CN114980904A - 硫酸乙酰肝素(hs)低聚糖在肝缺血再灌注损伤中的影响 - Google Patents
硫酸乙酰肝素(hs)低聚糖在肝缺血再灌注损伤中的影响 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114980904A CN114980904A CN202080092829.2A CN202080092829A CN114980904A CN 114980904 A CN114980904 A CN 114980904A CN 202080092829 A CN202080092829 A CN 202080092829A CN 114980904 A CN114980904 A CN 114980904A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- alkyl
- mer
- aryl
- compounds
- substituted
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
- A61K31/727—Heparin; Heparan
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
Abstract
公开了一种治疗受试者中肝缺血再灌注(I/R)损伤的方法。在一些方面,该方法包括提供患有肝I/R损伤或有患肝I/R损伤风险的受试者;和向受试者给予一种或多种硫酸乙酰肝素(HS)化合物。在一些方面,一种或多种HS化合物包含约5至约18个糖单元,可选地约12至约18个糖单元。在一些方面,一种或多种HS化合物包含约12个糖单元。
Description
相关申请的引用
本申请要求2019年11月13日提交的美国临时专利申请序列号62//934,845的权益,其通过引用整体并入本文。
联邦支持声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的授权号HL094463、HL144970、GM128484和HL142604下在政府支持下完成的。政府享有本发明中的某些权利。
技术领域
本文公开的主题总体上涉及用于治疗肝缺血再灌注(I/R)损伤的方法和组合物。更具体地,本文公开了硫酸乙酰肝素低聚糖化合物,以及使用其治疗肝缺血再灌注(I/R)损伤的方法。
背景技术
肝缺血再灌注(IR)损伤是肝移植和肝肿瘤切除术期间手术的主要并发症[1]。肝脏手术通常需要使用Pringle手法来减少失血,但以潜在的IR损伤为代价[2]。初始损伤从缺血期开始,其中血液流向组织被破坏,导致缺少氧和营养物质流动。当血流恢复到组织时,它会为缺血组织重新建立氧气和营养物质。然而,这实际上通过诱导血栓炎症增强了初始缺血性损伤,其特征是止血和炎症的紊乱[1]。目前,没有批准的药物来防止由IR损伤引起的肝损伤。
血栓形成和炎症传统上被视为独立的过程。然而,越来越多的证据支持血栓形成与炎症刺激和相互增强之间的关系,这被统称为血栓炎症[3]。血栓炎症在IR损伤[3]、败血症[4]和创伤[5]中很明显。对内皮的损害是血栓炎症发病机制的核心。通过在细胞表面呈递蛋白聚糖,内皮作为循环系统的抗粘连屏障。这些蛋白聚糖上的硫酸乙酰肝素(HS)链可以与抗凝血酶III结合并抑制凝血因子FXa和凝血酶。内皮在血栓炎性病情中失去了这种抗粘连和抗凝血屏障。此外,组织因子位于内皮下方并在血管壁损伤期间暴露,它可以作为外源性凝血途径和后续凝血酶生成的有效激活剂[3]。此外,IR损伤导致缺氧细胞释放高迁移率组框1(HMGB1)[6]。HMGB1已被证明通过肝脏IR后晚期糖基化终产物(RAGE)激活的受体募集中性粒细胞[7]。中性粒细胞募集和浸润通过释放包括髓过氧化物酶(MPO)在内的蛋白酶导致进一步的细胞死亡[8]。严重血栓炎症可以延伸到主要受影响的组织之外并导致多器官系统衰竭[3]。减轻血栓炎症程度的治疗对于改善患者预后是非常可取的[9]。
发明内容
本发明内容部分列出了本公开主题的多个实施方式,并且在许多情况下列出了这些实施方式的变型和排列。本概述仅仅是众多和变化的实施方式的示例。提及给定实施方式的一个或多个代表性特征同样是示例性的。这样的实施方式通常可以存在或不存在所提到的特征;同样,无论是否在本概述中列出,这些特征可以应用于当前公开主题的其它实施方式。为避免过度重复,本概要未列出或建议此类特征的所有可能组合。
根据本公开主题提供了治疗受试者中肝缺血再灌注(I/R)损伤的方法。在一些实施方式中,该方法包括提供患有肝I/R损伤或有患肝I/R损伤风险的受试者;和向该受试者给予一种或多种硫酸乙酰肝素(HS)化合物。在一些实施方式中,给予在受试者中提供抗炎和/或抗凝血活性。在一些实施方式中,一种或多种HS化合物包含约5至约18个糖单元,可选地约12至约18个糖单元。在一些实施方式中,一种或多种HS化合物包含约12个糖单元。在一些实施方式中,一种或多种HS化合物中的至少一种结合HMGB1。
在一些实施方式中,一种或多种HS化合物包含下式:
其中R1为–NHSO3H或–NHCOCH3,R2为-H、烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或官能柄并且n为0-6的整数。
在一些实施方式中,一种或多种HS化合物包含以下结构:
其中R1为–SO3H或–COCH3并且R2为-H、烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或官能柄。
在一些实施方式中,一种或多种HS化合物包含以下结构:
其中R1为–SO3H或–COCH3并且R2为-H、烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或官能柄。
在一些实施方式中,一种或多种HS化合物包含下式:
其中R为-H、烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或官能柄。
在一些实施方式中,一种或多种HS化合物包含下式:
其中R1为–SO3H或–H并且R2为-H、烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或官能柄。
在一些实施方式中,一种或多种HS化合物存在于非抗凝肝素和低分子量肝素中并且包含以下结构式之一:
在一些实施方式中,一种或多种HS化合物包含下式:
其中R为-H、烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或官能柄;并且其中R1和n定义如下:
在实施方式1中,R1=H,n=1;
在实施方式2中,R1=H,n=2;
在实施方式3(OSO3H)和4(OH)中,
在实施方式5(OSO3H)和6(OH)中,
在一些实施方式中,一种或多种HS化合物包含下式:
其中R为-H、烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或官能柄。
在一些实施方式中,需要治疗的受试者是哺乳动物受试者。在一些实施方式中,一种或多种HS化合物作为药物组合物的一部分给予。在一些实施方式中,药物组合物包含HS化合物和用于给予所述HS化合物的药学上可接受的载体或佐剂。
在一些实施方式中,给予包括给予两种或更多种HS化合物,可选其中两种或更多种HS化合物分别但同时给予,可选其中两种或更多种HS化合物在不同时间给予,可选其中两种或更多种HS化合物在单一组合物中给予。
根据本公开主题提供了硫酸乙酰肝素(HS)化合物。在一些实施方式中,作为用于治疗受试者中肝缺血再灌注(I/R)损伤的组合物提供了一种或多种HS化合物。在一些实施方式中,所述组合物包含:一种或多种硫酸乙酰肝素(HS)化合物,可选地其中一种或多种HS化合物包含约5至约18个糖单元,可选地约12至约18个糖单元,进一步可选地其中所述一种或更多种HS化合物包含约12个糖单元。在一些实施方式中,向受试者给予组合物在受试者中提供抗炎和/或抗凝血活性。
在一些实施方式中,一种或多种HS化合物包含下式:
其中R1为–NHSO3H或–NHCOCH3,R2为-H、烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或官能柄,并且n为0-6的整数。
在一些实施方式中,一种或多种HS化合物包含以下结构:
其中R1为–SO3H或–COCH3并且R2为-H、烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或官能柄。
在一些实施方式中,一种或多种HS化合物包含以下结构:
其中R1为–SO3H或–COCH3并且R2为-H、烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或官能柄。
在一些实施方式中,一种或多种HS化合物包含下式:
其中R为-H、烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或官能柄。
在一些实施方式中,一种或多种HS化合物包含下式:
其中R1为–SO3H或–H并且R2为-H、烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或官能柄。
在一些实施方式中,一种或多种HS化合物存在于非抗凝肝素和低分子量肝素中并且包含以下结构式之一:
在一些实施方式中,一种或多种HS化合物包含下式:
其中R为-H、烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或官能柄;并且其中R1和n定义如下:
在实施方式1中,R1=H,n=1;
在实施方式2中,R1=H,n=2;
在实施方式3(OSO3H)和4(OH)中,
在实施方式5(OSO3H)和6(OH)中,
在一些实施方式中,一种或多种HS化合物包含下式:
其中R为-H、烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或官能柄。
在一些实施方式中,其中一种或多种HS化合物结合HMGB1。在一些实施方式中,需要治疗的受试者是哺乳动物受试者。在一些实施方式中,组合物包含用于给予一种或多种HS化合物的药学上可接受的载体或佐剂。在一些实施方式中,组合物包含两种或更多种HS化合物。
因此,本公开主题的一个目的是提供用于治疗肝缺血再灌注(I/R)损伤的方法和组合物。通过本公开主题全部或部分地实现了这个和其它目的。此外,本公开主题的目的已经在上面阐述,在研究了以下描述、附图和实施例之后,本公开主题的其它目的和优点对于本领域技术人员将变得显而易见。
