CN102458113A - 与缺血再灌注相关的水肿的治疗方法 - Google Patents

与缺血再灌注相关的水肿的治疗方法 Download PDF

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CN102458113A CN2010800259139A CN201080025913A CN102458113A CN 102458113 A CN102458113 A CN 102458113A CN 2010800259139 A CN2010800259139 A CN 2010800259139A CN 201080025913 A CN201080025913 A CN 201080025913A CN 102458113 A CN102458113 A CN 102458113A
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Abstract

本文描述了通过用氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯处理被移植的器官或组织来预防或减少与缺血再灌注相关的水肿的方法。

Description

与缺血再灌注相关的水肿的治疗方法
相关申请
本申请主张2009年4月9日提交的美国专利申请61/168,089的权益，该申请所公开的内容以其整体通过援引加入本文。
技术领域
本文公开的主题涉及用于预防或减少与缺血再灌注相关的水肿的方法和组合物。
缩写
℃＝摄氏度
AGP＝氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯
AM＝肺泡巨噬细胞
ARDS＝成人呼吸窘迫综合征
BAL＝支气管肺泡灌洗
BMT＝骨髓移植
β-gal＝β-半乳糖苷酶
CO2＝二氧化碳
dpi＝每英寸点数
EBD＝伊文思蓝染料
EDTA＝乙二胺四乙酸
EGTA＝乙二醇四乙酸
FBS＝胎牛血清
FiO2＝吸入氧气分数
Fluc＝萤火虫荧光素酶
g＝相对离心力
Gy＝格雷
HCl＝盐酸
HEPES＝N-2-羟基乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸
HMVEC＝人肺微血管内皮细胞
hr＝小时
ICAM-1＝胞间粘附分子-1
IRI＝缺血再灌注损伤
LDH＝乳酸脱氢酶
LPS＝脂多糖
MAPK＝促分裂原激活性蛋白激酶
μg＝微克
μL＝微升
μm＝微米
μM＝微摩尔
mg＝毫克
min＝分钟
mL＝毫升
NF-κB＝核因子-κB
NHBD＝无心跳供体
nm＝纳米
O2＝氧
PAMP＝病原体相关的分子模式
PBS＝磷酸盐缓冲盐水
FEEP＝呼气末正压通气
PGN＝肽聚糖
PMSF＝苯基甲磺酰氟
PRMI＝Roswell Park Memorial Institute
SDS-PAGE＝十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
SIRS＝全身性炎症反应综合症.
TBS＝Tris缓冲盐水
TLR2＝Toll样受体2
TLR4＝Toll样受体4
TPCK＝L-1-甲苯磺酰氨基-2-苯基乙基氯甲基酮
Tris＝三(羟甲基)氨基甲烷
W/D＝湿/干重比
背景技术
急性肺损伤是败血症、全身性炎症反应和成人呼吸窘迫综合征的特征。非心源性肺水肿和气体交换受损均是急性肺损伤的后果而与病因学无关。人们对引起归因于急性肺损伤的肺水肿的机制仍不是很清楚。缺血再灌注损伤(IRI)是肺移植后立即出现的一种急性肺损伤形式，它是引起疾病和死亡的一种常见并发症。参见King等人，Ann.Thorac.Surg.，69，1681-1685(2000)。
缺血间期(interval of ischemia)后的再灌注导致涉及包括补体和凝血级联在内的固有免疫系统组分的炎症反应。实质细胞和髓系细胞二者均产生自由基、一氧化氮、促炎细胞因子和抗炎细胞因子。参见de Perrot等人，Am.J.Respir.Crit.Care Med.，167(4)，490-511(2003)；de Groot和Rauen，Transplant Proc.，39(2)，481-484(2007)；以及Mollen等人，Shock，26(5)，430-437(2006)。
对肺IRI更多的了解很有可能与许多类型的急性肺损伤相关，并且对除肺移植受体之外为数众多的患者是有利的。特别是此类知识对于在非肺器官中具有缺血再灌注相关水肿的患者是有利的。
发明概述
在一些实施方案中，本发明公开的主题提供预防或减少组织水肿的方法，所述方法包括使所述组织与有效量的式(I)的化合物或其药学可接受的盐接触：
Figure BPA00001480505800041
其中：
n是1-6的整数；
X1是O或S；
X2是O或S；
R1、R2和R3独立地是C2-C16酰基，其中R1、R2和R3中的至少一个是C2-C7酰基；
R4选自H、羟基烷基、-C(＝O)NH2和-(CH2)mC(＝O)OH，其中m是0-2的整数；并且
R5、R6和R7独立地是C10-C12烷基。
在一些实施方案中，n是1。在一些实施方案中，X1和X2各自是O。在一些实施方案中，R4是-C(＝O)OH。在一些实施方案中，R1、R2和R3各自是C2-C7酰基。
在一些实施方案中，所述式(I)的化合物是如下化合物或其药学可接受的盐：其中n是1；X1是O；X2是O；R1、R2和R3各自是-C(＝O)(CH2)4CH3；R4是-C(＝O)OH；并且R5、R6和R7各自是-(CH2)10CH3。
在一些实施方案中，所述水肿与缺血再灌注相关。在一些实施方案中，所述缺血再灌注与心肌梗塞或卒中相关。在一些实施方案中，所述缺血再灌注与心脏手术过程中的心脏麻痹相关或者与由矫形手术引起的骨骼肌中的缺血再灌注相关。在一些实施方案中，所述缺血再灌注与器官或组织移植相关。在一些实施方案中，所述组织移植是皮肤组织、肌肉组织或软组织移植。在一些实施方案中，所述组织移植是自体组织移植。
在一些实施方案中，所述组织与有效量的所述化合物的接触发生在缺血前、缺血过程中或缺血间期后。
在一些实施方案中，所述组织选自心、肝、肾、脑、小肠或大肠、胰、骨骼肌、皮肤、软组织和肺组织。在一些实施方案中，所述组织来自器官供体。在一些实施方案中，所述组织是来自肺移植供体的肺组织。在一些实施方案中，所述肺移植供体是人类肺移植供体。在一些实施方案中，所述器官供体是无心跳供体。
在一些实施方案中，所述化合物是Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)之一或二者的拮抗剂。在一些实施方案中，所述化合物是TLR2和LR4二者的拮抗剂。
在一些实施方案中，本文公开的主题提供预防或减少需要治疗水肿的个体中的水肿的方法，所述方法包括向所述个体给药有效量的式(I)的化合物或其药学可接受的盐。
在一些实施方案中，本文公开的主题提供预防或减少器官或组织移植个体中与缺血再灌注相关的水肿的方法，所述方法包括：提供用于移植的器官或组织；使所述器官或组织与式(I)的化合物或其药学可接受的盐接触；以及将经处理的器官或组织移植入需要所述移植的个体中，其中在所述个体中与缺血再灌注相关的水肿与使用未经所述化合物处理的器官或组织进行移植的个体中的与缺血再灌注相关的水肿相比得到了预防或减少。
在一些实施方案中，所述器官或组织选自心或心组织、肝或肝组织、肾或肾组织、胰或胰组织、小肠组织或大肠组织、骨骼肌组织、软组织、肺或肺组织以及脑组织。在一些实施方案中，所述器官或组织是肺或肺组织。在一些实施方案中，所述器官或组织来自无心跳器官供体。
在一些实施方案中，通过肺组织供体的气道、离体灌注回路的肺静脉和肺动脉中的一种进行所述接触。
在一些实施方案中，所述组织是皮肤组织、骨骼肌组织或软组织之一。在一些实施方案中，所述组织移植是自体组织移植。
在一些实施方案中，所述化合物是TLR2和TLR4之一或二者的拮抗剂。在一些实施方案中，所述化合物是TLR2和LR4二者的拮抗剂。
在一些实施方案中，所述式(I)的化合物是其中n是1的化合物。在一些实施方案中，X1和X2各自是O。在一些实施方案中，R4是-C(＝O)OH。在一些实施方案中，R1、R2和R3各自是C2-C7酰基。在一些实施方案中，所述式(I)的化合物是如下化合物或其药学可接受的盐：其中n是1；X1是O；X2是O；R1、R2和R3各自是-C(＝O)(CH2)4CH3；R4是C(＝O)OH；并且R5、R6和R7各自是-(CH2)10CH3。
在一些实施方案中，本发明公开的主题提供用于处理离体器官或器官组织的保存液，其包含式(I)的化合物或其药学可接受的盐。在一些实施方案中，所述离体器官或组织是肺或其部分。
本文公开的主题的目的是提供用于预防或减少水肿例如与缺血再灌注相关的水肿的方法和组合物。
上文已描述了本文公开的主题的目的，并且通过本文公开的主题全部或部分实现，当结合下文充分描述的随附实施例和附图一起考虑时，其它目的也会随着描述的进展而变得明显。
附图简述
图1A是再灌注后0min、15min、30min、1hr和3hr时Toll样受体4(TLR4)-充足(OuJ)小鼠和Toll样受体4(TLR4)-缺陷小鼠的再灌注肺中的水肿(以湿/干重比(W/D)测定)的柱形图。显示了OuJ小鼠的左肺(LL OuJ，空心柱)和右肺(RL OuJ，上色柱)的W/D数据以及HeJ小鼠的左肺(LLHeJ，有黑点的空心柱)和右肺(RL HeJ，有白色正方形的上色柱)的W/D数据。与对照相比，*＝p＜0.05，
Figure BPA00001480505800061
N＝6只/组。
图1B是在肺门钳闭1小时并且再灌注3小时后摘取的Toll样受体4(TLR4)-充足(OuJ)和Toll样受体4(TLR4)-缺陷(HeJ)小鼠的膨胀固定(25cmH2O)的左肺的一系列照片。上面两张照片中的箭头显示与来自HeJ小鼠的肺(右上角照片)相比，来自OuJ小鼠的肺(左上角照片)中支气管周围和血管周围间隙的间质水肿增加。下面两张照片中的箭头显示与来自HeJ小鼠的肺(右下角照片)相比，来自OuJ小鼠的肺(左下角照片)中肺泡壁更厚。上面的照片以40倍的放大率显示(上面照片的右下角中的线表示2.0mm)；下面的照面以200倍的放大率显示(下面照片的右下角中的线表示200μm)。这些照片表示4个标本。
图1C是在肺门钳闭1小时并且再灌注1小时后摘取的Toll样受体4(TLR4)-充足(OuJ)和Toll样受体4(TLR4)-缺陷小鼠的膨胀固定的左肺的一系列照片。尽管60min再灌注后的湿/干重比(W/D)的显著差异，但是在OuJ小鼠的肺(左上角照片)中或HeJ小鼠的肺(右上角照片)中均无间质支气管周围/血管周围水肿，并且无肺泡壁增厚(下面的照面)。这些照片代表四个标本。照片中显示的膨胀固定的切片表现得与对照标本(未显示)相同。上面的照片以40倍的放大率显示(上面照片的右下角中的线表示2.0mm)；下面的照片以200倍的放大率显示(下面照片的右下角中的线表示200μm)。
