM和HEX荧光值进行检测，样品包括早生新水’、‘秋水’，两者的F1杂交后代和一些表2中的主栽品种，KASP检测结果如图3所示，图中的a为qTang1分子标记引物组的检测结果，图中的b为qTang2分子标记引物组的检测结果。可知，qTang1分子标记的引物组扩增的PCR产物中，仅有FAM或FAM、HEX混合型荧光值代表7月初糖积累量高的基因型，此时位点的基因型分别为TT和TC，产物仅有HEX荧光值代表7月初糖积累量低的基因型，此时位点的基因型为CC。qTang2分子标记的引物组扩增的PCR产物中，有FAM或FAM、HEX混合型荧光值代表7月初糖积累量低的基因型，此时位点的基因型分别为TT和TC，产物仅有HEX荧光值时代表7月初糖积累量高的基因型，此时位点的基因型为CC。
实验例2分子标记的引物组的的验证
1、选择了8个梨品种(沪晶梨18号、沪晶梨67号、翠冠、苏翠1号、翠玉、黄花、圆黄和黄冠)对qTang1和qTang2分子标记进行上述实验例1中的PCR验证。
2、经验证可知，上述8个品种的基因型和表型如表2所示。结果显示不同品种间会同时含有两种表型的基因型，其中‘沪晶梨18号’和‘沪晶梨67号’为‘早生新水’后代，分别在1个位点表现出高糖，2021年7月10日进行糖含量测定，经过测定达到126.7mg/mL以上，具体见下表2，与预期结果相符。‘苏翠1号’虽然也是早熟品种，但是本研究中的2个位点均为低糖，说明影响该品种的早熟表现可能来自其它的QTL位点。据此可以得出本发明中的糖早期积累标记可以应用于‘早生新水’及其后代的杂交群体的筛选，只要拥有1个高糖基因型，后代就能在7月初表现为高糖表型。‘早生新水’、‘沪晶梨18号’和‘沪晶梨67号’在上海地区已经拥有一定的种植面积，是江浙沪地区的适栽品种，本标记及其引物组的开发应用将辅助于这些品种后续的杂交育种，可显著提高育种效率，缩短育种周期，促进了梨种植业的发展。
表2两个分子标记的引物组对8个品种的基因型和表型鉴定结果
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (6)
1.一种用于鉴定梨早期糖积累量的KASP分子标记的引物组，其特征在于，所述分子标记包含qTang1和qTang2两个分子标记；
其中，所述qTang1分子标记的引物组具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
所述qTang2分子标记的引物组具有如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
2.一种鉴定梨早期糖积累量的方法，其特征在于，包含如下步骤：
1)采集待测梨样品的幼嫩叶片，提取基因组DNA；
2)以待测梨样品的DNA为模板，利用如权利要求1中所述的qTang1分子标记的引物组、qTang2分子标记的引物组分别进行PCR扩增；
3)检测PCR扩增产物的荧光值，其中，由qTang1分子标记的引物组扩增的PCR产物中，仅有FAM荧光值或FAM和HEX混合型荧光值代表早期糖积累量高的基因型，产物仅有HEX荧光值代表早期糖积累量低的基因型；由qTang2分子标记的引物组扩增的PCR产物中，有FAM荧光值或FAM和HEX混合型荧光值代表早期糖积累量低的基因型，产物仅有HEX荧光值时代表早期糖积累量高的基因型。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的PCR扩增，其扩增体系总体积为10μL，包括1μL的浓度为10ng/μL的DNA模板、5μL的2X MasterMix、2μL的引物组合物、2μL的双蒸水；
其中，所述qTang1分子标记的引物组包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物qTang1-FAM，如SEQ ID NO.2所示的正向引物qTang1-HEX和如SEQ ID NO.3所示的反向引物qTang1-R；
所述qTang2分子标记的引物组包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的正向引物qTang2-F，如SEQ ID NO.5所示的反向引物qTang2-FAM和如SEQ ID NO.6所示反向引物qTang2-HEX；
所述qTang1的引物组合物为0.5μL的qTang1-FAM、0.5μL的qTang1-HEX和1μL的qTang1-R；所述qTang2的引物组合物为1μL的qTang2-F、0.5μL的qTang2-FAM和0.5μL的qTang2-HEX，其中，所有的引物浓度均为10mM。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的PCR扩增，其程序为两步法降落PCR，包括94℃预变性15min；94℃变性20s、61℃延伸60s，每个循环延伸温度下降0.6℃，共10个循环；94℃变性20s，55℃延伸60s，共26个循环。
5.一种鉴定梨早期糖积累量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1所述KASP分子标记的引物组。
6.如权利要求1所述的KASP分子标记的引物组在梨分子标记辅助育种中的应用，所述应用包含鉴定梨早期糖积累量的高低。
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