附图说明
通过参考以下附图可以更好地理解本公开的主题。附图并非旨在限制本公开主题的范围,而仅仅是为了阐明和举例说明本公开的主题。
图1A至图1F显示了肝脏IR增加肝损伤标志物的小鼠模型。图1A是肝脏IR模型的图解时间线。图1B是显示血浆ALT浓度的条形图。P=0.0083。图1C是显示通过H&E染色确定并使用100x图像的原始放大率量化的肝坏死面积百分比的条形图。P=0.0077。图ID是显示通过200倍放大图像的免疫组织化学染色定量的嗜中性粒细胞浸润到缺血叶的条形图。P=0.0018。图IE是显示血浆HMGB1浓度的条形图。P=0.0129。图1F是显示血浆多配体蛋白聚糖-1浓度的条形图。P=0.0170。数据代表平均值±SEM。假饲(Sham)n=4-5,IR n=4-8。通过学生t检验,*P<0.05且**P<0.01。
图2A至图2C显示,HMGB1与高度硫酸化的12-聚体结合。图2A说明了通过化学酶合成制备的12-聚体结构。图2B是条形图,显示了以磺达肝素为阳性对照的12-聚体的体外FXa活性确定。图2C是一组图像,显示了使用生物素化的12-聚体从肝裂解物中下拉HMGB1的免疫印迹(Western)分析。
图3A和图3B显示了使用12-聚体-1和12-聚体-3在IR后的体内抗凝血和肝损伤确定。用12-聚体-1或12-聚体-3给予,从接受了假饲或IR手术的小鼠测量血浆FXa活性(图3A)和ALT(图3B)。与IR相比,12-聚体-l显著降低了FXa活性(12-聚体-l对IR,P=0.0057)和ALT(假饲对IR,P=0.0233;12-聚体-l对IR,P=0.0480;12-聚体-3对IR,P=0.6200)。数据代表平均值±SEM。所有组的N=5-6。通过单向ANOVA,然后是Dunnett检验,*P<0.05和**P<0.01。
图4A至图4E显示,在肝IR后,12-聚体-1减少了缺血叶中的肝坏死面积。图4A.通过H&E染色确定并使用100x图像的原始放大倍数进行量化的肝坏死面积百分比。假饲对IR,P=0.0078;12-聚体-l对IR,P=0.0287;12-聚体-3对IR,P=0.1059。数据代表平均值±SEM。假饲n=3,IR n=4,12-聚体-l n=6,且12-聚体-3n=5。对比IR通过单向ANOVA,然后是Dunnett检验(新复极差法检验),*P<0.05且**P<0.01。图4B-图4E.H&E染色的肝组织的代表性图像。100x放大。200μm比例尺。
图5A至图5F显示,12-聚体-1减少了缺血肝脏中的中性粒细胞积聚。图5A.在假饲或缺血性肝裂解物中测量的MPO活性。假饲对IR,P=0.0121;12-聚体-1对IR,P=0.0229。图5B.每个100x视野的平均中性粒细胞定量。假饲对IR,P=0.0248;12-聚体-1对IR,P=0.0142;12-聚体-3对IR,P=0.0705。数据代表平均值±SEM。假饲n=6,IR n=3-4,12-聚体-1n=4-6,12-聚体-3n=6。单向ANOVA,然后是Dunnett检验,*P<0.05。图5C-图5F.中性粒细胞免疫组织化学染色的肝组织的代表性图像。200x放大。200μm比例尺。粉红色箭头指示染色的中性粒细胞。
图6A至图6D显示,HMGB1结合和抗凝对于肝脏保护是必需的。图6A.6-聚体-AXa结构示意图。图2A图例适用。图6B.以12-聚体-3和12-聚体-1作为阳性对照,使用生物素化的6-聚体-AXa来自肝裂解物的HMGB1下拉的免疫印迹分析。图6C.给予12-聚体-3+6-聚体-AXa或单独的6-聚体-Axa,从接受假饲或IR手术的小鼠测量血浆FXa活性。IR对12-聚体-3+6-聚体-AXa,P=0.0089;IR对6-聚体-AXa,P=0.0252。图6D.血浆ALT。IR对假饲,P=0.0026;IR对12-聚体-3+6-聚体-AXa,P=0.0086。数据代表平均值±SEM。假饲n=4,IR n=3-5,12-聚体-3+6-聚体-AXa n=6,6-聚体-AXa n=6。
图7A和7B显示了使用低聚糖从HMGB1下拉得到的完整蛋白质印迹图像。图7A.样品输入。泳道1:12-聚体-4;泳道2:12-聚体-2;泳道3:12-聚体-3;泳道4:12-聚体-1。图7B.样品洗脱。泳道5:12-聚体-4;泳道6:12-聚体-2;泳道7:12-聚体-3;泳道8:12-聚体-1。
图8A和图8B显示了使用12-聚体-1和6-聚体-AXa低聚糖从HMGB1下拉得到的完整蛋白质印迹图像。图8A.样品输入。泳道1:12-聚体-3;泳道2:12-聚体-1;泳道3:6-聚体-AXa。图8B.样品洗脱。泳道4:12-聚体-3;泳道5:12-聚体-1;泳道6:6-聚体-AXa。
图9是本公开主题的代表性HS抗凝剂(AXa)8-18-聚体结构的结构式。12-聚体-1(也称为12-聚体AXa(n=3))在肝缺血再灌注小鼠模型中具有保护作用。R如所示定义并且还可以定义为-H、烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或官能柄。
图10是本公开主题的代表性HS非抗凝剂16-18-聚体结构的结构式。这些结构是非抗凝剂。18-聚体(n=6),用于肝IR,结构包括R1=H且R2=苯基,其中X=硝基(对硝基苯基),例如官能柄。R2也可以定义为-H、烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基。
图11A至图11F显示,图10的18-聚体减少了肝缺血再灌注后的损伤。图11A.IR手术的实验设计。图11B.图表显示了在假饲、IR和18-聚体处理的IR小鼠中测量的血浆ALT水平。与IR相比,18-聚体显著降低了ALT水平。数据代表平均值±SEM。假饲的n=5,IR和18-聚体的n=7。单向ANOVA和Dunnett事后检验。*P<0.05,**P<0.01。图11C.图表显示了来自H&E染色的缺血性肝叶的坏死区域的量化;图11D-图11F.用苏木精和伊红(H&E)染色的肝组织的表示图像,用于定量坏死。原始放大倍数100x,比例尺200μm。
图12A-图12D是一组显示图7的18-聚体降低炎症标志物的图表。图12A.与IR相比,通过ELISA测量的血浆HMGB1水平在18-聚体处理组中降低。图12B.通过免疫组织化学测量的中性粒细胞浸润在18-聚体处理组中降低。图12C.通过ELISA测量的血浆IL-6水平在18-聚体处理组中降低。图12D.虽然没有统计学显著性。在18-聚体处理组中,TNF-α血浆水平趋于下降。
图13是显示12-聚体的化学酶合成的示意图。
具体实施方式
现在将在下文更全面地描述本公开的主题,其中描述了本公开主题的一些但不是全部实施方式。实际上,本公开的主题可以以许多不同的形式来体现,并且不应被解释为限于本文阐述的实施方式;相反,提供这些实施方式以便使本公开满足适用的法律要求。
硫酸乙酰肝素(HS)在结构上与抗凝药物肝素相似。HS和肝素包含连接到带有磺基的氨基葡萄糖残基的葡萄糖醛酸(GlcA)或艾杜糖醛酸(IdoA)的二糖重复单元[10]。肝素比HS具有更高的硫酸化和更多的IdoA残基。使用肝素和低分子量肝素(LMWH)治疗如脓毒症和IR等血栓炎性疾病的临床研究对其效果尚无定论[11,12]。肝素及其衍生物是复杂的、结构上无特征的低聚糖混合物,含有变化的链长和化学修饰。结构异质性使得很难确定低聚糖结构与其生物学功能的关系。此外,缺乏结构均一的HS低聚糖阻碍了利用HS的特性作为治疗剂的努力[13]。为了解决这个问题,已经开发了一种高效合成结构特异性HS低聚糖的化学酶方法[14-16]。根据本公开主题的特定方面,证明了具有抗凝活性和抗炎活性(例如结合HMGB1)的某些低聚糖,与仅与HMGB1结合或仅具有抗凝活性的低聚糖相比,在减少IR-介导的肝损伤方面更有效。通过使用合成的HS低聚糖,而不是肝素或LMWH,低聚糖的保肝作用可以是卓越的(distinguished)。
HS是一种在细胞表面和细胞外基质中含量丰富的硫酸化糖胺聚糖,具有多种生物活性,包括抗凝和抗炎。肝缺血再灌注损伤与凝血和炎症反应有关。根据本公开的主题,合成了具有确定的硫酸化模式的HS低聚糖,并且表明,合成的抗凝剂HS低聚糖可限制小鼠模型中的肝缺血再灌注损伤。根据本公开主题的特定方面,使用小型靶向的HS文库,证明了具有抗凝活性和对HMGB1具有结合亲和力(一种炎症靶)的低聚糖,与仅与HMGB1结合或仅具有抗凝活性的低聚糖相比,更能降低损伤。本公开的HS低聚糖为减少因缺血再灌注损伤引起的肝损伤提供了一种新的治疗选项。
通过阐述而非限制的方式,在本公开主题的一些实施方式中,本文公开的HS化合物的保肝作用涉及对尺寸和/或硫酸化模式的考虑。在一个非限制性实例中,具有提供抗凝活性和抗炎活性的硫酸化模式的12-聚体低聚糖提供了保肝作用。在另一个非限制性实例中,当与具有硫酸化模式抗凝活性的6-聚体一起给予时,具有提供抗炎活性的硫酸化模式的12-聚体低聚糖提供了保肝作用。在另一个非限制性实例中,具有非抗凝且提供抗炎活性的硫酸化模式的18-聚体HS低聚糖提供了肝保护。
在本公开主题的一些实施方式中,显示了硫酸乙酰肝素(HS)12-聚体,其可以减少由缺血再灌注损伤引起的肝损伤。本公开主题减少了用于肝移植和手术的损伤肝细胞的炎症反应。在一些实施方式中,HS合物包含约5至约18个糖单元,包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个糖单元。也在图中公开了代表性的HS化合物。在一些实施方式中,HS化合物被-H、烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基取代。在一些实施方式中,HS化合物被官能柄取代。
I.定义
本文使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的,并不旨在限制本公开的主题。
尽管相信本领域普通技术人员很好地理解以下术语,但提出以下定义以便于解释本公开的主题。
除非下文另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语旨在具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。对本文所用技术的引用意在指本领域中通常理解的技术,包括对本领域技术人员显而易见的对那些技术的变型或等效技术的替代。尽管相信以下术语被本领域普通技术人员很好地理解,但提出以下定义以便于解释本公开的主题。