图1D是在肺门钳闭1小时并且再灌注1小时后摘取的Toll样受体4(TLR4)-充足(OuJ)和Toll样受体4(TLR4)-缺陷(HeJ)小鼠的左肺(空心柱)和右肺(上色柱)中的伊文思蓝染料蓄积(以光密度(OD)/克(gm)样品测量)的柱形图。OuJ小鼠的数据显示于图左边的两个柱中，HeJ小鼠的数据显示于图右边的两个柱中。非配对t检验*＝p＜0.05；配对t检验
图1E是比较在肺门钳闭1小时并且再灌注1小时后摘取的来自Toll样受体4(TLR4)-充足(OuJ)小鼠(n＝6)、TLR4-缺陷(HeJ)小鼠、MyD88-缺陷小鼠(n＝5)和C57BL/6J小鼠(MyD88-缺陷小鼠的背景品系；n＝6)的左肺(空心柱)和右肺(上色柱)的水肿的(以湿/干重比(W/D)测量)柱形图。
图1F是在缺血1小时并且再灌注0或5分钟后在C57BL/6J小鼠品系上培育的Toll样受体4(TLR4)-缺陷小鼠的右肺(RL TLR4-/-，斑点柱)和左肺(LL TLR4-/-，空心柱)中水肿(以湿/干重比(W/D)测量)的柱形图。还测量了在左肺门钳闭1小时然后再灌注0或5分钟后背景品系C57BL/6J小鼠的右肺(RL BL6，条纹柱)和左肺(LL BL6，上深色柱)中的水肿。与BL6右肺以及TLR4-/-小鼠的右肺和左肺相比*p＜0.05(用Tukey事后比较进行方差分析)。N＝6只/组。
图2A的一系列蛋白质印迹照片显示对照、使得缺血1小时然后再灌注0、15、30、60或180分钟的Toll样受体4(TLR4)-充足(OuJ)和TLR4-缺陷小鼠的左肺中JNK、ERK、p38和NF-κB的活化的一系列蛋白质印迹凝胶照片。对于HeJ和OuJ品系中的每一种n＝4。对照表示提取自未进行缺血/再灌注的2只HeJ小鼠和2只OuJ小鼠的肺的蛋白。
图2B是来自图2A所述的蛋白质印迹的蛋白质浓度数据(通过激光扫描定量的密度)的一系列柱形图。分别用上浅色柱、上深色柱和空心柱表示对照、HeJ小鼠和OuJ小鼠的肺的数据。通过用磷酸化的促分裂原激活性蛋白激酶(MAPK)/促分裂原激活性蛋白激酶(MAPK)和IκBα/β-肌动蛋白除以对照的平均比值将每一个比值标准化，使各对照＝1.0，用误差线表示不同对照样品之间的变异性(平均值±SEM)。P46和p54JNK以及p44和p42ERK具有相似的模式和p值。通过使用用于多重比较的Tukey真实显著性差异进行方差分析，与对照相比*＝p＜0.05；
Figure BPA00001480505800081
图3是对NF-κB的p65组分进行免疫染色的肺组织样品的一系列照片。对照样品(最左边的照片)是来自刚处死的小鼠的肺组织的免疫染色。剩余的照片显示来自再灌注60或180分钟后的Toll样受体4(TLR4)-充足(OuJ)和TLR4-缺陷(HeJ)小鼠的右肺(下面四张照片)和左肺(上面四张照片)的肺组织的免疫染色。每一张照片右下角的线表示100μm。
图4A是骨髓移植后12周的嵌合小鼠的肺泡巨噬细胞(AM)中NF-κB活化(以萤火虫荧光素酶(fluc)/β-半乳糖苷酶(β-gal)活性测定)的柱形图。通过支气管肺泡灌洗(BAL)回收AM并且用Ad.NFκBLuc和Ad.CMV-LacZ感染，然后与磷酸盐缓冲盐水(PBS；空心柱)或1μg/mL脂多糖(LPS，上深色柱)温育。所观察到的萤火虫荧光素酶/β-半乳糖苷酶活性表明来自嵌合HeJ品系(P+M-)或嵌合OuJ品系(P-M+)的受体骨髓的完全替换。P＝实质细胞，M＝衍生自骨髓的细胞，+＝完整的TLR4(OuJ)，-＝非功能性TLR4(HeJ)。将回收自未照射的HeJ小鼠和OuJ小鼠的AM用作对照。n＝4个实验/组，p＜0.0001。
图4B是IRI后3小时嵌合小鼠的左肺(空心柱)和右肺(上深色柱)的肺组织中水肿(以湿/干重比(W/D)测定)的柱形图。P＝实质细胞，M＝衍生自骨髓的细胞，+＝完整的TLR4(OuJ)，-＝非功能性TLR4(HeJ)。与P-左肺的W/D相比，*＝p＜0.05，
Figure BPA00001480505800082
(用Tukey真实显著性差异进行方差分析)。
图4C是来自具有恢复的骨髓的嵌合小鼠(P-M-，P+M+)以及完整的HeJ和OuJ品系的左肺组织(空心柱)和右肺组织(上深色柱)的湿/干重比(W/D)的柱形图。
图5A是OuJ小鼠的右肺(上深色柱)和左肺(空心柱)在1小时的缺血再灌注损伤(IRI)后的水肿(以湿/干重比(W/D)测定)的柱形图，所述OuJ小鼠在肺门钳闭前一小时时开始用载体(盐水，图左边的柱)或TLR4竞争性抑制剂CRX-526(200μL盐水中10μg，图右边的柱)进行静脉内治疗30分钟。N＝5/组，通过配对t检验与同一动物的右肺相比，*＝p＝0.0014；通过非配对t检验，与用CRX-526预治疗的小鼠的左肺相比，p＝0.0023。
图5B的柱形图显示0.1、1、10和100μg浓度的CRX-526(即分别为Inhib 0.1、Inhib 1、Inhib 10、Inhib 100)实现的NF-κB活化的体外抑制(基于萤火虫荧光素酶(fluc)/β-半乳糖苷酶(β-gal)活性)。在用仅磷酸盐缓冲盐水(PBS)(空心柱)、10ng/mL脂多糖(LPS)(斑点柱)、5ng/mL LPS(条纹柱)或0.25ng/mL肿瘤坏死因子(TNF，上深色柱)刺激经CRX-526-处理的人肺微血管内皮细胞(HMVEC)后，测定Fluc/β-gal。将未经CRX-526处理的HMVEC用作对照。N＝4/组，通过方差分析与同一时间点的其它值相比，*p＜0.05。
图6是左肺门阻塞1小时并且再灌注15、30或60分钟后Toll样受体2缺陷小鼠(TLR2-/-)中的水肿(基于湿/干重比(W/D))图。以条纹柱表示TLR2-/-小鼠右肺(TLR2-/-RL)的水肿，以上浅色柱表示TLR2-/-小鼠的左肺(TLR2-/-LL)的水肿。还测定了作为对照的背景C57BL/6J小鼠品系的右肺(BL6RL，空心柱)和左肺(BL6LL，上深色柱)的水肿。与对照左肺相比，
图7A是C57BL/6J小鼠的左肺(BL6，上深色柱)、Toll样受体4缺陷小鼠的左肺(TLR4-/-，条纹柱)、Toll受体2缺陷小鼠的左肺(TLR2-/-，斑点柱)和从左肺门钳闭1小时之前1小时开始用10μg CRX-526预治疗超过30分钟的C57BL/6J小鼠的左肺(CRX-526，空心柱)的水肿图(以湿/干重比(W/D)测定)。对照(刚刚)数据来自处死未行肺门钳闭的动物后立即摘除的鼠肺。如图的x轴所示，其它数据来自左肺门钳闭1小时并且再灌注0、15、30、60或180分钟后的肺。n＝3-6。BL6W/D显著高于其它品系或CRX-526治疗小鼠。*p＜0.05，
Figure BPA00001480505800092
TLR2-/-与TLR4-/-和CRX-526-治疗小鼠相比，§p＜0.01，σp＜0.05(在各时间点用Tukey事后比较进行方差分析)。
图7B是C57BL/6J小鼠的右肺(BL6，上深色柱)、Toll样受体4缺陷小鼠的右肺(TLR4-/-，条纹柱)、Toll样受体2缺陷小鼠的右肺(TLR2-/-，斑点柱)以及从左肺门钳闭1小时之前1小时开始用10μg CRX-526预治疗超过30分钟的C57BL/6J小鼠的右肺(CRX-526，空心柱)的水肿的图(以湿/干重比(W/D)测定)。对照(刚刚)数据来自在肺门钳闭之前处死动物后立即摘除的鼠肺。如图的x轴所示，其它数据来自左肺门钳闭1小时并且再灌注0、15、30、60或180分钟后的肺。数据n＝3-6。
图8的柱形图显示CRX-526对由Toll样受体2(TLR2)配体刺激介导的NF-κB活化的作用。用重组第一代E1、E3缺陷型Ad.NF-κB-荧光素酶和组成型β-半乳糖苷酶载体转染人肺微血管内皮细胞(HMVEC)，从而使得当NF-κB被活化时，萤火虫荧光素酶(fluc)/β-半乳糖苷酶(β-gal)的比值增加。转染后四十八小时，用各种浓度的CRX-526(如X轴所显示)预治疗HMVEC1小时并且暴露于TLR2配体Pam(3)Cys(25μG/mL，上深色柱)或脂磷壁酸(LTA；1μg/mL，空心柱)8小时。将荧光素酶活性标准化至β-半乳糖苷酶以控制转染率。CRX-526降低了NF-κB活化。与载体相比，*p＜0.05，
Figure BPA00001480505800101
发明详述
现在将在下文中结合其中显示了代表性实施方案的随附实施例更全面地描述本文公开的主题。但是能够以不同的形式实施本文公开的主题并且不应理解为本文公开的主题限于本文所列出的实施方案。相反，提供这些实施方案是为了使本公开更加充分和完整，并且向本领域技术人员完全阐述所述实施方案的范围。
除非另外指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本文公开的主题所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献以其整体通过援引加入本文。
在整个说明书和权利要求书中，当存在旋光异构体和立体异构体以及外消旋混合物时，特定的化学式或化学名称应包括所有此类异构体和混合物。
I.定义
尽管认为本领域普通技术人员能够很好地理解以下术语，但是仍列出以下定义以帮助阐述本文公开的主题。
根据长久以来的专利法约定，当在包括权利要求书在内的本申请中使用时，英文术语“a”、“an”和“the”表示“一个或多个”。因此，例如，提及“化合物(a compound)”或“细胞(a cell)”时包括多个此类化合物或细胞，等等。
与“包括(including)”、“包含(containing)”或“特征是”同义的术语“包括(comprising)”是包含性的或开放式的，并且不排除另外的未陈述的要素或方法步骤。“包括”是用于权利要求书语言中的技术术语，其表示所提及的要素是必要的，但是其它要素也可加入并且仍然形成落入所述权利要求范围内的构成物(construct)。
本文使用的短语“由…组成”排除未在权利要求中指定的任何要素、步骤或成分。当短语“由…组成”出现在权利要求主体的从句中而不是紧随前序之后时，它仅限定在该从句中描述的要素；整个权利要求中不排除其它要素。
本文使用的短语“基本由…组成”将权利要求的范围限制于指定的物质或步骤，加上不会实质上影响要求保护的主题的基本且新颖的特征的那些物质或步骤。
对于术语“包括”、“由…组成”和“基本由…组成”，当这三个术语之一用于本文中时，本文公开和要求保护的主题可包括另外两个术语中任何一个的使用。
本文使用的术语“烷基”指包括C1-20(含端值)的线型的(即“直链”)、支链的或环状的饱和或至少部分饱和以及在某些情况下完全不饱和(即烯基和炔基)的烃链，包括例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、辛基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、辛烯基、丁二烯基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基以及丙二烯基(allenyl)。“支链的”指其中低级烷基例如甲基、乙基或丙基结合至线型烷基链的烷基。“低级烷基”指具有1-约6个碳原子(即C1-7烷基)，例如1、2、3、4、5或6个碳原子的烷基。“高级烷基”指具有约8-约20个碳原子，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子的烷基。
任选地，烷基可被相同或不同的一个或多个烷基取代基取代(“取代的烷基”)。术语“烷基取代基”包括但不限于烷基、取代的烷基、卤素、芳基氨基、酰基、羟基、芳氧基、烷氧基、烷硫基、芳硫基、芳基烷氧基、芳基烷硫基、羧基、烷氧羰基、氧代和环烷基。任选地，可沿着所述烷基链插入一个或多个氧原子、硫原子或者取代或未取代的氮原子，其中氮取代基是氢、低级烷基(本文中也称作“烷基氨基烷基”)或芳基。
因此，本文使用的术语“取代的烷基”包括如本文定义的烷基，其中所述烷基的一个或多个原子或官能团被包括例如烷基、取代的烷基、卤素、芳基、取代的芳基、烷氧基、羟基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硫酸根和巯基的另一原子或官能团代替。
术语“烯基”指包含一个或多个碳-碳双键的烷基。
本文使用的术语“芳基”指可为单芳环或多芳环的芳族取代基，所述多芳环可稠合在一起、共价连接或连接至共有基团(例如但不限于亚甲基或亚乙基基团)。所述共有连接基团还可为羰基(如在二苯甲酮中)、氧(如在二苯醚中)或者氮(如在二苯胺中)。术语“芳基”特别包括杂环芳族化合物。所述芳环可包括苯基、萘基、联苯基、二苯醚、二苯胺和二苯甲酮等。在具体的实施方案中，术语“芳基”表示包含约5-约10个碳原子例如5、6、7、8、9或10个碳原子并且包含5-和6-元烃芳环和杂环芳环的环状芳族化合物。
任选地，所述芳基可被相同或不同的一个或多个芳基取代基取代(“取代的芳基”)，其中“芳基取代基”包括烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、芳基烷氧基、羧基、酰基、卤素、硝基、烷氧羰基、芳氧基羰基、芳基烷氧羰基、酰氧基、酰基氨基、芳酰基氨基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、芳硫基、烷硫基、亚烷基以及-NR′R″，其中R′和R″可各自独立地是氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基和芳烷基。
因此，本文使用的术语“取代的芳基”包括如本文定义的芳基，其中所述芳基的一个或多个原子或官能团被包括例如烷基、取代烷基、卤素、芳基、取代的芳基、烷氧基、羟基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硫酸根和巯基的另一原子或官能团代替。
芳基的具体实例包括但不限于环戊二烯基、苯基、呋喃、噻吩、吡咯、吡喃、吡啶、咪唑、苯并咪唑、异噻唑、异噁唑、吡唑、吡嗪、三嗪、嘧啶、喹啉、异喹啉、吲哚、咔唑等。
“亚烷基”指具有1-约20个碳原子，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子的直链或支链二价脂族烃基。所述亚烷基可为直链、支链或环状的。任选地，所述亚烷基还可以是不饱和的和/或被一个或多个“烷基取代基”取代。任选地，可沿着所述亚烷基插入一个或多个氧原子、硫原子或者取代或未取代的氮原子(在本文中还称作“烷基氨基烷基”)，其中氮取代基是如前文所述的烷基。示例性的亚烷基包括亚甲基(-CH2-)；亚乙基(-CH2-CH2-)；亚丙基(-(CH2)3-)；亚环己基(-C6H10-)；-CH＝CH-CH＝CH-；-CH＝CH-CH2-；-(CH2)q-N(R)-(CH2)r-，其中q和r各自独立地是0-约20的整数，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，并且R是氢或低级烷基；亚甲基二氧基(-O-CH2-O-)；以及亚乙基二氧基(-O-(CH2)2-O-)。亚烷基可具有约2-约3个碳原子并且还可具有6-20个碳。
“羟基(hydroxy)”和“羟基(hydroxyl)”指-OH基团。
术语“羟基烷基”指端羟基烷基(hydroxy-terminated alkyl group)。在一些实施方案中，所述羟基烷基具有-(CH2)nOH结构。
术语“羧酸”指-C(＝O)OH基团。术语“羧酸根”指当从所述羧酸基团除去H时形成的阴离子。因此，“羧酸根”指-C(＝O)O-基团。羧酸根可与阳离子形成盐(即羧酸盐)。术语“亚烷基羧酸根”和“亚烷基羧酸”指羧酸或羧酸根基团连结至亚烷基上的一个开放的连结点而形成的一价基团(例如，-(CH2)nC(＝O)OH和-(CH2)nC(＝O)O-基团)。
本文使用的术语“酰基”指-C(＝O)R基团，其中R是如上定义的烷基或芳基。在一些实施方案中，所述酰基的R是C1-C16烷基。在一些实施方案中，所述酰基的烷基是直链烷基或烯基。在一些实施方案中，所述酰基的R是C1-C16直链烷基。
术语“磷酸基”指-P(＝O)(OH)2基团。术语“磷酸基”也包括除去所述磷酸基基团的一个或多个氢原子而形成的阴离子物质。
术语“硫醇”指具有-S-R结构的基团，其中R是烷基、酰基或芳基。术语“硫醇”还可指具有H-S-R结构的化合物，其中R是烷基、酰基或芳基。
术语“氨基”指具有-NR1R2结构的基团，其中R1和R2独立地选自H、烷基、酰基和芳基。
术语“氨基甲酰基”指-C(＝O)NH2基团。
术语“单糖”指式(CH2O)n+m的碳水化合物单体单元，其基于开链形式的具有化学结构H(CHOH)nC(＝O)(CHOH)mH的化合物，其中n+m的和是2-8的整数。因此，所述单体单元可包括丙糖、丁糖、戊糖、己糖、庚糖、壬糖以及它们的混合物。所述单糖可为所述化学结构的环化形式。因此，在一些实施方案中，所述化合物会包含半缩醛或半缩酮。在一些实施方案中，术语“单糖”指基于具有化学结构H(CHOH)nC(＝O)(CHOH)mH的化合物的环化单体单元，其中n+m是4或5。因此，单糖包括但不限于己醛糖、戊醛糖、己酮糖以及戊酮糖，例如阿拉伯糖、来苏糖、核糖、木糖、核酮糖、木酮糖、阿洛糖、阿卓糖、半乳糖、葡萄糖、古洛糖、艾杜糖、甘露糖、塔罗糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖和塔格糖。
术语“单糖类似物”指这样的单糖，其中所述单糖的一个或多个羟基被例如但不限于磷酸根、胺、硫醇或烷基的另一化学基团代替。
术语“氨基糖”指这样的单糖类似物，其中单糖的一个或多个羟基被胺代替。示例性的氨基糖是葡糖胺(即2-脱氧-2-氨基-α-D-吡喃葡萄糖)。
本文中与化合物一起使用的术语“片段”指这样的化合物，其小于完整的原始命名的化合物，其结构是所述原始命名的化合物的结构的任何意部分。因此，片段小于原始化合物，但是一般保留了所述原始化合物的部分或全部生物学活性。
“药学可接受的”指在可靠的医学判断范围内适合与人类和动物的组织接触而不引起过度的毒性、刺激、过敏反应、或者其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的那些化合物、物质、组合物和/或剂型。因此，在一些实施方案中，本文公开的化合物、物质、组合物和/或剂型对于在人类中的使用是药学可接受的。
一般而言，术语“减少”指通过例如将现有病症、疾病、紊乱或损伤的症状或作用减少或缓解至任意程度来治疗已有病症(例如水肿)的方法。
“预防”指以任何程度防止潜在的未来病症、疾病、紊乱或损伤或它们的症状出现的方法。“预防”可指减少或降低未来病症或损伤的作用从而使所述未来病症或损伤的作用与不存在所述预防行为时会发生的作用相比程度更小或持续时间更短的方法，以及指完全防止所述作用出现的方法。因此，“预防”指医学和兽医学治疗的预防方法。
术语“配体”指对生物学受体例如toll样受体具有结合亲和力的化合物。配体与受体的结合可以是可逆的或者不可逆的。在一些情况下，所述配体与受体的结合可引起生物学反应或活性(例如与该受体的活化相关的生物学活性)。可将与受体结合并且引起生物学反应的配体称作“激动剂”。可将与受体结合但是不引起或者防止生物学反应或活性的配体称作“拮抗剂”。激动剂或拮抗剂可与内源性配体竞争结合受体。激动剂和拮抗剂可为部分或完全激动剂和拮抗剂。例如，完全激动剂与受体的结合产生与内源性配体相同水平的对受体的活性，而部分激动剂的结合仅提供所述水平活性的一部分。激动剂或拮抗剂的功效可分别用例如EC50(半数最大有效浓度)或IC50(半数最大抑制浓度)来表示。
“水肿”指组织或器官内的间隙液增加。“水肿”还可指肺泡液增加。因此，在一些实施方案中，水肿与涉及内皮渗透性增加的病症相关。在一些实施方案中，所述水肿与缺血再灌注相关。
“内皮渗透性增加”指器官或组织中的血管对血液中的液体和/或蛋白质的渗透性增加，所述渗透性增加引起水肿，并可出现在许多临床情境中，例如但不限于成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、全身性炎症反应综合症(SIRS)，以及出现在各种细菌感染的情况中。
“缺血”指进入组织或器官的血流不足，其导致所述组织或器官不能满足代谢的要求。向缺血器官或组织的再灌注(血流的恢复)可导致产生过量的活性氧(ROS)和活性氮(RNS)，因此引起氧化性应激，所述氧化性应激导致一系列事件，例如线粒体氧化磷酸、ATP消耗(还发生在缺血期间或由缺血引起)化的改变、胞内钙以及导致细胞功能和/或完整性丧失的蛋白激酶、磷酸酶、蛋白酶、脂酶和核酶的活化的增加。
缺血再灌注损伤(IRI)指在经历缺血的组织中的血液循环重新开始(例如，当通过手术切除器官并重新连接时，如在移植或自体移植中)后发生的损伤。作为另外的并且非限制性的实例，在血液循环因器官移植而停止之后；心肌梗塞后用经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)、支架或搭桥治疗冠状动脉之后；以及向卒中患者给药溶栓药之后，当血液循环重新开始时也出现此类损伤。另一实例为：当向心血流因心脏手术暂时停止(常常通过同时给药心脏麻痹液)时。另一实例为当止血带在四肢上膨胀时阻断进入所述肢体的血流以使整形外科医生在无血区域进行手术。此类损伤可出现在许多组织中，例如肾、肝、肺、胰、骨骼肌、软组织(例如腱、韧带、筋膜、纤维组织、脂肪、滑膜、神经和血管)、肠以及心和脑。因此，通过本文所公开的主题治疗(例如减少或预防)的水肿可包括但不限于脑、视网膜、肝、肾、胰、脊髓、肠系膜、四肢、肠、脑、心肌、中枢神经系统、皮肤或肺的缺血再灌注、或者它们的组合。特别是可在器官移植中治疗与缺血再灌注相关的水肿。