在描述本公开的主题时,应当理解公开了许多技术和步骤。这些中的每一个都具有单独的益处,并且每一个也可以与其它公开的技术中的一个或多个或在某些情况下全部结合使用。
因此,为了清楚起见,本描述将避免以不必要的方式重复各个步骤的每个可能的组合。然而,在阅读说明书和权利要求时应该理解这样的组合完全在本发明和权利要求的范围内。
遵循长期存在的专利法惯例,术语“一(a)”、“一(an)”和“该/所述(the)”在本申请(包括权利要求)中使用时指的是“一个或多个”。因此,例如,对“一个细胞”的引用包括多个这样的细胞等。
除非另有说明,否则在说明书和权利要求书中使用的表达成分的量、反应条件等的数字都应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此,除非有相反的说明,否则本说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是近似值,其可以根据本公开主题寻求获得的所需特性而变化。
如本文所用,术语“约”在指组合物、质量、重量、温度、时间、体积、浓度、百分比等的值或量时,意在涵盖在一些实施方式中为指定量±20%的变化,在一些实施方式中为±10%,在一些实施方式中为±5%,在一些实施方式中为±1%,在一些实施方式中为±0.5%,且在一些实施方式中为±0.1%,因为这样的变化适合于执行公开的方法或使用公开的组合物。
术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义,是包括性的或开放式的,并且不排除附加的、未列举的要素或方法步骤。“包含”是在权利要求语言中使用的技术术语,其意味着所命名的要素是必不可少的,但可以添加其它要素并且仍然形成权利要求范围内的构造。
如本文所用,短语“由……组成”不包括权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。当短语“由……组成”出现在权利要求正文的一个条款中而不是紧跟在前序之后时,它仅限制了该条款中阐述的要素;并未从整个权利要求中排除其它要素。
如本文所用,短语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤,以及不实质影响要求保护的主题的基本和新颖特征的那些材料和步骤。
关于术语“包含”、“由……组成”和“基本上由……组成”,在本文使用这三个术语之一的情况下,本公开和要求保护的主题可以包括使用其它两个术语中的任一个。
如本文所用,术语“烷基”是指包括C1-20在内的线性(即“直链”)、支链或环状的饱和或至少部分且在一些情况下完全不饱和(即烯基和炔基)的烃链,包括例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、辛基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、辛烯基、丁二烯基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基和丙二烯基。“支链”是指其中低级烷基(如甲基、乙基或丙基)附接到线性烷基链上的烷基。“低级烷基”是指具有1至约8个碳原子的烷基(即C1-8烷基),例如1、2、3、4、5、6、7或8个碳原子。“高级烷基”是指具有约10至约20个碳原子的烷基,例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子。在某些实施方式中,“烷基”特别是指C1-8直链烷基。在其它实施方式中,“烷基”特别是指C1-8支链烷基。
烷基可以可选地被一个或多个烷基取代基取代(“取代的烷基”),所述烷基取代基可以相同或不同。术语“烷基取代基”包括但不限于烷基、取代的烷基、卤素、硝基、氨基、芳基氨基、酰基、羟基、芳氧基、烷氧基、烷硫基、芳硫基、芳烷基、芳烷氧基、芳烷硫基、羧基、烷氧基羰基、氧代和环烷基。可以可选地沿着烷基链插入一个或多个氧、硫或取代或未取代的氮原子,其中氮取代基是氢、低级烷基(在本文中也称为“烷基氨基烷基”)或芳基。
因此,如本文所用,术语“取代的烷基”包括如本文所定义的烷基,其中烷基的一个或多个原子或官能团被另一原子或官能团取代,包括例如烷基、取代的烷基、卤素、芳基、取代的芳基、烷氧基、羟基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硫酸酯和巯基。
术语“芳基”在本文中用于指芳族取代基,其可以是单个芳环,或稠合在一起、共价连接的或连接到共同基团(例如但不限于亚甲基或亚乙基部分)的多个芳环。常见的连接基团也可以是羰基(如二苯甲酮中)或氧(如二苯醚中)或氮(如二苯胺中)。术语“芳基”具体涵盖杂环芳族化合物。芳环可以包含苯基、萘基、联苯、二苯醚、二苯胺和二苯甲酮等。在具体实施方式中,术语“芳基”是指包含约5至约10个碳原子(例如5、6、7、8、9或10个碳原子)并且包括5-和6-元烃和杂环芳环的环状芳烃。
芳基可以可选地被一个或多个芳基取代基取代(“取代的芳基”),所述芳基取代基可以相同或不同,其中“芳基取代基”包括烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、羧基、酰基、卤素、硝基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、芳烷氧基羰基、酰氧基、酰氨基、芳酰基氨基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、芳硫基、烷硫基、亚烷基和–NR'R”,其中R'和R”可以各自独立地为氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基和芳烷基。
因此,如本文所用,术语“取代的芳基”包括如本文所定义的芳基,其中芳基的一个或多个原子或官能团被另一原子或官能团取代,包括例如烷基、取代的烷基、卤素、芳基、取代的芳基、烷氧基、羟基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硫酸酯和巯基。
芳基的具体实例包括但不限于环戊二烯基、苯基、呋喃、噻吩、吡咯、吡喃、吡啶、咪唑、苯并咪唑、异噻唑、异恶唑、吡唑、吡嗪、三嗪、嘧啶、喹啉、异喹啉、吲哚、咔唑等。
术语“芳烷基”是指-烷基-芳基,可选地其中所述烷基和/或芳基包含一个或多个烷基或芳基取代基。
在一些实施方式中,术语“二价”是指可以键合(例如共价键合)或键合至两个其它基团的基团,例如其它烷基、芳烷基、环烷基或芳基。通常,二价基团上的两个不同位点(例如两个不同的原子)可以与其它分子上的基团键合。例如,二价基团可以是亚烷基。
“亚烷基”可以指具有1至约20个碳原子(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子)的直链或支链二价脂肪烃基。亚烷基可以是直链的、支链的或环状的。亚烷基还可以可选地是不饱和的和/或被一个或多个“烷基取代基”取代。可以沿着亚烷基可选地插入一个或多个氧、硫或取代或未取代的氮原子(在本文中也称为“烷基氨基烷基”),其中氮取代基是如前所述的烷基。示例性的亚烷基包括亚甲基(–CH2–);亚乙基(–CH2-CH2–);亚丙基(–(CH2)3–);亚环己基(–C6H10–);–CH=CH—CH=CH–;–CH=CH–CH2–;–(CH2)q–N(R)–(CH2)r–,其中q和r各自独立地为0至约20的整数,例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20,并且R是氢或低级烷基;亚甲二氧基(–O–CH2–O–);和亚乙二氧基(–O–(CH2)2–O–)。亚烷基可以具有约2至约3个碳原子并且可以进一步具有6-20个碳。
“亚芳基”是指二价芳基。
“官能柄”用于指代促进化学酶合成的化学基团。在一些实施方式中,官能柄具有或不具有UV吸收和/或结合或不结合C18-柱。在一些实施方式中,官能柄也可以称为可检测标签。在一些实施方式中,官能柄包含如本文定义的烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基,例如对硝基苯基。
如本文所用,术语“和/或”当在实体列表的上下文中使用时,是指单独或组合存在的实体。因此,例如,短语“A、B、C和/或D”单独地包括的A、B、C和D,但也包括A、B、C和D的任何和所有组合和子组合。
II.化合物、组合物和方法
本公开的主题提供了HS化合物和包含其的组合物,包括包含如本文所公开的HS化合物的药物和/或治疗性组合物。在一些实施方式中,药物组合物可包含一种或多种如本文所公开的HS化合物。还公开了用所述HS化合物治疗受试者的方法。
在一些实施方式中,本公开的主题提供了一种硫酸乙酰肝素(HS)化合物。在一些实施方式中,本公开的主题提供了一种组合物,诸如药物组合物,其包含一种或多种本文公开的HS化合物。因此,在一些实施方式中,HS化合物作为药物组合物的一部分给予。在一些实施方式中,药物组合物包含一种或多种HS化合物和用于给予一种或多种HS化合物的药学上可接受的载体或佐剂。在一些实施方式中,提供了一种治疗受试者中肝缺血再灌注(I/R)损伤的方法。在一些实施方式中,该方法包括提供患有肝I/R损伤或有患肝I/R损伤风险的受试者;和向受试者给予一种或多种如本文公开的HS化合物。在一些实施方式中,一种或多种HS化合物具有基于提供抗炎和/或抗凝血活性的糖单元的硫酸化模式和/或尺寸,向受试者给予组合物在受试者中提供抗炎和/或抗凝血活性。
在一些实施方式中,HS化合物包含约5至约18个糖单元,可选地约12至约18个糖单元。在一些实施方式中,HS化合物包含约12个糖单元。在一些实施方式中,HS化合物结合HMGB1。在一些实施方式中,HS化合物是12-聚体-1、12-聚体-2、12-聚体-3或12-聚体-4,示意性地显示在图2A中。在一些实施方式中,HS化合物是6-聚体-AXa(在本文中示意性地显示在图6A中)。在一些实施方式中,HS化合物是如图10所示并且如实施例中所讨论的18-聚体。实施例中提供了具有基于糖单元的变化的硫酸化模式和尺寸的HS化合物的代表性合成路线。实施例中也提供了筛选抗炎活性和抗凝血活性的方法。