II.一般考量
“Toll样受体”或“TLR”具有多重作用，包括在胚胎形成和病原体相关的分子模式(PAMP)的识别中的作用。参见Sioud等人，J.Mol.Biol.，364(5)，945-954(2006)；和Janssens和Beyaert，Clin.Microbiol.Rev.，16(4)，637-646(2003)。TLR是I型跨膜蛋白，它们的胞外结构域中包含重复的富含亮氨酸的模体，并且其胞质尾区包含被称作Toll/IL1受体(TIR)结构域的保守区。至少已鉴定出10种人TLR蛋白，即Toll-样受体1-10。TLR通过侦测微生物或有害的环境物质从而在早期的先天免疫中起到对入侵病原体免疫的作用。这些与Drosophila Toll基因同源的在进化上保守的受体识别由微生物病原体表达的高度保守的结构模体(即PAMP)，并且侦测由有害物质引起的组织损害或组织损伤的产物，例如dsRNA、透明质酸片段、纤连蛋白等。PAMP包括各种细菌细胞壁组分，例如脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)和脂肽以及鞭毛蛋白、细菌DNA和病毒双链RNA。因此TLR通过产生对致病生物体的产物的“先天免疫”应答保护哺乳动物免受所述致病生物体(例如病毒、细菌、寄生虫或真菌)的侵袭和组织损伤。它们还可以保护动物免受破坏细胞并且释放可与所述TLR相互作用的dsRNA或其它PAMP的有害环境物质的侵害。
所述先天免疫应答导致编码数种炎症细胞因子和趋化因子以及共刺激分子的基因增加，并且在抗原特异性适应性免疫中起作用。PAMP引起的TLR活化引起涉及多种蛋白质例如MyD88和IRAK1的信号转导级联。该信号转导级联导致转录因子NF-kB的活化，其诱导引导适应性免疫应答的促炎细胞因子(例如TNFα和IL-1β)和效应器细胞因子的分泌。所述信号转导级联还涉及衔接蛋白例如TRIF/TICAM-1，其可进行IRF-3途径的信号转导以增加I型IFN的产生、活化Stat、增加IRF-1基因表达以及活化ISRE、干扰素应答因子(IRF)元件。
TRL4是LPS识别的必要受体。另外，TLR4参与内源性配体例如热休克蛋白(HSP60和HSP70)、纤连蛋白的结构域A以及透明质酸、硫酸肝素和纤维蛋白素原的寡糖的识别。
追溯至对内毒素融合蛋白(endotoxin infusion)(参见Parker和Brigham，J.Appl.Physiol.，63(3)，1058-1062(1987))或活化补体的作用的早期研究，已在许多形式的急性肺损伤中记载了两个阶段(早期和晚期)。参见Egan 等人，J.Surg.Res.，45，204-214(1988)。本文公开的主题涉及暗示肺微血管内皮细胞上的TLR4与由缺血再灌注引起的肺水肿的早期形成相关的数据。具体而言，如下文的实施例进一步描述的，本文公开的主题表明由缺血再灌注引起的水肿出现在MyD88-/-小鼠中并且由缺血再灌注引起的水肿的出现与MAPK和NF-κB活化无关。这一证据与鼠内皮细胞中不存在TRIF途径(参见Harari等人，Circ.Res.，98(9)，1134-1140(2006))一起表明由TLR4介导的水肿的出现不依赖于TLR4介导的转录事件。本文公开的主题还涉及已知的TLR4拮抗剂CRX-526在IRI模型中预防水肿这一发现。
III.式(I)
III.A.式(I)的化合物
在一些实施方案中，本文公开的主题涉及化合物在预防或减少水肿的用途，所述水肿包括与缺血再灌注相关的水肿。在一些实施方案中，所述化合物是包含单糖类似物的脂质A模拟物。在一些实施方案中，所述单糖类似物是氨基糖。在一些实施方案中，所述氨基糖是葡糖胺。在一些实施方案中，所述化合物是氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)或其药学可接受的盐。
一般而言，AGP是合成的(即化学合成的)脂质A模拟物并且可具有式(I)或其药学可接受的盐的结构：
Figure BPA00001480505800181
其中：
n是1-6的整数；
X1是O或S；
X2是O或S；
R1、R2和R3独立地是C2-C16酰基；
R4选自H、羟基烷基、-C(＝O)NH2和-(CH2)mC(＝O)OH，其中m是0-2的整数；并且
R5、R6和R7独立地是C10-C12烷基。
一些AGP充当TLR4的激动剂，而其它AGP据报道可抑制TLR4。参见，
Figure BPA00001480505800182
J.Biol.Chem.，279(6)，4440-4449(2004)。一般而言，抑制性AGP包含至少一条少于八个碳的二级酰基链(即R1、R2或R3)。因此，在一些实施方案中，R1、R2和R3中的至少一个是-C(＝O)R8，其中R8是C1-C6烷基(即，R1、R2和R3中的至少一个是C2-C7酰基)。在一些实施方案中，R1、R2和R3中的至少两个是C2-C7酰基。在一些实施方案中，R1、R2和R3中的至少一个是-C(＝O)R8，其中R8是C5烷基。在一些实施方案中，R5、R6和R7各自是C10-C12直链、完全饱和的烷基。
在一些实施方案中，所述化合物是CRX-526，即式(I)的化合物或其药学可接受的盐，其中n是1；X1和X2各自是O；R1、R2和R3各自是-C(＝O)(CH2)4CH3；R4是-C(＝O)OH；并且R5、R6和R7各自是-(CH2)10CH3。
以前已记载了各种AGP的合成和活性。参见，例如Cluff等人，Infectionand Immunity，73(5)，3044-3052(2005)；
Figure BPA00001480505800183
J.Biol.Chem.，279(6)，4440-4449(2004)；以及其中引用的文献。还可参见S.Johnson等人的美国专利6,113,918。
式(I)的化合物具有不对称碳原子并且因此能够以对映异构体或非对映异构体存在。可基于它们的物理化学差异，通过本领域已知的方法，例如通过色谱法和/或分级结晶，将非对映异构体混合物分离成它们的单独的非对映异构体。可通过如下方式分离对映异构体：通过与适合的旋光化合物(例如醇)反应将对映异构体混合物转化成非对映异构体混合物，分离非对映异构体并且将单独的非对映异构体转化(例如水解)成对应的纯对映异构体。所有此类异构体，包括非对映异构体、对映异构体和它们的混合物，均被视作本文所公开的主题的一部分。
III.B.药学可接受的盐
本文中与本文所公开主题的化合物(例如式(I)的化合物)一起使用的表述“药学可接受的盐”包括药学可接受的阳离子盐。表述“药学可接受的阳离子盐”旨在定义但不限于盐例如碱金属盐(例如钠盐和钾盐)、碱土金属盐(例如钙盐和镁盐)、铝盐、铵盐，以及与有机胺形成的盐，例如苄星(N，N′-二苄基乙二胺)、胆碱、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)、苯乙苄胺(N-苄基苯乙胺)、乙醇胺、二乙胺、哌嗪、三乙醇胺(2-氨基-2-羟基甲基-1，3-丙二醇)以及普鲁卡因。在一些实施方案中，本文使用的术语“药学可接受的盐”指在人体中药学可接受的盐。
可通过使式(I)的化合物的游离酸形式与通常为一个或多个当量的适合的碱在共溶剂中反应来容易地制备所述化合物的药学可接受的盐。共溶剂可包括但不限于乙醚、二甘醇二甲醚和丙酮。碱可包括但不限于氢氧化钠、甲醇钠、乙醇钠、氢化钠、甲醇钾、氢氧化镁、氢氧化钙、苄星、胆碱、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪以及三乙醇胺。通过浓缩至干燥或者通过加入非溶剂分离所述盐。在许多情况下，可通过如下方式制备盐：将所述酸的溶液与所述阳离子的不同盐(例如乙基己酸钠或乙基己酸钾、油酸镁)的溶液混合并且使用如上所述的共溶剂，期望的阳离子盐从所述共溶剂中沉淀或者可通过浓缩分离。
IV.预防或减少水肿的方法
在一些实施方案中，本文公开的主题涉及治疗水肿的方法。在一些实施方案中，本发明公开的主题提供预防或减少组织水肿的方法，所述方法包括使所述组织与有效量的式(I)的化合物或其药学可接受的盐接触：
Figure BPA00001480505800201
其中：
n是1-6的整数；
X1是O或S；
X2是O或S；
R1、R2和R3独立地是C2-C16酰基；
R4选自H、羟基烷基、-C(＝O)NH2和-(CH2)mC(＝O)OH，其中m是0-2的整数；并且
R5、R6和R7独立地是C10-C12烷基。
在一些实施方案中，R1、R2和R3中的至少一个是-C(＝O)R8，其中R8是C5直链、完全饱和的烷基。在一些实施方案中，R5、R6和R7各自是C10-C12直链、完全饱和的烷基。
在一些实施方案中，n是1。在一些实施方案中，X1和X2各自是O。在一些实施方案中，R4是-C(＝O)OH。在一些实施方案中，R1、R2和R3各自是C2-C7酰基。
在一些实施方案中，所述化合物是CRX-526，即式(I)的化合物或其药学可接受的盐，其中n是1；X1和X2各自是O；R1、R2和R3各自是-C(＝O)(CH2)4CH3；R4是-C(＝O)OH；并且R5、R6和R7各自是-(CH2)10CH3。
被预防或减少的水肿可与多种不同的原因相关，包括例如肺水肿、炎症、感染、外伤(例如手术)、吸入毒素、循环障碍或暴露于高海拔。在一些实施方案中，所述水肿与内皮渗透性增加相关。在一些实施方案中，待预防或减少的水肿与可出现在如下过程中的缺血再灌注相关(例如，由其引起或与其相关)：器官移植、组织移植(例如在诸如乳房再造的整形手术中)、自体移植(例如自体组织或皮肤移植)、其它血管化的移植物或瓣(例如肌肉移植物或肌皮瓣)、肺动脉栓子切除术(从肺动脉除去凝血块)或者肺动脉内膜血栓切除术(从肺血管系统除去机化的血凝块和纤维蛋白)。在一些实施方案中，所述缺血再灌注与心肌梗塞或卒中相关。在一些实施方案中，所述缺血再灌注与心脏手术过程中的心脏麻痹(即，在有意停止心搏时，例如在通过钳闭升主动脉以中断心脏灌注时)相关或者与由矫形手术引起的骨骼肌缺血(例如，在将止血带或其它装置施加至四肢以减少手术区域的血液或者阻断血流时)相关。
在一些实施方案中，在预测的缺血事件(例如移取用于器官移植的组织、心脏麻痹、使用止血带等)前使所述组织与有效量的所述化合物接触以预防或减少在缺血或之后的再灌注过程中对所述组织的损伤。在一些实施方案中，可在缺血过程中使所述组织与所述化合物接触。在一些实施方案中，可在缺血间期后(例如在再灌注过程中)使所述组织与所述化合物接触。在一些实施方案中，可在缺血前、在缺血过程中、在缺血间期后或它们的任意组合接触所述组织。
所述组织可包括皮肤、骨、骨髓、脑、软骨、角膜、骨骼肌、心肌、心瓣膜、平滑肌、血管、四肢或指(趾)、肾或其部分、肝或其部分、心或其部分、胰或其部分、肠或其部分或者肺或其部分。在一些实施方案中，所述组织选自心、肝、肾、脑、小肠、胰、骨骼肌、皮肤和肺组织。在一些实施方案中，所述肺组织包括由肺移植供体提供的肺或其部分(例如肺叶)，其中预期将所述肺组织移植入肺移植受体。
在涉及移植的实施方案中，供体或受体可以是人或非人类哺乳动物。器官或组织移植供体(例如肺移植供体)可以是有生命的或无生命的(即尸体)。在一些实施方案中，所述供体是无心跳供体(NHBD)。在一些实施方案中，所述供体可与所述受体是同一个体(即在自体移植中)。
在一些实施方案中，当止血带膨胀引起缺血间期以为所选择的矫形手术提供无血区域时，所述组织可为骨骼肌、骨或其它软组织。在一些实施方案中，当通过压迫肝门三联体暂时阻断入肝血流时，所述组织可为接受Pringle法(Pringle maneuver)的肝脏。
预期式(I)的化合物中有许多为TLR4拮抗剂。因此，在一些实施方案中，所述化合物会是TLR4拮抗剂。在一些实施方案中，所述式(I)的化合物是TLR2拮抗剂。在一些实施方案中，所述化合物是TLR4和TLR2二者的拮抗剂。
在一些实施方案中，本文公开的主题提供预防或减少需要治疗水肿的个体中的水肿的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述个体给药有效量的式(I)的化合物或其药学可接受的盐。在一些实施方案中，在所预测的缺血事件前、在缺血过程中和/或在缺血间期后向个体给药所述化合物。可通过任何适合的途径(即口服、静脉内、肠胃外等)给药所述化合物。
在一些实施方案中，所述个体是哺乳动物。在一些实施方案中，所述个体是人。
V.在移植过程中预防或减少与缺血再灌注相关的水肿的方法
在一些实施方案中，本文公开的主题提供预防或减少器官或组织移植个体中与缺血再灌注相关的水肿的方法，所述方法包括：提供用于移植的器官或组织；使所述器官或组织与式(I)的化合物或其药学可接受的盐接触，由此提供经处理的器官或组织；将所述经处理的器官或组织移植入需要所述移植的个体中，其中所述个体中的与缺血再灌注相关的水肿与使用未经所述化合物处理的器官或组织进行移植的个体中的与缺血再灌注相关的水肿相比得到了预防或减少。
在一些实施方案中，所述器官或组织可选自但不限于肾或其部分、肝或其部分、心或其部分、视网膜、胰或其部分、肠或其部分(例如小肠或大肠组织)、骨骼肌组织、皮肤组织、软组织、肌肉组织(骨骼肌或平滑肌)、脑组织或者肺或其部分。在一些实施方案中，所述器官或组织是由肺移植供体提供的肺或其部分(例如肺叶)，其中预期将所述肺组织移植入肺移植受体。
器官或组织供体或受体可为人或非人类哺乳动物。在一些实施方案中，所述供体和受体是同一物种。在一些实施方案中，所述供体和受体是同一个体。在一些实施方案中，所述供体和受体是不同物种。因此，本文公开的主题可用作异种移植操作的一部分。
所述肺(或其它器官或组织)移植供体可以是有生命的或无生命的(即尸体)。在一些实施方案中，所述供体是无心跳供体(NHBD)。
肺移植供体与预期的肺移植受体通常是(但不一定是)相同的物种。肺供体的选择一般基于综合临床所见进行，例如：供体年龄、吸烟史、动脉血气、胸片所见、支气管镜检所见以及摘取时肺的体格检查。因为本文公开的方法可减少或预防与缺血再灌注(一般与肺移植相关)相关的水肿，所以在一些实施方案中，可考虑将功能略微受损的肺组织用于移植(即，因为在移植操作中的功能损失较少)。
可通过经任何适合的途径(即口服、静脉内、肠胃外、经气道等)给药包含所述化合物的制剂进行所述接触。所述方法还可包括从供体移获所述组织或器官的步骤。因此，所述接触可发生在移取前、移取后或者移取前和移取后。所述方法还可包括所述器官或组织的冷保存或温保存。所述接触可发生在冷保存或温保存前、冷保存或温保存过程中或者冷保存或温保存前和冷冻保存或温保存过程中。在一些实施方案中，可通过供体吸入包含所述化合物的药物制剂进行所述接触。对于NHBD或其它供体，可经气道进行所述接触。在一些实施方案中，可通过将包含所述化合物的制剂给药至离体灌注回路的肺动脉中或经肺静脉逆行进行所述接触。在一些实施方案中，所述接触可发生在用于在从供体摘除后灌注器官的离体灌注回路或设备中。在一些实施方案中，所述接触可发生在用于灌注肺和使肺通气的离体通气/灌注回路或设备中。
在一些实施方案中，所述式(I)的化合物是TLR2和TLR4之一或二者的拮抗剂。在一些实施方案中，所述化合物是TLR2和LR4二者的拮抗剂。
VI.药物组合物
本文使用的术语“活性化合物”可指式(I)的化合物和它们的药学可接受的盐。可通过任何适合的方法使所述活性化合物与所述组织接触。本文使用的术语“有效量”指能够抑制本文所述的各种病症和后遗症的一种或多种活性化合物的量。术语“抑制(inhibit)”或“抑制(inhibiting)”指阻止、预防、治疗、缓解、改善、停止、抑制、减少、减缓或逆转病症的进展或者降低其严重性，所述病症例如但不限于与具有水肿风险的个体的组织损伤(例如肺组织)相关或由其引起的病症。因此，本文公开的给药活性化合物的方法包括医学治疗性(急性)和/或预防性(预防)给药，视情况而定。
当然，所给药活性化合物的量和时间取决于被治疗的个体、疾患的严重性、给药方式以及处方医生的判断。因此，由于个体间的差异，下文给出的剂量为指导性的并且医生可逐步增加所述化合物的剂量以达到医生认为适合个体的治疗。在考虑期望的治疗程度时，医生可均衡多种因素，例如个体的年龄、已有疾病的存在以及其它疾病的存在。可将药物制剂配制成用于下文更为详细描述的口服、静脉内或气雾剂给药。
其用途属于本文所述实施方案范围内的任何特定活性化合物的治疗有效剂量可在某种程度上随化合物和个体而变化，并且可视个体的病症和给药途径而定。作为一般性建议，约0.1-约50mg/kg的剂量可具有治疗功效，其中所有重量基于所述活性化合物的重量计算，包括使用盐的情况。较高水平下的毒性问题可将静脉内剂量限制于较低水平，例如至多约10mg/kg，其中所述重量基于所述活性碱的重量计算，包括使用盐的情况。约10mg/kg-约50mg/kg的剂量可用于口服给药。通常，约0.5mg/kg-5mg/kg的剂量可用于肌内注射。在一些实施方案中，对于静脉内或口服给药，剂量可为约1-μmol/kg-约50μmol/kg，或任选地为约22μmol/kg-约33μmol/kg所述化合物。
本文描述的体外和体内测定提供了可以比较化合物活性的方法。这些比较的结果可用于确定在包括人在内的哺乳动物中用于预防水肿的剂量水平。此类测定提供式(I)的化合物和包括其它TLR4和/或TLR2配体在内的其它化合物的活性的比较。这些比较的结果可用于确定此类剂量水平。
根据本文公开的方法，可将本文描述的药学活性化合物以固体或液体形式口服给药，或者可肌内、静脉内给药，或者以溶液剂、混悬剂或乳剂形式吸入给药。在一些实施方案中，还可将所述化合物或盐以脂质体混悬剂形式通过吸入、静脉内或肌内给药。当通过吸入给药时，所述活性化合物或盐可为粒径约0.5-约5微米、任选约1-约2微米的多个固体颗粒或液滴的形式。在一些实施方案中，可在纳米颗粒递送载体中给药所述活性化合物。
所述药物制剂可包含在任意药学可接受的载体中的本文所述活性化合物或其药学可接受的盐。如果需要溶液剂，对于水溶性化合物或盐而言，水可作为载体选择。对于水溶性化合物或盐而言，有机载体例如甘油、丙二醇、聚乙二醇或它们的混合物可以是适合的。在后者的情况中，所述有机载体可包含大量的水。在两者中任一情况下，可接着以本领域技术人员已知的适合的方法，通常利用通过0.22微米滤器过滤，将所述溶液剂灭菌。灭菌后可将所述溶液剂分装入适合的容器中，例如去热原的玻璃小瓶。任选地，可通过无菌方法进行所述分装。然后可将灭菌的塞子置于所述小瓶上，并且视需要可将小瓶内容物冻干。
除了所述活性化合物或它们的盐(例如式(I)的化合物)之外，所述药物制剂还可包含其他添加剂，例如pH调节剂。具体而言，可用的pH调节剂包括酸例如盐酸、碱或缓冲剂例如乳酸钠、醋酸钠、磷酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠或葡糖酸钠。另外，所述制剂可包含抗菌防腐剂。可用的抗菌防腐剂包括尼泊金甲酯、尼泊金丙酯和苯甲醇。当将所述制剂置于设计成用于多剂量用途的小瓶中时，通常使用所述抗菌防腐剂。可使用本领域公知的技术将本文所述的药物制剂冻干。
对于口服给药，药物组合物可采取溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂等形式。包含各种赋形剂例如柠檬酸钠、碳酸钙和磷酸钙的片剂可与各种崩解剂例如淀粉(例如土豆或木薯淀粉)和某些复合硅酸盐，以及粘合剂例如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明胶和阿拉伯胶一起使用。另外，诸如硬脂酸镁、十二烷基基硫酸钠和滑石的润滑剂通常对于压片非常有用。相似类型的固体组合物还可用作软胶囊和硬胶囊内的填充物。与此相关的物质还包括乳糖或乳糖以及高分子量聚乙二醇。当需要水性混悬剂和/或酏剂用于口服给药时，可将本文所公开主题的化合物与各种甜味剂、调味剂、着色剂、乳化剂和/或助悬剂以及稀释剂诸如水、乙醇、丙二醇、甘油及其各种类似组合混合。
在本文所述主题的另一实施方案中，提供了可注射的稳定无菌制剂，其为在密封容器内的单位剂型的形式，所述制剂包含本文所述化合物或其盐。以冻干物的形式提供所述化合物或盐，可用适合的药学可接受的载体将所述冻干物复溶(reconstitute)以形成适合将其注射入个体的液体制剂。当所述化合物或盐基本为水不溶性时，可以足量使用生理学可接受的足量的乳化剂，以在水性载体中将所述化合物或盐乳化。特别有用的乳化剂包括磷脂酰胆碱和卵磷脂。
本文提供的另外的实施方案包括本文所述活性化合物的脂质体制剂。形成脂质体混悬剂的技术为本领域公知。当所述化合物是水溶性盐时，可使用常规的脂质体技术将其包封入脂质囊泡中。在此类情况下，由于所述活性化合物的水溶性，可将活性化合物基本包封在脂质体的亲水中心或核心内。所使用的脂质层可以是任何常规组成，并且可包含胆固醇或者可不包含胆固醇。当感兴趣的活性化合物为水不溶性时，同样可使用常规的脂质体形成技术将所述盐基本包封在形成所述脂质体的结构的疏水脂质双层中。在两种情况中任一种中，如通过使用标准超声技术和均化技术可减小制备的脂质体的大小。可将包含本文公开的活性化合物的脂质体制剂冻干以制备冻干物，可用诸如水的药学可接受的载体将所述冻干物复溶以重新形成脂质体混悬剂。
还提供适用于作为气雾剂通过吸入给药的药物制剂。这些制剂包含本文所述的期望化合物或其盐的溶液或悬浮液、或者所述化合物或盐的多个固体颗粒。可将所述期望的制剂置于小室中并喷雾。可通过压缩气体或通过超声能量实现喷雾以形成包含所述化合物或盐的多个液滴或固体颗粒。所述液滴或固体颗粒的粒径应为约0.5-约10微米，任选约0.5-约5微米。可通过本领域已知的任何方法例如通过微粉化加工所述固体化合物或其盐来获得所述固体颗粒。任选地，所述固体颗粒或液滴的大小可以为约1-约2微米。在此方面，可使用可商购的喷雾器实现这一目的。可按照美国专利5,628,984(其公开全部通过援引加入本文)中所述的方法，通过可吸入颗粒的气雾混悬剂给药所述化合物。