通过阐述而非限制的方式,在本公开主题的一些实施方式中,本文公开的HS化合物的保肝作用涉及对尺寸和/或硫酸化模式的考虑。在一个非限制性实例中,具有提供抗凝活性和抗炎活性的硫酸化模式的12-聚体低聚糖提供了保肝作用。在一些实施方式中,具有相同或相似硫酸化模式的11-聚体或13-聚体应该表现相似。在另一个非限制性实例中,当与具有提供抗凝活性的硫酸化模式的6-聚体一起给予时,具有提供抗炎活性的硫酸化模式的12-聚体低聚糖提供了保肝作用。此处同样,具有相同或相似硫酸化模式的11-聚体或13-聚体应该表现相似。在另一个非限制性实例中,在本文公开的尺寸范围的较大端的HS化合物,例如具有非抗凝剂且提供抗炎活性的硫酸化模式的18-聚体HS低聚糖提供了肝保护。
本公开的主题减少了用于肝移植和手术的损伤肝细胞的炎症反应。在一些实施方式中,HS化合物包含约5至约18个糖单元,包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个糖单元。图中也公开代表性的HS化合物。在一些实施方式中,HS化合物被-H、烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基取代。在一些实施方式中,HS化合物被官能柄取代。
在一些实施方式中,证明了抗炎(例如通过HMGB1抑制)和抗凝活性在IR模型中提供了保护。这些活性可以来自一个分子(例如,HS化合物在本文中称为12-聚体-1或12-聚体AXa)或来自两个分子的组合剂量(例如,HS化合物在本文中称为6-聚体-AXa(在图6A中示意性地示出)+12-聚体NS2S6S(在本文中也称为12-聚体-3)。因此,在一些实施方式中,提供了一种联合治疗,包含给予一种或多种HS化合物,该化合物具有基于糖单元数量的硫酸化模式和尺寸,其向有需要的受试者提供抗炎(例如通过HMGB1抑制)和抗凝活性,例如患有肝I/R损伤或有患肝I/R损伤风险的受试者。包括实施例在内的本文公开了评估抗炎和抗凝活性的方法以及与之相关的HS化合物结构,包括基于糖单元数量的硫酸化模式和尺寸。在一些实施方式中,联合治疗包含给予6-聚体-AXa+12-聚体NS2S6S(在本文中也称为12-聚体-3)。
在一些实施方式中,当给予两种或更多种HS化合物时,两种或更多种HS化合物单独但同时给予。在一些实施方式中,两种或更多种HS化合物在不同时间给予但彼此足够接近以具有期望的治疗效果。在一些实施方式中,两种或更多种HS化合物在单一组合物或配方中给予。
在一些实施方式中,HS化合物包含下式:
其中R1为–NHSO3H或–NHCOCH3,R2为-H、烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或官能柄,并且n为0-6的整数。
在一些实施方式中,HS化合物包含以下结构:
其中R1为–SO3H或–COCH3并且R2为-H、烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或官能柄。
在一些实施方式中,HS化合物包含以下结构:
其中R1为–SO3H或–COCH3并且R2为-H、烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或官能柄。
在一些实施方式中,HS化合物包含下式:
其中R为-H、烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或官能柄。
在一些实施方式中,HS化合物包含下式:
其中R1为–SO3H或–H并且R2为-H、烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或官能柄。
在一些实施方式中,HS化合物是存在于非抗凝肝素和低分子量肝素中的HS分子,并且包含以下结构式之一:
在一些实施方式中,本公开的主题提供了一种HS化合物,其包含5-聚体、6-聚体或7-聚体。在一个实例中,6-聚体是在本文中称为6-聚体-AXa的HS化合物(在本文中示意性地显示在图6A中)。在一些实施方式中,HS化合物包含下式:
其中R为-H、烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或官能柄;并且其中R1和n定义如下:
在实施方式1中,R1=H,n=1;
在实施方式2中,R1=H,n=2;
在实施方式3(OSO3H)和4(OH)中,
在实施方式5(OSO3H)和6(OH)中,
在一些实施方式中,所述官能柄包含如本文定义的烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基,例如对硝基苯基。在一个实例中,6-聚体是在本文中称为6-聚体-AXa的HS化合物(在本文中示意性地显示在图6A中)。在一些实施方式中,HS化合物包含式
其中R为-H、烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或官能柄。
参考图9,呈现的是本公开主题的代表性HS抗凝剂(AXa)8-18-聚体结构的结构式。12-聚体AXa(n=3)在肝缺血再灌注小鼠模型中具有保护作用。R如所示定义并且还可以定义为-H、烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或官能柄。在一些实施方式中,此类HS化合物具有基于提供抗炎和/或抗凝活性的糖单元的硫酸化模式和/或尺寸,向受试者给予组合物可在受试者中提供抗炎和/或抗凝活性.
参考图10,呈现的是本公开主题的代表性HS非抗凝剂16-18-聚体结构的结构式。这些结构是非抗凝的。18-聚体(n=6),用于肝IR,结构包括R1=H且R2=苯基,X=硝基(对硝基苯基),例如官能柄。R2也可以定义为-H、烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基。因此,在另一个非限制性实例中,在本文公开的尺寸范围的较大端的HS化合物具有为非抗凝剂且提供抗炎活性以提供肝保护的硫酸化模式。
在一些实施方式中,药物组合物还可以含有药学上可接受的载体或佐剂。在一些实施方式中,载体是药学上可接受用于人类的。载体或佐剂理想地本身不应诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体并且不应是有毒的。合适的载体可以是较大的、缓慢代谢的大分子,例如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和无活性的病毒颗粒。
可以使用药学上可接受的盐,例如矿物酸盐,例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐,或有机酸盐,例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。
治疗性组合物中的药学上可接受的载体可以附加地含有液体,例如水、盐水、甘油和乙醇。此外,辅助物质,例如润湿剂或乳化剂或pH缓冲物质,可存在于此类组合物中。这样的载体使得药物组合物能够被配制用于给予于患者。
本公开主题的药物组合物的合适配方包括水性和非水性无菌注射溶液,其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、杀菌抗生素和使配方与预期接受者的体液等渗的溶质;水性和非水性无菌悬浮液,可包括助悬剂和增稠剂。配方可存在于单位剂量或多剂量容器中,例如密封的安瓿和小瓶中,并且可以在冷冻或冷冻干燥(冻干)条件下储存,其仅需要在临用前添加无菌液体载体,例如注射用水。一些示例性成分是SDS,在一些实施方式中在0.1至10mg/ml范围内,在一些实施方式中为约2.0mg/ml;和/或甘露醇或另一种糖,在一些实施方式中在10至100mg/ml范围内,在一些实施方式中为约30mg/ml;和/或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。考虑到所讨论的配方类型,可以使用本领域常规的任何其它试剂。在一些实施方式中,载体是药学上可接受的。在一些实施方式中,载体是药学上用于人类可接受的。
本公开主题的药物组合物可具有5.5至8.5、优选6至8且更优选约7的pH。可以通过使用缓冲剂来维持pH。该组合物可以是无菌的和/或无热原的。该组合物对于人类可以是等渗的。本公开主题的药物组合物可以在气密密封容器中提供。
根据本公开主题的治疗性方法包括向有需要的受试者给予本文公开的HS或相关化合物。
将有效剂量的本公开主题的药物组合物给予于有需要的受试者。术语“治疗有效量”、“治疗有效剂量”、“有效量”、“有效剂量”及其变型在本文中可互换使用,并且是指本公开主题的治疗组合物或药物组合物足以产生可测量的响应(例如减轻肝缺血再灌注(I/R)损伤的症状)的量。可以改变实际剂量水平,以便给予有效于实现特定受试者所需治疗响应的量。
在一些实施方式中,向受试者给予的本公开主题的治疗nt一组合物的量将取决于许多因素,包括但不限于受试者的大小、体重、年龄、靶组织或器官、给予途径、要治疗的病情、和要治疗的病情的严重程度。
所述治疗性组合物的效力可以变化,并且因此“治疗有效”量可以变化。然而,使用下文所述的测定方法,本领域技术人员可以容易地评估本公开主题的药物组合物的效力和功效并相应地调整治疗方案。
III.受试者
在本公开的主题中治疗的受试者理想地是人类受试者,尽管应当理解,所公开的主题的原理表明组合物和方法对于无脊椎动物和包括哺乳动物在内的所有脊椎动物物种都是有效的,旨在包含在术语“受试者”中。此外,哺乳动物应被理解为包括需要治疗肝缺血再灌注(I/R)病情的任何哺乳动物物种,特别是农业和驯养哺乳动物物种。
本公开主题的方法在治疗温血脊椎动物中特别有用。因此,本公开的主题涉及哺乳动物和鸟类。
更具体地,本文提供了对哺乳动物(例如人类)的治疗,以及对那些由于濒临灭绝而具有重要意义的哺乳动物(例如东北虎)、对人类具有经济重要性(在农场饲养以供人类食用的动物)和/或社会重要性的那些哺乳动物(作为宠物或动物园饲养的动物)(例如,人类以外的食肉动物(如猫和狗)、猪(猪、猪和野猪)、反刍动物(如家牛、牛、羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼)和马)的治疗。还提供了对鸟类的治疗,包括治疗那些濒临灭绝、饲养在动物园中的鸟类,以及家禽,更特别是家养家禽,即家禽,例如火鸡、鸡、鸭、鹅、珍珠鸡等,因为它们对人类也具有经济重要性。因此,本文提供的是对家畜的治疗,包括但不限于家养猪(猪和猪)、反刍动物、马、家禽等。