当适于以气雾剂形式给药的药物制剂是液体形式时，所述制剂可包含在含有水的载体中的水溶性活性化合物。可存在表面活性剂，当进行雾化时，其降低所述制剂的表面张力使得足以形成在期望大小范围内的液滴。
如本文所示，提供水溶性和水不溶性的活性化合物。本文使用的术语“水溶性”旨在定义以约50mg/mL或更大的量在水中可溶的任何组合物。而且，本文使用的术语“水不溶性”旨在定义在水中的溶解度低于约20mg/mL的任何组合物。在一些实施方案中可能需要水溶性的化合物或盐，
然而在其它实施方案中同样可能需要水不溶性的化合物或盐。
在一种给药方式中，可在存在缺血风险的手术前(例如在诸如心脏手术或移植手术的术前24小时内)、手术过程中和/或手术后(例如术后二十四小时内)给药本文所公开主题的化合物。在另一给药方式中，在手术前以起始负荷剂量(例如推注或输注)给药所述活性化合物，然后在手术前、手术过程中和手术后以恒量输注给药所述活性化合物。可长期内以每日给药的方式给药所述活性化合物。
用一定量的活性成分制备各种药物组合物的方法是已知的，或者，鉴于本公开，可由本领域技术人员确定。制备药物组合物的方法的实例可参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easter，Pa.，第16版(1980)。本文所公开主题的药物组合物可包含例如0.0001％-95％的一种或多种所述活性化合物。在任何情况下，待给药的所述组合物或制剂可包含有效治疗被治疗个体的疾病/病症的量的一种或多种活性化合物。
在一些实施方案中，本文所公开主题的方法可用于预防或减少与体外组织或器官内或者从组织或器官供体移植入移植受体的组织或器官内的缺血再灌注相关的水肿。体外组织或器官是不在个体中的组织或器官(还称作离体)。对于组织和器官移植，所移取的供体组织和器官在获取时、转移中和移植入受体后也会经历缺血再灌注。本文公开的方法可用于通过例如添入用于维持或保存可移植组织或器官的溶液来提高可移植组织或器官的功能。例如，所述方法和组合物可用于在运输过程中浸泡所述可移植的组织或器官，或者在移植前、移植过程中或移植后与所述可移植的组织或器官接触。在一些实施方案中，可在组织或器官存在于供体中时使本文所公开主题的制剂与所述器官或组织接触。
本文所公开主题的溶液可用于灌注装置中(例如离体灌注回路)。本文使用的灌注装置是用于以包含化合物或组合物的溶液注入特定器官或体循环的任何机械装置。此类装置可包含一个或多个贮库。所述装置可包括延伸自所述贮库并且可插入器官、静脉或动脉的管、导管或插管。所述装置可为具有电泵和用于控制溶液的温度、递送溶液的速度或体积的装置的机电装置。在某些实施方案中，所述装置是程序化的以便以适合具体临床情况、器官重量或器官大小(例如心肺旁路手术对比肾移植对比肝移植)的温度、速度或体积递送一种或多种溶液。因此，在一些实施方案中，本文公开的主题涉及用于离体器官或组织的保存液。在一些实施方案中，所述保存液包含式(I)的化合物。在一些实施方案中，所述式(I)的化合物是CRX-526。在一些实施方案中，所述化合物是TLR2和LR4二者的拮抗剂。
VII.个体
在一些实施方案中，期望地是，本文所公开主题中被治疗的个体是人类个体，然而应理解本文所述方法对于术语“个体”所要包括的所有脊椎动物物种均有效。本文所述方法在水肿的治疗和/或预防中特别有用，例如但不限于温血脊椎动物中与缺血再灌注相关的水肿。因此，所述方法可用作哺乳动物和鸟类的治疗。在一些实施方案中，本文所公开方法的个体是器官移植受体。
更具体而言，本文提供对哺乳动物的治疗，例如人类以及由于濒临灭绝而具有重要性(例如东北虎)的、具有经济价值的(农场中饲养的用于人类消费的动物)和/或对人具有社会价值的(作为宠物饲养或动物园中的动物)那些哺乳动物，例如除人之外的食肉动物(例如猫和狗)、猪(猪(pig)、肉猪(hog)和野猪)、反刍动物(例如牛(cattle)、牛(oxen)、绵羊、长颈鹿、鹿、养、野牛和骆驼)以及马。本文还提供鸟类的治疗，其包括对如下种类的鸟类的治疗：濒临灭绝的鸟类，饲养在动物园中或作为宠物的鸟类，以及家禽(fowl)，更具体地为家养禽，即家禽(poultry)，例如火鸡、鸡、鸭、鹅、珠鸡等，因为它们也对人类具有经济价值。因此，本文所述方法的实施例包括家畜的治疗，其包括但不限于家猪(猪(pig)和肉猪(hog))、反刍动物、马、家禽等。
实施例
以下实施例提供示例性的实施方案。根据本文公开的内容和本领域技术的一般水平，本领域技术人员能够理解以下实施例仅为示例性的，并且可进行多种变化、修改和改变而不偏离本文所公开主题的范围。
实施例1
通用方法
雄性C3H/HeJ、C3H/OuJ、TLR4-/-和C57BL/6J小鼠购自JacksonLaboratories(Bar Harbor，Maine，United States of America)，MyD88-/-小鼠由Dr.Shizuo Akira(Osaka University，Osaka，Japan)提供。另参见Adachi，O.等 人，Immunity，9，143-150(1998)。将小鼠饲养在无病原体的设施中直到它们的体重达到25-30克并且为8-10周龄。除非指明，试剂均购自Sigma(St.Louis，Missouri，United States of America)。
鼠肺IRI的手术模型和屏障功能评价
通过腹膜内注射氯胺酮(0.1mg/gm体重)和赛拉嗪(0.01mg/gm)将小鼠麻醉，然后每小时给药三分之一的起始剂量。行气管切开术使能够用Columbus Instruments Ventilator CIV-101(Columbus Instruments，Columbus，Ohio，United States of America)进行机械通气(潮气量0.4mL、呼吸速率120/min、I/E 0.4、PEEP 3cm H2O、FiO2，1.0)。行右颈静脉插管用于通过注射泵(Medfusion 2010i；Medex，Carlsbad，California，United States ofAmerica)以450μL/小时输注在0.9％盐水中的2.5％白蛋白以维持水合。监测直肠温度并且用加热垫维持。经左胸廓切开术用微血管钳阻断左肺门1小时。除去血管钳开始再灌注。在15分钟至三小时的间隔通过心切除术处死动物并且切除双肺。将每一只肺的肺尖部分切除并且立即称重，然后在60℃烘箱内干燥48小时并且重新称重以测定湿/干重比(W/D)。将剩余的肺组织在液氮中快速冷冻并且-80℃保存。将处死后立刻切除的肺用作对照。
用伊文思蓝染料(EBD)测定血管外白蛋白渗出
通过已记载的EBD技术测定1小时IRI后的血管外白蛋白渗出。参见Saria等人，J.Neurosci Methods，8(1)，41-49(1983)。阻断左肺门后，将溶解于250μL 0.9％盐水溶液的30mg/kg EBD注射入右颈静脉。再灌注1小时后，行正中胸骨切开术开胸，通过右心室切开术对小鼠实施安乐死，将18号血管导管插入肺动脉干并且将左心耳切断。用生理盐水冲洗双肺以除去血管外EBD，将其切除并称重。将肺组织悬浮在甲酰胺中(100mg肺组织/1mL甲酰胺，Roche Diagnostics，Indianapolis，Indiana，United States ofAmerica)并且于50℃温育24小时。然后将样品离心(13,000g x 30分钟)，并将50μL上清液置于96孔板中用于在μQuant分光光度计(Bio-TekInstruments，Inc.，Winooski，Vermont，United States of America)中于620nm进行比色法评估。用样品重量将相对光密度值标准化。
用于组织学的膨胀固定
60或180分钟的IRI(n＝4只/品系/组)后，于室温下在25cm H2O的恒压下用4％缓冲的低聚甲醛经气管将肺组织块膨胀固定24小时，然后包埋在石蜡中。用苏木精和伊红将五微米的切片染色。将在气管切开术后立即处死的动物(n＝4只/品系)的肺用作对照。
NF-κB易位的免疫染色
用1∶100稀释的兔多克隆p65抗体(ab 31481；Abcam plc，Cambridge，United Kingdom)进行膨胀固定的肺组织的免疫组织化学染色。将样品切成5μm切片，干燥过夜并且于60℃烘烤一小时。将切片脱蜡并用6.0pH CitraAntigen Retrieval Buffer(Dakocytomation，Carpinteria，California，UnitedStates of America)于100℃进行表位修复30min。用过氧化物酶阻断剂、无血蛋白阻断剂和抗生物素蛋白/生物素阻断剂(Dakocytomation，Carpinteria，California，United States of America)封闭背景。于4℃将切片与一抗p65温育过夜。用LSAB+二抗和用于显色的DAB发色团(Dakocytomation，Carpinteria，California，United States of America)一起完成检测。未进行复染色。由对样品组设盲的病理学家对玻片的p65核染色进行评分并且分级为1+(轻度，部分细胞核染色明显)、2+(中度，部分深染色，但是不一致)或3+(基本所有的细胞核具有一致的深染色)。
蛋白质印迹和光密度测定
按照以前的记载进行蛋白质浓度测定和免疫印迹。参见Wu等人，Respir Res，6(1)，26(2005)。简而言之，将冷冻的肺组织悬浮在10μl/mg冰冷RIPA裂解缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.0、100mM NaCl、5mM NaF、2mM EDTA、1％NP-40、1mM Na3VO4、100μM TPCK、1μM胃蛋白酶抑制剂A、2μM亮肽素、1mM PMSF、100μM槲皮素)中，Dounce匀浆，并且于4℃以13,200rpm离心10分钟以除去不溶性物质。使用CoomassieProtein Assay Reagent(Pierce Biotechnology，Rockford，Illinois，United Statesof America)测定上清液的蛋白质浓度。加入β-巯基乙醇(5％)和示踪染料后，使样品变性，并且通过SDS-PAGE(10％tris-甘氨酸或4％-12％bis-tris凝胶；Invitrogen，Carlsbad，California，United States of America)分离(resolve)等量的蛋白质并且转移至Immobilon-P膜(Millipore Corp.，Billerica，Massachusetts，United States of America)。将斑点在具有0.1％Tween-20和5％脱脂奶粉的TBS中封闭1小时，与一抗温育然后和二抗温育，然后进行过氧化物酶的化学发光检测(Millipore Corp.，Billerica，Massachusetts，UnitedStates of America)。抗磷酸化的或总JNK、p38、ERK和IκBα的抗体购自Cell Signaling Technology(Beverly，Massachusetts，United States of America)。在Epson Precision 4180平板式扫描仪(Epson America，Inc.，Long Beach，California，United States of America)上在16比特灰度以600dpi扫描膜。用METAMORPH