肝缺血再灌注(IR)损伤是肝移植和肝肿瘤切除手术期间的主要并发症。肝脏手术通常需要使用Pringle手法来减少失血,但代价是潜在的IR损伤。最初的损伤始于缺血期,此时血液流向组织被破坏,导致缺少氧和营养物质流动。因此,在肝移植期间接受手术的受试者是待治疗的代表性受试者。然而,可以治疗在阅读本公开内容后对于本领域普通技术人员将显而易见的任何合适的受试者,例如患有肝I/R损伤或有患肝I/R损伤风险的受试者。
IV.实施例
包括以下实施例以向本领域普通技术人员提供实践本公开主题的代表性实施方式的指引。鉴于本公开内容和本领域技术人员的一般水平,本领域技术人员可以理解以下实施例仅是示例性的,并且在不背离本本公开主题范围的情况下可以采用多种变化、修改和变更。
材料和方法
化学酶法合成低聚糖
先前已经描述了12-聚体和6-聚体-AXa的合成[15]。还参见图13。简而言之,对于12-聚体-4的合成,使用pmHS2用UDP-GlcNTFA(步骤a)和UDP-GlcA(步骤b)将葡萄糖醛酸-pNP延长以达到12-聚体。接下来,使用LiOH使GlcNTFA脱保护,然后用NST进行N-硫酸化(步骤c),以产生12-聚体N-磺基氨基葡萄糖残基。接下来,使用6-OST1和6-OST3(步骤d)安装6-O-硫酸化,以产生12-聚体-4GlcNS6S-GlcA-GlcNS6S-GlcA-GlcNS6S-GlcA-GlcNS6S-GlcA-GlcNS6S-Gl cA-GlcNS6S-GlcA-pNP。通过将单糖延长为五糖中间体来合成12-聚体-1、-2和-3。接下来,使用LiOH将GlcNTFA进行脱保护,然后用NST进行N-硫酸化以产生具有两个N-磺基氨基葡萄糖残基的5-聚体。用UDP-GlcNTFA延长5-聚体NS以产生6-聚体中间体。两个N-磺基氨基葡萄糖残基之间的葡萄糖醛酸残基通过C5-差向异构酶进行差向异构化和通过2-OST进行2-O-硫酸化(步骤e),产生6-聚体中间体GlcNTFA-GlcA-GlcNS-IdoA2S-GlcNS-GlcA-pNP。为生成6-聚体-AXa,该6-聚体中间体通过步骤c、d、e和通过3-OST1进行的3-O-硫酸化(步骤f),得到GlcNS6S-GlcA-GlcNS6S3S-IdoA2S-GlcNS6S-GlcA-pNP。为了生成12-聚体-2,使6-聚体中间体重复经历步骤b、c、a和e三次,以产生GlcNS-GlcA-GlcNS-IdoA2S-GlcNS-IdoA2S-GlcNS-IdoA2S-GlcNS-IdoA2S-GlcNS-GlcA-pNP。通过6-OST1和6-OST-3(步骤e)通过GlcNS残基的6-O-硫酸化,将12-聚体-2转化为12-聚体-3,得到结构GlcNS6S-GlcA-GlcNS6S-IdoA2S-GlcNS6S-IdoA2S-GlcNS6S-IdoA2S-GlcN S6S-IdoA2S-GlcNS6S-GlcA-pNP。最后,通过步骤f将12-聚体-3转化为化合物12-聚体-1,得到结构GlcNS6S-GlcA-GlcNS6S3S-IdoA2S-GlcNS6S-IdoA2S-GlcNS6S-IdoA2S-Glc NS6S-IdoA2S-GlcNS6S-GlcA-pNP。通过高分辨率DEAE-HPLC测量,不同12-聚体和6-聚体-AXa的纯度>95%。通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)和NMR确认了化学结构[15]。
使用与PCT国际专利申请序列号PCT/US2018/059152中所述相同的方法将低聚糖转化为生物素化的版本。简而言之,将12-聚体和6-聚体-Axa与pNP标签(5-10mg)和0.5mgPd/C溶解在20mM NaOAc,pH 5.0中,总体积为4ml。将反应混合物抽真空并用H2重新填充三次。然后将反应在室温下温育4h。之后,过滤以除去木炭。使用500mM Na2HPO4将过滤后的溶液调节至pH 8.5。加入6-叠氮基己酸琥珀酰亚胺酯(20摩尔当量的起始低聚糖)并在37℃下温育过夜。通过DEAE-HPLC柱纯化反应以产生叠氮基标记的低聚糖。PBS(pH7.4)缓冲液用N2鼓泡5分钟以制备0.1M CuSO4、0.1M三(3-羟丙基-三唑基甲基)胺(THPTA)(Sigma)、0.15M抗坏血酸钠、0.01M叠氮基标记的低聚糖和0.02M生物素-PEG4-炔烃(Sigma)的样品溶液。涡旋混合400μl THPTA和80μl CuSO4的混合物,然后加入160μl抗坏血酸钠、200μl叠氮标记的低聚物和200μl生物素-PEG4-炔烃,并用N2鼓泡2分钟,然后在37℃温育过夜。反应通过DEAE-HPLC柱纯化以产生生物素化的产物。通过ESI-MS确认了生物素化的12-聚体和6-聚体-AXa产物。
从肝裂解物中亲和纯化HMGB1
按照PCT国际专利申请序列号PCT/US2018/059152中描述的方法,制备6-聚体-AXa和12-聚体生物素化的低聚糖用于从肝裂解物中亲和纯化HMGB1。简而言之,在处死时通过在液氮中快速冷冻组织来制备肝裂解物。在含有200mM MES、500mM磷酸盐和1mM EDTA的缓冲液(pH 6)中机构均质化组织,然后进行三轮冻融。在4℃下将裂解的样品以10,000x g离心15分钟。在100mM NaCl 20mM HEPES pH 7.2中将生物素化的HS低聚糖(终浓度0.1mM)与20μl新鲜肝裂解物(~0.6mg)混合,并在4℃下温育过夜。使用亲和素-琼脂糖和增加浓度的NaCl洗涤实现纯化和生物素化的HS结合复合物。通过凝胶电泳分离每个样品的洗脱液,转移至硝酸纤维素膜,并使用抗HMGB1一抗(Abcam),然后通过抗兔HRP(Abcam)进行HMGB1印迹。
低聚糖的体外和离体抗FXa活性的确定
测定基于先前公布的方法[16]。简而言之,用PBS将人类FXa(Enzyme ResearchLaboratories)稀释至50U ml-1。在水中将显色底物S-2765(Diapharma)稀释至1mg ml-1。对于体外研究,将磺达肝素(以商品名ARIXTRA获得)和12-聚体低聚糖以不同浓度(0–131nM)溶解于PBS中。将16μl样品与60μl的35μl ml-1抗凝血酶(Cutter Biologics)在室温下温育2分钟。接下来,加入100μl FXa并在室温下温育4分钟。添加30μl S-2765底物并在405nm下连续测量反应混合物的吸光度5分钟。PBS用作对照样品。通过除以对照样品的最大斜率,将每个样品的最大斜率转化为FXa活性百分比。
对于离体研究,在6小时再灌注期后收集小鼠血浆并进行与上述相同的测定。
肝脏缺血再灌注手术设计
肝脏缺血再灌注(IR)手术由北卡罗来纳大学教堂山分校麦卡利斯特心脏研究所的动物手术核心实验室(Animal Surgery Core Laboratory of the McAllister HeartInstitute,University of North Carolina Chapel Hill,NC)进行。小鼠实验得到了UNC动物护理和使用委员会的批准,并符合美国国立卫生研究院的指导方针。IR手术中使用了约8周龄的雄性C57BL/6J小鼠。小鼠在外科手术前30分钟接受皮下(SC)注射1mg/kg低聚糖或等量盐水。对于12-聚体-3+6-聚体-AXa的联合治疗,将等浓度的每种低聚糖组合成单一溶液。在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下,做腹部正中切口以暴露门静脉。将钳夹在门静脉和胆管上至三个主要肝叶以引起70%的肝缺血。缺血性肝叶的明显漂白证实了夹子的正确放置。使用夹子上的肌肉和皮肤的临时缝合闭合来防止缺血期的脱水。在缺血期(60分钟),小鼠留在加热垫上并处于麻醉状态。60分钟后取下夹子,当血液开始再灌注组织时,缺血的肝叶恢复了红色,这是正确再灌注发生的指标。用5-0丝线缝合两层切口,小鼠恢复活动状态(在再灌注阶段不使用麻醉)。6小时后,再次麻醉小鼠,通过心脏穿刺抽血并收获缺血肝叶进行组织学检查(在10%福尔马林中固定)。
肝脏I/R损伤的评估
使用ALT Infinity试剂(Thermo Fisher)按照制造商的说明,测量血浆ALT。使用小鼠TNF-αDuoSet试剂盒(R&D Systems)根据制造商的说明,测量血浆TNF-α。使用HMGB1ELISA试剂盒(Tecan US)根据制造商的说明,确定了血浆HMGB1水平。小鼠多配体蛋白聚糖-1ELISA(CellSciences)根据制造商的说明,确定了血浆多配体蛋白聚糖-1水平。使用小鼠IL-6ELISA(R&D Systems)确定了血浆IL-6水平。
组织学/免疫组织化学
缺血肝组织在室温下在10%中性缓冲福尔马林中固定24小时,石蜡包埋,并且切片。肝切片(4μm)用苏木精-伊红(H&E)染色,或用单克隆抗体抗中性粒细胞(Abcam,Ab2557,NIMP-R14)然后用山羊抗大鼠或山羊抗兔生物素化的二抗(Abcam)进行免疫染色。在北卡罗来纳大学(UNC)教堂山的动物组织病理学和检验医学核心设施进行包埋、切片和H&E染色。由UNC教堂山的转化病理学实验室核心设施使用Aperio ImageScope软件(LeicaBiosystems,Concord,Canada)进行H&E分析。使用附接到明场显微镜(Leica DM 1000LED,Leica Microsystems Inc.,IL,USA)的高清相机捕获IHC图像,并使用ImageJ进行处理。对于嗜中性粒细胞定量,为每个样品随机选择五个100x图像,并报告平均嗜中性粒细胞/视野。
MPO活性
在50mM CTAB 50mM磷酸钾pH 6中以每10mg组织100μl缓冲液的比例将缺血肝叶机械匀浆。样品在15,000x g下在4℃下离心20分钟,收集上清液并储存在-20℃。通过Bradford测定法测量总蛋白质浓度。将10μl肝裂解物与80μl 0.75mM H2O2和110μl TMB(TMB液体试剂,即用型,Sigma)在37℃下在温和搅拌下温育10分钟。通过添加2.5M H2SO4终止反应并在450nm处读数。将活性(U/g蛋白质)计算为样品的吸光度减去空白的吸光度除以温育时间。该值通过蛋白质浓度归一化。
统计分析
所有数据均表示为平均值±SEM。通过双尾非配对学生t检验分析实验组和对照组之间的统计显著性,在多组之间通过单向ANOVA后是Dunnett或Tukey的多重比较检验,并使用GraphPad Prism软件(版本7.03;GraphPad Software,Inc.,graphpad.com/scientific-software/prism/)通过对数秩检验分析Kaplan-Meier生存曲线。
实施例1
肝脏IR增加肝损伤和炎症
使用部分肝IR损伤小鼠模型来评估低聚糖的体内功效。在该模型中,使用夹具在70%的肝脏中诱导缺血(图1A)。1小时后,移除夹具并开始再灌注期。再灌注6小时后处死动物。通过血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)、坏死细胞面积和中性粒细胞浸润到缺血性肝脏中的升高来测量肝损伤(图1B-1D)。此外,IR导致血浆HMGB1(图1E,P=0.013)和多配体蛋白聚糖-1(图1F,P=0.017)的显著增加。升高的HMGB1和多配体蛋白聚糖-1水平是细胞死亡和内皮损伤的指标[17,18]。
实施例2
HMGB1结合高度硫酸化的HS低聚糖
HMGB1与肝脏IR后的破坏性炎症反应有关[17,19]。在最近的一份报告中,研究了HMGB1与特定残基重复长度的HS低聚糖的结合[20]。在本实施例中,测试了在硫酸化度和2-O-磺基艾杜糖醛酸残基方面有差异的一组12-聚体。接近这些12-聚体允许进一步剖析硫酸化或2-O-磺基艾杜糖醛酸残基对HMGB1结合的影响(图2A)。该组包括四个12-聚体,涵盖了本研究中的不同硫酸化类型。12-聚体-l具有最高的硫酸化程度,带有17个磺基和四个2-O-磺基艾杜糖醛酸残基。12-聚体-2具有10个磺基,是四个12-聚体中最少的,并且含有四个2-O-磺基艾杜糖醛酸残基。12-聚体-3含有16个磺基和四个2-O-磺基艾杜糖醛酸残基。12-聚体-1和12-聚体-3之间的结构差异在于12-聚体-1在一个氨基葡萄糖残基中含有3-O-磺基,但这种3-O-硫酸化在12-聚体-3中不存在。12-聚体-4含有12个磺基并且没有2-O-磺基艾杜糖醛酸残基。通过抑制因子Xa(抗FXa)的活性来测量,12-聚体-l的抗凝活性类似于磺达肝素,这是一种FDA批准的抗凝药物,商品名为ARIXTRA。12-聚体-1和磺达肝素的抗FXa IC50值分别为63和18nM,而12-聚体-2、-3和-4不显示抗FXa活性,因此没有抗凝活性(图2B)。接下来,使用带有生物素标签的低聚糖从肝脏裂解物中拉下内源性HMGB1(图2C)。有趣的是,12-聚体-1和12-聚体-3成功地拉下HMGB1,表明在这种尺寸的低聚糖下,硫酸化程度是HMGB1结合的重要因素。
参见图7A和图7B,示出了来自使用低聚糖的HMGB1下拉的蛋白质印迹图像。图7A:样品输入。泳道1:12-聚体-4;泳道2:12-聚体-2;泳道3:12-聚体-3;泳道4:12-聚体-1。图7B:样品洗脱。泳道5:12-聚体-4;泳道6:12-聚体-2;泳道7:12-聚体-3;泳道8:12-聚体-1。
参见图8A和图8B,示出了来自使用12-聚体-1和6-聚体-AXa低聚糖的HMGB1下拉的完整蛋白质印迹图像。图8A:样品输入。泳道1:12-聚体-3;泳道2:12-聚体-1;泳道3:6-聚体-AXa。图8B:样品洗脱。泳道4:12-聚体-3;泳道5:12-聚体-1;泳道6:6-聚体-AXa。
实施例3
12-聚体-l减少IR后的肝损伤
基于与HMGB1结合的能力,将12-聚体-1和12-聚体-3用于肝脏IR的体内模型。在缺血前30分钟给予化合物。在血浆中证实了12-聚体-1的抗凝活性(图3A)。尽管12-聚体-1和12-聚体-3都与HMGB1结合,但只有12-聚体-1显著降低血浆ALT(图3B;12-聚体-1对IR P=0.048,12-聚体-3对IR P=0.620)。与IR组相比,12-聚体-l还减少了缺血性肝叶的肝坏死(图4;12-聚体-1对IR P=0.0287,12-聚体-3对IR P=0.1059)。这表明12-聚体-l的抗凝和抗炎特性提供了针对肝脏IR损伤的保护。
实施例4
12-聚体-l减少中性粒细胞积聚和MPO至缺血性肝脏
在肝脏IR中,中性粒细胞在再灌注期迅速募集到缺血后组织[8]。中性粒细胞迁移到肝脏后,它们会释放包括活性氧和蛋白酶在内的细胞毒性化合物以清除受损组织[21]。中性粒细胞及其强效货物由于对损伤与健康组织缺乏特异性,因此是无菌炎症的关键效应物。因此,中性粒细胞的募集继续并使炎症持续存在。
据报道,包括弹性蛋白酶、MMP-9、组织蛋白酶G、蛋白酶-3和髓过氧化物酶(MPO)在内的中性粒细胞衍生蛋白酶与IR诱导的肝损伤有关[8]。特别是,MPO在中性粒细胞中高度表达,并且可作为中性粒细胞积累的标志物。MPO通过与过氧化氢反应在组织中导致氧化应激[8]。在缺血性肝裂解物中测量MPO活性(图5A)。与IR组相比,12-聚体-l治疗使MPO活性降低了60%。相比之下,12-聚体-3和IR组之间的MPO活性几乎相同(分别为96.00和96.33U/g蛋白)。此外,通过免疫组织化学测量了缺血组织中的中性粒细胞积累(图5B-5F)。与MPO趋势相似,12-聚体-1降低了中性粒细胞浸润,而12-聚体-3则没有(12-聚体-1对IR P=0.0142,12-聚体-3对IR P=0.0705)。
实施例5
仅抗凝不足以保肝
接下来,研究了保肝作用是否需要抗凝活性。为了实现这一点,使用了6-聚体-AXa低聚糖(图6A)。与12-聚体-1相似,6-聚体-AXa通过抑制FXa而具有抗凝活性,如先前所证明的[15]。生物素化的6-聚体-AXa不会从肝裂解物拉下HMGB1(图6B),因此用作没有HMGB1结合的抗凝剂活性的对照。关于代表性HS化合物的大小和硫酸化模式,为了确定硫酸乙酰肝素低聚糖的抗炎(例如HMGB1结合)和抗凝对于IR后的肝保护是否都是必需的,单独或与12-聚体-3组合使用了6-聚体-AXa低聚糖。两个治疗组之间的抗凝水平相似(图6C),然而只有具有HMGB1结合能力(12-聚体-3)和抗凝活性(6-聚体-AXa)的低聚糖的联合治疗才会以统计学显著性降低IR后的血浆ALT。IR-损伤组和6-聚体AXa-治疗组之间的ALT浓度没有统计学差异。该结果表明,两种活性,无论是源自具有双重活性的一种化合物,还是源自具有不同功能的两种化合物的组合,都对肝保护起作用。
实施例1-5的讨论
与对乙酰氨基酚诱导的肝损伤不同,据报道,肝脏IR除了炎症外还涉及凝血障碍,因此被描述为血栓炎症[3]。抗凝剂HS低聚糖对对乙酰氨基酚诱导的肝损伤无效[20];然而,由于肝脏IR涉及血栓炎症,抗凝剂12-聚体-l被纳入本研究,以探索抗凝活性和HMGB1结合如何影响肝脏IR损伤中的肝保护。这样做,证明了合成的HS低聚糖是另一种疾病模型中的治疗剂。
在实施例1-5中,通过筛选一组具有各种硫酸化模式的12-聚体低聚糖来探索HS低聚糖与HMGB1结合的结构-活性关系。12-聚体-1和12-聚体-3都是高度硫酸化的低聚糖,是唯一成功从肝裂解物中拉下HMGB1的化合物。然而,在体内观察到12-聚体-1而不是12-聚体-3降低了缺血性肝叶中的ALT和坏死。12-聚体-1的抗炎活性与结合HMGB1、减少组织MPO和减少缺血性肝叶中中性粒细胞积累的能力有关。有趣的是,如体内12-聚体-3所示,结合HMGB1不足以保护肝脏。结果表明,在IR模型中,通过与12-聚体-3组合或单独使用6-聚体-AXa,抗凝和抗炎活性均在实现肝保护方面发挥作用。以此方式,检查了在不存在或存在HMGB1结合的情况下的抗凝血。单独使用6-聚体-AXa治疗不会具有统计学显著性地降低ALT浓度,但联合治疗会。虽然不希望受任何特定操作理论的束缚,但似乎12-聚体-l的保肝作用可归因于抗凝和抗炎的双重活性,因为这两种机制在肝脏IR的病理生理学中都必不可少。
实施例1-5证明,2-聚体-1是一种活跃的抗炎剂以及抗凝血剂。除了12-聚体-1在肝脏IR中的保护机制外,12-聚体-1还具有多种有利的药物样特性。因为大多数肝移植患者也有肾功能受损,因此考虑了12-聚体-l的肾脏清除率[23]。使用肾脏IR模型证明了12-聚体-l的肾脏清除受损[16]。然而,12-聚体-l适于剂量调整,因为它是一种具有均匀抗凝活性的化合物,对于肾功能不全的患者潜在地是一种安全的选择。已经报道了出血问题,9%的肝素治疗的肝移植受者需要对出血并发症进行手术干预[24]。LMWH降低了出血风险,但它不能被鱼精蛋白完全逆转[16]。12-聚体-l抗凝活性可通过鱼精蛋白逆转,这增加了改善出血并发症的额外益处[16]。因此,控制剂量和具有通过鱼精蛋白可逆性的潜力是12-聚体-l的方面。此外,12-聚体-l在大鼠模型中在高剂量下没有表现出毒性[20]。因此,抗血栓炎症特性、通过鱼精蛋白的可逆性、缺乏毒性和精确控制剂量的能力使得12-聚体-l成为有吸引力的用于肝移植/IR患者的治疗剂。药代动力学研究调查了12-聚体-l剂量和针对肝IR损伤的响应之间的关系。
肝素和脱硫肝素与P-选择素结合[J.Wang;Geng,J.,Thromb Haemost90,7(2003)],一种用于大多数器官和组织中的中性粒细胞的束缚分子。有趣的是,与经典模型相比,向肝脏募集的中性粒细胞有多个不同之处。例如,几乎没有证据表明中性粒细胞迁移到肝脏需要选择素或β2-整合素介导的粘附[8]。相反,中性粒细胞在物理上被困在肝血窦中,其中发生近80%的白细胞运输[S.L.Maas,O.Soehnlein,J.R.Viola,Frontiers inImmunology 9,(2018)]。因此,不希望受任何特定操作理论的束缚,似乎用12-聚体AXa处理后中性粒细胞积累的减少不是由于选择素抑制引起的。
达肝素是一种低分子量肝素,可减少大鼠中的肝脏IR损伤[22]。有趣的是,在这项研究中,在使用选择性因子Xa抑制剂DX9065a时,他们没有观察到保护,表明达肝素的保护作用不仅仅是由于抗凝引起的。达肝素降低MPO水平,表明了对中性粒细胞募集的影响。然而,由于达肝素的结构表征不完整,进一步的生化分析即使不是不可能也非常困难。化学酶合成技术产生具有或不具有抗凝活性的肝素低聚糖。随着肝素的抗炎特性越来越得到认可[25],本公开的主题有助于解决使用低聚糖的异质混合物来表征生物效应的问题。
化学酶合成技术产生结构明确的HS低聚糖。随着肝素的抗炎特性越来越得到认可[25],本公开的主题有助于将治疗领域从使用低聚糖的异质混合物转向一类新的基于均质、精确的低聚糖的治疗剂。
实施例6
HS低聚糖在肝缺血再灌注损伤中的作用–
描述18-聚体的结果
背景:
在肝缺血再灌注(IR)小鼠模型中使用具有N-磺基氨基葡萄糖和2-O-磺基艾杜糖醛酸重复单元的18-聚体(图10)。该化合物是非抗凝剂,因为它缺少抗凝所需的特定硫酸酯。如上文所讨论的,在一些实施方式中,如果使用更大的HS化合物,例如18-聚体,非抗凝剂18-聚体表现出保护作用。18-聚体治疗可降低肝IR损伤的严重程度。
IR手术:
在缺血期开始前30分钟,通过皮下注射给予1mg/kg的18-聚体或等体积的无菌盐水。是通过将门静脉和胆管夹住60分钟造成70%的肝脏缺血。去除夹子后,再灌注期持续6小时,然后处死动物以收集肝组织和血液。对于手术对照,进行了假饲手术,使动物经历与IR小鼠相同的麻醉、腹部中线切口和缝合(图11A)。
结果:
用18-聚体治疗可减少IR后的肝损伤。血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)是肝损伤的标志物。与IR组相比,18-聚体治疗降低了ALT水平(图11B)。
对于18-聚体保护的组织学证据,缺血肝叶用H&E染色以量化坏死面积。与IR相比,18-聚体显著减少了坏死面积(图11C-11F)。
除了减少坏死面积外,18-聚体还对许多炎症介质具有深远的影响(图12A-12D)。HMGB1是IR后释放的一种已知损伤相关分子模式,与无菌炎症和肝损伤的传播有关[A.Tsung et al.,The Journal of experimental medicine 204,2913-2923(2007);J.C.Evankovich,SW;Zhang,R;Cardinal,J;et.al.,J Bio Chem 285,9(2010)]。观察到,18-聚体减少了血浆HMGB1(图12A)和中性粒细胞浸润到缺血性肝叶(图12D)。此外,使用18-聚体治疗降低了包括IL-6和TNF-α在内的其它血浆炎症标志物
结论:
18-聚体可能通过抑制HMGB1-介导的中性粒细胞浸润和减轻无菌炎症来降低肝IR损伤。可能的是,具有相似结构的其它化合物,包括具有N-磺基氨基葡萄糖和2-O-磺基艾杜糖醛酸的相同重复二糖单元的16-聚体,在体内也有效。此外,化合物可以被修饰以具有N-,6-O-磺基氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸残基,这在体内也可能有效。此外,这些化合物可以用不同的化学手柄进行官能化,以研究体外结合并进一步阐明肝脏IR中的保护机制(图10,R2位置)。
参考文献
本文列示的包括但不限于所有专利、专利申请及其公开、科学期刊文章和数据库条目(例如数据库条目和其中可用的所有注释)在内的所有参考文献均通过引用以其全部内容并入本文,在某种程度上,它们补充、解释了本文采用的方法、技术和/或组合物,为本文采用的方法、技术和/或组合物提供了背景,或教导了本文采用的方法、技术和/或组合物。
1 Konishi,T.&Lentsch,A.B.Hepatic ischemia/reperfusion:mechanisms oftissue injury,repair,and regeneration.Gene Expr 17,277-287,doi:10.3727/105221617X15042750874156(2017).
2 Man,K.et al.Tolerance of the liver to intermittent pringle maneuverin hepatectomy for liver tumors.JAMA Surgery 134,533-539,doi:10.1001/archsurg.134.5.533(1999).
3 Jackson,S.D.,R;Schoenwaelder,SM.Thromboinflammation:challenges oftherapeutically targeting coagulation and other host defense mechanisms.Blood133,12(2019).
4 Iba,T.,Levy,J.H.,Raj,A.&Warkentin,T.E.Advance in the management ofsepsis-induced coagulopathy and disseminated intravascular coagulation.J ClinMed 8,728(2019).
5 Pierce,A.&Pittet,J.-F.Inflammatory response to trauma:implicationsfor coagulation and resuscitation.Curr Opin Anesthesio 27,246-252,doi:10.1097/aco.0000000000000047(2014).
6 Tsung,A.et al.HMGB1 release induced by liver ischemia involvesToll-like receptor 4 dependent reactive oxygen species production andcalcium-mediated signaling.J Exp Med 204,2913-2923,doi:10.1084/jem.20070247(2007).
7 Huebener,P.et al.The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediatedinjury amplification following necrosis.J Clin Invest 125,539-550(2015).
8 Oliveira,T.H.C.d.,Marques,P.E.,Proost,P.&Teixeira,M.M.M.Neutrophils:a cornerstone of liver ischemia and reperfusion injury.LabInvest98,51-62,doi:10.1038/labinvest.2017.90(2018).
9 Lu,L.et al.Innate Immune Regulations and Liver Ischemia-ReperfusionInjury.Transplantation 100,2601-2610(2016).
10 Gama,C.et al.Sulfation patterns of glycosaminoglycans encodemolecular recognition and activity.Nat Chem Biol 2,467-473(2006).
11 Feltracco,P.et al.Perioperative thrombotic complications in livertransplantation.World J Gastroenterol 21,8004-8013,doi:10.3748/wjg.v21.i26.8004(2015).
12 Jaimes,F.et al.Unfractioned heparin for treatment of sepsis:Arandomized clinical trial(The HETRASE Study)*.Crit Care Med 37,1185-1196,doi:10.1097/CCM.0b013e31819c06bc(2009).
13 Liu,J.&Linhardt,R.J.Chemoenzymatic synthesis of heparan sulfateand heparin.Nat Prod Rep 31,1676-1685(2014).
14 Xu,Y.et al.Chemoenzymatic synthesis of homogeneous ultra-lowmolecular weight heparin.Science 334,498-501(2011).
15 Xu,Y.et al.Homogeneous low-molecular-weight heparins withreversible anticoagulant activity.Nat Chem Biol 10,248-250,doi:10.1038/nchembio.1459(2014).
16 Xu,Y.et al.Synthetic oligosaccharides can replace animal-sourcedlow–molecular weight heparins.Sci Transl Med 9,eaan5954,doi:10.1126/scitranslmed.aan5954(2017).
17 Tsung,A.et al.The nuclear factor HMGB1 mediates hepatic injuryafter murine liver ischemia-reperfusion.J Exp Med 201,1135-1143,doi:10.1084/jem.20042614(2005).
18Teng,Y.H.-F.,Aquino,R.S.&Park,P.W.Molecular functions of syndecan-1in disease.Matrix Biol 31,3-16,doi:10.1016/j.matbio.2011.10.001(2012).
19Yamamoto,T.&Tajima,Y.HMGB1 is a promising therapeutic target foracute liver failure.Expert Rev Gatroenterol Hepatol 11,673-682(2017).
20Arnold,K.et al.Design of anti-inflammatory heparan sulfate toprotect against acetaminophen-induced acute liver failure.Sci Transl Med 12,eaav8075,doi:10.1126/scitranslmed.aav8075(2020).
21Kubes,P.&Mehal,W.Z.Sterile inflammation in theliver.Gastroenterology 143,1158-1172,doi:https://doi.org/10.1053/j.gastro.2012.09.008(2012).
22Naoaki Harada,M.K.O.,MD;Mitsuhiro Uchiba,MD.Dalteparin,a lowmolecular weight heparin,attenuates inflammatory responses and reducesischemia-reperfusion-induced liver injury in rats.Crit Care Med 34,8(2006).