Figure BPA00001480505800311
软件(MDS Analytical Technologies，Inc.，Sunnyvale，California，United States of America)进行光密度测定。
骨髓移植(BMT)
使用已记载的操作通过BMT产生嵌合小鼠。参见Schwaller等人，EmboJ，17(18)，5321-5333(1998)。将受体小鼠暴露于以间隔4小时的2个剂量(700cGy，然后500cGy)递送的12Gy的致死辐射(Gammacell 40137 Cs γ-辐射源；Nordion，Ottawa，Canada)。通过用培养基(Roswell Park Memorial Institute(RPMI)缓冲液+10％胎牛血清(FBS)+100单位肝素+1M HEPES)冲洗供体它们的股骨和胫骨获得骨髓。使收获的髓细胞通过0.2μM滤器，计数并且重悬至在200μL无菌PBS+10％FBS中106个细胞的浓度。然后，在受体接受了第二个剂量的γ-辐射后立即将髓细胞眶后注射入受体。将受体小鼠在无菌的微隔离饲养笼内饲养12周以实现完全的体液重建。
生成了四组嵌合体以产生具有在实质细胞(P)或髓系细胞(M)上的功能性TLR4(+)的小鼠。HeJ小鼠具有从OuJ供体(P-M+)重建的骨髓；而OuJ小鼠具有从HeJ小鼠(P+M-)重建的骨髓。通过从相同的品系(P-M-)和(P+M+)重建骨髓产生“对照”嵌合体。
测定细胞培养试验的活力
在平行三份进行的独立试验中，使HMVEC在进行了模拟IRI的p35培养皿上生长至汇合。在相同时间点，根据生产商的说明使用CytoTox96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega，Madison，Wisconsin，UnitedStates of America)评价细胞和细胞培养基或林格乳酸盐以测定乳酸脱氢酶(LDH)活性。除实验模型外，还在时间0和24小时时取对照样品以评价细胞活力。将培养基和林格乳酸盐用作背景对照，用来将来自其它样品的吸光值标准化。将细胞毒性计算为培养基的LDH活性除以总LDH活性(细胞团加培养基)。细胞活力是倒数并且表示为每一时间点的活力百分数。
支气管肺泡灌洗(BAL)和肺泡巨噬细胞(AM)细胞培养
BMT后120天通过BAL从HeJ和OuJ小鼠收获AM。将特制的18号导管(Becton Dickinson，Sandy，Utah，United States of America)插入气管。通过经气管缓慢递送4等份(35Lx克体重)具有0.2mM EGTA的预热的、无菌、无内毒素、无钙且无镁的PBS进行BLA。通过温和的抽吸吸出灌洗液，将每只小鼠的灌洗液合并，并且以250g离心5分钟。将细胞重悬于包含10％热灭活FBS(Atlanta Biologicals，Lawrenceville，GA)、青霉素G(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)的RPMI 1640中(Gibco BRL，Rockville，Maryland，United States of America)。经台盼蓝排斥测定，细胞活力一致＞95％。以20000个每孔将细胞接种至96-孔板。培养2小时后，用PBS洗板以除去未粘附的细胞。在具有5％CO2的加湿培养箱中于37℃在RPMI1640中培养粘附的AM。
NF-κB受体测定
制备重组第一代E1，E3-缺陷型血清5型腺病毒载体(参见Sanlioglu等 人，J.Biol.Chem.，276，30188-30198(2001))，并且按照以前对上皮细胞的记载转染HMVEC和AM。参见Wu等人，Respir.Res.，6，26(2005)。
统计学分析
所有数据均报告为平均值±SEM。通过使用STATISTICA
Figure BPA00001480505800321
(StatSoft，Inc.，Tulsa，Oklahoma，United States of America)用Tukey事后检验或者通过配对或非配对t检验进行方差分析来比较各组。
实施例2
TLR4介导与缺血再灌注相关的肺水肿
通过比较TLR4充足(OuJ)小鼠和TLR4缺陷(HeJ)小鼠的肺中的缺血后液体蓄积研究TLR4对缺血再灌注相关肺水肿的影响。如图1A所示，在再灌注的15分钟内，通过1小时肺门钳闭造成缺血的左肺的再灌注在OuJ小鼠的左肺中诱导早期、明显的液体蓄积(表现为W/D升高)，该蓄积持续3小时的再灌注。相反，HeJ小鼠在15和30分钟再灌注后经历了显著较轻的水肿并且表现出较早的恢复。HeJ小鼠的W/D在1小时和3小时再灌注后均正常。
另外，如图1B所示，与HeJ小鼠的肺相比，来自再灌注3小时的OuJ小鼠的膨胀固定的左肺中存在更多的血管周水肿和肺泡壁水肿。但是如图1C所示，1小时再灌注后，小鼠品系之间的间质水肿无组织学差异。经被设盲的观察者判断，再灌注3小时后的四个HeJ样品和一小时后研究的所有八个肺样品均正常并且与四个对照样品(2个HeJ和2个OuJ)无差异。不愿受到任何理论的约束，假定再灌注3小时后OuJ肺中间质水肿增加归因于快速肺泡淹溺(alveolar flooding)，其由于再灌注后60分钟的膨胀固定变得不可被检测。与该假设一致，OuJ小鼠的左肺与HeJ小鼠的左肺以及这两个品系的右肺相比，其EBD含量增加(微血管对白蛋白渗透性的量度(参见Saria等人，J Neurosci Methods，8(1)，41-49(1983)))。参见图1D。因此，W/D的差异表现为归因于与HeJ小鼠相比在OuJ小鼠中早期出现的肺泡淹溺，以及之后液体被吸收进入肺泡壁和间质。
受体活化的TLR4信号转导下游涉及衔接蛋白的募集，其包括骨髓分化因子初次应答基因88(MyD88)和诱导含TIR结构域的衔接蛋白的干扰素-β(TRIF)。参见O’Neill等人，Nat Rev Immunol，7(5)，353-364(2007)。由于TRIF不存在于鼠内皮细胞(参见Harari等人，Circ Res，98(9)，1134-1140(2006))，所以MyD88信号转导是这些细胞中TLR4的关键衔接蛋白下游。当使MyD88-缺陷(MyD88-/-)小鼠经历1小时的I RI时，MyD88-/-小鼠的肺中形成了与MyD88-/-小鼠的背景品系OuJ小鼠和C57BL/6J小鼠肺中相当的水肿。参见图1E。因此，由缺血再灌注引起的TLR4-介导的肺水肿表现出不依赖于通过MyD88衔接蛋白的下游信号转导。为了验证早期水肿是由TLR4所引起，在TLR4-/-小鼠中重复所述试验并且与TLR4-/-小鼠的背景品系C57BL/6J小鼠比较。一小时肺门钳闭并且再灌注15、30和60分钟后，TLR4-/-小鼠形成比C57BL/6J小鼠显著更轻的水肿。如图1F所示，在C57BL/67小鼠中水肿快速出现(再灌注约5分钟内)，而在TLR4-/-小鼠中则不然。
实施例3
TLR4介导由肺IRI引起的早期MAPK和NF-κB活化
蛋白质浓度测定表明，除了在肺缺血后的早期水肿形成中起作用，功能性TLR4还介导与炎症相关的信号转导途径的早期活化。如图2A和2B所示，OuJ小鼠中的功能性TLR4在再灌注后引起p38的早期磷酸化(在缺血过程中观察到)、ERK和JN的早期磷酸化以及NF-κB的早期活化。相比而言，TLR4-缺陷HeJ小鼠表现出延迟的或减少的p38、ERK、NF-κB和JNK活化。但是，在HeJ小鼠中观察到一定程度的MAPK和NF-κB活化，表明涉及非TLR4的替代活化途径。
如图3所示，NF-κB的p65组分的免疫染色表明对照(刚刚处死的)小鼠的肺中的细胞核定位最少，而与TLR4-缺陷(HeJ)小鼠(其中染色为1-2+级)相比，在来自TLR4-充足(OuJ)小鼠的60min再灌注样品中观察到显著的细胞核染色(其中染色为3+级)。免疫染色强度补充了在图2A和2B中观察到的IκBα降解，除了尽管在180min再灌注时OuJ动物中p65染色更强但是在180min再灌注时HeJ和OuJ品系中IκBα水平表现得相当。这表明再灌注后180min OuJ小鼠中的IκBα蛋白质的部分恢复。令人惊讶的是，右肺和左肺的p65染色相同，表明尽管右肺无水肿，但是在相同的再灌注时间下NF-κB在右(不缺血)肺中被活化得程度相同。因此，NF-κB活化表现出不一定与水肿形成相关。再灌注后3小时HeJ小鼠左肺的p38活化明显，W/D正常。与形成的迅速一起考虑，这一模型中的急性期肺水肿表现出不是由MAPK或NF-κB活化引起的。
实施例4
肺实质细胞和衍生自骨髓的细胞上的TLR4的比较
为了测定肺实质细胞上的功能性TLR4相对于衍生自骨髓的细胞特别是肺泡巨噬细胞(AM)上的功能性TLR4的重要性，如实施例1所述，通过以致死剂量辐射每一品系(OuJ和HeJ)的小鼠并且通过骨髓移植(BMT)重建骨髓产生嵌合小鼠。如图4A所示，脂多糖(LPS)刺激导致自然OuJ AM和回收自嵌合品系P-M+(具有表达TLR4的衍生自骨髓的细胞和不表达TLR4的实质细胞的嵌合体)的AM中荧光素酶活性的约60倍增加。因此，嵌合动物中的AM替换在BMT后12周基本完全。回收自用相同品系的骨髓重建的受辐射小鼠的AM具有相同的表现。
3小时的缺血再灌注后，P+M-嵌合动物表现出W/D显著增加。参见图4B。但是，即使AM具有功能性TLR4(P-M+)，W/D也未升高。因此，仅当功能性TLR4存在于肺实质细胞(P)上时才出现明显的水肿，不论功能性TLR4是否存在于髓系细胞(M)上。虽然AM上的功能性TLR4不足以形成水肿，但是在肺实质细胞上具有功能性TLR4的小鼠中它可能会放大水肿，因为观察到P+M+动物的W/D略高于P+M-动物。但是，这一差异不是统计学显著的。
如图4C所示，与未辐射品系相比，嵌合对照(OuJ嵌合入OuJ和HeJ嵌合入HeJ)未显示出肺水肿形成方面的差异，这表明致死的辐射对缺血再灌注引起的水肿的形成没有影响。来自这些“对照嵌合体”的AM对LPS的响应与来自自然品系的AM相同(数据未显示)。
因此，由缺血再灌注引起的早期水肿归因于肺实质细胞上的功能性TLR4，但是髓系细胞上的TLR4对于早期的缺血再灌注相关水肿不是关键性的。本文公开的数据表明缺血再灌注诱导的肺水肿是由再灌注后极早期的毛细血管渗漏增加引起的。
实施例5
TLR4的竞争性抑制剂预防缺血再灌注引起的肺水肿
从左肺门钳闭前60分钟开始在30分钟内向OuJ小鼠静脉内给药竞争性TLR4抑制剂CRX-526(10μg在200μL盐水中)预防了缺血1小时的再灌注后的水肿。参见图5A。CRX-526还阻止暴露于LPS的培养的人肺微血管内皮细胞(HMVEC)中的NF-κB活化。参见图5B。所述TLR4抑制剂表现出对NF-κB活化的TNF刺激没有影响。
实施例6
TLR2和缺血再灌注
通过比较在C57BL/6J(BL6)背景品系上繁育的TLR2-缺陷(TLR2-/-)小鼠在肺门阻塞1小时并且再灌注后的W/D与TLR2-充足BL6小鼠的W/D，研究了功能性TLR2对缺血再灌注相关水肿的作用。如图6所示，由于IRI，TLR2-/-小鼠形成水肿，但是水肿的形成晚于BL6小鼠。15分钟的再灌注后，TLR2-/-小鼠左肺的W/D正常，而BL/6小鼠的W/D升高。
进行了进一步的研究以比较用TLR4抑制剂进行预治疗的作用。从1小时的左肺门钳闭之前60分钟时开始在30分钟的时间内给药CRX-526(10μg)来预治疗BL6小鼠。在长达180min的再灌注中，这些小鼠中形成了即使有也是很少的水肿。参见图7A和7B。CRX-526治疗表现出产生与TLR4和TLR2缺陷的相加作用相似的W/D，再灌注30和60min后更是如此。如图8所示，在转染的HMVEC中的研究表明CRX-526可降低由TLR2配体刺激的NF-κB活化。
总而言之，本文公开的数据表明CRX-526在减少缺血再灌注相关水肿方面的作用不仅仅归因于其抑制TLR4的能力。
本领域技术人员会理解可改变本文所公开主题的各种细节而不偏离本文所公开主题的范围。而且，前文的描述仅用于举例说明并且不具有限制性。

Claims (58)

1.预防或减少组织水肿的方法，所述方法包括使所述组织与有效量的式(I)的化合物或其药学可接受的盐接触：
Figure FPA00001480505700011
其中：
n是1-6的整数；
X1是O或S；
X2是O或S；
R1、R2和R3独立地是C2-C16酰基，其中R1、R2和R3中的至少一个是C2-C7酰基；
R4选自H、羟基烷基、-C(＝O)NH2和-(CH2)mC(＝O)OH，其中m是0-2的整数；并且
R5、R6和R7独立地是C10-C12烷基。
2.权利要求1的方法，其中n是1。
3.权利要求1的方法，其中X1和X2各自是O。
4.权利要求1的方法，其中R4是-C(＝O)OH。
5.权利要求1的方法，其中R1、R2和R3各自是C2-C7酰基。
6.权利要求1的方法，其中所述式(I)的化合物是如下化合物或其药学可接受的盐，其中：
n是1；
X1是O；
X2是O；
R1、R2和R3各自是-C(＝O)(CH2)4CH3；
R4是-C(＝O)OH；以及
R5、R6和R7各自是-(CH2)10CH3。
7.权利要求1的方法，其中所述水肿与缺血再灌注相关。
8.权利要求7的方法，其中所述缺血再灌注与心肌梗塞或卒中相关。
9.权利要求7的方法，其中所述缺血再灌注与心脏手术过程中的心脏麻痹相关或者与由矫形手术引起的骨骼肌中的缺血相关。
10.权利要求7的方法，其中所述缺血再灌注与器官或组织移植相关。
11.权利要求10的方法，其中所述组织移植是皮肤移植、肌肉移植或软组织移植。
12.权利要求11的方法，其中所述组织移植是自体组织移植。
13.权利要求7的方法，其中所述组织与有效量的所述化合物的接触发生在缺血前、缺血过程中或缺血间期后。
14.权利要求1的方法，其中所述组织选自心、肝、肾、脑、小肠、大肠、胰、骨骼肌、皮肤、软组织和肺组织。
15.权利要求14的方法，其中所述组织来自器官供体。
16.权利要求15的方法，其中所述组织是来自肺移植供体的肺组织。
17.权利要求16的方法，其中所述肺移植供体是人类肺移植供体。
18.权利要求15的方法，其中所述器官供体是无心跳供体。
19.权利要求1的方法，其中所述化合物是Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)之一或二者的拮抗剂。
20.权利要求19的方法，其中所述化合物是TLR2和TLR4二者的拮抗剂。
21.预防或减少需要治疗水肿的个体中的水肿的方法，所述方法包括向所述个体给药有效量的式(I)的化合物或其药学可接受的盐：
Figure FPA00001480505700031
其中：
n是1-6的整数；
X1是O或S；
X2是O或S；
R1、R2和R3独立地是C2-C16酰基，其中R1、R2和R3中的至少一个是C2-C7酰基；
R4选自H、羟基烷基、-C(＝O)NH2和-(CH2)mC(＝O)OH，其中m是0-2的整数；并且
R5、R6和R7独立地是C10-C12烷基。
22.权利要求21的方法，其中n是1。
23.权利要求21的方法，其中X1和X2各自是O。
24.权利要求21的方法，其中R4是-C(＝O)OH。
25.权利要求21的方法，其中R1、R2和R3各自是C2-C7酰基。
26.权利要求21的方法，其中所述式(I)的化合物是如下化合物或其药学可接受的盐，其中：
n是1；
X1是O；
X2是O；
R1、R2和R3各自是-C(＝O)(CH2)4CH3；
R4是-C(＝O)OH；以及
R5、R6和R7各自是-(CH2)10CH3。
27.权利要求21的方法，其中所述水肿与缺血再灌注相关。
28.权利要求27的方法，其中所述缺血再灌注与心肌梗塞或卒中相关。
29.权利要求27的方法，其中所述缺血再灌注与心脏手术过程中的心脏麻痹相关或者与由矫形手术引起的骨骼肌中的缺血相关。
30.权利要求27的方法，其中所述缺血再灌注与器官或组织移植相关。
31.权利要求30的方法，所述组织移植是皮肤移植、肌肉移植或软组织移植之一。
32.权利要求31的方法，其中所述组织移植是自体组织移植。
33.权利要求27的方法，其中在所预测的缺血事件前、缺血过程中或缺血间期后向所述个体给药所述化合物。
34.权利要求21的方法，其中所述化合物是Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)之一或二者的拮抗剂。
35.权利要求34的方法，其中所述化合物是TLR2和TLR4二者的拮抗剂。
36.预防或减少器官或组织移植个体中与缺血再灌注相关的水肿的方法，所述方法包括：
提供用于移植的器官或组织；
使所述器官或组织与式(I)化合物或其药学可接受的盐接触，由此提供经处理的器官或组织：
Figure FPA00001480505700051
其中：
n是1-6的整数；
X1是O或S；
X2是O或S；
R1、R2和R3独立地是C2-C16酰基，其中R1、R2和R3中的至少一个是C2-C7酰基；
R4选自H、羟基烷基、-C(＝O)NH2和-(CH2)mC(＝O)OH，其中m是0-2的整数；并且
R5、R6和R7独立地是C10-C12烷基；以及
将所述经处理的器官或组织移植入需要所述移植的个体中，其中所述个体中的与缺血再灌注相关的水肿与使用未经所述化合物处理的器官或组织进行移植的个体中的与缺血再灌注相关的水肿相比得到了预防或减少。
37.权利要求36的方法，其中所述器官或组织选自心或心组织、肝或肝组织、肾或肾组织、胰或胰组织、小肠组织、大肠组织、皮肤组织、骨骼肌组织、软组织、肺或肺组织以及脑组织。
38.权利要求37的方法，其中所述器官或组织是肺或肺组织。
39.权利要求38的方法，其中通过肺组织供体的气道、离体灌注回路的肺静脉和肺动脉中的一种进行所述接触。
40.权利要求37的方法，其中所述组织是皮肤组织、骨骼肌组织或软组织。
41.权利要求40的方法，其中所述组织移植是自体组织移植。
42.权利要求36的方法，其中所述器官或组织来自无心跳器官供体。
43.权利要求36的方法，其中所述化合物是Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)之一或二者的拮抗剂。
44.权利要求43的方法，其中所述化合物是TLR2和TLR4二者的拮抗剂。
45.权利要求36的方法，其中n是1。
46.权利要求36的方法，其中X1和X2各自是O。
47.权利要求36的方法，其中R4是-C(＝O)OH。
48.权利要求36的方法，其中R1、R2和R3各自是C2-C7酰基。
49.权利要求36的方法，其中所述化合物是式(I)的氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯或其药学可接受的盐，其中：
n是1；
X1是O；
X2是O；
R1、R2和R3各自是-C(＝O)(CH2)4CH3；
R4是-C(＝O)OH；并且
R5、R6和R7各自是-(CH2)10CH3。
50.用于处理离体器官或器官组织的保存液，其包含式(I)的化合物或其药学可接受的盐：
Figure FPA00001480505700071
其中：
n是1-6的整数；
X1是O或S；
X2是O或S；
R1、R2和R3独立地是C2-C16酰基，其中R1、R2和R3中的至少一个是C2-C7酰基；
R4选自H、羟基烷基、-C(＝O)NH2和-(CH2)mC(＝O)OH，其中m是0-2的整数；并且
R5、R6和R7独立地是C10-C12烷基。
51.权利要求50的保存液，其中n是1。
52.权利要求50的保存液，其中X1和X2各自是O。
53.权利要求50的保存液，其中R4是-C(＝O)OH。
54.权利要求50的保存液，其中R1、R2和R3各自是C2-C7酰基。
55.权利要求50的保存液，其中所述式(I)的化合物是如下化合物或其药学可接受的盐，其中：
n是1；
X1是O；
X2是O；
R1、R2和R3各自是-C(＝O)(CH2)4CH3；
R4是-C(＝O)OH；并且
R5、R6和R7各自是-(CH2)10CH3。
56.权利要求50的保存液，其中所述化合物是Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)之一或二者的拮抗剂。
57.权利要求56的保存液，其中所述化合物是TLR2和TLR4二者的拮抗剂。
58.权利要求50的保存液，其中所述离体器官或组织是肺或其部分。
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Application publication date: 20120516

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