23Weber,M.L.,Ibrahim,H.N.&Lake,J.R.Renal dysfunction in livertransplant recipients:Evaluation of the critical issues.Liver Transplant 18,1290-1301,doi:10.1002/lt.23522(2012).
24Kaneko,J.et al.Coagulation and fibrinolytic profiles andappropriate use of heparin after living-donor liver transplantation.ClinTransplant 19,804-809,doi:10.1111/j.1399-0012.2005.00425.x(2005).
25Oduah,E.I.,Linhardt,R.J.&Sharfstein,S.T.Heparin:Past,present,andfuture.Pharmaceuticals(Basel)9,38,doi:10.3390/ph9030038(2016).
26美国专利No.9,951,149,2018年4月24日授权.
27PCT国际专利申请序列号PCT/US2018/059152,公开为WO 2019/090203,公开日为2019年5月9日。
应当理解的是,可以改变本公开主题的各种细节而不脱离本公开主题的范围。此外,以上描述仅用于说明目的,并非用于限制。
Claims (29)
1.一种治疗受试者中肝缺血再灌注(I/R)损伤的方法,所述方法包括:
提供患有肝I/R损伤或有患肝I/R损伤风险的受试者;和
向所述受试者给予一种或多种硫酸乙酰肝素(HS)化合物。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述一种或多种HS化合物包含约5至约18个糖单元,可选地约12至约18个糖单元,其中所述给予在所述受试者中提供抗炎和/或抗凝活性。
3.权利要求1或2的方法,其中,所述一种或多种HS化合物包含约12个糖单元。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中,所述一种或多种HS化合物中的至少一种结合HMGB1。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法,其中,所述需要治疗的受试者是哺乳动物受试者。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法,其中,所述一种或多种HS化合物作为药物组合物的一部分给予。
15.根据权利要求14所述的方法,其中,药物组合物包含HS化合物和用于给予所述HS化合物的药学上可接受的载体或佐剂。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法,其中,所述给予包括给予两种或更多种HS化合物,可选地其中所述两种或更多种HS化合物单独但同时给予,可选地其中所述两种或更多种HS化合物在不同时间给予,可选地其中所述两种或更多种HS化合物在单一组合物中给予。
17.一种用于治疗受试者中肝缺血再灌注(I/R)损伤的组合物,其中,所述组合物包含:一种或多种硫酸乙酰肝素(HS)化合物,可选地其中所述一种或多种HS化合物包含约5至约18个糖单元,可选地约12至约18个糖单元,进一步可选地,其中所述一种或多种HS化合物包含约12个糖单元,进一步可选地,其中向受试者给予所述组合物在该受试者中提供抗炎和/或抗凝活性。
26.如权利要求16至25中任一项所述的组合物,其中,所述一种或多种HS化合物结合HMGB1。
27.根据权利要求16至26中任一项所述的组合物,其中,所述需要治疗的受试者是哺乳动物受试者。
28.根据权利要求16至27中任一项所述的组合物,包含用于给予所述一种或多种HS化合物的药学上可接受的载体或佐剂。
29.根据权利要求16至28中任一项所述的组合物,其中,包含两种或更多种HS化合物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201962934845P | 2019-11-13 | 2019-11-13 | |
US62/934,845 | 2019-11-13 | ||
PCT/US2020/060581 WO2021097345A1 (en) | 2019-11-13 | 2020-11-13 | Heparan sulfate (hs) oligosaccharides effect in liver ischemia reperfusion injury |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114980904A true CN114980904A (zh) | 2022-08-30 |
Family
ID=75912907
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202080092829.2A Pending CN114980904A (zh) | 2019-11-13 | 2020-11-13 | 硫酸乙酰肝素(hs)低聚糖在肝缺血再灌注损伤中的影响 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220265699A1 (zh) |
EP (1) | EP4041251A4 (zh) |
JP (1) | JP2023501568A (zh) |
CN (1) | CN114980904A (zh) |
WO (1) | WO2021097345A1 (zh) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7330893B2 (ja) | 2017-03-10 | 2023-08-22 | ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル | 短時間作用型ヘパリンベースの抗凝集剤化合物及び方法 |
US11865137B2 (en) | 2017-11-03 | 2024-01-09 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Sulfated oligosaccharides having anti-inflammatory activity |
JP2021528421A (ja) | 2018-06-20 | 2021-10-21 | ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒルThe University Of North Carolina At Chapel Hill | 細胞保護の方法と組成物 |
WO2023086998A2 (en) * | 2021-11-12 | 2023-05-19 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Compositions and methods for rare heparan sulfate glycan-targeted cancer treatment |
CN116987212B (zh) * | 2023-09-25 | 2023-12-26 | 山东大学 | 低分子量硫酸乙酰肝素及其衍生物和制备方法与应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019090203A1 (en) * | 2017-11-03 | 2019-05-09 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Sulfated oligosaccharides having anti-inflammatory activity |
CN110446511A (zh) * | 2017-03-10 | 2019-11-12 | 北卡罗来纳大学查珀尔希尔分校 | 短效的基于肝素的抗凝血剂化合物和方法 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3713276B2 (ja) * | 1995-09-29 | 2005-11-09 | バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド | 炎症反応の軽減のためのヘパリナーゼの使用 |
MX2011010616A (es) * | 2009-04-09 | 2012-03-14 | Univ North Carolina | Metodos para tratar edema relacionado a isquemia-reperfusion. |
JP6636334B2 (ja) * | 2013-03-08 | 2020-01-29 | ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー | 遠隔虚血再灌流傷害の治療および予防 |
-
2020
- 2020-11-13 WO PCT/US2020/060581 patent/WO2021097345A1/en unknown
- 2020-11-13 EP EP20887629.2A patent/EP4041251A4/en active Pending
- 2020-11-13 CN CN202080092829.2A patent/CN114980904A/zh active Pending
- 2020-11-13 JP JP2022527682A patent/JP2023501568A/ja active Pending
-
2022
- 2022-05-13 US US17/744,407 patent/US20220265699A1/en active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110446511A (zh) * | 2017-03-10 | 2019-11-12 | 北卡罗来纳大学查珀尔希尔分校 | 短效的基于肝素的抗凝血剂化合物和方法 |
WO2019090203A1 (en) * | 2017-11-03 | 2019-05-09 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Sulfated oligosaccharides having anti-inflammatory activity |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
TSUNG A, SAHAI R, TANAKA H, ET AL.: "The nuclear factor HMGB1 mediates hepatic injury after murine liver ischemia-reperfusion", THE JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 201 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP4041251A1 (en) | 2022-08-17 |
EP4041251A4 (en) | 2023-11-29 |
US20220265699A1 (en) | 2022-08-25 |
WO2021097345A1 (en) | 2021-05-20 |
JP2023501568A (ja) | 2023-01-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN114980904A (zh) | 硫酸乙酰肝素(hs)低聚糖在肝缺血再灌注损伤中的影响 | |
KAKEGAWA et al. | Inhibitory effects of tannins on hyaluronidase activation and on the degranulation from rat mesentery mast cells | |
EP2807176B1 (en) | Novel galactoside inhibitors of galectins | |
CN111032658B (zh) | 作为C5a抑制剂的5-5稠合环类 | |
JP4861596B2 (ja) | ヒアルロン酸オリゴ糖画分およびそれを含む医薬 | |
CN110446511B (zh) | 短效的基于肝素的抗凝血剂化合物和方法 | |
US20230277580A1 (en) | Cell protective methods and compositions | |
US11865137B2 (en) | Sulfated oligosaccharides having anti-inflammatory activity | |
Baek et al. | Self-assembled nucleo-tripeptide hydrogels provide local and sustained doxorubicin release | |
Arnold et al. | Synthetic anticoagulant heparan sulfate attenuates liver ischemia reperfusion injury | |
Xie et al. | PICK1 confers anti-inflammatory effects in acute liver injury via suppressing M1 macrophage polarization | |
WO2013138951A1 (zh) | 喹唑啉衍生物及其作为细胞凋亡抑制剂的用途 | |
BRPI0715269A2 (pt) | composto, sal do composto, composiÇço farmacÊutica, mÉtodo para a fabricaÇço de uma composiÇço farmacÊutica, uso de um composto e mÉtodo para o tratamento de uma disfunÇço na coagulaÇço sanguÍnea | |
AU2018273411B2 (en) | Methods of preventing or treating atherosclerosis with inhibitors of specific isoenzymes of human neuraminidase | |
Yang et al. | Targeting formyl peptide receptor 1 with anteiso‐C13‐surfactin for neutrophil‐dominant acute respiratory distress syndrome | |
RU2743293C1 (ru) | Применение пептида Gly-His-Lys-Val-Glu-Pro для повышения обучаемости и улучшения памяти. | |
JP6353849B2 (ja) | Bace−1の阻害剤としての糖樹状クラスター化合物 | |
US20230135239A1 (en) | Drug for treating severe acute respiratory syndrome caused by coronavirus and complications thereof and use of the drug | |
Gadi | Activated protein C reverses epigenetically sustained p66Shc expression in plaque-associated macrophages in diabetes mellitus | |
Liu et al. | Ulinastatin protects against myocardial ischemia/reperfusion injury in rats via Rho/ROCK signaling pathway | |
ES2903411T3 (es) | AMD3100 para el tratamiento y/o la prevención de caquexia, y composición farmacéutica del mismo | |
JP7121110B2 (ja) | ヘパラン硫酸糖模倣物化合物並びにその医薬品及び薬用化粧品としての使用 | |
Li et al. | Design and synthesis of novel hederagonic acid analogs as potent anti-inflammatory compounds capable of protecting against LPS-induced acute lung injury | |
WO2024086708A2 (en) | Compositions and methods for preventing cardiomyopathy | |
Pedriali | The role of c subunit of F1FO-ATP synthase in mitochondrial permeability transition pore activity for the treatment of reperfusion injury after myocardial infarction |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |