CN105683163B - RNA干扰中使用的RNAi剂的3’端帽 - Google Patents

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Abstract

本披露涉及新颖的化合物和包含RNAi剂的组合物，该RNAi剂包含新颖的化合物作为3’端帽。本披露还涉及用于制备此类组合物的工艺，以及此类组合物例如介导RNA干扰的方法和用途。

Description

RNA干扰中使用的RNAi剂的3’端帽
发明领域
本披露涉及新颖的化合物和包含RNAi剂的组合物，该RNAi剂包含新颖的化合物作为3’端帽。本披露还涉及用于制备此类组合物的工艺，以及此类组合物的制备方法和此类组合物例如介导RNA干扰的用途。
发明背景
RNA干扰(RNAi)是一种序列特异性基因沉默机制。这个过程可以通过向细胞中引入靶向具体序列的RNAi剂而人工诱导。许多结构适于RNAi剂，包括但不限于短干扰RNA(siRNA)。RNAi剂可以具有多种结构中的任一种(包括双链RNA)，该结构可以被修饰。
RNAi剂用于治疗性用途是令人希望的。然而，这种用途受到活性持续时间短的限制，这种限制有时是通过血清中的这些分子的降解介导的。裸RNAi剂通常具有数分钟的半衰期。雷泽尔(Layzer)等人2004RNA 10:766-771；庄(Choung)等人2006生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)342:919-927；萨托(Sato)等人2007控释杂志(J.Control.Rel.)122:209-216。
因此对RNAi剂的新颖修饰存在需求，这些修饰不妨碍RNA干扰活性，而是增加该活性、血清中的生物半衰期和/或活性持续时间。
具有这些修饰的RNAi剂在经由RNA干扰机制的靶标特异性沉默方法中是有用的。
发明简述
在一个实施例中，本披露涵盖一种具有化学式Ia的化合物：
其中：
X是H；OH，其中该羟基基团可以任选地被官能化为琥珀酸酯或附接至固体支持物；ODMT；羧酸；RNAi剂的链的3’端；或包含RNAi剂的链的分子的3’端，其中该链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子和第二磷酸酯或修饰的核苷间接头；
Y是CH或N；
m是0或1；
p是1、2或3；
R3是氢、2-(羟基-甲基)-苄基、3-(羟基-甲基)-苄基、琥珀酸酯或固体支持物(例如，珠粒或树脂)；
其中该(CH2)m-O-R3部分附接至苯基环的3位或4位；
R4是氢；
R5是氢；或R4和R5连同R4和R5所附接的苯基环一起形成6H-苯并[c]色烯。
ODMT是经由氧原子连接的DMT(4,4'-二甲氧基三苯甲基)。
在于此描述的不同实施例中，固体支持物包括但不限于珠粒、树脂或载体。许多适合的固体支持物都可以用于固定这些化合物。适合的固体支持物的实例包括琼脂糖、纤维素、右旋糖酐(作为例如Sephadex、Sepharose可商购的)、羧甲基纤维素、聚苯乙烯、聚乙二醇(PEG)、滤纸、硝酸纤维素、离子交换树脂、塑料膜、聚胺甲基乙烯基醚马来酸共聚物、玻璃珠、氨基酸共聚物、乙烯-马来酸共聚物、尼龙、丝线等。
在不同实施例中，具有化学式Ia的化合物选自表1A：
表1A.
在一个实施例中，本披露涵盖一种具有化学式Ib的化合物：
其中：
X是H；OH，其中该羟基基团可以任选地被官能化为琥珀酸酯或附接至固体支持物；ODMT；羧酸；RNAi剂的链的3’端；或包含RNAi剂的链的分子的3’端，其中该链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子和第二磷酸酯或修饰的核苷间接头；
q是0、1或2；
R6是苯基，其未被取代或被选自苯甲氧基和3,4-二羟基丁基的基团取代；
R7是氢或羟基-乙基，其中如果R7是羟基-乙基，则该羟基可以任选地被官能化为琥珀酸酯或附接至固体支持物；
R8是氢或甲氧基；
Y1是CH或N；并且
Y2是N或CR9；其中R9选自氢和甲基。
在不同实施例中，具有化学式Ib的化合物选自表1B：
表1B.
在不同实施例中，本披露涉及一种选自表1C的化合物：
表1C.
其中：
X是H；OH，其中该羟基基团可以任选地被官能化为琥珀酸酯或附接至固体支持物；ODMT；羧酸；RNAi剂的链的3’端；或包含RNAi剂的链的分子的3’端，其中该链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子和第二磷酸酯或修饰的核苷间接头，并且
q选自1和2。
在一个实施例中，本披露涵盖一种为RNAi剂的链的3’端加帽的方法，该方法包括使该RNAi剂与选自表1D的化合物反应：
表1D.
其中：
X是H；OH，其中该羟基基团可以任选地被官能化为琥珀酸酯或附接至固体支持物；ODMT；羧酸；RNAi剂的链的3’端；或包含RNAi剂的链的分子的3’端，其中该链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子和第二磷酸酯或修饰的核苷间接头，并且q选自1和2。
在不同实施例中，本披露涉及DMT-配体、琥珀酸酯-配体和/或羧酸酯配体，如表4中列出的那些。这些配体在产生包含3’端帽的RNAi剂中是有用的，该3’端帽包含具有化学式Ia或Ib的化合物、来自在此的任何表中的化合物或在此披露的任何3’端帽。
在不同实施例中，本披露涉及一种具有化学式Ia的化合物，其中X选自H；OH，其中该羟基基团可以任选地被官能化为琥珀酸酯或附接至固体支持物；ODMT；羧酸；RNAi剂的链的3’端；以及包含RNAi剂的链的分子的3’端，其中该链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子和第二磷酸酯或修饰的核苷间接头；并且R3选自氢、2-(羟基-甲基)-苄基、3-(羟基-甲基)-苄基和琥珀酸酯，或者附接至固体支持物(例如，珠粒或树脂)。
在不同实施例中，本披露涉及一种具有化学式Ia的化合物，其中X是包含RNAi剂的链的分子的3’端，其中该链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子和第二磷酸酯或修饰的核苷间接头。
在一个实施例中，本披露涵盖一种包含第一链和第二链的RNAi剂，其中至少一条链的3’-末端包含3’端帽，其中该3’端帽选自具有化学式Ia或Ib的化合物(其中X是RNAi剂的链的3’端)、来自在此的任何表中的化合物或在此披露的任何3’端帽。
在一个实施例中，该RNAi剂的第一链和/或第二链不超过约49个核苷酸长。
在一个实施例中，该RNAi剂的第一链和/或第二链不超过约30个核苷酸长。
在一个实施例中，该第一链和/或第二链是19个核苷酸长。
在一个实施例中，该第一链是反义链并且是19个核苷酸长。
在一个实施例中，该RNAi剂具有1个或2个平端。
在另一个实施例中，该RNAi剂在至少一个5’端或3’端上包含突出端。
在另一个实施例中，该RNAi剂在至少一个5’端或3’端上包含1至6核苷酸突出端。
在一个实施例中，该RNAi剂包含间隔子。
在一个实施例中，该间隔子是核糖醇或其他类型的脱碱基核苷酸。
在一个实施例中，该间隔子是核糖醇或其他类型的脱碱基核苷酸、2’-脱氧-核糖醇、二核糖醇、2’-甲氧基乙氧基-核糖醇(具有2’-MOE的核糖醇)、C3、C4、C5、C6或4-甲氧基丁烷-1,3-二醇。
在一个实施例中，该RNAi剂的至少一个核苷酸被修饰。
在一个实施例中，所述至少一个修饰的核苷酸选自2’烷氧基核糖核苷酸、2’烷氧基烷氧基核糖核苷酸或2’-氟核糖核苷酸。在另一个实施例中，所述至少一个修饰的核苷酸选自2’-OMe、2’-MOE和2’-H。在不同方面中，该核苷酸亚基在该糖的2’位被化学修饰。在一个方面中，该2’化学修饰选自卤素、C1-10烷基、C1-10烷氧基、卤素等。在具体方面中，该2’化学修饰是选自-OCH3(即，“OMe”)、-OCH2CH3(即，“OEt”)或-CH2OCH2CH3(即，甲氧基乙基)的C1-10烷氧基；或者是选自F的卤素。
在不同实施例中，一个或多个核苷酸被修饰或者是DNA或者被肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、吗啉代核苷酸、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、阿拉伯糖核酸(ANA)、2′-氟阿拉伯糖核酸(FANA)、环己烯核酸(CeNA)、脱水己糖醇核酸(HNA)和/或解锁核酸(UNA)置换；和/或至少一个核苷酸包含修饰的核苷间接头(例如，其中核苷酸的至少一个磷酸酯被修饰的核苷间接头置换)，其中该修饰的核苷间接头选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酰胺酯、硼烷膦酸酯(boranophosphonoate)、酰胺接头以及具有化学式(I)的化合物(如在此的其他地方所描述的)。
在一个实施例中，在该第一链和/或第二链的3’端上的前两个碱基配对核苷酸被修饰。
在一个实施例中，在该第一链和/或第二链的3’端上的前两个碱基配对核苷酸是2’-MOE。
在一个实施例中，该第一链和/或第二链的3’末端磷酸酯被修饰的核苷间接头置换。
在另一个实施例中，该第一链或第二链是正义链，该正义链包含5’端帽，该5’端帽减少由该正义链介导的RNA干扰的量。
在不同实施例中，该正义链包含选自以下项的5’端帽：缺乏5’磷酸酯或5’-OH的核苷酸；缺乏5’磷酸酯或5’-OH并且还包含2-OMe或2’-MOE修饰的核苷酸；5’-脱氧-2’-O-甲基修饰；5’-OME-dT；ddT；以及5’-OTr-dT。
在不同实施例中，本披露涵盖一种包含第一链和第二链的RNAi剂，其中至少一条链的3’-末端包含3’端帽，其中该3’端帽选自具有化学式Ia或Ib的化合物、来自在此的任何表中的化合物或在此披露的任何3’端帽；其中任选地每条链是49-mer或更短，任选地该第一链和/或第二链是约30个核苷酸长或更短，和/或任选地该第一链和/或第二链是19个核苷酸长；其中任选地该RNAi剂具有1个或2个平端或该RNAi剂在至少一个5’端或3’端上包含突出端，任选地是1至6核苷酸突出端；其中该RNAi剂任选地包含间隔子，其中任选地该间隔子是核糖醇或其他类型的脱碱基核苷酸、2’-脱氧-核糖醇、二核糖醇、2’-甲氧基乙氧基-核糖醇(具有2’-MOE的核糖醇)、C3、C4、C5、C6或4-甲氧基丁烷-1,3-二醇；其中任选地一条链或两条链是RNA或任选地该RNAi剂的至少一个核苷酸被修饰，其中任选地所述至少一个修饰的核苷酸选自2’烷氧基核糖核苷酸、2’烷氧基烷氧基核糖核苷酸或2’-氟核糖核苷酸，并且任选地所述至少一个修饰的核苷酸选自2’-OMe、2’-MOE和2’-H；其中任选地一个或多个核苷酸被修饰或者是DNA或者被肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、吗啉代核苷酸、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、阿拉伯糖核酸(ANA)、2′-氟阿拉伯糖核酸(FANA)、环己烯核酸(CeNA)、脱水己糖醇核酸(HNA)和/或解锁核酸(UNA)(非核苷酸无环类似物，其中C2’-C3’键不存在)置换；和/或至少一个核苷酸包含修饰的核苷间接头，其中该修饰的核苷间接头选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酰胺酯、硼烷膦酸酯、酰胺接头以及具有化学式(I)的化合物；并且其中任选地在该第一链和/或第二链的3’端上的前两个碱基配对核苷酸被修饰，并且任选地在该第一链和/或第二链的3’端上的前两个碱基配对核苷酸是2’-MOE；并且其中任选地该第一链和/或第二链的3’末端磷酸酯被修饰的核苷间接头置换；并且其中任选地该第一链或该第二链是正义链，该正义链包含5’端帽，该5’端帽减少由该正义链介导的RNA干扰的量，其中任选地该5’端帽选自缺乏5’磷酸酯或5’-OH的核苷酸；缺乏5’磷酸酯或5’-OH并且还包含2-OMe或2’-MOE修饰的核苷酸；5’-脱氧-2’-O-甲基修饰；5’-OME-dT；ddT；以及5’-OTr-dT。
不互斥的在此披露的不同实施例的不同要素[例如，组合物和方法；以及3’端帽的选择、核苷酸修饰或置换(如用DNA)、修饰模式、链长、存在或不存在突出端、和/或5’端帽及递送运载体]可以被组合。
在一个实施例中，本发明提供了一种包含RNAi剂的药物组合物，该RNAi剂具有任何一种或多种上述特性。
在另一个实施例中，本发明提供了一种用作药物的、具有任何一种或多种上述特性的RNAi剂。
在另一个实施例中，本披露涉及一种抑制细胞中的靶基因的方法或涉及一种用于抑制或降低细胞中的靶基因的水平和/或活性的方法，所述方法包括向该细胞中引入如上所述的任何RNAi剂中的一种或多种的步骤。
多种RNAi剂(其可以包括相同或不同类型的RNAi剂，和/或3’端帽、序列、长度、突出端、5’端帽、核苷酸置换和/或修饰和/或修饰模式等的组合)可以分开给予或共同给予。可以在相同的递送运载体、相同类型的递送运载体中或者在不同的递送运载体中给予多种RNAi剂。
下文描述了不同的另外的实施例。
本披露的一个或多个方面的细节陈述于附图和下文的描述中。不互斥的在此披露或在本领域已知的不同方面的要素(例如，序列、修饰、取代、间隔子、修饰的核苷间接头、端帽、RNAi剂组合、递送运载体、涉及RNAi剂与另一种药剂的联合疗法等)可以彼此组合，其条件是这种RNAi剂或这些RNAi剂仍能够介导RNA干扰。例如，在此披露的任何RNAi剂序列可以与在此披露的任何一组修饰或端帽组合。类似地，修饰、5’端帽和/或3’端帽的任何组合可以与在此披露的任何RNAi剂序列一起使用。在此披露的任何RNAi剂(具有修饰或端帽的任何组合或不具有修饰或端帽)可以与在此披露的任何其他RNAi剂或者其他治疗组合物或方法组合。
根据本说明书、附图并且根据权利要求书，本披露的其他特征、目标和优点是显而易见的。
附图简述
图1展示了实例1中使用的包含3’端帽的RNAi剂的结构和序列。图1中的序列从上到下由SEQ ID NO:1和2(通用序列)及SEQ ID NO:3和4(反义和正义F7)表示。在此和/或在美国专利号8,084,600中提供了3’端帽(“X”)的结构。
图2示出了如实例1中所述的包含3’端帽(C3、C6、C12、二醇、环己基、苯基、联苯基、石胆酸、C7氨基或C3氨基)的RNAi剂在允许该RNAi剂介导RNA干扰方面的效能。在此和/或在美国专利号8,084,600中提供了3’端帽(“X”)的结构。
图3示出了实例1中所述的3’端帽在降低和/或防止血清中的核酸酶降解方面的效能。
图4示出了实例1中使用的不同RNAi剂的质量对照。
图5A和5B示出了残余表达水平，指示了由不同RNAi剂介导的体外RNA干扰或KD(敲低)，这些RNAi剂在引导链上包含3’端帽：BP(联苯基)、C6、X027、X038、X050、X051、X052、X058、X059、X060、X061、X062、X063、X064、X065、X066、X067、X068和X069，如实例3A中所述的。这些RNAi剂不具有2’-MOE夹(-)或具有2’-MOE夹(MOE)；或者不具有核糖醇间隔子(-)或具有核糖醇间隔子(rib)。对图5A的描述被提供在图5B的底部，并且此数据涉及实例3A。这些是针对铁调素的RNAi剂。
图6A和6B详述了在示于图5A和5B的数据中和在实例3A等中使用的RNAi剂中的一些。图6A中的序列从上到下由SEQ ID NO:5至10(400)、SEQ ID NO:11至16(402)和SEQ IDNO:17(400 21-mer)表示。图6B中的序列从上到下由SEQ ID NO:18至23(400)；SEQ ID NO:24至29(402)和SEQ ID NO:30(400 21-mer)表示。这些是针对铁调素的RNAi剂。
图7示出了包含3’端帽(C6、BP、X027、X058、X067、X038、X069或X052)的RNAi剂的残余基因活性[其中残余基因活性＝100％-敲低(KD)]，范围是从1.57nM至15nM。指明了这些链的形式，如实例3A中所述的。这些是针对小鼠铁调素的RNAi剂。
图8A和8B显示在ABI Hamp1Taqman测定(图8A)和Hamp1特异性Taqman测定(图8B)两者中，在以1x 3mg/kg剂量给药后48小时时，所有具有3’端帽的RNAi剂都能够在体内介导敲低。使用的3’端帽是：X052、X058、X067、X038、X069和X027，其中C6作为对照，如实例3B中所述的。这些是针对在体内测试的小鼠铁调素的RNAi剂。
图9A显示包含X058 3’端帽的双链体在以1x 3mg/kg剂量给药后168小时(7天)时仍能够介导RNA干扰(通过铁调素敲低测量的)，如实例3B中所述的。图9B示出了与包含C63’端帽的双链体的缔合相比，包含X058 3’端帽的双链体与Ago2的缔合增加。这些是针对在体内测试的小鼠铁调素的RNAi剂。
图10示出了具有A160&A161形式和不同3’端帽(C6或BP)或核糖醇间隔子和3’端帽(ribC6)的RNAi剂的体内比较，如实例3B中所述的。这些是人铁调素RNAi剂。
图11(顶部)示出了18-mer RNAi剂形式的非限制性实例。“L”指示非核苷酸“配体”，例如，可以使用的任何不同3’端帽(例如，PAZ配体)。这通用序列SEQ ID NO:31和32表示。图11(中部)也示出了18-mer RNAi剂的具体实例，该RNAi剂按5’至3’顺序在不同链的3’末端包含以下项并且结合至3’末端磷酸酯：核糖醇间隔子(rib)、磷酸酯(p)和3’端帽(X058或C6)。这些序列由SEQ ID NO:33和34(400)及SEQ ID NO:35和36(402)表示。还示出了不同修饰(底部)。
图12示出了使用琥珀酸酯形式合成包含3’端帽(X058)的RNAi剂的非限制性实例。
图13示出了X058、X109、X110、X111、X112和X113 3’端帽的结构。TF-26-BC53指示RNAi剂，并且这些3’端帽可以与具有任何序列或靶标的任何RNAi剂的任一条或两条链一起使用。
图14示出了不同RNAi剂的体外效能，这些RNAi剂包含3’端帽(C6)；或者，按5’至3’顺序包含间隔子(C3)、磷酸酯(p)和3’端帽(C6)，或C3pC6。这些序列从上到下由SEQ ID NO:37至44表示。测试的RNAi剂是针对小鼠因子VII。
图15A和15B示出了RNAi剂的若干不同修饰方案。这些RNAi剂包含3’端帽(C3)。图15B示出了在“wt”(野生型)和修饰的RNAi剂的背景下的修饰方案，其中这些RNAi剂包含核苷酸dTdT或dTsdT突出端，这些突出端可以被3’端帽置换。图15C也示出了在19bp或18bp茎(双链区)的背景下的示例性修饰方案，该茎可以进一步包含3’二核苷酸突出端或3’端帽(L，或非核苷酸配体)。所示的不同修饰方案可以与如在此披露的包含3’端帽的不同RNAi剂一起使用。在图15A中，通用序列从上到下由SEQ ID NO:45至48表示。在图15B中，这些序列从上到下由SEQ ID NO:49至52表示。在图15C中，通用序列从上到下由SEQ ID NO:53至56表示。在图15C中，在一个实例中，可以通过缺失反义链上的末端3’核苷酸和正义链上的5’末端核苷酸来将示例性19-mer转化为18-mer以保留双链分子。
图16A示出了包含任何不同3’端帽(X058、X109、X110、X111、X112、X113或C6(阳性对照))的RNAi剂的体外效能。图16B示出了在此实验以及其他实验中使用的分子的结构。这些包含X109、X110、X111、X112或X113的RNAi剂在反义链的5’端包含DNA修饰。将双链体编号为20至28。图16B中的序列由SEQ ID NO:57(第一序列)和SEQ ID NO:58(第二序列)表示。这些是针对HuR(ELAVL1)的RNAi剂。该序列被指定为hs(人)1186，但是在人类、小鼠和大鼠之间具有交叉反应性。
图17A至17I示出了与RNAi剂的5’端加帽有关的数据。图17A示出了两个5’端。图17B示出了5’端加帽对HAMP RNAi剂的影响。图17C图示了不同5’端帽。图17D展示了不同5’端帽和序列。图17A中的序列从上到下并且从左到右由SEQ ID NO:59至66表示。图17C中的序列从上到下由SEQ ID NO:67至72表示。图17D和17F中的双链体被编号为10至15。
图18A、18B和18C示出了包含C6、C8或C10 3’端帽的不同SSB RNAi剂的结构和效能，如实例5中所述的。图18C示出了RNAi剂链的3’端的示例性结构。该链终止于核苷酸(具有碱基)和3’磷酸酯，该3’磷酸酯结合至：二核苷酸(wt或野生型)；或3’端帽(C6、C8或C10)。这些结构用于例如LNP配制的SSB siRNA中，但是可以用于具有任何长度、任何序列或靶标的任何RNAi剂。这些RNAi剂是针对SSB(舍格伦综合征抗原B)并且包含具有3’端帽(C6、C8或C10)的19-mer。被指定为SSB-309A22S26的化合物是21-mer对照。该实验在小鼠中在体内完成。图18B示出了用于产生示于图18A中的条形图的数据点。图18C还显示3’末端磷酸酯可以被描绘的化合物置换。该RNAi剂的任一条或两条链的任何磷酸酯都可以被描绘的化合物置换。
图19图示了RNAi剂的3’末端核苷酸的结构，该结构结合至以下项：二核苷酸(例如，CU突出端)或作为二核糖醇、核糖醇和X027的3’端帽。还示出了3’末端核苷酸(2’-MOE)和磷酸酯的结构，其按5’至3’顺序结合至：间隔子(核糖醇)、第二磷酸酯和3’端帽(C6或X058)。
图20A和20B示出了包含不同修饰的3’端帽和2’-MOE夹的效能。在不同RNAi剂中，两条链的3’末端磷酸酯(P或PO)被硫代磷酸酯(P或PS)置换，并且3’端帽是C3。对照RNAi剂缺乏3’端帽并且包含3’末端二核苷酸(dTpdT，其中“p”是磷酸酯或硫代磷酸酯)。图20A和20B示出了包含硫代磷酸酯-C3(PS-C3)的3’端帽的RNAi剂的效能。图20C、20D和20E示出了包含2’-MOE夹的RNAi剂的效能，其中从5’向3’数最后两个碱基配对nt是RNA、DNA、2’-MOE、2’-F或LNA。因此，在不同RNAi剂中，一个或多个核苷酸被LNA置换。对于图20D和20E中的RNAi剂而言，所有测试的RNAi剂都是有效的。应当指出的是百分比不表示敲低，而是相对于其他RNAi剂的敲低。例如，100％表示这些有效的RNAi剂的所有反义链的平均敲低。图20A中的序列从上到下由SEQ ID NO:73至84表示。图20C中的序列从上到下由SEQ ID NO:85和86表示。
图21示出了包含间隔子[其是核糖醇(rib)、C3或4-甲氧基丁烷-1,3-二醇(A5300)]；磷酸酯；和作为X058的3’端帽的示例性RNAi剂的结构。该图在18-mer RNAi剂和特定3’端帽的背景下描绘了间隔子，但是这些间隔子可以与具有任何长度、序列或靶标的任何RNAi剂链一起使用，以及与任何3’端帽一起使用。
图22示出了包含链的示例性RNAi剂的RNAi剂活性的效能和持续时间，其中该链的3’端终止于磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含作为核糖醇(rib)、C3或4-甲氧基丁烷-1,3-二醇(A5300)的间隔子；磷酸酯；以及作为X058或C6的3’端帽。将双链体编号为1至6。这些是针对HuR(ELAVL1)的RNAi剂。UNT：未处理的(阴性对照)。NTC：非靶标对照(阴性对照，使用靶向不同靶标的不相关RNAi)。
图23A-C示出了包含3’端帽的RNAi剂的效能，该3’端帽是：
X109、X110、X111、X112、X113、X1009、X1010、X1024或X1025(图23A)；
X1011、X1012、X1013、X058、X1015、X1016、X1017、X1026、X1027(图23B)；或
X1018；X1019、X1020、X1021、X1022或X1028(图23C)。术语C3接头、C4接头和C5接头指示3’端帽的部分。
图24A和24B示出了包含3’端帽的RNAi剂的效能和持续时间，该3’端帽是X110、X1012、X1018、X111、X1013、X112、X058、X1019、X1025、X1027或X1028。
发明详述
本披露涉及新颖的化合物，包括：具有化学式Ia或Ib的化合物、来自在此的任何表中的化合物或在此披露的任何3’端帽。
在不同实施例中，本披露涉及DMT-配体、琥珀酸酯-配体和/或羧酸酯配体，如表4中列出的那些，这些配体在产生包含3’端帽的RNAi剂中是有用的，该3’端帽包含具有化学式Ia或Ib的化合物(例如，其中X是H或OH)、来自在此的任何表中的化合物或在此披露的任何3’端帽。
在不同实施例中，本披露涉及一种具有化学式Ia的化合物，其中X选自H、OH、ODMT、羧酸和RNAi剂的链的3’端；并且R3选自氢、2-(羟基-甲基)-苄基、3-(羟基-甲基)-苄基和琥珀酸酯，或者附接至固体支持物(例如，珠粒或树脂)。
在不同实施例中，本披露涉及一种在此被指定为X058的化合物，其中X选自H、OH、ODMT、羧酸和RNAi剂的链的3’端；并且R3选自氢、2-(羟基-甲基)-苄基、3-(羟基-甲基)-苄基和琥珀酸酯，或者附接至固体支持物(例如，珠粒或树脂)。
在不同实施例中，本披露涉及一种包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且进一步包含作为X058的3’端帽。在这种情况下，X表示该第一链或第二链。
在一个实施例中，具有化学式Ia和Ib的化合物以及表1A、1B或1C的那些可以被用作RNAi剂上的3’端帽；在这些实施例中，X是RNAi剂链的3’端。
在一个实施例中，本披露涵盖一种包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’-末端包含3’端帽(例如，3’端处的修饰)，其中该3’端帽选自列于表1或2中的3’端帽或在此另外披露的那些。
在不同实施例中，本披露涵盖一种包含正义链和反义链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中该反义链的3’-末端包含3’端帽(例如，3’端处的修饰)，其中该3’端帽选自列于表1或2中的3’端帽或在此另外披露的那些。
在不同实施例中，该RNAi剂可以是双链RNA。在不同实施例中，一个或多个RNA核苷酸可以被DNA、PNA、LNA、吗啉代、TNA、GNA、ANA、HNA、CeNA、FANA和/或UNA置换。在一些实施例中，用DNA，或具有不同主链的核苷酸，或PNA、LNA、吗啉代、TNA、GNA、ANA、HNA、CeNA、FANA置换或取代RNA可以被认为是“修饰”。在不同实施例中，一个或多个磷酸酯可以被硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酰胺酯、硼烷膦酸酯、酰胺接头或具有化学式(I)的化合物(如在此的其他地方所述的)置换。
在不同实施例中，本披露涉及一种包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端终止于磷酸酯(在此被指定为“p”或“PO”)或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、第二磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，其中该间隔子是核糖醇、2’-脱氧-核糖醇、二核糖醇、2’-甲氧基乙氧基-核糖醇(具有2’-MOE的核糖醇)，或者C3、C4、C5或C6或4-甲氧基丁烷-1,3-二醇；其中该3’端帽选自列于表1或2中或在此另外披露的3’端帽；其中任选地一个或多个核苷酸被修饰或者是DNA或者被肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、吗啉代核苷酸、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)和/或解锁核酸(UNA)置换；并且其中任选地一个或多个核苷酸包含修饰的核苷间接头(例如，其中核苷酸的至少一个磷酸酯被修饰的核苷间接头置换)。
在此披露的3’端帽和间隔子可以与任何RNAi剂的一条链或两条链一起使用，不管长度、序列或靶标如何。
已知裸siRNA(例如，缺乏如披露的3’端帽的那些)在血清中、在肠液中具有非常短的生物半衰期，通常仅有数分钟。这种短半衰期可以归因于例如被核酸酶降解。已经针对在RNAi剂中使用对许多3’端帽进行了测试，但是大部分不是既(1)允许RNA干扰活性和又(2)增加活性的持续时间(例如，减少降解)。相比之下，本发明的3’端帽能够允许RNAi剂的RNA干扰并且增加其持续时间(例如，减少降解)。优选的3’端帽具有改善的敲低(RNA干扰活性)和/或进一步改善的活性持续时间。不希望受任何具体科学理论束缚，本披露表明这些效应中的一者或两者可能起因于与Dicer的PAZ结构域的特异性相互作用和/或经由降低的外切核酸酶活性通过稳定性的改善。
此外，因为RNAi剂是双链的，所以任一条链都可以被装载进RISC(RNA诱导的沉默复合体)中。因此，问题在于正义链可以被装载，但是仅反义链靶向正确序列。在此披露的新颖3’端帽(包括被指定为“PAZ配体”的那些)帮助装载反义链，这提高了效率、稳定性和效应的持续时间。因此，在一些实施例中，反义链的3’端包含如在此披露的3’端帽。
本披露还涵盖在体外或在生物体(如哺乳动物，如人)中减少靶基因的表达或者抑制或降低其基因产物的水平和/或活性的方法，或者治疗与靶基因的过表达相关的疾病的方法，其中该方法包括以下步骤：向该人给予生理活性量的组合物，该组合物包含含有第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’-末端包含3’端帽(例如，3’碳处的修饰)，其中该3’端帽选自列于表1或2中或在此另外披露的3’端帽。
不同3’端帽(包括被指定为“PAZ配体”的那些)的结构示于下文的下表1中。应当指出的是，尽管一些3’端帽被指定为“PAZ配体”，但是本披露不受任何具体理论束缚。
表1.RNA干扰用的RNAi剂的3’端帽(包括“PAZ配体”)的结构
表1的结构表示可以在RNAi剂的一条链或两条链的3’端处的3’端帽(由X表示)。在一些实施例中，该3’端帽在反义链的3’端上。
表1的结构的具体实施例图示于表2中。
在表1和2的结构中：
在一些实施例中，羟基基团是存在的并且X代表RNAi剂的链的3’端。例如，RNAi的链的3’端可以终止在3’端帽所结合的磷酸酯基团处。这样一种结构的非限制性实例示于例如图15A(C3)、图18C(C6、C8和C10)；和图19(X027、C6和X058)中。尤其而言，X027和X058在体外在19-mer上是有活性的。表2示出了与RNAi剂的链的3’端处的磷酸酯结合的不同3’端帽的结构。作为非限制性实例：已经显示X058(在此示出的数据和未示出的数据)在具有不同长度、序列和靶标的多种不同RNAi剂上在体外和体内都是功能性3’端帽。X058是有效的3’端帽，例如在21-mer平端HuR RNAi剂上，其中每条链是21-mer，并且这两条链一起形成平端双链体，并且每条链的3’端终止于磷酸酯并且进一步包含作为X058的3’端帽。X058与18-mer形式的若干不同靶标和序列一起也是有效的。例如，构建了若干包含第一链和第二链的有效RNAi剂，其中该第一链和第二链都是18-mer，并且这两条链一起形成平端双链体，其中引导链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和作为X058的3’端帽。构建了若干包含第一链和第二链的有效RNAi剂，其中该第一链和第二链都是18-mer，并且这两条链一起形成平端双链体，其中引导链的3’端终止于磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和作为X058的3’端帽。构建了若干包含第一链和第二链的有效RNAi剂，其中该第一链和第二链都是18-mer，并且这两条链一起形成平端双链体，其中引导链的3’端终止于磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：作为核糖醇的间隔子、磷酸酯和作为X058的3’端帽。X058在其他RNAi剂上也是有效的。因此，X058在具有不同长度、靶标和序列的多种RNAi剂上在体内和体外都是有效的3’端帽。
在一些实施例中，在羟基基团存在的情况下，该羟基可以按受保护形式存在。OH的适合的保护基团在本领域中是已知的。OH的受保护形式包括但不限于醚、磷酸酯、甲基四乙酰基葡糖醛酸酯、全乙酰基糖苷和氨基酸多肽酯。
包含间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽的实施例
在一些实施例中，该RNAi剂的一条链或两条链在3’端处并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽(例如，如在此披露的3’端帽)。
因此：
在一个实施例中，X是包含RNAi剂的链的分子的3’端，其中该链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子和第二磷酸酯或修饰的核苷间接头。在不同实施例中，该间隔子是核糖醇、2’-脱氧核糖醇、或2’-甲氧基乙氧基-核糖醇(具有2’-MOE的核糖醇)、C3、C4、C5或C6或4-甲氧基丁烷-1,3-二醇。下文更加详细地描述不同实施例。
间隔子：核糖醇、二核糖醇、2’-脱氧核糖醇、2’-甲氧基乙氧基核糖醇、C3、C4、C5、C6或4-甲氧基丁烷-1,3-二醇(5300)
在一些实施例中，该RNAi剂的一条链或两条链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽(例如，如在此披露的3’端帽)。间隔子是旨在或用于在两个其他化学部分之间产生或维持一定距离(例如，适当的或功能性间距)的化学部分；例如，在两个磷酸酯或修饰的核苷间接头之间。间隔子可以选自例如核糖醇、二核糖醇、2’-脱氧核糖醇或2’-甲氧基乙氧基-核糖醇(具有2’-MOE的核糖醇)或本领域普通技术人员已知的等效脱碱基核苷酸，或者低级烷基或烷氧基基团，如C3、C4、C5或C6，或4-甲氧基丁烷-1,3-二醇，如下文所述的。
核糖醇间隔子。
在一些实施例中，该间隔子是核糖醇或其他类型的脱碱基核苷酸。
在一个实施例中，该RNAi剂包含链，其中该链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：作为核糖醇的间隔子，第二磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端(例如，在此描述的或本领域已知的任何3’端帽)。换言之：在一个实施例中，该RNAi剂按5’至3’顺序包含：链，该链包含3’末端磷酸酯或修饰的核苷间接头；作为核糖醇的间隔子；磷酸酯或修饰的核苷间接头；和3’端帽(例如，在此描述的或本领域已知的任何3’端帽)。因此，在一个实施例中，该RNAi剂按5’至3’顺序包含：链，该链包含3’末端磷酸酯；作为核糖醇的间隔子；磷酸酯或修饰的核苷间接头；和3’端帽。
这里示出了3’末端磷酸酯和核糖醇间隔子的结构：核糖醇间隔子。
在一些文献中，该核糖醇间隔子被指定为N027(C027等)。
一个实施例示于图18中，其中该RNAi剂按5’至3’顺序包含：18-mer链，其中该18-mer链的3’端终止于磷酸酯，并且按5’至3’顺序进一步包含：作为核糖醇的间隔子、磷酸酯和作为X058的3’端帽。此结构可以在具有任何序列或靶标的任何RNAi链上。此外，在此披露的任何3’端帽都可以用于代替X058。
相关结构示于图19中(“具有X058的核糖醇”)，其中该18-mer链的最后一个核苷酸被示出(并且是2’-MOE)，并且该18-mer链的3’端终止于磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：作为核糖醇的间隔子、第二磷酸酯和作为X058的3’端帽。
另一个实施例示于图19中(“具有C6帽的核糖醇”)，其中该18-mer链的最后一个核苷酸被示出(并且是2’-MOE)，并且该18-mer链的3’端终止于磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：作为核糖醇的间隔子、磷酸酯和作为C6的3’端帽。
在一个实施例中，该RNAi剂按5’至3’顺序包含：终止于3’磷酸酯的18-mer链、核糖醇间隔子、磷酸酯和C6 3’端帽。这在表2中图示为ribpC6(或ribC6)。
在一个实施例中，该RNAi剂按5’至3’顺序包含：终止于3’磷酸酯的18-mer链、核糖醇间隔子、磷酸酯和BP 3’端帽。这在表2中图示为ribpBP(或ribBP)。
在一个实施例中，该RNAi剂按5’至3’顺序包含：终止于3’磷酸酯的18-mer链、核糖醇间隔子、磷酸酯和C10 3’端帽。这在表2中图示为ribpC10(或ribC10)。
一个实施例示于图21中，其中该RNAi剂包含链，其中该链的3’端终止于磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：作为核糖醇的间隔子、磷酸酯和作为X058的3’端帽。虽然图21中展示的结构是18-mer RNAi剂，但是此结构可以针对具有任何长度、序列或靶标的任何RNAi链。此外，在此披露的任何3’端帽都可以用于代替X058。
在一些实施例中，该3’端帽是核糖醇。因此，该RNAi剂包含18-mer链，其中该18-mer链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：作为核糖醇的间隔子，第二磷酸酯或修饰的核苷间接头和作为第二核糖醇的3’端帽。在一个实施例中，该18-mer链的3’端终止于磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：作为核糖醇的间隔子、第二磷酸酯和作为第二核糖醇的3’端帽。这样一种结构展示于图19中(包括3’末端核苷酸和磷酸酯)并且将其指定为“二核糖醇”。
在不同实施例中，该3’端帽是三甘醇、环己基、苯基、BP(联苯基)、石胆酸(lithochol，lithocholic acid)、金刚烷、C3氨基、C7氨基、C3、C6、C8、C10、C12、X027、X038、X050、X051、X052、X058、X059、X060、X061、X062、X063、X064、X065、X066、X067、X068、X069、X097、X098、X109、X110、X111、X112、X113、X1009、X1010、X1011、X1012、X1013、X1015、X1016、X1017、X1018、X1019、X1020、X1021、X1022、X1024、X1025、X1026、X1027、X1028、X1047、X1048、X1049、X1062、X1063、X1064或核糖醇，或者在此披露的或本领域已知的任何3’端帽。包含以下RNAi剂的结构可以对于具有任何长度、序列或靶标的任何RNAi剂(包括但不限于双链RNA)使用：该RNAi剂按5’至3’顺序包含终止于3’末端磷酸酯或修饰的核苷间接头的链、核糖醇间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽(例如，在此披露的任何3’端帽，包括但不限于列于先前句子中的那些)，其中任选地一个或多个磷酸酯被修饰的核苷间接头置换，任选地一个或多个核苷酸被修饰，并且任选地一个或多个RNA核苷酸被DNA、PNA、LNA、吗啉代、TNA、GNA、ANA、HNA、CeNA、FANA和/或UNA置换。
二核糖醇间隔子。
在一些实施例中，该间隔子是二核糖醇。
在一个实施例中，该RNAi剂包含链，其中该链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子(其中该间隔子按5’至3’顺序包含：第一核糖醇；磷酸酯或修饰的核苷间接头；第二核糖醇；磷酸酯或修饰的核苷间接头)；和3’端帽。
在一个实施例中，该RNAi剂按5’至3’顺序包含：链，该链包含3’末端磷酸酯；第一核糖醇间隔子；磷酸酯；第二核糖醇间隔子；磷酸酯或修饰的核苷间接头；和3’端帽。这里示出了具有3’末端磷酸酯、第一核糖醇、磷酸酯和第二核糖醇的此结构：
二核糖醇间隔子
在一个实施例中，该RNAi剂按5’至3’顺序包含：终止于3’末端磷酸酯或修饰的核苷间接头的链、第一核糖醇间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头、第二核糖醇间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和作为核糖醇的3’端帽；此结构被指定为三核糖醇。
在一个实施例中，该RNAi剂按5’至3’顺序包含：终止于3’磷酸酯的链、核糖醇间隔子、磷酸酯和C6 3’端帽。这在表2中图示为ribpC6(或ribC6)。
在一个实施例中，该RNAi剂按5’至3’顺序包含：终止于3’磷酸酯的链、核糖醇间隔子、磷酸酯和BP 3’端帽。这在表2中图示为ribpBP(或ribBP)。
在一个实施例中，该RNAi剂按5’至3’顺序包含：终止于3’磷酸酯的链、核糖醇间隔子、磷酸酯和C10 3’端帽。这在表2中图示为ribpC10(或ribC10)。在不同实施例中，该3’端帽是三甘醇、环己基、苯基、BP(联苯基)、石胆酸(lithochol，lithocholic acid)、金刚烷、C3氨基、C7氨基、C3、C6、C8、C10、C12、X027、X038、X050、X051、X052、X058、X059、X060、X061、X062、X063、X064、X065、X066、X067、X068、X069、X097、X098、X109、X110、X111、X112、X113、X1009、X1010、X1011、X1012、X1013、X1015、X1016、X1017、X1018、X1019、X1020、X1021、X1022、X1024、X1025、X1026、X1027、X1028、X1047、X1048、X1049、X1062、X1063、X1064或在此披露的或本领域已知的任何3’端帽。
包含以下RNAi剂的结构可以对于具有任何长度、序列或靶标的任何RNAi剂(包括但不限于双链RNA)使用：该RNAi剂按5’至3’顺序包含终止于3’末端磷酸酯或修饰的核苷间接头的链、第一核糖醇间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头、第二核糖醇间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽(例如，在此披露的任何3’端帽)，其中任选地一个或多个磷酸酯被修饰的核苷间接头置换，任选地一个或多个核苷酸被修饰，并且任选地一个或多个RNA核苷酸被DNA、PNA、LNA、吗啉代、TNA、GNA、ANA、HNA、CeNA、FANA和/或UNA置换。
2’-甲氧基乙氧基核糖醇间隔子。
在一些实施例中，该间隔子是2’-甲氧基乙氧基核糖醇或其他类型的脱碱基核苷酸。
在一个实施例中，该RNAi剂包含链，其中该链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：作为2’-甲氧基乙氧基核糖醇的间隔子，第二磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端(例如，在此描述的或本领域已知的任何3’端帽)。换言之：在一个实施例中，该RNAi剂按5’至3’顺序包含：一链，该链包含3’末端磷酸酯或修饰的核苷间接头；作为2’-甲氧基乙氧基核糖醇的间隔子；磷酸酯或修饰的核苷间接头；和3’端帽(例如，在此描述的或本领域已知的任何3’端帽)。因此：在一个实施例中，该RNAi剂按5’至3’顺序包含：链，该链包含3’末端磷酸酯；作为2’-甲氧基乙氧基核糖醇的间隔子；磷酸酯或修饰的核苷间接头；和3’端帽。
这里示出了具有3’末端磷酸酯和2’-甲氧基乙氧基核糖醇间隔子的结构：2’-甲氧基乙氧基核糖醇间隔子。
在一个实施例中，该RNAi剂按5’至3’顺序包含：18-mer链，其中该18-mer链的3’端终止于磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：作为2’-甲氧基乙氧基核糖醇的间隔子、磷酸酯和作为X058的3’端帽。此结构可以在具有任何序列或靶标的任何RNAi链上。此外，在此披露的任何3’端帽都可以用于代替X058。
相关结构是2’-甲氧基乙氧基核糖醇与X058，其中该18-mer链的最后一个核苷酸是2’-MOE，并且该18-mer链的3’端终止于磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：作为2’-甲氧基乙氧基核糖醇的间隔子、第二磷酸酯和作为X058的3’端帽。
另一个实施例是2’-甲氧基乙氧基核糖醇与C6帽，其中该18-mer链的最后一个核苷酸是2’-MOE，并且该18-mer链的3’端终止于磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：作为2’-甲氧基乙氧基核糖醇的间隔子、磷酸酯和作为C6的3’端帽。
在一个实施例中，该RNAi剂按5’至3’顺序包含：终止于3’磷酸酯的18-mer链、2’-甲氧基乙氧基核糖醇间隔子、磷酸酯和C6 3’端帽。
在一个实施例中，该RNAi剂按5’至3’顺序包含：终止于3’磷酸酯的18-mer链、2’-甲氧基乙氧基核糖醇间隔子、磷酸酯和BP 3’端帽。
在一个实施例中，该RNAi剂按5’至3’顺序包含：终止于3’磷酸酯的18-mer链、2’-甲氧基乙氧基核糖醇间隔子、磷酸酯和C10 3’端帽。
在另一个实施例中，该RNAi剂包含链，其中该链的3’端终止于磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：作为2’-甲氧基乙氧基核糖醇的间隔子、磷酸酯和作为X058的3’端帽。
在一些实施例中，该3’端帽是2’-甲氧基乙氧基核糖醇。因此，该RNAi剂包含18-mer链，其中该18-mer链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：作为2’-甲氧基乙氧基核糖醇的间隔子，第二磷酸酯或修饰的核苷间接头和作为第二2’-甲氧基乙氧基核糖醇的3’端帽。在一个实施例中，该18-mer链的3’端终止于磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：作为2’-甲氧基乙氧基核糖醇的间隔子、第二磷酸酯和作为第二2’-甲氧基乙氧基核糖醇的3’端帽。
在不同实施例中，该3’端帽是三甘醇、环己基、苯基、BP(联苯基)、石胆酸(lithochol，lithocholic acid)、金刚烷、C3氨基、C7氨基、C3、C6、C8、C10、C12、X027、X038、X050、X051、X052、X058、X059、X060、X061、X062、X063、X064、X065、X066、X067、X068、X069、X097、X098、X109、X110、X111、X112、X113、X1009、X1010、X1011、X1012、X1013、X1015、X1016、X1017、X1018、X1019、X1020、X1021、X1022、X1024、X1025、X1026、X1027、X1028、X1047、X1048、X1049、X1062、X1063、X1064或2’-甲氧基乙氧基核糖醇，或者在此披露的或本领域已知的任何3’端帽。包含以下RNAi剂的结构可以对于具有任何长度、序列或靶标的任何RNAi剂(包括但不限于双链RNA)使用：该RNAi剂按5’至3’顺序包含终止于3’末端磷酸酯或修饰的核苷间接头的链、2’-甲氧基乙氧基核糖醇间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽(例如，在此披露的任何3’端帽，包括但不限于列于先前句子中的那些)，其中任选地一个或多个磷酸酯被修饰的核苷间接头置换，任选地一个或多个核苷酸被修饰，并且任选地一个或多个RNA核苷酸被DNA、PNA、LNA、吗啉代、TNA、GNA、ANA、HNA、CeNA、FANA和/或UNA置换。
2’-脱氧核糖醇间隔子。
在一些实施例中，该间隔子是2’-脱氧核糖醇。
在一个实施例中，该RNAi剂按5’至3’顺序包含：终止于3’磷酸酯或修饰的核苷间接头的链、作为2’-脱氧核糖醇(2’-脱氧rib)的间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽。
在一个实施例中，该RNAi剂按5’至3’顺序包含：终止于3’磷酸酯的链、作为2’-脱氧核糖醇(2’-脱氧rib)的间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽。这里示出了具有3’末端磷酸酯和2’-脱氧核糖醇的结构：2’-脱氧核糖醇(2’-脱氧rib)。
在一个实施例中，该RNAi剂按5’至3’顺序包含：链，该链包含3’末端磷酸酯；第一核糖醇间隔子；磷酸酯；第二核糖醇间隔子；磷酸酯或修饰的核苷间接头；和3’端帽。
在一个实施例中，该RNAi剂按5’至3’顺序包含：终止于3’磷酸酯的链、2’-脱氧核糖醇间隔子、磷酸酯和C12 3’端帽。这在表2中图示为ribpC12(或ribC12)。此实施例被指定为“2’脱氧ribC12”并且被展示于表2中。
在不同实施例中，该3’端帽是三甘醇、环己基、苯基、BP(联苯基)、石胆酸(lithochol，lithocholic acid)、金刚烷、C3氨基、C7氨基、C3、C6、C8、C10、C12、X027、X038、X050、X051、X052、X058、X059、X060、X061、X062、X063、X064、X065、X066、X067、X068、X069、X097、X098、X109、X110、X111、X112、X113、X1009、X1010、X1011、X1012、X1013、X1015、X1016、X1017、X1018、X1019、X1020、X1021、X1022、X1024、X1025、X1026、X1027、X1028、X1047、X1048、X1049、X1062、X1063、X1064或在此披露的或本领域已知的任何3’端帽。
包含以下RNAi剂的结构可以对于具有任何长度、序列或靶标的任何RNAi剂(包括但不限于双链RNA)使用：该RNAi剂按5’至3’顺序包含终止于3’末端磷酸酯或修饰的核苷间接头的链、2’-脱氧核糖醇间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽(例如，在此披露的任何3’端帽)，其中任选地一个或多个磷酸酯被修饰的核苷间接头置换，任选地一个或多个核苷酸被修饰，并且任选地一个或多个RNA核苷酸被DNA、PNA、LNA、吗啉代、TNA、GNA、ANA、HNA、CeNA、FANA和/或UNA置换。
C3间隔子。
在一些实施例中，该间隔子是C3。
在一个实施例中，该RNAi剂按5’至3’顺序包含：终止于3’磷酸酯或修饰的核苷间接头的链、作为C3的间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽。
在一个实施例中，该RNAi剂按5’至3’顺序包含：终止于3’磷酸酯的链、作为C3的间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽。
该C3间隔子具有化学式-(CH2)3-。这里示出了具有3’末端磷酸酯和C3间隔子的结构：C3。
一个实施例示于图21中，其中该RNAi剂按5’至3’顺序包含：终止于3’磷酸酯的链、C3间隔子、磷酸酯和作为X058的3’端帽。虽然图21中展示的结构是18-mer RNAi剂，但是此结构可以针对具有任何长度、序列或靶标的任何RNAi链。此外，在此披露的任何3’端帽都可以用于代替X058。
另一个实施例示于图14中，它展示了针对因子VII的RNAi剂的一部分，该RNAi剂包含链，其中该链终止于磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：C3间隔子、磷酸酯和作为C6的3’端帽。这被指定为“C3pC6突出端”。此结构可以在具有任何序列或靶标的任何RNAi链上。此外，在此披露的或本领域已知的任何3’端帽都可以用于代替C6，并且任何修饰的核苷间接头都可以用于代替磷酸酯。
包含C3间隔子的RNAi剂的效能示于图22中。制备了包含一链的两种不同HuR构建体，其中该链的3’端终止于磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：C3间隔子、磷酸酯和3’端帽(其是C6或X058)。这两种构建体都能够介导RNA干扰。
在不同实施例中，该3’端帽是三甘醇、环己基、苯基、BP(联苯基)、石胆酸(lithochol，lithocholic acid)、金刚烷、C3氨基、C7氨基、C3、C6、C8、C10、C12、X027、X038、X050、X051、X052、X058、X059、X060、X061、X062、X063、X064、X065、X066、X067、X068、X069、X097、X098、X109、X110、X111、X112、X113、X1009、X1010、X1011、X1012、X1013、X1015、X1016、X1017、X1018、X1019、X1020、X1021、X1022、X1024、X1025、X1026、X1027、X1028、X1047、X1048、X1049、X1062、X1063、X1064或在此披露的或本领域已知的任何3’端帽。
包含以下RNAi剂的结构可以对于具有任何长度、序列或靶标的任何RNAi剂(包括但不限于双链RNA)使用：该RNAi剂按5’至3’顺序包含终止于3’末端磷酸酯或修饰的核苷间接头的链、C3间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽(例如，在此披露的任何3’端帽)，其中任选地一个或多个磷酸酯被修饰的核苷间接头置换，任选地一个或多个核苷酸被修饰，并且任选地一个或多个RNA核苷酸被DNA、PNA、LNA、吗啉代、TNA、GNA、ANA、HNA、CeNA、FANA和/或UNA置换。
C4间隔子、C5间隔子和C6间隔子。
在不同实施例中，该间隔子是C4或C5或C6。
在一个实施例中，该RNAi剂包含链，其中该链的3’端终止于3’磷酸酯或修饰的核苷间接头，并且进一步包含作为C4或C5或C6的间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽。
在一个实施例中，该RNAi剂包含两条链，其中每条链的3’端终止于3’磷酸酯或修饰的核苷间接头，并且进一步包含间隔子、第二磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，其中一条链或两条链中的间隔子是C4或C5或C6。
C3至C6间隔子可以被定义为：
C3＝1,3-丙烷-二醇
C4＝1,4-丁烷-二醇
C5＝1,5-戊烷-二醇
C6＝1,6-己烷-二醇
在一些背景下：
该C4间隔子具有化学式-(CH2)4-。
该C5间隔子具有化学式-(CH2)5-。
该C6间隔子具有化学式-(CH2)6-。
在不同实施例中，该3’端帽是三甘醇、环己基、苯基、BP(联苯基)、石胆酸(lithochol，lithocholic acid)、金刚烷、C3氨基、C7氨基、C3、C6、C8、C10、C12、X027、X038、X050、X051、X052、X058、X059、X060、X061、X062、X063、X064、X065、X066、X067、X068、X069、X097、X098、X109、X110、X111、X112、X113、X1009、X1010、X1011、X1012、X1013、X1015、X1016、X1017、X1018、X1019、X1020、X1021、X1022、X1024、X1025、X1026、X1027、X1028、X1047、X1048、X1049、X1062、X1063、X1064或在此披露的或本领域已知的任何3’端帽。
包含以下RNAi剂的结构可以对于具有任何序列或靶标的任何RNAi剂(包括但不限于双链RNA)使用：该RNAi剂按5’至3’顺序包含终止于3’末端磷酸酯或修饰的核苷间接头的链、C4或C5或C6间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽(例如，在此披露的任何3’端帽)，其中任选地一个或多个磷酸酯被修饰的核苷间接头置换，任选地一个或多个核苷酸被修饰，并且任选地一个或多个RNA核苷酸被DNA、PNA、LNA、吗啉代、TNA、GNA和/或UNA置换。
作为澄清性注释，本披露指出，术语“C3”[-(CH2)3-]、“C4”[-(CH2)4-]和“C5”[-(CH2)5-]在此通常用于指定间隔子，类似术语(C3、C4、C5“接头”)还用于指定3’端帽的一部分。在这些图中，不同接头用于区分不同3’端帽的部分。还应当指出的是，术语“C3”用于指定C3 3’端帽(例如，图15A)、C3间隔子(图21)和C3接头(图13)。C6间隔子也应该与C6端帽区别开来。
4-甲氧基丁烷-1,3-二醇(5300)间隔子。
在不同实施例中，该间隔子是4-甲氧基丁烷-1,3-二醇。4-甲氧基丁烷-1,3-二醇也被指定为5300、A5300、C5300、G5300和UG5300。
在一个实施例中，该RNAi剂按5’至3’顺序包含：终止于3’磷酸酯(3’末端磷酸酯)或修饰的核苷间接头的链、作为4-甲氧基丁烷-1,3-二醇的间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽。
这里示出了具有3’末端磷酸酯和4-甲氧基丁烷-1,3-二醇间隔子的结构：
4-甲氧基丁烷-1,3-二醇也被指定为5300、A5300、C5300、G5300和UG5300。在一个实施例中，该RNAi剂按5’至3’顺序包含：终止于3’磷酸酯的链、作为4-甲氧基丁烷-1,3-二醇的间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽。
一个实施例示于图21中，其中该RNAi剂按5’至3’顺序包含：终止于3’磷酸酯的链、4-甲氧基丁烷-1,3-二醇间隔子、磷酸酯和作为X058的3’端帽。虽然图21中展示的结构是18-mer RNAi剂，但是此结构可以针对具有任何长度、序列或靶标的任何RNAi链。此外，在此披露的任何3’端帽都可以用于代替X058。
包含C5300间隔子的RNAi剂的效能示于图22中。制备了包含18-mer的两种不同HuR构建体，其中该18-mer的3’端终止于磷酸酯并且进一步包含C5300间隔子、磷酸酯和3’端帽(其是C6或X058)。这两种构建体都能够介导RNA干扰。
在不同实施例中，该3’端帽是三甘醇、环己基、苯基、BP(联苯基)、石胆酸(lithochol，lithocholic acid)、金刚烷、C3氨基、C7氨基、C3、C6、C8、C10、C12、X027、X038、X050、X051、X052、X058、X059、X060、X061、X062、X063、X064、X065、X066、X067、X068、X069、X097、X098、X109、X110、X111、X112、X113、X1009、X1010、X1011、X1012、X1013、X1015、X1016、X1017、X1018、X1019、X1020、X1021、X1022、X1024、X1025、X1026、X1027、X1028、X1047、X1048、X1049、X1062、X1063、X1064或在此披露的或本领域已知的任何3’端帽。
包含以下RNAi剂的结构可以对于具有任何长度、序列或靶标的任何RNAi剂(包括但不限于双链RNA)使用：该RNAi剂按5’至3’顺序包含终止于3’末端磷酸酯或修饰的核苷间接头的链、4-甲氧基丁烷-1,3-二醇间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽(例如，在此披露的任何3’端帽)，其中任选地一个或多个磷酸酯被修饰的核苷间接头置换，任选地一个或多个核苷酸被修饰，并且任选地一个或多个RNA核苷酸被DNA、PNA、LNA、吗啉代、TNA、GNA、ANA、HNA、CeNA、FANA和/或UNA置换。
磷酸酯或修饰的核苷间接头
在不同实施例中，该修饰的核苷间接头是：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酰胺酯、硼烷膦酸酯、酰胺接头或具有化学式(I)的化合物，如下文详述的。
在一些实施例中，该RNAi剂的一条链或两条链在3’端包含间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽(例如，如在此披露的3’端帽)。
在不同实施例中，该RNAi剂的一条链或两条链的磷酸酯中的一个或多个被置换。因此：在不同实施例中，一条链或两条链的一个或多个核苷酸具有修饰的核苷间接头。在一些实施例中，3’末端磷酸酯被置换。在一些实施例中，一条链或两条链的一个或多个核苷酸具有修饰的核苷间接头，和/或修饰的核苷间接头被插在间隔子与3’端帽之间。
在一个实施例中，本披露涵盖一种包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’-末端包含3’端帽，其中该3’端帽选自列于表1或2中或在此另外披露的3’端帽，并且其中至少一个核苷酸具有修饰的核苷间接头(例如，其中核苷酸的至少一个磷酸酯被修饰的核苷间接头置换)，其中该修饰的核苷间接头是：硫代磷酸酯(PS)、二硫代磷酸酯、磷酰胺酯、硼烷膦酸酯、酰胺接头或具有化学式(I)的化合物：其中R3选自O-、S-、NH2、BH3、CH3、C1-6烷基、C6-10芳基、C1-6烷氧基和C6-10芳基-氧基，其中C1-6烷基和C6-10芳基未被取代或任选地独立地被独立地选自以下各项中的1至3个基团取代：卤素、羟基和NH2；并且R4选自O、S、NH或CH2。
图20D和E示出了不同RNAi剂的效能，其中正义(S)链或反义(AS)链的2个3’末端NT(核苷酸)是2’MOE磷酸酯(MOE_PO)、2’OMe磷酸酯(OMe-PO)、RNA(RNA_PO)、DNA(DNA_PO)、2’FPS(F_PS)、RNA PS(RNA_PS)、LNA磷酸酯(LNA_PO)、2’F磷酸酯(F_PO)、2’OMe PS(OMe_PS)、2’MOE PS(MOE_PS)、DNA PS(DNA_PS)或LNA PS(LNA_PS)。对于图20D和20E中的RNAi剂而言，所有测试的RNAi剂都是有效的。应当指出的是百分比不表示敲低，而是相对于其他RNAi剂的敲低。例如，100％表示这些有效的RNAi剂的所有反义链的平均敲低。
在一个实施例中，本披露涵盖一种包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’-末端包含3’端帽，其中该3’端帽选自列于表1或2中或在此另外披露的3’端帽，并且其中一条链或两条链上的至少3’末端核苷酸具有修饰的核苷间接头(例如，其中一条链或两条链上的3’核苷酸的磷酸酯被修饰的核苷间接头置换)，其中该修饰的核苷间接头是硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酰胺酯、硼烷膦酸酯、酰胺接头或具有化学式(I)的化合物。
在一个实施例中，表1的化合物经由末端磷酸酯基团连接，所述基团结合至至少一条RNAi剂链的3’末端处的3’碳。此类化合物示于例如表2中。
在一个实施例中，表2的化合物具有末端硫代磷酸酯基团，所述基团结合至至少一条RNAi剂链的3’末端处的3’碳。因此，在不同实施例中，在列于表2中的3’端帽中，磷酸酯基团被硫代磷酸酯置换。在另外的实施例中，在此列为C3、C6、C12、三甘醇、环己基、苯基、联苯基、金刚烷、石胆酸的不同3’端帽的磷酸酯基团可以被硫代磷酸酯置换。在一个具体实施例中，C3 3’端帽中的磷酸酯基团被硫代磷酸酯置换(并且被指定为“PS-C3”，如在表2中展示的以及实例6和图20A-E中所描述的)。在一个具体实施例中，C6 3’端帽中的磷酸酯基团被硫代磷酸酯置换(并且被指定为“PS-C6”，如在表2中展示的)。在一个具体实施例中，C10 3’端帽中的磷酸酯基团被硫代磷酸酯置换(并且被指定为“PS-C10”，如在表2中展示的)。在一个具体实施例中，联苯基(BP)3’端帽中的磷酸酯基团被硫代磷酸酯置换(并且被指定为“PS-BP”，如在表2中展示的)。
在不同实施例中，R1＝OH；并且R2＝具有化学式(I)的化合物。此结构还示于图18C中。
3’端帽
在一些实施例中，该RNAi剂的一条链或两条链在3’端包含间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽(例如，如在此披露的3’端帽)。
3’端帽是与包含RNAi剂的分子的3’端结合的非核苷酸化学部分，例如，以下项的3’末端(或3’端)：(a)包含链的分子，其中该链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头；或(b)按5’至3’顺序包含以下项的分子：链(其中该链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头)、间隔子和第二磷酸酯或修饰的核苷间接头。3’端帽执行以下功能中的至少一种：允许由该分子介导的RNA干扰，保护该分子免于被降解或降低该分子(例如，被核酸酶)降解的量或速率，降低正义链的脱靶效应，或提高由该分子介导的RNA干扰的活性、持续时间或效能。通过将3’端帽描述为“非核苷酸的”，意指核苷酸包含三种组分：磷酸酯、戊糖(例如，核糖或脱氧核糖)和核碱基，并且3’端帽不包含所有三种组分。
下表2呈现了不同3’端帽(包括示于表1中的那些中的一些)的一些结构。在若干这些结构中，还针对上下文示出了RNAi剂链的末端3’磷酸酯，尽管此磷酸酯不是3’端帽的一部分。
另外的信息可以发现于美国专利申请61/886,753；61/930,681；61/886,748；61/886,739；和61/886,760中，将其全部通过引用以其全文而结合。
表2.RNA干扰中使用的RNAi剂的3’端帽
2.A.用于在RNAi剂中使用的3’端帽。
在一些实施例中，RNAi剂的链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且任选地按5’至3’顺序进一步包含间隔子和磷酸酯或修饰的核苷间接头。作为非限制性实例，这里示出磷酸酯键合至3’端帽。
2.B.包含链的RNAi剂，其中该链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽。
以下非限制性实例示出了例如其中间隔子是C3、核糖醇或2’-脱氧核糖醇的RNAi剂。示出了具体3’端帽(C3、C6、C8、C10、C12、BP、C058等)，但是任何3’端帽都可以与任何间隔子或磷酸酯或修饰的核苷间接头组合使用。
另外的结构尤其包括：ribp三甘醇、ribp环己基、ribp苯基、ribpBP(联苯基)、ribp石胆酸(lithochol，lithocholic acid)、ribp金刚烷、ribpC3氨基、ribpC7氨基、ribpC3、ribpC6、ribpC8、ribpC10、ribpC12、ribpX027、ribpX027、ribpX038、ribpX050、ribpX051、ribpX052、ribpX059、ribpX060、ribpX061、ribpX062、ribpX063、ribpX064、ribpX065、ribpX066、ribpX067、ribpX068、ribpX069、ribpX097、ribpX098、ribpX109、ribpX110、ribpX111、ribpX112、ribpX113、ribpX1009、ribpX1011、ribpX1012、ribpX1013、ribpX1015、ribpX1016、ribpX1017、ribpX1018、ribpX1019、ribpX1020、ribpX1021、ribpX1022、ribpX1024、ribpX1025、ribpX1026、ribpX1027、ribpX1028、ribpX1047、ribpX1048、ribpX1049、ribpX1062、ribpX1063、ribpX1064、ribp核糖醇等。这些表示作为核糖醇的间隔子、磷酸酯和作为三甘醇、环己基、苯基、BP(联苯基)、石胆酸(lithochol，lithocholicacid)、金刚烷、C3氨基、C7氨基、C3、C6、C8、C10、C12、X027、X038、X050等的3’端帽。
另外的结构尤其包括：diribp三甘醇、diribp环己基、diribp苯基、diribpBP(联苯基)、diribp石胆酸(lithochol，lithocholic acid)、diribp金刚烷、diribpC3氨基、diribpC7氨基、diribpC3、diribpC6、diribpC8、diribpC10、diribpC12、diribpX027、diribpX027、diribpX038、diribpX050、diribpX051、diribpX052、diribpX059、diribpX060、diribpX061、diribpX062、diribpX063、diribpX064、diribpX065、diribpX066、diribpX067、diribpX068、diribpX069、diribpX097、diribpX098、diribpX109、diribpX110、diribpX111、diribpX112、diribpX113、diribpX1009、diribpX1011、diribpX1012、diribpX1013、diribpX1015、diribpX1016、diribpX1017、diribpX1018、diribpX1019、diribpX1020、diribpX1021、diribpX1022、diribpX1024、diribpX1025、diribpX1026、diribpX1027、diribpX1028、diribpX1047、diribpX1048、diribpX1049、diribp1062、diribp1063、diribp1064、diribp核糖醇等。这些表示作为二核糖醇的间隔子、磷酸酯和作为三甘醇、环己基、苯基、BP(联苯基)、石胆酸(lithochol，lithocholic acid)、金刚烷、C3氨基、C7氨基、C3、C6、C8、C10、C12、X027、X038、X050等的3’端帽。
另外的结构尤其包括：2’-脱氧ribp三甘醇、2’-脱氧ribp环己基、2’-脱氧ribp苯基、2’-脱氧ribpBP(联苯基)、2’-脱氧ribp石胆酸(plithochol，lithocholic acid)、2’-脱氧ribp金刚烷、2’-脱氧ribpC3氨基、2’-脱氧ribpC7氨基、2’-脱氧ribpC3、2’-脱氧ribpC6、2’-脱氧ribpC8、2’-脱氧ribpC10、2’-脱氧ribpC12、2’-脱氧ribpX027、2’-脱氧ribpX027、2’-脱氧ribpX038、2’-脱氧ribpX050、2’-脱氧ribpX051、2’-脱氧ribpX052、2’-脱氧ribpX059、2’-脱氧ribpX060、2’-脱氧ribpX061、2’-脱氧ribpX062、2’-脱氧ribpX063、2’-脱氧ribpX064、2’-脱氧ribpX065、2’-脱氧ribpX066、2’-脱氧ribpX067、2’-脱氧ribpX068、2’-脱氧ribpX069、2’-脱氧ribpX097、2’-脱氧ribpX098、2’-脱氧ribpX109、2’-脱氧ribpX110、2’-脱氧ribpX111、2’-脱氧ribpX112、2’-脱氧ribpX113、2’-脱氧ribpX1009、2’-脱氧ribpX1011、2’-脱氧ribpX1012、2’-脱氧ribpX1013、2’-脱氧ribpX1015、2’-脱氧ribpX1016、2’-脱氧ribpX1017、2’-脱氧ribpX1018、2’-脱氧ribpX1019、2’-脱氧ribpX1020、2’-脱氧ribpX1021、2’-脱氧ribpX1022、2’-脱氧ribpX1024、2’-脱氧ribpX1025、2’-脱氧ribpX1026、2’-脱氧ribpX1027、2’-脱氧ribpX1028、2’-脱氧ribpX1047、2’-脱氧ribpX1048、2’-脱氧ribpX1049、2’-脱氧ribp 1062、2’-脱氧ribp1063、2’-脱氧ribp 1064、2’-脱氧ribp核糖醇等。这些表示作为2’-脱氧核糖醇的间隔子、磷酸酯和作为三甘醇、环己基、苯基、BP(联苯基)、石胆酸(lithochol，lithocholic acid)、金刚烷、C3氨基、C7氨基、C3、C6、C8、C10、C12、X027、X038、X050等的3’端帽。
另外的结构尤其包括：C3p三甘醇、C3p环己基、C3p苯基、C3pBP(联苯基)、C3p石胆酸(lithochol，lithocholic acid)、C3p金刚烷、C3pC3氨基、C3pC7氨基、C3pC3、C3pC6、C3pC8、C3pC10、C3pC12、C3pX027、C3pX027、C3pX038、C3pX050、C3pX051、C3pX052、C3pX059、C3pX060、C3pX061、C3pX062、C3pX063、C3pX064、C3pX065、C3pX066、C3pX067、C3pX068、C3pX069、C3pX097、C3pX098、C3pX109、C3pX110、C3pX111、C3pX112、C3pX113、C3pX1009、C3pX1011、C3pX1012、C3pX1013、C3pX1015、C3pX1016、C3pX1017、C3pX1018、C3pX1019、C3pX1020、C3pX1021、C3pX1022、C3pX1024、C3pX1025、C3pX1026、C3pX1027、C3pX1028、C3pX1047、C3pX1048、C3pX1049、C3pX1062、C3pX1063、C3pX1064、C3p核糖醇等。这些表示作为C3的间隔子、磷酸酯和作为三甘醇、环己基、苯基、BP(联苯基)、石胆酸(lithochol，lithocholic acid)、金刚烷、C3氨基、C7氨基、C3、C6、C8、C10、C12、X027、X038、X050等的3’端帽。
另外的结构尤其包括：C4p三甘醇、C4p环己基、C4p苯基、C4pBP(联苯基)、C4p石胆酸(lithochol，lithocholic acid)、C4p金刚烷、C4pC4氨基、C4pC7氨基、C4pC4、C4pC6、C4pC8、C4pC10、C4pC12、C4pX027、C4pX027、C4pX038、C4pX050、C4pX051、C4pX052、C4pX059、C4pX060、C4pX061、C4pX062、C4pX063、C4pX064、C4pX065、C4pX066、C4pX067、C4pX068、C4pX069、C4pX097、C4pX098、C4pX109、C4pX110、C4pX111、C4pX112、C4pX113、C4pX1009、C4pX1011、C4pX1012、C4pX1013、C4pX1015、C4pX1016、C4pX1017、C4pX1018、C4pX1019、C4pX1020、C4pX1021、C4pX1022、C4pX1024、C4pX1025、C4pX1026、C4pX1027、C4pX1028、C4pX1047、C4pX1048、C4pX1049、C4pX1062、C4p1063、C4p1064、C4p核糖醇等。这些表示作为C4的间隔子、磷酸酯和作为三甘醇、环己基、苯基、BP(联苯基)、石胆酸(lithochol，lithocholic acid)、金刚烷、C4氨基、C7氨基、C4、C6、C8、C10、C12、X027、X038、X050等的3’端帽。
另外的结构尤其包括：C5p三甘醇、C5p环己基、C5p苯基、C5pBP(联苯基)、C5p石胆酸(lithochol，lithocholic acid)、C5p金刚烷、C5pC5氨基、C5pC7氨基、C5pC5、C5pC6、C5pC8、C5pC10、C5pC12、C5pX027、C5pX027、C5pX038、C5pX050、C5pX051、C5pX052、C5pX059、C5pX060、C5pX061、C5pX062、C5pX063、C5pX064、C5pX065、C5pX066、C5pX067、C5pX068、C5pX069、C5pX097、C5pX098、C5pX109、C5pX110、C5pX111、C5pX112、C5pX113、C5pX1009、C5pX1011、C5pX1012、C5pX1013、C5pX1015、C5pX1016、C5pX1017、C5pX1018、C5pX1019、C5pX1020、C5pX1021、C5pX1022、C5pX1024、C5pX1025、C5pX1026、C5pX1027、C5pX1028、C5pX1047、C5pX1048、C5pX1049、C5pX1062、C5pX1063、C5pX1064、C5p核糖醇等。这些表示作为C5的间隔子、磷酸酯和作为三甘醇、环己基、苯基、BP(联苯基)、石胆酸(lithochol，lithocholic acid)、金刚烷、C5氨基、C7氨基、C5、C6、C8、C10、C12、X027、X038、X050等的3’端帽。
2.C.RNAi剂，其中链终止于3’末端硫代磷酸酯并且具有3’端帽。
在本披露的一些RNAi剂中，链的3’端终止于修饰的核苷间接头(例如，PS)并且进一步包含3’端帽(C3、C6等)。这里示出了此类结构的非限制性实例，包括3’端帽、末端修饰的核苷间接头，并且在第一种情况下，包括糖和碱基。换言之，至少一条链的3’-末端在3’碳处包含修饰，其中该修饰选自PS-C3、PS-C6、PS-C8、PS-C10、PS-C12、PS-BP、PS-X058等，或在此所述的任何修饰的核苷间接头，和在此所述的任何3’端帽。
另外的结构尤其包括：PS-三甘醇、PS-环己基、PS-苯基、PS-BP(联苯基)、PS-石胆酸(lithochol，lithocholic acid)、PS-金刚烷、PS-C3氨基、PS-C7氨基、PS-C3、PS-C6、PS-C8、PS-C10、PS-C12、PS-X027、PS-X027、PS-X038、PS-X050、PS-X051、PS-X052、PS-X059、PS-X060、PS-X061、PS-X062、PS-X063、PS-X064、PS-X065、PS-X066、PS-X067、PS-X068、PS-X069、PS-X097、PS-X098、PS-X109、PS-X110、PS-X111、PS-X112、PS-X113、PS-X1009、PS-X1011、PS-X1012、PS-X1013、PS-X1015、PS-X1016、PS-X1017、PS-X1018、PS-X1019、PS-X1020、PS-X1021、PS-X1022、PS-X1024、PS-X1025、PS-X1026、PS-X1027、PS-X1028、PS-X1047、PS-X1048、PS-X1049、PS-X1062、PS-X1063、PS-X1064、PS-核糖醇等。这些表示硫代磷酸酯(PS)和作为三甘醇、环己基、苯基、BP(联苯基)、石胆酸(lithochol，lithocholic acid)、金刚烷、C3氨基、C7氨基、C3、C6、C8、C10、C12、X027、X038、X050等的3’端帽。
关于表2(包括2.A、2.B和2.C)：
没有提供C7氨基和C3氨基(也被分别指定为氨基C7或氨基C3)的合成方案，因为这些分子可从格伦研究公司(Glen Research)(斯特林(Sterling)，弗吉尼亚州)商购并且合成方案先前由该公司公开。
C7氨基：目录号：20-2957-xx；描述：3'-氨基-修饰剂C7 CPG500；2-二甲氧基三苯甲基氧基甲基-6-芴基甲氧基羰基氨基-己烷-1-琥珀酰基-长链烷基氨基-CPG；技术通报：氨基修饰剂C3或C7 CPG的预合成(Technical Bulletin:Pre-Synthesis Labeling ofAminomodifier C3 or C7 CPG)，格伦研究公司(斯特林，弗吉尼亚州)。
C3氨基：目录号：20-2913-xx；描述：3'-间隔子C3CPG；(1-二甲氧基三苯甲基氧基-丙二醇-3-琥珀酰基)-长链烷基氨基-CPG，格伦研究公司(斯特林，弗吉尼亚州)。格伦研究公司还指出，格伦研究公司没有关于丙基CPG的确切数据来支持以下断言，即它保护寡聚物免于被外切核酸酶消化并且不允许聚合酶延伸。格伦研究公司的结论基于与丙基氨基-修饰剂CPG类比[森德贵(Zendegui)等人核酸研究(Nucleic Acids Research)，1992，20，307-314](目录号20-2950-41)。这种修饰保护寡聚物免于被外切核酸酶消化但允许很小程度的聚合酶延伸，因为该修饰剂从3’端被消除至约10％的水平，从而使得3'-羟基基团可利用。HPLC实验已经显示不存在丙基基团从由间隔子C3-CPG形成的寡聚物上的可检测消除。
在RNAi剂链的情况下，示例性3’端帽C8和C10也展示于图18C中，并且核糖醇和二核糖醇展示于图19中。
应当指出的是表2列出了包含间隔子(例如，C3p、核糖醇或2'-脱氧核糖醇)和3’端帽两者的不同3’端帽。因此，例如，取决于上下文，“C3pC6”可以被认为是“3’端帽”，或者被认为是“间隔子和磷酸酯和3’端帽”(C3+p+C6)或间隔子、磷酸酯和3’端帽。包含间隔子和3’端帽的RNAi剂的效能示于例如5A、5B、10和14中。
本披露涵盖包含如示于表1或2中或在此另外披露的3’端帽的任何RNAi剂。
3’端帽对于不同序列和靶标的用途
多项实验已经显示在此披露的3’端帽可以用于有效RNAi剂的不同链的3’端，这些RNAi剂可以介导针对多种不同mRNA靶标的RNA干扰，这些靶标包括铁调素、HuR(ELAVL1)、PLK1、SSB和FVII(因子7或F7)。这些3’端帽也可以用在针对多种物种的RNAi剂上，包括多种哺乳动物物种，因为包含不同3’端帽的RNAi剂在小鼠和人类细胞中都是有效的。还针对若干另外的基因靶标(未在此描述)构建了包含在此披露的不同3’端帽的成功的RNAi剂。已经发现在此所述的3’端帽在RNAi剂中在体内和在体外都是有用的。此外，构建并测试了多种成功的RNAi剂，其中一条链或两条链在3’端按5’至3’顺序包含如在此披露的间隔子、如在此披露的磷酸酯或核苷间接头和如在此披露的3’端帽。
显然，如本领域的普通技术人员应已知的，并不是每个测试的序列都产生成功的RNAi剂，并且当然也并不是与任何3’端帽，或者与任何间隔子、磷酸酯或核苷间接头和3’端帽组合都产生成功的RNAi剂。然而，在此所述的3’端帽可以用于设计并测试不同RNAi剂，其中的一些可以具有近似等于其他形式(例如，标准结构)的活性；并且一些可以产生改善的品质(例如，增加的活性、活性持续时间，减少的脱靶效应等)。
因此，在此披露的新颖3’端帽可以与多种不同序列和基因靶标一起使用。
包含3’端帽的铁调素RNAi剂。
如在此(例如图5A至9)详述的，构建了靶向铁调素的包含在此披露的不同3’端帽的有效RNAi剂。
这些构建体详述于图和图注中。这些构建体成功地靶向小鼠和人类铁调素两者。
在这些RNAi剂中使用的成功的3’端帽包括BP、C6、X027、X038、X050、X051、X052、X058、X059、X060、X061、X062、X063、X064、X065、X066、X067、X068、X069等。这些RNAi剂中的一些包含链，其中该链的3’端终止于磷酸酯并且进一步包含3’端帽。其他RNAi剂包含链，其中该链的3’端终止于磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子(例如，核糖醇)、磷酸酯和3’端帽。
包含3’端帽的HuR(ELAV1)RNAi剂。
构建了包含不同3’端帽的针对HuR的有效RNAi剂。参见图16A和B以及22-24，图注等。
例如：下文示出了针对另一靶标HuR的有效18-mer RNAi剂：
AS：u U a A u U a U c U a U u C c G u A rib C6
S：C6 rib A a U u A a U a G a U a A g G c A u
n(a、u、c、g)：2'Ome-n(a、u、c、g)
上文按5’至3’示出的AS(反义)链的序列是SEQ ID NO:87；上文按3’至5’示出的S(正义)链的序列是SEQ ID NO:88。此RNAi剂包含两条链，每条链按5’至3’顺序包含RNAi剂链、间隔子(核糖醇或rib)、磷酸酯(未示出)和3’端帽(C6)。可以使用其他间隔子和3’端帽，并且此磷酸酯和其他磷酸酯可以被修饰的核苷间接头置换。
产生了其他有效的HuR RNAi剂，其中使用的序列是：
U002pUpApApU004pU004pApU004pCpU004pApU004pU004pCpCpGpU005pA005pC027pXnnnn(SEQID NO:89)
其中C027是核糖醇(或其他间隔子，如C3或C5300，视需要)。
002＝DNA
004＝2'Ome
005＝2'MOE
所有其他位置是RNA
027＝核糖醇
p＝磷酸酯
Xnnn＝3’端帽(X058、X109等)
在于此披露的这个序列和不同其他序列中，U004指示具有U碱基具有2’Ome修饰的核苷酸；U002指示具有U碱基的核苷酸，其是DNA；U005指示具有U碱基具有2’MOE修饰的nt。类似地，其他核苷酸被修饰，例如，U004指示具有U碱基和2’Ome修饰的核苷酸。
用此HuR序列产生了有效的RNAi剂，这些RNAi剂包含RNAi剂链，该链在3’端按5’至3’顺序进一步包含：间隔子(核糖醇)、磷酸酯和3’端帽(X058、X109、X110、X111、X112、X113、X1009、X1010、X1011、X1012、X1013、X1015、X1016、X1017、X1018、X1019、X1020、X1021、X1022、X1024、X1025、X1026、X1027或X1028)。在Huh-7细胞中在体外测试了这些RNAi剂并且在30pM下全部都展示出至少约60％至80％的基因敲低。
进一步测试了这些HuR构建体中的若干构建体，包括包含该RNAi剂链的那些，该链在3’端按5’至3’顺序进一步包含：间隔子(核糖醇)、磷酸酯和3’端帽(X058、X110、X111、X112、X1012、X1013、X1018、X1019、X1025、X1027、X1028)。在Huh-7细胞中在体外测试了这些构建体并且在第3天在1nM下全部都展示出至少约80％至90％的基因敲低。
构建了包含3’端帽的另外的HuR构建体，它们包含具有以上18-mer序列的链，该链在3’端按5’至3’顺序进一步包含：(a)核糖醇间隔子、磷酸酯和X058 3’端帽；(b)核糖醇间隔子、磷酸酯和C6 3’端帽；(c)C3间隔子、磷酸酯和X058 3’端帽；(d)C3间隔子、磷酸酯和C63’端帽；(e)C5300间隔子、磷酸酯和X058 3’端帽；以及(f)C5300间隔子、磷酸酯和C6 3’端帽。在Huh-7细胞中在体外测试了这些构建体中的每者并且在第3天在1nM下全部都展示出约90％的基因敲低。
构建了包含两条链的针对HuR的另外的RNAi剂，每条链是18-mer，这两条链一起形成平端双链体，其中至少一条链终止于3’硫代磷酸酯(PS)处，该链在3’端按5’至3’顺序进一步包含间隔子(核糖醇)、修饰的核苷间接头(另一个硫代磷酸酯)和3’端帽(C6)。
包含3’端帽的SSB RNAi剂。
还构建了如下有效的RNAi剂，这些RNAi剂靶向SSB并且包含3’端帽，或者间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，如在此披露的。例如，在一些针对这些靶标的RNAi剂中，一条或两条链在3’端按5’至3’顺序进一步包含间隔子(例如，C3)、磷酸酯和3’端帽(C6)。
例如，被指定为hs_SSB_309_AS_18mer-C3-C6的人SSB RNAi剂在体外介导RNA干扰方面是有效的，并且被下文示出：
AS：UuAcAUuAAAGUCUGU87-C3pC6 8＝2’甲氧基乙基T；7＝2’甲氧基乙基G
S：cAAcAGAcuuuAAuGu55-C3pC6 5＝2’甲氧基乙基A
n：2'Ome-n
上文按5’至3’示出的AS(反义)链的序列是SEQ ID NO:90。上文按5’至3’示出的S(正义)链的序列是SEQ ID NO:91。8、7、5和5是2’-MOE核苷，如上定义的。
构建了如下多种RNAi剂，这些RNAi剂靶向SSB并且包含3’端帽或者间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，如在此披露的。这些RNAi剂具有多种靶序列。例如，在构建的不同SSB RNAi剂中，一条或两条18-mer链在3’端按5’至3’顺序进一步包含：间隔子(C3或核糖醇)、磷酸酯和3’端帽(C6、BP、第二核糖醇或二核糖醇)。可以构建靶向SSB的其他RNAi剂。
包含3’端帽的因子VII RNAi剂。
构建了如下多种RNAi剂，这些RNAi剂靶向因子VII(F7)并且包含3’端帽(C3、C6、C12、二醇、环己基、苯基、联苯基、石胆酸、C7氨基和C3氨基)；这些构建体的效能示于图1至3中。
还构建了如下多种RNAi剂，这些RNAi剂靶向因子VII(F7)并且包含3’端帽或者间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，如在此披露的。作为非限制性实例，这包括包含链的RNAi，该链在3’端按5’至3’顺序进一步包含间隔子(C3)、磷酸酯和3’端帽(C6)。可以构建靶向F7的其他RNAi剂。
包含3’端帽的PLK1RNAi剂。
构建并测试了多种包含3’端帽的PLK1RNAi剂。
构建了如下RNAi剂，该RNAi剂是针对靶标PLK1并且包含3’端帽或者间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，如在此披露的，例如，包含链，该链在3’端按5’至3’顺序进一步包含间隔子(C3)、磷酸酯和3’端帽(C6)。
3’端帽的改善的活性。
如上文指出的，在若干情况下，已经显示包含3’端帽或者间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽(如在此披露的)的RNAi剂相对于缺乏这样一个3’端帽的相应siRNA具有增加的活性。在不同实验中，已经显示多种siRNA在体外和在体内具有增加的RNA干扰活性、增加的活性持续时间、对核酸酶降解的增加的抗性和/或增加的特异性，这些siRNA包含3’端帽或者间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，如在此披露的。参见例如图1至3。
例如，针对靶标F7构建了若干测试siRNA，包括21-mer(具有标准结构，带有两个二核苷酸突出端)和平端18-mer(包含C3pC6)。在该C3pC6分子中，反义链的3’端按5’至3’顺序进一步包含：作为C3的间隔子、磷酸酯和作为C6的3’端帽。21-mer和18-mer都靶向相同的序列；两者具有相同的5’开始。然而，包含C3pC6的RNAi剂示出比21-mer(0.61(±0.017)mg/kg)更低的ED50(0.44(±0.022)mg/kg)。
此外，当在体内测试铁调素RNAi剂(具有X058 3’端帽)时，2天后发现比相应的21-mer RNAi剂(其具有二核苷酸突出端)更有效力。针对铁调素，已经开发了一些比相应的21-mer(具有二核苷酸突出端)更有效力的包含如在此披露的3’端帽的RNAi剂。
还发现铁调素21-mer siRNA的正义链相对于具有如下3’端的相应18-mer更易于掺入RISC中，所述3’端包含间隔子、磷酸酯或核苷间接头和3’端帽。因此，在这种情况下，该21-mer的特异性较低。
因此，在不同实验中，与相应的21-mer siRNA相比，包含如下3’端的RNAi剂可以展示出改善的活性，该3’端包含间隔子、磷酸酯或核苷间接头和3’端帽。
本披露还涵盖在体外或在生物体(如哺乳动物，如人)中减少靶基因的表达或者抑制或降低其基因产物的水平和/或活性的方法，或者治疗与靶基因的过表达相关的疾病的方法，其中该方法包括以下步骤：向该人给予生理活性量的组合物，该组合物包含具有如下3’端的RNAi剂，该3’端包含间隔子、磷酸酯或核苷间接头和3’端帽，如在此披露的。
包含3’端帽的RNAi剂
在不同实施例中，本披露涵盖：
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是C7氨基。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是C3氨基。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是18个核苷酸，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是C6。已经证明该C6与18-mer形式一起在体外和在体内是有活性的。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是C8。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是C10。该C10与18-mer和19-mer形式一起具有已证明的有益的siRNA持续时间。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是C12。已经显示该C12在体外在siRNA上是有活性的。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X027。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X038。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X050。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X051。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X052。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X058。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X059。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X060。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X061。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X062。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X063。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X064。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X065。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X066。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X067。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X068。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X069。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X097。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X098。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X109。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X110。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X111。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X112。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X113。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X1009。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X1010。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X1011。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X1012。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X1013。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X1015。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X1016。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X1017。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X1018。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X1019。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X1020。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X1021。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X1022。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X1024。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X1025。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X1026。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X1027。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X1028。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X1047。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X1048。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X1049。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X1062。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X1063。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是X1064。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中至少一条链的3’端包含3’端帽，并且其中该3’端帽是核糖醇。
对于列于此部分中的这些RNAi剂中的各自与每者，该RNAi剂可以具有任何长度、序列或靶标，并且作为非限制性实例可以是双链RNA，其中任选地一个或多个磷酸酯被修饰的核苷间接头置换，任选地一个或多个核苷酸被修饰，并且任选地一个或多个RNA核苷酸被DNA、PNA、LNA、吗啉代、TNA、GNA、ANA、HNA、CeNA、FANA和/或UNA置换。
RNAi剂，其终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽
在不同实施例中，本披露涉及如下RNAi剂，该RNAi剂按5’至3’顺序包含终止于3’末端磷酸酯或修饰的核苷间接头的链、间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽(例如，列于表1或2中或在此另外披露的任何3’端帽)。
在不同实施例中，本披露涵盖：
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该间隔子是2’-脱氧-核糖醇。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该间隔子是二核糖醇。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该间隔子是2’-甲氧基乙氧基-核糖醇。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该间隔子是C3。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该间隔子是C4。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该间隔子是C5。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该间隔子是C6。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该间隔子是4-甲氧基丁烷-1,3-二醇。
在各个和每种RNAi剂中，在此第二链中，该3’端帽选自：三甘醇、环己基、苯基、BP(联苯基)、石胆酸(lithochol，lithocholic acid)、金刚烷、C3氨基、C7氨基、C3、C6、C8、C10、C12、X027、X038、X050、X051、X052、X058、X059、X060、X061、X062、X063、X064、X065、X066、X067、X068、X069、X097、X098、X109、X110、X111、X112、X113、X1009、X1010、X1011、X1012、X1013、X1015、X1016、X1017、X1018、X1019、X1020、X1021、X1022、X1024、X1025、X1026、X1027、X1028、X1047、X1048、X1049、X1062、X1063、X1064或核糖醇。此外，对于列于此部分中的这些RNAi剂中的各自与每者，该RNAi剂可以具有任何长度、序列或靶标，并且作为非限制性实例可以是双链RNA，其中任选地一个或多个磷酸酯被修饰的核苷间接头置换，任选地一个或多个核苷酸被修饰，并且任选地一个或多个RNA核苷酸被DNA、PNA、LNA、吗啉代、TNA、GNA、ANA、HNA、CeNA、FANA和/或UNA置换。
包含间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽的另外的实施例
本披露尤其涵盖：
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是C3并且该3’端帽是C6。此结构被指定为C3pC6。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是C3。此结构被指定为ribC3或ribpC3。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是C6。此结构被指定为ribpC6。包含ribpC6的RNAi剂的效能示于图5A中。包含此3’端帽的有效RNAi剂示于图11中。RibpC6在18-mer形式上在体内也是有活性的。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是C6。此结构被指定为ribC6或ribpC6。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是C8。此结构被指定为ribC8或ribpC8。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是C10。此结构被指定为ribC10或ribpC10。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是C12。此结构被指定为ribC12或ribpC12。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是BP。此结构被指定为ribpBP。包含此3’端帽的RNAi剂的效能示于图5A中。此3’端帽在18-mer形式中在体外是有活性的。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X027。此结构被指定为ribX027。包含此3’端帽的RNAi剂的效能示于图5A中。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X038。此结构被指定为ribX038。包含此3’端帽的RNAi剂的效能示于图5A中。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X050。此结构被指定为ribX050。包含此3’端帽的RNAi剂的效能示于图5A中。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X051。此结构被指定为ribX051。包含此3’端帽的RNAi剂的效能示于图5A中。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X052。此结构被指定为ribX052。包含此3’端帽的RNAi剂的效能示于图5A中。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X058。此结构被指定为ribX058。包含此3’端帽的RNAi剂的效能示于图5A中。包含此3’端帽的有效RNAi剂示于图11中。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X059。此结构被指定为ribX059。包含此3’端帽的RNAi剂的效能示于图5A中。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X060。此结构被指定为ribX060。包含此3’端帽的RNAi剂的效能示于图5A中。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X061。此结构被指定为ribX061。包含此3’端帽的RNAi剂的效能示于图5B中。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X062。这被指定为ribX062。包含此3’端帽的RNAi剂的效能示于图5B中。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X063。此结构被指定为ribX063。包含此3’端帽的RNAi剂的效能示于图5B中。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X064。ribX064。包含此3’端帽的RNAi剂的效能示于图5B中。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X065。此结构被指定为ribX065。包含此3’端帽的RNAi剂的效能示于图5B中。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X066。此结构被指定为ribX066。包含此3’端帽的RNAi剂的效能示于图5B中。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X067。此结构被指定为ribX067。包含此3’端帽的RNAi剂的效能示于图5B中。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X068。此结构被指定为ribX068。包含此3’端帽的RNAi剂的效能示于图5B中。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X069。此结构被指定为ribX069。包含此3’端帽的RNAi剂的效能示于图5B中。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X097。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X098。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X109。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X110。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X111。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X112。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X113。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X1009。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X1010。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X1011。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X1012。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X1013。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X1015。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X1016。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X1017。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X1018。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X1019。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X1020。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X1021。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X1022。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X1024。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X1025。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X1026。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X1027。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X1028。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X1047。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X1048。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X1049。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X1062。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X1063。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是X1064。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于3’末端磷酸酯并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯和3’端帽，并且其中该间隔子是核糖醇并且该3’端帽是核糖醇。
对于列于此部分中的结构中的各自与每者，该RNAi剂可以具有任何长度、序列或靶标，并且作为非限制性实例可以是双链RNA，其中任选地一个或多个磷酸酯被修饰的核苷间接头置换，任选地一个或多个核苷酸被修饰，并且任选地一个或多个RNA核苷酸被DNA、PNA、LNA、吗啉代、TNA、GNA、ANA、HNA、CeNA、FANA和/或UNA置换。
包含间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽的另外的实施例
本披露尤其涵盖：
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是C3。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是C6。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是C8。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是C10。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是C12。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是BP。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X027。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X038。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X050。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X051。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X052。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X058。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X059。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X060。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X061。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X062。这被指定为ribX062。包含此3’端帽的RNAi剂的效能示于图5B中。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X063。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X064。ribX064。包含此3’端帽的RNAi剂的效能示于图5B中。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X065。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X066。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X067。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X068。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X069。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X097。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X098。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X109。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X110。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X111。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X112。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X113。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X1009。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X1010。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X1011。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X1012。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X1013。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X1015。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X1016。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X1017。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X1018。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X1019。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X1020。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X1021。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X1022。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X1024。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X1025。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X1026。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X1027。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X1028。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X1047。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X1048。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X1049。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X1062。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X1063。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是X1064。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是核糖醇。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，并且其中该3’端帽是三甘醇、环己基、苯基、BP(联苯基)、石胆酸(lithochol，lithocholic acid)、金刚烷、C3氨基、C7氨基、C3、C6、C8、C10、C12、X027、X038、X050、X051、X052、X058、X059、X060、X061、X062、X063、X064、X065、X066、X067、X068、X069、X097、X098、X109、X110、X111、X112、X113、X1009、X1010、X1011、X1012、X1013、X1015、X1016、X1017、X1018、X1019、X1020、X1021、X1022、X1024、X1025、X1026、X1027、X1028、X1047、X1048、X1049、X1062、X1063、X1064或核糖醇。
对于列于此部分中的结构中的各自与每者，该RNAi剂可以具有任何长度、序列或靶标，并且作为非限制性实例可以是双链RNA，其中任选地一个或多个磷酸酯或修饰的核苷间接头被修饰的核苷间接头置换，任选地一个或多个核苷酸被修饰，并且任选地一个或多个RNA核苷酸被DNA、PNA、LNA、吗啉代、TNA、GNA、ANA、HNA、CeNA、FANA和/或UNA置换。
本披露还涵盖一种包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于PS(硫代磷酸酯)，并且进一步包含3’端帽。本披露还涵盖一种包含第一链和第二链的RNAi剂，其中该第一链和/或第二链终止于PS(硫代磷酸酯)，并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽。
因此，本披露涵盖：
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中该第一链和/或第二链终止于PS并且进一步包含3’端帽，其中该3’端帽是C3。此结构被指定为PS-C3。包含此3’端帽的RNAi剂的这种效能描述于实例6和图20A-E中。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中该第一链和/或第二链终止于PS并且进一步包含3’端帽，其中该3’端帽是C6。此结构被指定为PS-C6。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中该第一链和/或第二链终止于PS并且进一步包含3’端帽，其中该3’端帽是C8。此结构被指定为PS-C8。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中该第一链和/或第二链终止于PS并且进一步包含3’端帽，其中该3’端帽是C10。此结构被指定为PS-C10。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中该第一链和/或第二链终止于PS并且进一步包含3’端帽，其中该3’端帽是C12。此结构被指定为PS-C12。
包含第一链和第二链的RNAi剂，其中每条链是49-mer或更短，并且其中该第一链和/或第二链终止于PS并且进一步包含3’端帽，其中该3’端帽是BP。此结构被指定为PS-BP。
3’端帽的替代名称以及DMT、琥珀酸酯和羧酸酯变体
在不同实施例中，本披露涵盖不同3’端帽的DMT、琥珀酸酯和羧酸酯形式，这些形式可以用来构建包含3’端帽(或间隔子和3’端帽)的RNAi剂。在示于表1中的化合物中，例如，独立地，R1＝OH、琥珀酸酯或OH的受保护形式；并且R2＝ODMT(其中ODMT是经由氧原子连接的DMT(4,4'-二甲氧基三苯甲基))或羧酸酯。受保护形式的OH包括但不限于醚、磷酸酯、甲基四乙酰基葡糖醛酸酯、全乙酰基糖苷和氨基酸多肽酯。
已经为不同3’端帽(也称为“配体”)的不同DMT、琥珀酸酯和羧酸酯形式设计了替代别称。
琥珀酸酯形式可以任选地用来将这些分子装载到固体支持物上，用于RNAi剂合成。一种这样的合成示于图12中，但是其他途径也是可能的。
除用于固相CPG装载和寡核苷酸合成的琥珀酰(CO2H-(CH2)n-CO2H；n＝2)接头之外，还可以使用具有变化长度的其他二酸[CO2H-(CH2)n-CO2H]以及本领域已知的其他“广用支持物”策略(例如，来自弗吉尼亚州斯特林的格伦研究公司的Glen UnySupportTM)，包括对苯二酚-O,O’-二酰基(本(Pon)等人核酸研究(Nucl.Acids Res.)1997，18，3629-3635)、N-甲基-琥珀酰亚胺基[3,4-b]-7-氧杂双环[2.2.1]庚烷-6-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)-5-琥珀酰(古萨维(Guzaev)等人美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)2003，125，2380-2381；库马尔(Kumar)等人四面体(Tetrahedron)2006，62，4528-4534)、(2S,3S,4R,5R)-4-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-2,5-二甲氧基四氢呋喃-3-琥珀酰基(斯科特(Scott)等人|“固相合成的创新与展望，第三届国际学术研讨会(Innovations and Perspectivesin Solid Phase Synthesis，3rd International Symposium)”，1994，编辑罗杰爱普顿(Roger Epton)，全球五月花(Mayflower Worldwide)，115-124)和1-二甲氧基三苯甲基氧基-2-O-二氯乙酰基-丙基-3-N-琥珀酰基(阿扎耶夫(Azhayev).四面体，1999，55，787-800；阿扎耶夫等人.四面体2001，57，4977-4986)。
琥珀酸酯是无痕迹的，因为它仅是合成性把手，不存在于siRNA的最终形式中。
然而，应当指出的是使用羧酸酯变体的PAZ结合测定不能预测效能，因为下文所披露的若干PAZ配体在此测定中不结合该PAZ配体，但是后来发现当与siRNA缀合时作为3'帽是有效的。
这些3’端帽的DMT-配体、琥珀酸酯-配体和羧酸酯形式的结构示于下表4中。
包含3’端帽的RNAi剂
因此，本披露提供了一种包含第一链和第二链的双链RNAi剂(一种能够介导RNA干扰的双链分子，包括但不限于siRNA)，其中该第一链和/或第二链包含靶基因的至少15个至至少19个或更多个连续核苷酸，其中该RNAi剂在一条链或两条链上包含3’端帽。取决于上下文，该第一链和第二链可以是反义链和正义链，或者正义链和反义链。正义链和反义链可以是非连续的、连续的或共价结合的，例如经由环或接头。具体而言，该3’端帽选自列于表1或2中或在此另外披露的那些。如果两条链都包含3’端帽，则每条链上的3’端帽可以是相同的或不同的。具体地，在一个实施例中，该RNAi剂的每条链可以包含少于30个核苷酸，例如像17-23个核苷酸、15-19个、18-22个核苷酸和/或19-21个核苷酸，并且在一个或多个核苷酸处可以被修饰和未被修饰(例如，在2’碳处)。
这些双链RNAi剂可以在3’和/或5’端的一端或两端具有0、1或2个平端和/或突出端[例如，具有1、2、3或4个核苷酸(即，1至4nt)]。
该RNAi剂可以仅含有天然存在的核苷酸亚基(例如，核糖核苷酸)，或者在置换核苷酸亚基的一个或多个上含有一个或多个对糖、磷酸酯或碱基的修饰，无论这些置换核苷酸亚基包含核糖核苷酸亚基还是脱氧核糖核苷酸亚基还是其他相关的修饰变体。因此，RNAi剂包括含有替代性主链核苷酸(例如，PNA、吗啉代、LNA、TNA、GNA、ANA、HNA、CeNA、FANA和/或UNA等)和/或修饰的核苷酸对天然存在的核苷酸的取代的那些。
在一个实施例中，所披露的RNAi剂的修饰变体用胸苷(作为RNA，或优选地DNA)代替尿苷，或者具有肌苷碱基。在一些实施例中，所披露的RNAi剂的修饰变体可以在“过客”(亦称“正义”)链中具有切口，在引导链和过客链之间具有错配，用DNA代替引导链和过客链两者的一部分(例如，种子区)的RNA和/或具有缩短的过客链(例如，15、16、17或18nt)。一旦鉴定出适于与引导链一起使用的功能性3’端帽，便可以容易地得到该RNAi剂的修饰和变体。所披露的3’端帽可以用于包含不互斥的实施例或特征的任何组合的任何RNAi剂中(例如，碱基修饰与缩短的过客链的组合；或带切口的过客链和碱基修饰的组合；或代替一部分或全部种子区的DNA和剩余RNA中的碱基修饰的组合；或修饰与任何递送运载体的组合；等)。
在一个实施例中，这些修饰改善该RNAi剂的效能、稳定性(例如，在例如血清或肠液中对抗核酸酶)和/或降低该RNAi剂的免疫原性。本披露的一个实施例涉及包含至少一个非天然核碱基的双链寡核苷酸。在某些实施例中，该非天然核碱基是二氟甲苯基、硝基吲哚基、硝基吡咯基或硝基咪唑基。在一个具体实施例中，该非天然核碱基是二氟甲苯基。在某些实施例中，两条寡核苷酸链中仅一条链含有非天然核碱基。在某些实施例中，两条寡核苷酸链都含有非天然核碱基。
这种或这些RNAi剂可以任选地附接至经选择改善一种或多种特征的配体(例如，胆固醇或其衍生物)，所述特征是例如像该RNAi剂的稳定性、分布和/或细胞摄取。这种或这些RNAi剂可以是分离的或者是用于在此描述的方法的药物组合物的一部分。具体地，该药物组合物可以被配制用于递送至特定组织(例如，受靶基因相关疾病折磨的那些)或被配制用于肠胃外给药。该药物组合物可以任选地包含两种或更多种类型或序列的RNAi剂，每种RNAi剂针对靶基因mRNA的相同或不同区段。任选地，该药物组合物可以进一步包含用于任何靶基因相关疾病的任何已知治疗或与用于任何靶基因相关疾病的任何已知治疗组合使用。该药物组合物可以包括包含3’端帽的RNAi剂和在此披露的或本领域已知的任何适合的递送运载体。
本披露进一步提供了用于抑制或降低细胞中的靶基因mRNA的水平和/或活性的方法，特别是在由该靶基因的过表达或活性过高表征的疾病的情况下。包含靶基因的改变(如突变、过表达和/或活性过高)的细胞被称为“靶基因缺陷”细胞。此类方法包括以下步骤：向细胞给予本披露的RNAi剂中的一种或多种，如下文进一步所述的。本发明方法利用RNA干扰所涉及的细胞机制以选择性降解细胞中的靶RNA，并且包括使细胞与本披露的RNAi剂中的一种或多种接触的步骤。
本披露还涵盖一种治疗具有至少部分由靶基因表达介导的病理状态的人类受试者的方法，该方法包括以下步骤：向该受试者给予治疗有效量的靶向该靶基因的RNAi剂。
本披露的方法和组合物(例如，方法和靶基因RNAi剂组合物)可以按任何适当剂量和/或在于此描述或本领域已知的配制品中使用，以及与在此描述或本领域已知的任何适合的给药途径一起使用。
该方法还任选地进一步包括给予第二药剂的步骤。在一些实施例中，该第二药剂是针对靶基因的另一种RNAi剂。在其他实施例中，该第二药剂是另一种治疗，如针对另一靶标的治疗，所述靶标在病理状态下也是活性过高的、突变的和/或过表达的。
本披露的一个或多个实施例的细节陈述于附图和下文的描述中。不互斥的不同实施例的要素(例如，3’端帽、序列、修饰、修饰模式、5’端帽、RNAi剂的组合、涉及靶基因RNAi剂和另一种药剂的联合疗法等)可以彼此组合，如在此所述的并且如本领域已知或开发的。例如，在此披露的任何3’端帽可以与在此披露的任何一组修饰或序列组合。修饰、5’端帽和/或序列的任何组合可以与在此披露的任何3’端帽一起使用。在此披露的任何RNAi剂(具有修饰或端帽的任何组合或不具有修饰或端帽)可以与在此披露的任何其他RNAi剂或者其他治疗组合物或方法组合。
因此，本披露涵盖在此披露的任何RNAi剂，或涉及在此披露的任何RNAi剂的任何方法，其中该RNAi剂包含至少一个如在此披露的3’端帽。
定义
为方便起见，下文提供了说明书、实例和所附权利要求中使用的某些术语和短语的含义。如果在本说明书中的其他部分中的术语使用与在本部分提供的该术语的定义有明显偏差，应该以在本部分中的定义为准。
“烷基”是具有指定数目的碳原子的单价饱和烃链。例如，C1-6烷基是指具有从1至6个碳原子的烷基基团。烷基基团可以是直链的或支链的。代表性的支链烷基基团具有一个、两个或三个分支。烷基基团的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基(正丙基和异丙基)、丁基(正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基)、戊基(正戊基、异戊基和新戊基)以及己基。
“芳基”是具有芳香族环的烃环系统。芳基基团是单环的环系统或双环的环系统。单环的芳基环是指苯基。双环的芳基环是指萘基并且是指其中苯基稠合至如在此定义的C5-7环烷基或C5-7环烯基环的环。
RNA干扰
如在此使用的，“RNA干扰”(RNAi)是一项转录后靶向基因沉默技术，其使用RNAi剂来降解含有与该RNAi剂相同或非常相似的序列的信使RNA(mRNA)。参见：扎穆尔(Zamore)和哈利(Haley)，2005，科学(Science)，309，1519-1524；扎穆尔等人，2000，细胞(Cell)，101，25-33；艾巴希尔(Elbashir)等人，2001，自然(Nature)，411，494-498；以及克鲁策尔(Kreutzer)等人，PCT公开WO 00/44895；菲尔(Fire)，PCT公开WO 99/32619；梅略(Mello)和菲尔，PCT公开WO 01/29058；等等。当长dsRNA被引入细胞中并且被核糖核酸酶III(Dicer)切割成称为siRNA的较短片段时天然地发生RNAi的过程。天然产生的siRNA标准地是约21个核苷酸长并且包含具有约19个碱基对的双链体，具有两个2-nt突出端(“标准”结构)。siRNA的一条链掺入RNA诱导的沉默复合体(RISC)中。这条链(被称为反义链或引导链)将RISC引导至互补mRNA处。然后RISC中的一种或多种核酸酶介导靶mRNA的切割，以诱导沉默。对靶RNA的切割发生在与反义链互补的区域的中部。参见：尼坎宁(Nykanen)等人2001细胞(Cell)107:309；夏普(Sharp)等人2001基因与发育(Genes Dev.)15:485；伯恩斯坦(Bernstein)等人2001自然(Nature)409:363；艾巴希尔(Elbashir)等人2001基因与发育15:188。
如在此使用的，除能够介导RNA干扰的各种天然和人工结构之外，术语“RNAi剂”还涵盖siRNA(包括但不限于具有“标准”结构的那些)。如下文详述的，这些结构可以比标准结构长或短，和/或是平端的，和/或包含一个或多个修饰、错配、空位和/或核苷酸置换。本披露的3’端帽可以与任何RNAi剂一起使用并且可以允许以下两种功能：(1)允许RNA干扰；和(2)增加活性持续时间和/或生物半衰期，这可以例如通过增加与Dicer的PAZ结构域的结合和/或降低或防止该RNAi剂(例如，被核酸酶，如血清或肠液中的那些)降解来实现。
本披露的这种或这些RNAi剂靶向(例如，结合至、退火至等)靶mRNA。使用针对该靶标的RNAi剂导致靶标活性、水平和/或表达的减少，例如，靶基因或靶序列的“敲低”或“敲除”。具体地，在一个实施例中，在由靶基因的过表达或活性过高表征的疾病状态的情况下，给予针对靶基因的RNAi剂敲低该靶基因至足以恢复正常的靶基因活性水平。
可以通过本领域已知的或本领域的普通技术人员能想到的任何方法来选择合适的RNAi剂。例如，选择标准可以包括以下步骤中的一个或多个：对靶基因序列的初始分析和设计RNAi剂；此设计可以考虑到物种(人、食蟹猴、小鼠等)间的序列相似性和与其他(非靶基因)基因的相异性；在体外筛选RNAi剂(例如，在细胞中，在10nM下)；在细胞中确定EC50；确定用RNAi剂处理的细胞的生存力，包括其存活不需要靶基因的不敏感细胞或其存活的确需要靶基因的敏感细胞；用人PBMC(外周血单核细胞)进行测试，例如，测试TNF-α的水平以评价免疫原性，其中免疫刺激序列是较不令人希望的；在人全血测定中进行测试，其中将新鲜人血用RNAi剂处理并且确定细胞因子/趋化因子水平[例如，TNF-α(肿瘤坏死因子-α)和/或MCP1(单核细胞趋化蛋白1)]，其中免疫刺激序列是较不令人希望的；在测试动物中使用皮下肿瘤确定体内基因敲低；靶基因调节分析，例如，使用药效动力学(PD)标记，例如，其表达受靶基因影响的其他因子，其中靶基因敲除导致那些组分的丰度出现剂量依赖性下降；以及优化RNAi剂的特异性修饰。
因此，包含在此描述的3’端帽的RNAi剂在靶基因的RNA干扰方面是有用的。
本领域中已知的是，裸siRNA(缺乏适合的3’端帽，如在此披露的那些)在体内的活性持续时间较短；它被血清中的核酸酶快速降解，半衰期通常为数分钟。雷泽尔(Layzer)等人2004RNA 10:766-771；庄(Choung)等人2006生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)342:919-927；以及萨托(Sato)等人2007控释杂志(J.Control.Rel.)122:209-216。先前所述的许多3’端帽不是既允许RNA干扰又允许保护分子免受核酸酶影响或延长持续时间。
包含在此披露的3’端帽的RNAi剂介导这些活性。
下文描述了适于与所披露的3’端帽一起使用的RNAi剂结构的非限制性实例。
RNAi剂的结构：具有不同长度的反义链和正义链，(任选的)突出端，(任选的)5’端帽，(任选的)修饰；(任选的)修饰模式。
RNAi剂介导RNA干扰并且包含第一链和第二链，例如，正义链和反义链(或反义链和正义链)，其中这些链任选地主要是RNA(任选地其中一个或多个核苷酸被置换和/或修饰)，(任选地)进一步包含一个或两个突出端和(任选地)一个或两个5’端帽，其中这些任选的修饰可以任选地处于不同的修饰模式，并且这些链可以任选地具有各种长度。本披露的RNAi剂在正义链和/或反义链上包含3’端帽。
反义链和正义链
如在此使用的，术语“反义链”(AS)是指RNAi剂的这样一条链，所述链包括与靶序列完全或基本互补的区域。“反义链”有时被称为“引导”链。如在此使用的，术语“互补区域”是指反义链上与靶mRNA序列完全或基本互补的区域。在互补区域与靶序列不完全互补的情况下，错配可以位于分子的内部或末端区域中。通常，最耐受的错配位于末端区域中，例如，在5’和/或3’端的5、4、3或2个核苷酸内。对错配最敏感的反义链部分被称为“种子区”。在包含恰好19nt的链的RNAi剂中，第19个位置(从5’向3’数)可以耐受一些错配。
如在此使用的，术语“正义链”(S)是指RNAi剂的这样一条链，所述链包括与作为在此定义的术语反义链的区域基本互补的区域。“正义”链有时被称为“过客”链或“反引导”链。借助它们的序列，反义链靶向所希望的mRNA，同时正义链靶向不同靶标。因此，如果反义链被掺入RISC中，则正确的靶标被靶向。正义链的掺入可以导致脱靶效应。这些脱靶效应可以通过在正义链上使用修饰或使用5’端帽加以限制，如下所述的。
基因序列在个体之间可以是不同的，尤其是在编码区段内的摆动位置处，或在非翻译区中；个体的编码序列也可以彼此不同，导致mRNA的另外的差异。因此需要时，RNAi剂的正义链和反义链序列可以被设计为与个体患者的序列对应。还可以修饰RNAi剂的序列来降低免疫原性、与不希望的mRNA的结合(例如，“脱靶效应”)或来增加在血液中的稳定性。这些序列变体独立于碱基的化学修饰或RNAi剂的5’或3’或其他端帽。
反义链和正义链的长度
RNAi剂的反义链和正义链可以具有不同长度，如在此所述的并且如本领域已知的。
在一个实施例中，每条链是49-mer或更短。
已经发现较短长度的siRNA产生有效的siRNA。例如，两条RNA链中的每条链都可以是19至25个核苷酸(nt)，具有14-24个碱基对(bp)的双链区和至少一个1-5nt的3’端突出端。参见例如：美国专利号7,056,704和7,078,196；日本专利号JP 2002/546670；以及欧洲专利号EP 1407044。可替代地，链可以各自21nt长，从而与两个2nt突出端形成19bp区。这样一种结构在此被定义为“标准”结构。
可替代地，这些链可以各自是19-mer并且这两条链可以一起形成平端双链体。
可替代地，这些链可以各自是18-mer并且这两条链可以一起形成平端双链体。
可替代地，正义链可以显著短于反义链。在一些实施例中，反义链是约21nt长，而正义链仅15或16nt长。缩短正义链减少了由将被掺入RISC中的正义链介导的脱靶效应。孙(Sun)等人2008自然生物技术(Nature Biotech.)26:1379-1382；楚(Chu)和拉纳(Rana).2008RNA 14:1714-1719。正义链可以按不同组合被缩短、修饰和/或5’端加帽，以降低其RNAi活性。
任何长度的反义链或正义链都可以与如在此所述的RNAi剂的任何其他实施例(例如，任何3’端帽、修饰、核苷酸置换、5’端帽、突出端、递送运载体等)组合，只要此类组合不互斥即可(例如，突出端的存在或不存在可以由反义链和正义链的具体长度决定)。
因此，在此描述的3’端帽可以与具有任何长度的一条或多条链的任何功能性RNAi剂一起使用。
(任选的)一个或多个突出端
这些RNAi剂还可以具有突出端，0、1或2个突出端；在0nt突出端的情况下，它们是平端的。RNAi剂可以因此具有0、1或2个平端。在“平端RNAi剂”中，两条链都终止于碱基对；因此，平端分子缺乏3’或5’单链核苷酸突出端。
本披露的3’端帽可以代替突出端的功能，或者可以用于添加至一条链或两条链上的突出端上。
如在此使用的，术语“突出端”或“核苷酸突出端”是指从RNAi剂的双链体结构的两条链中的至少一条链的末端突出来的至少一个未配对的核苷酸。这个或这些突出端可以在正义和/或反义链的5’和/或3’端上。
虽然siRNA的两条链通常都是RNA(尽管这些核苷酸中的一个或多个可以被置换和/或修饰)，但是突出端可以是RNA或其变体。适合的突出端包括：具有任何序列或长度(例如，1-5nt)的RNA，TT(二胸苷二核苷酸)或UU或其变体，如dTdT、sdT、dTsdT、sdTsdT或sdTdT等，其在双链体中可以处于与靶基因特定序列相反(inverted/reverse)的取向或处于与靶基因特定序列相同的5’至3’取向。
核苷酸突出端(如TT或UU)不识别靶mRNA并且不被认为是靶序列的一部分。尽管如此，但是突出端可以具有功能性，因为许多标准siRNA没有它们时不能良好地发挥功能。此外，突出端为RNAi剂提供一些保护使其免于被核酸酶(如血清或肠液中的那些)降解。参见：艾巴希尔(Elbashir)等人2001欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)23:6877-6888，尤其是图1F；艾巴希尔等人2001自然(Nature)411:494-498；和克赖纳克(Kraynack)等人2006RNA12:163-176
如在此所示的并且如本领域已知的，已经对用3’端帽代替突出端进行了许多尝试，以产生优良的RNAi剂。然而，如下文详述的，这些尝试通常产生不能既(1)介导RNA干扰又(2)在血清中具有对核酸酶的增加的抗性和/或延长的持续时间的RNAi剂。相比之下，在此披露的3’端帽允许RNA干扰并且增加血清中的RNA干扰活性的持续时间。
因为它们有时代替二核苷酸突出端，在一些文献中3’端帽(特别是PAZ配体)被称为“二核苷酸代用物”。然而，应当指出的是如在此披露的3’端帽还可以用于添加至突出端上。
因此，本文献涵盖用于在RNAi剂中使用的例如像示于表1和2中和/或在此另外描述的3’端帽。
(任选的)一个或多个5’端帽
“5’帽”可以任选地附接在正义链或反义链的5’端。反义链和正义链的功能不同，这些链对5’端的结构要求也不同。反义链上的5’端帽不应干扰由此链介导的RNAi活性；然而，在一些实施例中，正义链上的5’端帽可以干扰由该正义链介导的RNAi活性。任一条链都可以被装载进RISC中，但是仅反义链靶向所希望的靶标。正义链的装载可以导致脱靶效应，例如，不希望的靶标的RNA干扰。杰克逊(Jackson)等人2003自然生物技术(Nat.Biotech.)21:635-637
在反义链的情况下：5’端帽不应干扰此链的RNAi活性，但是至少可以提供一些保护(例如，免受核酸酶如血清或肠液中的那些的影响)。引导链上的5’-磷酸酯通常是最佳RNAi活性所需的。5’dT修饰提供了反义链稳定性并增加了效力。阻断磷酸化作用导致活性降低。相比之下，被添加至5’端的1至3个核糖核苷酸改善抑制。莫里西(Morrissey)等人2005自然生物技术(Nat.Biotech.)23:1002-1007。已经阐明了反义链5’端与RISC的阿尔古特-2(Argonaute-2，Ago2)组分的一些分子相互作用。帕克(Parker)等人2005.自然(Nature)434:663-666；和弗兰克(Frank)等人2010自然465:818-822。
相比之下，在正义链的情况下：抑制RNA干扰的5’端帽在此链上可以是有用的。如上文指出的，5’-磷酸酯通常是最佳RNAi活性所需的。去除5’-OH基团是最简单的防止正义链磷酸化的途径
除5’端帽之外，其他修饰或修饰组也可以用于降低正义链的活性。
本披露的3’端帽可以与任何RNAi剂一起使用，这些RNAi剂在正义链上包含5’端帽和/或降低正义链的活性的任何修饰或修饰组。
(任选的)另外的核苷酸置换和/或修饰
siRNA的链可以通常包含如在自然界中表达或发现的RNA分子(即，天然存在的)，但是其还可以包含非天然存在的核苷酸类似物和衍生物，所述类似物和衍生物包含如在此所述的或如本领域已知的一种或多种核糖核苷酸/核糖核苷类似物或衍生物。
在一些位置中，RNA核苷酸可以被DNA，或具有不同主链的核苷酸，或PNA、LNA、吗啉代、TNA、GNA、ANA、HNA、CeNA、FANA和/或UNA置换；和/或被修饰(包括但不限于2’-MOE、2’-OMe、2’-F和2’-H)。在不同实施例中，该RNAi剂可以包含一个或多个LNA，它们在5’端和/或在3’端(例如，19-mer中的位置18和19或18-mer中的位置17和18)，和/或在一条链的中部。
在一些实施例中，核苷酸置换是在最后两个碱基配对nt(从5’向3’数)中，从而形成夹。夹包括但不限于2’-MOE夹[其中最后两个碱基配对(从5’向3’数)各自具有2’-MOE修饰]。其他夹变体是可能的，其中，例如，其中最后两个碱基配对nt(从5’向3’数)各自是DNA、2’-OMe、2’-F或LNA，如图20C-E所示。应当指出的是最后两个nt(从5’向3’数)也可以被认为是每条链的3’端的前两个碱基配对核苷酸(从3’向5’数)。如在此和在美国专利号8,084,600中所示的，夹可以在反义链和/或正义链上。
因此，虽然每条链中的核苷酸通常是RNA(意味着大部分核苷酸是RNA)，但是一些可以被DNA或具有替代性主链的核苷酸(如肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、吗啉代、苏糖核酸(TNA)和/或二醇核酸(GNA))置换。在一些实施例中，一条链或两条链中仅有1或2或3nt被置换。在一些实施例中，一条链或两条链中仅有约1-3nt被DNA置换。其非限制性实例示于图15B和17A中。
任一条链中的RNA核苷酸因此都可以被置换和/或修饰。
RNA可以在核碱基结构中或在核糖-磷酸酯主链结构中被修饰。然而，在大部分实施例中，包含核糖核苷类似物或衍生物的分子保留形成双链体的能力。作为非限制性实例，RNA分子还可以包括至少一个修饰的核糖核苷，包括但不限于2'-O-甲基修饰的核苷酸、包含5'硫代磷酸酯基团的核苷、连接至胆固醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团的末端核苷、锁核苷、脱碱基核苷、2'-脱氧-2'-氟修饰的核苷、2'-氨基-修饰的核苷、2'-烷基修饰的核苷、吗啉代核苷、解锁核糖核苷酸(例如，无环核苷酸单体，如WO 2008/147824中所述的)、磷酰胺酯或包含非天然碱基的核苷或其任何组合。可替代地，RNA分子可以包含至少两个修饰的核糖核苷，至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个或更多个，直至dsRNA分子的全长。对于RNA分子中这些多个修饰的核糖核苷中的每者，修饰无需是相同的。在一个实施例中，考虑用于在于此描述的方法和组合物中使用的修饰的RNA包含如在此披露的3’端帽并且具有形成所需双链体结构的能力并且允许或介导经由RISC途径对靶RNA的特异性降解。
可以用于生成RNAi剂的修饰的核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、怀丁苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w以及2,6-二氨基嘌呤。
在此披露的序列的“修饰的变体”包括包含相同序列，但是在碱基、糖、磷酸酯或主链中具有修饰(而非碱基取代，例如，A取代G，或C取代U)的任何变体。因此，修饰的变体可以包含上述任何修饰的核苷酸(例如，5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶等)。当碱基被相应的修饰碱基置换时(例如，用修饰的A置换A)，这些修饰的核苷酸不构成错配或碱基差异。因此，在具体位置处具有U的给定序列和在相同序列处包含5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶或5-碘尿嘧啶的修饰变体相差0nt(或没有错配)；然而，在具体位置处具有C的给定序列和具有5-氟尿嘧啶的不同序列(其中这两个序列在其他方面是相同的)相差1nt(具有1个错配)。
在一些实施例中，根据本发明的RNAi剂通过在这些链的至少一条链中包括3’端帽和至少一个修饰的核苷酸来赋予高体内稳定性。因此，根据本发明的RNAi剂优选含有至少一个修饰的或非天然的核糖核苷酸。许多已知化学修饰的冗长描述陈述于公开的PCT专利申请WO 200370918中并且这里不再赘述。用于口服递送的合适修饰更具体地陈述于在此的实例和说明书中。适合的修饰包括但不限于对糖部分的修饰(即，糖部分的2'位，例如像2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(马丁(Martin)等人，瑞士化学学报(Helv.Chim.Acta)，1995，78，486-504)即，烷氧基烷氧基基团)或对碱基部分的修饰(即非天然的或修饰的碱基，其维持与另一核苷酸链中的另一个特异碱基配对的能力)。
其他修饰包括所谓的“主链”修饰，包括但不限于置换磷酸酯基团(用例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯连接相邻的核糖核苷酸)。在不同实施例中，一个或多个磷酸酯基团被以下项置换：或在不同的另外的实施例中，一个或多个磷酸酯基团被以下项置换：其中R3选自O-、S-、NH2、BH3、CH3、C1-6烷基、C6-10芳基、C1-6烷氧基和C6-10芳基-氧基，其中C1-6烷基和C6-10芳基未被取代或任选地独立地被独立地选自以下各项中的1至3个基团取代：卤素、羟基和NH2；并且R4选自O、S、NH或CH2。这些置换磷酸酯基团中的一些还示于图18C中。
在不同实施例中，磷酸酯基团中的磷酸酯被砷(As)、硒(Se)或锑(Sb)置换。在一个实施例中，间隔子是核糖醇并且没有磷酸酯基团被置换。在不同实施例中，磷酸酯基团被磺酰胺基团或氰基基团或羧酰胺置换。在不同实施例中，3’端帽的磷酸酯基团被砷、硒、锑或磺酰胺基团或氰基基团或羧酰胺置换。在不同实施例中，接头(例如，C3、C4或C6或核糖醇、二核糖醇、2’-脱氧核糖醇或2’-甲氧基乙氧基核糖醇)的磷酸酯基团被砷、硒、锑或磺酰胺基团或氰基基团或羧酰胺置换。
W＝O，S，NH，CH2，...
X1，X2＝O-，S-，NH2，BH3 -，CH3，烷基，芳基，O-烷基，O-芳基，...
Y＝O，S，NH，CH2，...
Z＝C，Si，P，S，As，Se，Sb，Te，...
R1＝H，OH，F，NH2，O-烷基，O-芳基，O-烷基-芳基，O-芳基-烷基，NH-烷基，N-二烷基，...
R2＝烷基，芳基，烷基-芳基，芳基-烷基，...(PAZ配体)
碱基＝H，腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，尿嘧啶，胸腺嘧啶，...
因此，与在此披露的3’端帽一起有用的RNAi剂的任一条或两条链的核苷酸可以被置换和/或修饰。
(任选的)修饰模式
在对RNAi剂的核苷酸进行修饰的一些情况下，这些修饰不是随机的，而是按模式排列。这些模式(或方案)增加RNAi剂的效能(RNAi活性)，降低正义链的活性即所谓减少脱靶效应，减少降解或免疫原性和/或增加生物半衰期(例如，活性的持续时间)。
在一种修饰模式中，正义链的多个位置是2’-MOE。作为非限制性实例，正义链中的大部分或所有嘧啶是2’MOE。用2’-MOE修饰正义链中的超过一半的位置可以降低活性。当正义链的所有位置都是2’-MOE时，活性通常被消除。
不同修饰模式示于图7、11、14、15A、15B和17A中。
图15A(顶部)示出了19-mer平端RNAi剂中的2’-OMe和2’-MOE修饰模式的安排的非限制性实例。在该实例中，所示的3’端帽是C3，但是其他3’端帽也可以与此修饰模式一起使用(例如，在此披露的那些)。此修饰模式还包括MOE夹(其中从5’向3’数最后两个碱基配对核苷酸具有2’-MOE修饰)。从5’向3’数最后两个nt也可以被认为是每条链的3’端的前两个碱基配对核苷酸(从3’向5’数)。
图15A(底部)示出了使用2’F修饰的修饰模式的非限制性实例。同样地，在此实例中，所示的3’端帽是C3，但是其他3’端帽也可以与此修饰方案一起使用(例如，在此披露的那些)。
图15B(顶部)示出了“wt”(“野生型”)siRNA和此siRNA的相应的非限制性示例性修饰方案。示例性修饰的siRNA具有2’-OMe和一个或多个硫代磷酸酯。
图15B(底部)示出了针对标准21-mer siRNA，和针对18-mer或19-mer形式的修饰方案的非限制性实例。在这些方案中，“L”指示3’端帽(例如，PAZ配体)。
在多种其他修饰模式中，该RNAi剂包含至少一个5’-尿苷-腺嘌呤-3’(5’-ua-3’)二核苷酸，其中该尿苷是2’-修饰的核苷酸；至少一个5’-尿苷-鸟嘌呤-3’(5’-ug-3’)二核苷酸，其中该5’-尿苷是2’-修饰的核苷酸；至少一个5’-胞苷-腺嘌呤-3’(5’-ca-3’)二核苷酸，其中该5’-胞苷是2’-修饰的核苷酸；和/或至少一个5’-尿苷-尿苷-3’(5’-uu-3’)二核苷酸，其中该5’-尿苷是2’-修饰的核苷酸。
其他修饰模式可以与包含如在此披露的3’端帽的任何RNAi剂一起使用。
特别优选的修饰模式包括但不限于：
所有3’突出端都是2’-OMe-U 2’-OMe-U
A85：所有U都是2’-OMe-U，位置1、2和14除外
S26：所有U都是2’-OMe-U并且所有C都是2’-OMe-C
A51：所有U都是2’-OMe-U并且所有C都是2’-OMe-C，位置1、2和14除外
S26：所有U都是2’-OMe-U并且所有C都是2’-OMe-C
A48：UA是2’-OMe-U A并且所有CA都是2’-OMe-C A，第一5’-N是DNA
S26：所有U都是2’-OMe-U并且所有C都是2’-OMe-C
因此在此披露的3’端帽可以与任何RNAi剂一起使用，其中该RNAi剂的至少一条链的至少一个核苷酸已经被置换和/或修饰，并且其中这个或这些核苷酸的这种或这些修饰可以按一种或多种修饰模式排列。
在不同修饰模式中，该模式包含2’-MOE夹[其中最后两个碱基配对(从5’向3’数)各自具有2’-MOE修饰]。其他夹变体是可能的，其中，例如，其中最后两个碱基配对nt(从5’向3’数)各自是DNA、2’-OMe、2’-F或LNA，如图20C-E所示。应当指出的是最后两个nt(从5’向3’数)也可以被认为是每条链的3’端的前两个碱基配对核苷酸(从3’向5’数)。如在此和在美国专利号8,084,600中所示的，夹可以在反义链和/或正义链上。
在此描述的任何RNAi剂的任何实施例都可以与任何其他实施例组合，其条件是这些实施例不互斥(例如，单个RNAi剂不能同时具有恰好0个和恰好2个突出端)。
因此，在此披露的3’端帽可以与如在此所述的或如本领域已知的任何RNAi剂一起使用，其中该RNAi剂的链具有任何长度，该RNAi剂可以包含0、1或2个突出端或者0、1或2个平端，一条或两条链的一个或多个核苷酸可以被置换或修饰，并且这种或这些修饰可以按一种或多种修饰模式或方案排列，并且反义链和/或正义链可以包含5’端帽，其中正义链的5’端帽(如果存在的话)降低由该正义链介导的RNA干扰活性。
在此披露的3’端帽还可以与在此披露的或本领域已知的任何另外的RNAi剂形式或结构一起使用。
另外的RNAi剂
除上文列出的结构之外，还已经设计了也能够介导RNA干扰的另外类型的分子。在这些结构中，这些链未必是RNA，并且这些链可以比标准链长或短，和/或是平端的，和/或包含一个或多个修饰、错配、空位和/或核苷酸置换。
术语“RNAi剂”旨在涵盖在此所述的或本领域已知的能够介导RNA干扰的任何分子，包括但不限于siRNA(无论具有标准结构还是其他结构)或能够介导RNA干扰的任何其他分子。在此描述的3’端帽可以与任何RNAi剂一起使用。
因此，在此披露的3’端帽可以用于任何RNAi剂(包括siRNA)或任何其他RNAi剂上，尤其包括但不限于：
shRNA(小发夹RNA或短发夹RNA)，其包含形成紧密发夹回转的RNA序列并且像siRNA一样经由RISC使靶标沉默。反义链和正义链因此通过发夹连接。shRNA例如可以经由质粒的递送或者通过病毒载体或细菌载体表达。各种各样的shRNA在本领域是已知的。参见例如：项(Xiang)等人2006.自然生物技术(Nature Biotech.)24:697-702；麦克雷(Macrae)等人2006科学(Science)311:195-8.隆巴尔多(Lombardo)等人2007.自然生物技术25:1298-1306；王(Wang)等人2011.药学研究(Pharm.Res.)28:2983-2995；森泽尔(Senzer)等人2011.分子治疗学(Mol.Ther.)20:679-686。
作为小RNA分子(约22nt)的miRNA(微小RNA)像siRNA一样也经由RISC使靶标沉默。天然存在的miRNA由真核生物的核DNA编码；miRNA通过转录后RNA加工产生，并且经由与mRNA分子内的互补序列碱基配对而发挥功能，通常导致翻译性抑制或靶标降解和基因沉默。人类基因组可以编码超过1000种miRNA，其可以靶向约60％的哺乳动物基因并且在许多人类细胞类型中是丰富的。各种各样的天然存在的miRNA和miRNA的人工衍生物在本领域是已知的。参见例如：路易斯(Lewis)等人2003.细胞(Cell)115:787-798；利姆(Lim)等人2003.基因与发育(Genes Dev.)17:991-1008；何(He)等人2004.自然遗传学综述(Nat.Rev.Genet.)5:522-31；本特威奇(Bentwich)等人2005.自然遗传学(Nat.Genet.)37:766-70；路易斯等人2005.细胞120:15-20；库森达(Kusenda)等人2006.Biomed Pap MedFac Univ Palacky Olomouc Czech Repub 150:205-15；张(Zhang)等人2006.普通遗传学杂志(J.Gen.Gen.)36:1-6；布罗德森(Brodersen)等人2008.科学(Science)320:1185-90；弗里德曼(Friedman)等人2009.基因组研究(Genome Res.)19(1):92-105；巴特尔(Bartel)2009.细胞136(2):215-33。
sisiRNA(小中心片段化干扰RNA)，其中正义链包含至少一个单链切口。这个切口减少正义链掺入RISC复合体中并且因此减少脱靶效应。参见：WO 2007/107162。
DNA-RNA嵌合体，其中每条链的种子部分是DNA，而每条链的其余部分是RNA。参见：大和(Yamato)等人2011.癌症基因治疗(Cancer Gene Ther.)18:587-597。
包含两个错配的siRNA，其中该分子包含三个短双链区。在此RNAi剂的一个实施例中，引导(反义)链是22-mer，而正义链是20-mer(仅在反义链的3’端上产生单个2-nt突出端；并且两个错配产生6、8和4bp的双链区。参见：美国专利申请2009/0209626
aiRNA(不对称干扰RNA)，其中正义链短于19-nt长，这样使得反义链被优先装载进RISC中，并且因此减少脱靶效应。在此RNAi剂的不同实施例中，反义链是21-nt长，但是正义链仅15或16nt长。参见：孙(Sun)等人2008自然生物技术(Nature Biotech.)26:1379-1382；和楚(Chu)和拉纳(Rana).2008RNA 14:1714-1719。
因此，在此披露的任何3’端帽都可以与上文描述的或本领域另外已知的任何多种RNAi剂形式一起使用，包括siRNA(包括但不限于具有标准结构的那些)、shRNA、miRNA、sisiRNA、DNA-RNA嵌合体、包含两个错配(或更多个错配)的siRNA、或aiRNA。
3’端帽
本披露的RNAi剂包含3’端帽。术语“3’端帽”、“3’端帽修饰”、“端帽”、“帽”、“3’端修饰”等包括附接至双链核苷酸双链体的末端的化学部分，但是在此用于排除作为核苷酸或核苷的化学部分。“3’端帽”附接在核苷酸或寡核苷酸的3’端(例如，是至少一条链的3’末端的3’核苷酸的3’碳处的修饰)并且保护该分子免于被例如核酸酶(如血清或肠液中的那些)降解。“3’端帽”包括但不限于“PAZ配体”，该术语包括与酶Dicer的PAZ结构域相互作用的3’端帽。3’端帽有时被称为“非核苷酸突出端模拟物”或“二核苷酸突出端的LMW模拟物”等。
本披露指出一些文献将如在此所述的3’端帽(例如，X109或X110或X111等)称为“突出端”或“3’突出端”；然而，该文献将3’端帽与“突出端”区别开来并且使用术语“突出端”仅指代核苷酸突出端(例如，仅包含核苷酸(如A、C、G、U或T)的突出端，如UU或TT)。因此，如在此定义的，“3’端帽”不是突出端。
如在此定义的，3’端帽可以用于代替或添加至突出端(即，核苷酸突出端)。用标准siRNA结构进行的早期工作表明2-nt突出端有用于RNA干扰活性，而平端dsRNA(缺乏突出端)通常是无效的。参见例如，艾巴希尔(Elbashir)等人2001欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)23:6877-6888，尤其是图1F。然而，dsRNA即使具有这些突出端仍经受酶降解。如诸位申请人在其他地方指出的，“未修饰的siRNA经受酶消化，主要是经受核酸酶消化”。(WO2007/128477，第1页)。因此3’端帽被设计成执行若干功能，包括(1)允许该分子介导RNA干扰活性，和(2)保护该分子免于被降解。
然而应当指出的是，在此披露的3’端帽可以用于添加至以及代替3’突出端。
因为3’端帽可以用于代替突出端(如UU或TT)，所以在此描述的3’端帽有时被称为“3’-二核苷酸代用物”。
已经披露了几个用于与siRNA一起使用的3’端帽。应当指出的是，在已经通过化学方法描述的3’端帽之中，许多这些端帽已经被显示不具有功能性。功能性3’端帽可以能够执行这些功能：(1)允许双链RNA在RNA干扰中发挥功能；和(2)增加分子的稳定性，例如通过保护它免受核酸酶(如血清或肠液中发现的那些)影响。
非功能性3’端帽
描述于文献中的许多3’端帽不能同时执行这些功能。在一些情况下，端帽的放置是重要的；一些端帽当仅被放置在一条链上时可以具有功能性，但是如果被放置在两条链上和/或两条链的5’和3’端两者上则没有功能性。
在不进行实验的情况下预测哪些3’端帽执行两种功能是不可能的。事实上，虽然许多端帽被预测适于RNA干扰(例如，在US 2003/0143732中)，但是后来发现许多端帽不同时执行两种功能。
其他科学家已经凭经验发现(尽管是预测)一些端帽或突出端(1)稳定siRNA但是(2)不允许RNAi活性。例如，在所有位置处的与2’-OMe修饰组合的TT(二胸苷)，科詹德纳(Czauderna)等人2003核酸研究(Nucl.Acids Res.)31:2705-2716，图4B。哈德威格(Hadwiger)等人还指出完全的2’-O-甲基化使得siRNA对血清核酸酶有抗性，但是基因沉默活性几乎被完全消除。哈德威格(Hadwiger)等人2005，第194-206页，在RNA干扰技术(RNAInterference Technology)中，编辑K.阿帕萨尼(K.Appasani)，剑桥大学出版社(Cambridge University Press)，剑桥，英国。
其他端帽或突出端(1)不稳定siRNA，但是(2)它们的确允许RNAi活性。例如，siRNA的两个3’端或两个5’端处的TT。科詹德纳(Czauderna)等人2003，图4B。
还有其他端帽(1)不稳定siRNA并且(2)不允许RNAi活性，此类实例包括：氨基-C6接头或反向脱碱基核苷酸。科詹德纳(Czauderna)等人2003，图4B。
在至少一些条件下不具有功能性的3’端帽的另外的实例包括：
反向(脱氧)脱碱基物(abasic)，其当存在于两个5’端和两个3’端时既不稳定siRNA又不允许siRNA活性。参见：科詹德纳(Czauderna)等人2003核酸研究(Nucl.AcidsRes.)31:2705-2716，图4B。
修饰的碱基核苷酸，如5-丙炔基-U，其不是既稳定siRNA又允许RNAi活性。德利维(Deleavey)等人2009核酸化学实验手册(Curr.Prot.Nucl.Acid Chem.)16.3.1-16.3.22；特拉萨斯(Terrazas)等人2009核酸研究(Nucleic Acids Res.)37:346-353。
至少一些氨基取代的低级烷基，包括氨基己基磷酸酯，其不能稳定siRNA。当存在于两个5’端和两个3’端上时，它阻止RNAi活性。参见：科詹德纳(Czauderna)等人2003，图4B。
荧光素(例如，荧光生色团)，发现当与反义链的3’端缀合时其抑制RNA干扰活性。正义链可以耐受例如在3’-端缀合荧光素，但是反义链不能耐受。哈博特(Harboth)等人2003反义与核酸药物开发(Antisense Nucl.Acid Drug Dev.)13:83-105。参见：哈博特(Harboth)等人2003反义与核酸药物开发(Antisense Nucl.Acid Drug Dev)13:83-105。
花菁(例如，Cy5)，其没有功能性。参见：宋(Song)等人2003自然医学(NatureMed.)9:347-351。参见第347页，第二列。
作为3’端帽的3’磷酸酯，由美国专利号5,998,203提议(第[017]段)，但是后来显示不是既稳定siRNA的3’端又允许RNAi活性，施瓦兹(Schwarz)等人2002分子细胞学(Mol.Cell)10:537-548；和利帕迪(Lipardi)等人2001细胞(Cell)107:299-307。
3’-氨基丙基磷酸酯，其减少RNA干扰活性。参见：施瓦兹(Schwarz)等人2002分子细胞学(Mol.Cell)10:537-548，图2。
因此，并不是作为3’端帽测试的所有部分都能够既允许RNA干扰又保护该分子免于被降解。
功能性3’端帽
与上述非功能性3’端帽和突出端相比之下，功能性3’端帽描述于例如美国专利号8,097,716；8,084,600；8,344,128；8,404,831；和8,404,832中。这些专利披露了包含磷酸酯的功能性3’端帽并且被别称为C3、C6、C12、三甘醇、环己基(Cyclohexyl或Cyclohex)、苯基、联苯基、金刚烷和石胆酸(Lithocholic acid或Lithochol)。
下文图示了这些功能性3’端帽，其中它们被示出与磷酸酯键合：
应当指出的是，本披露中使用的术语与美国专利号8,097,716；8,084,600；8,344,128；8,404,831；和8,404,832中使用的术语略有不同。在不同实施例中，本披露涉及包含第一链和第二链的RNAi剂，其中在一些实施例中，该第一链和/或第二链的3’端终止于磷酸酯(或修饰的核苷间接头)并且进一步包含3’端帽。在正上方的图表中，示出了磷酸酯和3’端帽。
披露于美国专利号8,097,716；8,084,600；8,344,128；8,404,831；和8,404,832中的3’端帽优于先于它们之前设计的那些。例如，不同于其他可能的端帽，这些端帽能够既保护siRNA免于被降解(例如，被核酸酶，如血液或肠液中的)又允许RNA干扰。
然而，本披露的许多新颖的3’端帽(例如，列于表1和2中的那些)甚至进一步得到改善。例如，具有X058的siRNA(如在此披露的)比具有C6的siRNA显示出更高的活性持续时间(图22)。具有X058的HuR siRNA在Huh-7细胞中在第7天和在第10天显示出更大的效能。
在此披露的各种新颖的3’端帽包括被指定为PAZ配体的那些，因为它们与Dicer的PAZ结构域相互作用。
PAZ配体
如上文指出的，当长dsRNA分子被引入细胞中时，Dicer将该dsRNA剁成称为siRNA的更短片段。Dicer的同系物为已经观察到dsRNA介导的基因沉默的所有生物体所共有。迈尔斯(Myers)等人2005.在RNA干扰技术(RNA Interference Technology)中，编辑阿帕萨尼(Appasani)，剑桥大学出版社，剑桥英国，第29-54页；伯恩斯坦(Bernstein)等人2001自然(Nature)409:363-366；和肖尔(Schauer)等人2002植物科学发展趋势(Trends PlantSci.)7:487-491。Dicer是一种RNaseIII酶并且由六个可识别的结构域构成。在N-末端处或接近N-末端是约550aa DExH-盒RNA解旋酶构域，其后紧跟称为DUF283的保守的约100aa结构域。DUF283结构域的C-末端恰好是PAZ(Piwi/Argonaute/Zwille的简称)结构域。该结构域识别单链二核苷酸突出端。林格尔(Lingel)等人2003自然(Nature)426:465-469；宋(Song)等人2003自然结构生物学(Nature Struct.Biol.)10:1026-1032；严(Yan)等人2003自然426:468-474；林格尔等人2004自然结构与分子生物学(Nature Struct.Mol.Biol.)11:576-577；马(Ma)等人2004自然429:318-322。据推测，Dicer中的PAZ结构域也可以将RNA结合至催化结构域切割的位置。张(Zhang)等人2004细胞(Cell)118:57-68。Dicer蛋白的C-末端由两个RNAse III催化结构域和推定的dsRNA结合结构域构成。
表2列出了多种3'端帽，包括许多PAZ配体。
3’端帽的安排和不同性质
反义链和正义链在生物化学上是不同的。如上文指出的，反义链被优选装载进RISC中，因为此链靶向所希望的靶标。正义链的掺入可以导致脱靶效应。
已知的是一些3’端帽在一条链上可以比在另一条链上更有用。例如，如上文指出的，正义链可以耐受例如在3’-端缀合荧光素，但是反义链不能耐受。哈博特(Harboth)等人2003反义与核酸药物开发(Antisense Nucl.Acid Drug Dev.)13:83-105。
包含在此描述的3’端帽的RNAi剂
在一个特定的具体实施例中，本披露涉及一种包含RNAi剂的组合物，该RNAi剂包含第一链和第二链，其中该第一链或第二链包含选自列于表2中的3’端帽的3’端帽。在一个实施例中，该组合物包含如下RNAi剂，该RNAi剂包含第一链和第二链，其中该第一链和第二链包含选自列于表2中的3’端帽的3’端帽。因此，简言之：在一个实施例中，该组合物包含如下RNAi剂，该RNAi剂包含第一链和第二链，其中该第一链和/或第二链包含选自列于表2中的3’端帽的3’端帽。在一些实施例中，该第一链和第二链分别是反义链和正义链。在一些实施例中，该第一链和第二链分别是正义链和反义链。
RNAi剂是一种能够介导RNA干扰的双链分子，包括但不限于siRNA。
下文描述了此实施例的多个具体实施例。
在一个实施例中，该组合物进一步包含第二RNAi剂。在不同实施例中，该第二RNAi剂与第一RNAi剂是物理上分开的；或者这两种RNAi剂是物理上连接的(例如，共价连接的或以其他方式缀合)或组合在同一药物组合物中，或者都是同一治疗方案中的要素。
在一个实施例中，反义链的长度是约30或更少nt。
在一个实施例中，正义链和反义链形成双链体区域，长度是约15至约30个核苷酸对。
在一个实施例中，反义链的长度是约15至约36nt，包括长度约18至约30nt，并且进一步包括长度约19至约21nt和长度约19至约23nt。在一个实施例中，反义链至少具有选自约15nt、约16nt、约17nt、约18nt、约19nt、约20nt、约21nt、约22nt、约23nt、约24nt、约25nt、约26nt、约27nt、约28nt、约29nt以及约30nt的长度。
在一个实施例中，3’端帽使得该RNAi剂在生物样品或环境中具有增加的稳定性，所述生物样品或环境是例如细胞质、间质液、血清、肺或肠灌洗液。
在一个实施例中，该RNAi剂进一步包含至少一种糖主链修饰(例如，硫代磷酸酯接头)和/或至少一个2’-修饰的核苷酸。在一个实施例中，所有嘧啶都是2’O-甲基-修饰的核苷酸。
在一个实施例中，该RNAi剂包含：至少一个5’-尿苷-腺嘌呤-3’(5’-ua-3’)二核苷酸，其中该尿苷是2’-修饰的核苷酸；和/或至少一个5’-尿苷-鸟嘌呤-3’(5’-ug-3’)二核苷酸，其中该5’-尿苷是2’-修饰的核苷酸；和/或至少一个5’-胞苷-腺嘌呤-3’(5’-ca-3’)二核苷酸，其中该5’-胞苷是2’-修饰的核苷酸；和/或至少一个5’-尿苷-尿苷-3’(5’-uu-3’)二核苷酸，其中该5’-尿苷是2’-修饰的核苷酸。
在一个实施例中，该RNAi剂包含选自下组的2'-修饰，该组由以下各项组成：2'-脱氧、2'-脱氧-2’-氟、2’-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨基丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP)、2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)以及2'-O-N-甲基乙酰胺基(2'-O-NMA)。在一个实施例中，所有嘧啶都是2’O-甲基-修饰的核苷酸。
在一个实施例中，该RNAi剂包含平端。
在一个实施例中，该RNAi剂包含具有1至4个未配对的核苷酸的突出端。
在一个实施例中，该RNAi剂在该RNAi剂的反义链的3’-端包含突出端。
在一个实施例中，该RNAi剂与一种或多种诊断性化合物、报道基团、交联剂、核酸酶抗性赋予部分、天然或非常见核碱基、亲脂性分子、胆固醇、脂质、凝集素、类固醇、乌苏醇(uvaol)、龙舌兰皂苷配基、薯蓣皂苷配基、萜、三萜、萨洒皂苷配基(sarsasapogenin)、无羁萜、表无羁萜醇衍生的石胆酸、维生素、碳水化合物、右旋糖酐、普鲁兰多糖、壳多糖、壳聚糖、合成碳水化合物、低聚乳酸15-mer、天然聚合物、低分子量或中等分子量聚合物、菊粉、环糊精、透明质酸、蛋白质、蛋白质结合剂、整合素靶向分子、聚阳离子、肽、聚胺、肽模拟物和/或转铁蛋白连接。
在一个实施例中，在10nM的浓度下，该RNAi剂能够在体外将靶基因在细胞中的表达抑制至少约60％。
在一个实施例中，在10nM的浓度下，该RNAi剂能够在体外将靶基因在细胞中的表达抑制至少约70％。
在一个实施例中，在10nM的浓度下，该RNAi剂能够在体外将靶基因在细胞中的表达抑制至少约80％。
在一个实施例中，在10nM的浓度下，该RNAi剂能够在体外将靶基因在细胞中的表达抑制至少约90％。
在一个实施例中，该RNAi剂在体外在细胞中具有不超过约0.1nM的EC50。
在一个实施例中，该RNAi剂在体外在细胞中具有不超过约0.01nM的EC50。
在一个实施例中，该RNAi剂在体外在细胞中具有不超过约0.001nM的EC50。
针对靶基因的RNAi剂的药物组合物
在一个特定的具体实施例中，本披露涉及一种包含RNAi剂的组合物，该RNAi剂包含第一链和第二链，其中该第一链和/或第二链包含选自列于表2中的3’端帽的3’端帽，其中该组合物处于药学上有效的配制品的形式。
在一个实施例中，本披露涉及RNAi剂在生产用于治疗靶基因相关疾病的药物中的用途，其中该RNAi剂包含正义链和反义链，其中该反义链包含至少15个连续的核苷酸，其与选自在此提供以及如列于例如表2中的那些特定双链体中的针对靶基因的RNAi剂的反义链相差0、1、2或3个核苷酸。
在一个实施例中，该药物组合物包含递送运载体和包含3’端帽的RNAi剂。
本领域的普通技术人员已知的其他修饰也被考虑涵盖在本发明之内。示例性修饰包括但不限于在正义链和反义链的碱基对之间存在空位或错配、在正义链的核苷间键联中存在切口或断裂等。
药物组合物
旨在口服使用的组合物可以根据本领域已知用于生产药物组合物的任何方法来制备，并且此类组合物可以含有一种或多种此类甜味剂、调味剂、着色剂或防腐剂，以便提供药学上精致且适口的制剂。片剂含有活性成分，其与无毒的药学上可接受的赋形剂混合，所述赋形剂适合生产片剂。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂；如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂可以是未包衣的或者它们可以通过已知技术进行包衣。口服使用的配制品还能以硬明胶胶囊的形式呈现，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或者以软明胶胶囊的形式呈现，其中活性成分与水或油介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。水性悬浮液含有与适于生产水性悬浮液的赋形剂混合的活性材料。
本发明组合物的口服给药包括直接向胃或肠给予物质的所有标准技术，最重要的是通过患者控制性吞咽剂量形式，但是还有通过此类递送的其他机械和辅助方式。
每天每千克体重约0.1mg至约140mg级别的剂量水平在治疗上文指出的病症中是有用的(每位受试者每天约0.5mg至约7g)。可以与载体材料组合以产生单剂型的活性成分的量取决于所治疗的宿主和具体给药方式而不同。单位剂型通常含有从约1mg至约500mg之间的活性成分。应当理解的是，针对任何具体受试者的特定剂量水平取决于多种因素，包括所用的特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径和排泄速率、药物组合以及经历治疗的具体疾病的严重性。
本发明治疗剂的治疗效果可以通过与其他药剂组合而得到加强。典型地，此类其他药剂包括已知用于在治疗类似疾病如血管生成障碍中使用的药剂。
本发明的RNAi剂及其配制品可以按剂量单位配制品的形式口服、局部、肠胃外、通过吸入或喷雾或经直肠给予，所述剂量单位配制品含有常规的无毒的药学上可接受的载体、佐剂和/或运载体。如在此使用的术语肠胃外包括经皮、皮下、血管内(例如，静脉内)、肌内、腹膜内或鞘内注射或输注技术等。在给予两种或更多种不同RNAi剂的情况下，每种RNAi剂可以分开给予或共同给予。在分开给予每种RNAi剂的情况下，给药方法和/或部位可以是相同的或不同的，例如，两种RNAi剂都可以静脉内或皮下给予，或者第一RNAi剂可以静脉内给予而第二RNAi剂皮下给予等。
在不同实施例中，本披露涵盖一种包含RNAi剂的组合物或药物组合物，其中一条链或两条链包含3’端帽，该组合物进一步包含辅助脂质、中性脂质和/或隐形脂质。
在不同实施例中，该组合物进一步包含辅助脂质。
在不同实施例中，该组合物进一步包含中性脂质。
在不同实施例中，该组合物进一步包含隐形脂质。
在不同实施例中，该辅助脂质、中性脂质和隐形脂质选自披露于公开的专利申请US 2011-0200582中的那些。可以用于递送各种RNAi剂的另外的组合物在本领域是已知的，例如，被提供于美国申请号61/774759；61/918,175(提交于2013年12月19日)；61/918,927；61/918,182；61/918941；62/025224；62/046487；以及国际申请号PCT/US 04/042911；PCT/EP 2010/070412；PCT/IB 2014/059503中。
在不同实施例中，该组合物进一步包含另外的生物活性剂。
在不同实施例中，该辅助脂质是胆固醇并且该生物活性剂是siRNA。
在不同实施例中，该组合物处于脂质纳米粒子的形式。
使用在此描述的RNAi剂的治疗方法
在一个特定的具体实施例中，本披露涉及一种治疗个体的靶基因相关疾病的方法，该方法包括以下步骤：向该个体给予治疗有效量的包含RNAi剂的组合物，该RNAi剂包含第一链和第二链，其中该第一链和/或第二链包含选自列于表2中的3’端帽的3’端帽。在一个特定的具体实施例中，本披露涉及一种抑制个体中的靶基因表达的方法，该方法包括以下步骤：向该个体给予治疗有效量的包含本披露的RNAi剂的组合物。
在该方法的一个实施例中，该组合物进一步包含药学上有效的配制品。
下文描述了这些实施例的多个特定的具体实施例。
在一个实施例中，该方法进一步包括给予另外的治疗。在一个实施例中，该另外的治疗是治疗有效量的组合物。
在一个实施例中，该另外的治疗是方法(或程序)。
在一个实施例中，该另外的治疗和该RNAi剂可以按任何顺序给予，或者可以同时给予。
在一个实施例中，该方法进一步包括给予用于该疾病的另外的治疗的步骤。
在一个实施例中，该方法进一步包括以下步骤：给予选自针对靶基因相关疾病的另外的拮抗剂清单的另外的治疗或疗法。
在一个实施例中，该组合物包含针对靶基因的第二RNAi剂。在不同实施例中，该第二RNAi剂与第一RNAi剂是物理上分开的，或者两者是物理上连接的(例如，共价连接的或以其他方式缀合)。
其他实施例
下文描述了本披露的多个特定的具体实施例。
在一个实施例中，本披露涉及一种根据在此描述的任何实施例的组合物，所述组合物用于在治疗个体的靶基因相关疾病的方法中使用，该方法包括以下步骤：向该个体给予治疗有效量的根据任何权利要求的组合物。
本披露的一个实施例是根据任何这些实施例的组合物在生产用于治疗靶基因相关疾病的药物中的用途。
在一个实施例中，本披露涉及任何以上实施例的组合物，该组合物用于在靶基因相关疾病的治疗中使用。
另外的定义
除非另外定义，在此使用的技术和科学术语具有与熟悉本披露所属领域的技术人员通常理解的相同含义。
除非另外指明，没有详细地具体描述的所有方法、步骤、技术和操作可以并且已经按照本身已知的方式进行，这应是技术人员所清楚的。再次对例如在此提及的标准手册和普通背景技术和其中引用的另外的参考文献进行引用。
本披露的权利要求是非限制性的并且提供于下文中。
尽管在此已经详细披露了具体实施例和权利要求，但是这仅是出于说明的目的以举例方式来进行的，并且这并不旨在对所附权利要求的范围或任何相应的未来申请的权利要求主题的范围加以限制。具体而言，诸位发明人考虑到，在不脱离如由权利要求定义的本披露的精神和范围的情况下，可以对本披露进行多种替代、改变和修饰。核酸起始材料、感兴趣的克隆或文库类型的选择被认为对于具有在此所述的实施例的知识的本领域普通技术人员而言是常规的。其他方面、优点和修饰被认为落入下列权利要求的范围内。在今后提交的相应申请中重写权利要求的范围可能是由于不同国家专利法的限制，而不应当被理解为放弃权利要求的主题。
本领域的普通技术人员可以设计出所述的3’端帽的多种另外的配制品和明显变体。在以下实例中描述了非限制性示例性RNAi剂(其中一条链或两条链包含3’端帽)，这些实例不限制如在权利要求中描述的本披露的范围。
实例
实例1.具有3’端帽的siRNA的血清稳定性
测试了多种不同3’端帽(3’-末端突出端)的效能。
制备10个具有相同序列(mF7-III靶基因、19-mer平端、A12S17修饰方案)的siRNA
使用了10个不同的非核苷酸3’-末端帽。
在4个时间点在小鼠和人类血清中测试这些端帽
A6S11形式的亲本mF7-III和wt(野生型)luc(荧光素酶)siRNA被用作对照
使用的分子图示于图1中。
下表5提供了这些分子的序列。
表5.
正义序列从上到下由SEQ ID NO:92至114表示；引导(反义)序列从上到下由SEQID NO:115至137表示。在RNAi剂链的情况下，以下图示了在此实例中使用的3’端帽：
材料与方法：
将RNA样品在100％小鼠血清和人血清中在37℃下孵育，在0、5’、6h和24h时间点抽出并速冻。将寡聚物通过预制水凝胶(Elchrom科技公司)分离并且用SYBR金(伯乐公司(Biorad)，Chemidoc XRS)可视化。
图2示出了实例1中所述的不同3’端帽在允许该RNAi剂介导RNA干扰方面的效能。所有的3’端帽-C3、C6、C12、三甘醇、环己基、苯基、联苯基、金刚烷和石胆酸-都允许该RNAi剂进行RNA干扰。
图3示出了实例1中所述的不同3’端帽在降低和/或防止血清中的核酸酶降解方面的效能。
在小鼠血清中，所有3‘-加帽的A12S17siRNA都展现出高达24h的高抗性。
在人血清中，C3、C12和石胆酸当与其他衍生物相比时显得更不稳定。然而，在两个实验中，C3、联苯基和石胆酸当与其他衍生物相比时展现出显著更弱的带。然而，需要澄清这是由于合成/dsRNA品质较低(如由基于凝胶的QC指示的)还是由于基于凝胶的技术假象(石胆酸可以附着于人血清并且因此被保护免于SYBR金插入)。
单链反义A12在人血清中被快速降解，而亲本正义S17链(具有更多的化学修饰)抵抗时间稍长但是不及dsRNA。酶稳定性与dsRNA热稳定性相关。
因此，此实例显示具有这些不同3’端帽的siRNA能够介导针对FVII(因子VII)的RNA干扰。与荧光素酶和dTsdT对照相比，被指定为C3、C6、C12、二醇、环己基、苯基、联苯基、石胆酸、C7氨基和C3氨基的3’端帽修饰在1’、30’、6h和24hr时在小鼠血清中显示出增加的稳定性。与对照相比，被指定为C3、C6、二醇、环己基、苯基和联苯基、C7氨基和C3氨基的那些3'-端修饰在人血清中也显示出增加的稳定性。
实例2.下文呈现了不同3’端帽琥珀酸酯和醇的合成。
实例2.下文呈现了不同3’端帽琥珀酸酯和醇的合成。
2.A.X027琥珀酸酯的合成
方案1：琥珀酸酯9的合成概述。
向DMF(200mL)中的化合物1(10.0g，70.0mmol)的溶液中添加DMT-Cl 2(28.4g，84.0mmol)和2,6-二甲基吡啶(15.0g，140mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物倾倒进冰水中并用EtOAc(3x500mL)萃取。将有机萃取物经硫酸钠干燥并在真空中浓缩，以给出粗产物，将其通过硅胶层析纯化(庚烷/乙酸乙酯/NEt3)，以给出呈白色固体的希望的产物(16g，36％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):3.73(s,6H),4.17(s,2H),6.91(d,J＝8.8Hz,4H),7.35-7.22(m,7H),7.42(d,J＝7.6Hz,2H),7.48(d,J＝8.4Hz,1H),7.83-7.80(m,1H),8.33(d,J＝1.6Hz,1H)。
向二噁烷(160mL)/H2O(40mL)中的化合物2(8.0g，18mmol)的溶液中添加3-羟基苯基硼酸4(3.5g，25mmol)、Pd(PPh3)4(1.1g，1.0mmol)和Na2CO3(4.0g，38mmol)。将反应混合物用氮气鼓泡并在90℃下搅拌过夜。然后将反应混合物倾倒进水中并用EtOAc(3x 800mL)萃取。将有机萃取物经硫酸钠干燥，在真空中浓缩，并且通过硅胶层析纯化(庚烷/乙酸乙酯/NEt3)，以给出呈不纯的淡黄色油状物的4(6g)。
向丙酮(600mL)中的化合物4(10g粗品，20mmol)的溶液中添加化合物5(4.0g，17.6mmol)、K2CO3(4.0g，28mmol)和KI(316mg，1.9mmol)。将反应混合物在回流下搅拌过夜。将反应混合物冷却之后，将溶剂在真空中浓缩。将残余物用水稀释并用EtOAc(3x 800mL)萃取。将有机相经硫酸钠干燥并在真空中浓缩，以给出粗产物，将其通过硅胶层析纯化(庚烷/乙酸乙酯/NEt3)，以给出呈淡黄色油状物的6(9g，69％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):3.74(s,6H),3.84(s,3H),4.19(s,2H),6.93(d,J＝8.8Hz,4H),7.11-7.08(m,1H),7.27-7.23(t,J＝7.2Hz,1H),7.46-7.31(m,9H),7.59-7.55(t,J＝7.6Hz,1H),7.68(d,J＝8.0Hz,1H),7.79-7.75(m,2H),7.84-7.80(m,1H),7.97-7.92(m,2H),8.10(s,1H),8.61(d,J＝1.6Hz,1H)。
在0℃下，将氢化铝锂(THF中的30.7mL 1.0M悬浮液，30.7mmol)添加至THF(150mL)中的化合物6(8.0g，12mmol)的溶液中。在0℃下2小时之后，将反应混合物用水(200mL)淬灭，并且然后将反应混合物用二氯甲烷(3x 200mL)萃取，将合并的有机相经硫酸钠干燥，过滤，并且在真空中浓缩，以给出呈白色固体的希望的产物7(6.1g，80％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):3.74(s,6H),4.19(s,2H),5.54(d,J＝5.6Hz,2H),5.18(s,2H),5.27-5.24(t,J＝6.0Hz,1H),6.93(d,J＝8.8Hz,4H),7.10-7.07(m,1H),7.47-7.23(m,14H),7.67(d,J＝8.0Hz,1H),7.75(s,1H),7.83-7.81(m,1H),7.95(d,J＝8.0Hz,1H),8.61(d,J＝1.2Hz,1H)。
在氩下，向10mL干吡啶中的2.00g(3.21mmol)7和390mg(3.21mmol)N,N-二甲基氨基吡啶(DMAP)的溶液中添加640mg(6.41mmol)琥珀酸酐(8)。将反应混合物在室温下搅拌17h并且然后添加0.5mL水。继续搅拌30min。将反应混合物用100mL二氯甲烷稀释并且用50mL冰冷10％水性柠檬酸和水(2x 50mL)洗涤。将水层用50mL二氯甲烷再萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥并蒸发。将剩余的油状物与甲苯共蒸发两次并且将粗产物通过硅胶层析纯化(二氯甲烷/甲醇/三乙胺97:2:1)，以给出1.35g(1.64mmol，51％)呈灰白色泡沫的9。1HNMR(400MHz,CDCl3):1.12(t,J＝7.3Hz,9H),2.51-2.55(m,2H),2.59-2.62(m,2H),2.89(q,J＝7.3Hz,6H),3.72(s,6H),4.17(s,2H),5.08(s,4H),5.68(s br.,1H),6.76-6.80(m,4H),6.93(dd,J＝8.1,2.5Hz,1H),7.14-7.18(m,1H),7.21-7.34(m,10H),7.41-7.46(m,4H),7.62(dd,J＝5.1,2.5Hz,2H),7.71(dd,J＝8.2,1.9Hz,1H),8.59(d,J＝1.5Hz,1H)。
2.B X038琥珀酸酯的合成
方案1：琥珀酸酯13的合成概述。
方案2：7的合成概述。
方案3：9的合成概述。
向2000-mL 3颈圆底烧瓶中放入6-溴-1H-吲哚-2-甲酸1(100g，417mmol)在甲醇(1000mL)中的溶液。随后伴随搅拌滴加亚硫酰氯(100g，840mmol)。将所得溶液加热至回流持续2h。将反应混合物冷却至室温并且形成沉淀。将固体通过过滤收集，用甲醇洗涤，并且在减压下在烘箱中干燥，从而给出呈白色固体的2(95g，90％)。
向用氮惰性气氛吹扫并维持的2000-mL 3颈圆底烧瓶中放入2(90g，354mmol)在乙二醇二甲醚(500mL)中的溶液、水(500mL)、(吡啶-3-基)硼酸3(43.6g，355mmol)、NEt3(107g，1.06mol)和Pd(PPh3)4(9g，7.79mmol)。将所得溶液加热至回流过夜。将反应混合物冷却至室温并且通过添加800mL水淬灭，从而形成沉淀。将固体通过过滤收集，用水洗涤，并且在减压下在烘箱中干燥，从而给出呈棕色固体的4(78g，87％)。
向2000-mL圆底烧瓶中放入4(75g，297mmol)在DMF(500mL)中的溶液。随后滴加NBS(53.5g，301mmol)。将所得溶液在室温下搅拌2h。然后将反应通过添加1000mL水淬灭，从而形成沉淀。将固体通过过滤收集，用水洗涤，并且在减压下在烘箱中干燥，从而给出呈棕色固体的5(70g，71％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):3.94(s,3H),7.51-7.58(m,2H),7.67-7.76(m,2H),8.11(d,J＝7.6Hz,1H),8.60(d,J＝4.4Hz,1H),8.91(s,1H),12.48(s,1H)。
向2000-mL圆底烧瓶中放入5(68g，205)在甲醇(500mL)中的溶液、水(100mL)和氢氧化钠(25g，625mmol)。将所得溶液加热至回流持续2hr。将所得溶液冷却至室温并用500mL水稀释。将溶液的pH值用2N HCl(水性)调节至5-6，从而形成沉淀。将固体通过过滤收集，用水洗涤，并且在减压下在烘箱中干燥，从而给出呈淡黄色固体的6(50g，77％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):7.50-7.53(m,2H),7.65-7.71(m,2H),8.09(d,J＝7.6Hz,1H),8.59(d,J＝4Hz,1H),8.91(s,1H),12.30(s,1H),13.55(s,1H)。
向2000-mL圆底烧瓶中放入2-氨基乙-1-醇7a(30g，491mmol)在THF(600mL)中的溶液、Fmoc-OSu(166g，491mmol)和NEt3(199g，1.97mol)。将所得溶液在室温下搅拌过夜。将混合物在真空下浓缩并且通过硅胶层析纯化(乙酸乙酯/石油醚)，从而给出呈白色固体的7b(130g，93％)。
向2000-mL圆底烧瓶中放入7b(130g，459mmol)在吡啶(500mL)中的溶液、1-[氯(4-甲氧基苯基)苄基]-4-甲氧基苯(DMT-Cl)(233g，688mmol)和4-二甲基氨基吡啶(2.8g，22.9mmol)。将所得溶液在室温下搅拌过夜。然后将反应通过添加水淬灭，并且将所得溶液用乙酸乙酯(3x 500mL)萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥并在真空中浓缩。将残余物通过硅胶层析纯化(乙酸乙酯/石油醚)，从而给出呈棕色固体的7c(210g，78％)。
向2000-mL圆底烧瓶中放入7c(210g，359mmol)在二氯甲烷(500mL)和NEt3(500mL)中的溶液。将所得溶液在室温下搅拌过夜。将所得混合物在真空下浓缩。将残余物通过硅胶层析纯化(乙酸乙酯/石油醚)，从而给出呈棕色固体的7(95g，73％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)2.42(br.s,2H),3.70-3.82(m,2H),3.80(s,6H),6.79-6.87(m,4H),7.19-7.25(m,2H),7.29(d,J＝9.2Hz,2H),7.33-7.40(m,3H),7.49(d,J＝7.6Hz,2H)。
向2000-mL圆底烧瓶中放入6(40g，126mmol)在DMF(800mL)中的溶液、7(69g，190mmol)、HATU(96g，252mmol)和i-Pr2EtN(65g，503mmol)。将所得溶液在室温下搅拌4h并且然后通过添加1000mL水淬灭。将所得溶液用乙酸乙酯(3x 800mL)萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥并在真空下浓缩。将残余物通过硅胶层析纯化(乙酸乙酯/石油醚)，从而给出呈淡黄色固体的8(30g，36％)。
向2000-mL圆底烧瓶中放入4-(氯甲基)苯甲酸9a(50g，293mmol)在THF(200mL)中的溶液。随后在0℃下伴随搅拌经1hr滴加1M BH3/THF(586mL，586mmol)。将所得溶液在室温下搅拌4h。然后将反应通过添加600mL 1N HCl淬灭。将溶液用500ml乙酸乙酯萃取。将有机层用300ml碳酸钠(水性)和300ml盐水洗涤。将有机层经硫酸钠干燥并在真空下浓缩，从而给出呈白色固体的9b(35g，76％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)4.50(d,J＝4.8Hz,2H),4.75(s,2H),5.21(t,J＝4.8Hz,1H),7.32(d,J＝7.6Hz,2H),7.39(d,J＝7.6Hz,2H)。
向1000-mL 3颈圆底烧瓶中放入9b(35g，223mmol)在THF(300mL)中的溶液和TEA(68g，672mmol)。随后伴随搅拌滴加TMS-Cl(36.4g，335mmol)。将所得溶液在室温下搅拌过夜。然后将反应通过添加500mL水淬灭并用500ml乙酸乙酯萃取。将有机层用500ml NaHCO3(水性)、500ml盐水洗涤，并且经硫酸钠干燥。将残余物在真空下浓缩，从而给出呈无色油状物的9(35g，68％)。
向1000-mL 3颈圆底烧瓶中放入8(30g，45.3mmol)在DMF(300mL)中的溶液和氢化钠(1.1g，45.8mmol)。将混合物在室温下搅拌0.5h。然后添加9(15.5g，67.8mmol)在THF(100ml)中的溶液，并且将所得溶液在60℃下搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温并且通过添加500mL水淬灭。将所得溶液用二氯甲烷(3x 500mL)萃取，并且将合并的有机层在真空下浓缩。将残余物通过硅胶层析纯化(乙酸乙酯/石油醚)，从而给出呈白色固体的10(15g，39％)。
向500-mL圆底烧瓶中放入10(15g，17.6mmol)在THF(150mL)中的溶液和TBAF(7g，26.8mmol)。将所得溶液在室温下搅拌30min。将所得溶液用300mL水稀释并用500mL乙酸乙酯萃取。将有机层用水(2x 300mL)和300mL盐水洗涤，并且经硫酸钠干燥。将所得混合物在真空下浓缩并且将粗产物从己烷中重结晶，从而给出呈黄色固体的11(5.5g，40％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：3.30(m，2H)，3.66-3.65(m，2H)，3.78(s，6H)，4.51(s，2H)，5.68(s，2H)，6.84(d，J＝8.8Hz，4H)，7.09(d，J＝8Hz，2H)，7.19-7.35(m，9H)，7.47-7.54(m，4H)，7.70(d，J＝9.2Hz，2H)，8.10(d，J＝8Hz，1H)，8.51(d，J＝4.8Hz，1H)，8.79(s，1H)。
在氩下，向8mL干吡啶中的1.57g(2.00mmol)11和244mg(2.00mmol)N，N-二甲基氨基吡啶(DMAP)的溶液中添加400mg(4.00mmol)琥珀酸酐(12)。将反应混合物在室温下搅拌22h并且然后添加0.5mL水。继续搅拌30min。将反应混合物吸收进100mL二氯甲烷中并且用50mL冰冷10％水性柠檬酸和水(2x 50mL)洗涤。将水层用50mL二氯甲烷再萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥并蒸发。将剩余的油状物与甲苯共蒸发两次并且将粗产物通过硅胶层析纯化(二氯甲烷/甲醇/三乙胺94:5:1)，以给出2.05g(2.00mmol，定量的)呈灰白色泡沫的13。1H NMR(400MHz,CDCl3):1.05(t,J＝7.2Hz,9H),2.45(t,J＝6.5Hz,2H),2.54(t,J＝6.5Hz,2H),2.66(q,J＝7.2Hz,6H),3.29(t,J＝4.9Hz,2H),3.60(q,J＝5.1Hz,2H),3.70(s,6H),4.97(s,2H),5.75(s,2H),6.72-6.76(m,4H),7.01(d,J＝8.1Hz,2H),7.12-7.23(m,6H),7.26-7.31(m,5H),7.35-7.41(m,4H),7.63(d,J＝8.3Hz,1H),7.79(dt,J＝8.1,1.9Hz,1H),8.49(dd,J＝4.8,1.5Hz,1H),8.73(d,J＝2.0Hz,1H)。
2.C.X052琥珀酸酯的合成
方案1：琥珀酸酯6的合成概述。
在氩下，在干燥的两颈圆底烧瓶中，将3.33g(17.8mmol)4-溴苄基醇、2.35g(17.8mmol)4-乙炔基苄基醇、750mg(1.07mmol)双-(三苯基膦)-二氯化钯和340mg(1.78mmol)碘化铜(I)溶解于45mL干THF中。然后添加12.4mL(9.21g，71.3mmol)胡宁氏碱(Hünig’s base)并且将混合物加热至回流持续4h。将反应混合物冷却至室温，通过Hyflo垫，将滤饼用THF洗涤，并且将滤液蒸发至干燥。将粗产物通过硅胶层析纯化(二氯甲烷/甲醇99:1至49:1)，以给出呈微黄色固体的3(1.03g，24％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):4.54(d,J＝5.6Hz,4H),5.29(t,J＝5.8Hz,2H),7.37(d,J＝8.3Hz,4H),7.51(d,J＝8.1Hz,4H)。
在氩下将二醇3(960mg，4.03mmol)溶解于17mL吡啶中并冷却至0℃。然后经15min分部分地添加4,4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(DMT-Cl，1.37mg，4.03mmol)。将溶液在环境温度下搅拌过夜。将反应混合物溶解于100mL二氯甲烷中并且萃取两次，每次用50mL饱和水性NaHCO3。将水层用100mL二氯甲烷再萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥并蒸发至干燥。将粗产物与甲苯共蒸发两次并且通过硅胶层析纯化(庚烷/乙酸乙酯3:1至2:1，含有0.1％Et3N)，以给出产率61％呈泡沫的4(1.32g，2.44mmol)。1H NMR(400MHz,CDCl3):1.67(t br.,1H),3.72(s,6H),4.11(s,2H),4.64(s br.,2H)6.76-6.79(m,4H),7.13-7.17(m,1H),7.21-7.34(m,10H),7.41-7.47(m,6H)。
在氩下，向12mL干吡啶中的1.30g(2.40mmol)4和290mg(2.40mmol)N,N-二甲基氨基吡啶(DMAP)的溶液中添加480mg(4.81mmol)琥珀酸酐(5)。将反应混合物在室温下搅拌19h并且然后通过添加1.5mL水淬灭。继续搅拌60min，之后将反应混合物用150mL二氯甲烷稀释并且用75mL冰冷10％水性柠檬酸和水(2x 75mL)洗涤。将水层用150mL二氯甲烷再萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥并蒸发。将剩余的油状物与甲苯共蒸发两次并且将粗产物通过硅胶层析纯化(二氯甲烷/甲醇/三乙胺97:2:1)，以给出1.36g(1.83mmol，76％)呈灰白色粘性泡沫的6。1H NMR(400MHz,CDCl3):1.16(t,J＝7.3Hz,9H),2.50(t,J＝6.5Hz,2H),2.60(t,J＝6.7Hz,2H),2.87(q,J＝7.3Hz,6H),3.72(s,6H),4.11(s,2H),5.05(s,2H),5.65(s br.,1H),6.75-6.79(m,4H),7.13-7.16(m,1H),7.21-7.34(m,10H),7.41-7.44(m,6H)。
2.D.X058琥珀酸酯的合成
方案1：琥珀酸酯13的合成概述
方案2：胺10的合成
在氩下将甲苯(4.94L，4.94mol)中的三氯化硼的1M溶液用5L甲苯稀释，之后经40min的时间添加400mL甲苯中的850g(4.94mol)2-溴苯胺(1)的溶液，从而在轻微放热反应中得到澄清的浅棕色溶液。伴随冷却将温度保持在24℃以下。然后添加1.53L甲苯中的1529g(14.8mol)苯甲腈(2)的溶液，随后添加725g(5.44mol)AlCl3，得到变为浅绿色的微细悬浮液。将此混合物在20℃至24℃下搅拌1h，然后加热至回流持续6h。在回流下1h之后，得到澄清的浅棕色溶液，4h之后其变为浅黄色并且最终变混浊。总计7h之后，允许将反应混合物冷却至20℃过夜，得到乳液，并且然后通过添加15L冰冷1M HCl淬灭(注意：在添加开始时为放热反应伴随强烈的气体逸出)。通过冷却将温度保持在22℃至35℃。将此双相混合物加温至80℃持续60分钟。将水相分离并且用5L甲苯再萃取。将两个有机相用5L 1M HCl、10L2M NaOH溶液和5L盐水洗涤。将合并的甲苯层经MgSO4干燥并且蒸发(55℃，5毫巴)成棕色油状物，将其在80℃和0.5毫巴下进一步干燥。1h之后粗产物在室温下固化并且然后通过硅胶层析纯化(庚烷/乙酸乙酯)，从而产生812g(2.94mol，58％)3。1H NMR(400MHz,乙腈-d3):6.52-6.68(m,3H),7.42(dd,J＝7.8,1.3Hz,1H),7.47-7.54(m,2H),7.57-7.64(m,3H),7.66(dd,J＝7.8,1.3Hz,1H)。
在氩下并且伴随剧烈搅拌，将120g(1033mmol)甲基-4-氧代丁酸酯一次性添加至3.5L冰醋酸中的二苯甲酮3(233g，808mmol)的溶液中，从而得到澄清的黄色溶液。添加2.5mL(4.60g，46.9mmol)浓硫酸之后，颜色变为浅红色。将溶液加热至回流过夜。然后将黄色溶液冷却至室温并且缓慢倾倒进3kg氯化铵在10L水中的冰冷溶液中。将混合物萃取两次，每次用5L二氯甲烷。将合并的有机层用6L饱和NaHCO3水溶液萃取两次(注意：气体逸出)。将有机层经MgSO4干燥并且蒸发至干燥，以给出338g呈浅黄色固体的粗产物。将此材料从6L庚烷/乙酸乙酯(4:1)中结晶，从而产生136g(382mmol，47％)呈无色晶体的5。1H NMR(400MHz,乙腈-d3):3.58(s,3H),3.65(s,2H),7.25-7.31(m,2H),7.32-7.38(m,1H),7.40-7.45(m,1H),7.53-7.61(m,3H),8.07(dd,J＝7.6,1.5Hz,1H),8.97(s,1H)。
在氩下，将苯基喹啉5(338g，949mmol)、乙烯基硼酸酯6(175g，1139mmol)和碳酸钾(266g，1926mmol)溶解于4.6L 1,4-二噁烷/水(1:1)中。将混合物搅拌5min，之后添加31.9g(78mmol)S-PHOS和10.0g(44.6mmol)乙酸钯(II)。将混合物加温至70℃并且在氩下搅拌5h。然后将黄色混合物冷却至室温，用3L叔丁基甲基醚稀释并且萃取两次，用2.5L水，随后用2L盐水。将水相用2L叔丁基甲基醚再萃取。将合并的有机层用MgSO4干燥并且蒸发至干燥，从而产生348g黄色油状物。将粗产物通过硅胶层析纯化(庚烷/乙酸乙酯4:1)，从而给出196g(645mmol，68％)7。1H NMR(400MHz,乙腈-d3):3.58(s,3H),3.63(s,2H),5.50(dd,J＝11.1,1.5Hz,1H),6.04(dd,J＝17.9,1.8Hz,1H),7.24-7.30(m,2H),7.35(dd,J＝8.3,1.3Hz,1H),7.43-7.50(m,1H),7.51-7.59(m,3H),7.97(dd,J＝7.1,1.0Hz,1H),8.06(dd,J＝17.9,11.4Hz,1H),8.91(s,1H)
在氩下将乙烯基-喹啉7(194g，640mmol)溶解于3L THF中。将黄色溶液冷却至15℃并搅拌10min。然后在15℃至18℃下，在30min的时间期间滴加THF(900mmol)中的9-硼杂双环[3.3.1]壬烷的1.8L的0.5M溶液。在室温下继续搅拌过夜。冷却至-50℃之后(干冰/丙酮)，经5min滴加水(2937mmol)中的300mL的30％过氧化氢(放热反应)，随后添加520mL的3MNaOH水溶液(1560mmol)，得到黄色悬浮液。允许将反应混合物加温至0℃至2℃并且然后在此温度下搅拌3h。将黄色悬浮液用3L水稀释并且然后用3L乙酸乙酯萃取两次。将两个有机层用2L水洗涤，随后用2L盐水洗涤。将合并的有机相经MgSO4干燥并蒸发，以给出浅棕色油状物，将其通过硅胶层析纯化(二氯甲烷中的2％-3％甲醇)，从而产生163g(507mmol，79％)8。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：3.42(t，J＝6.8Hz，2H)，3.53(s，3H)，3.65(s，2H)，3.76-3.84(m，2H)，4.54(t，J＝5.3Hz，1H)，7.19(dd，J＝8.6，1.5Hz，1H)，7.21-7.25(m，2H)，7.40(dd，J＝8.1，7.1Hz，1H)，7.49-7.59(m，3H)，7.62(d，J＝7.1Hz，1H)，8.91(s，1H)。
将甲酯8(64.5g，201mmol)溶解于600ml甲醇中。向此溶液中添加450mL的0.5M水性NaOH(225mmol)。将混浊溶液在50℃下搅拌1h。然后将反应混合物蒸发至约600mL并且将残余物萃取两次，每次用800mL叔丁基甲基醚。将醚层用300mL水洗涤。将合并的水相蒸发至干燥并且将残余物与甲苯共蒸发两次，以给出67g的米色固体。将此材料溶解于1L水中并且然后谨慎地添加250mL 1M水性柠檬酸。将所得悬浮液搅拌15min并且然后萃取两次，每次用1L乙酸乙酯。将有机层经MgSO4干燥并且蒸发至干燥，从而产生54.1g(176mmol，88％)呈米色固体的酸9。1H NMR(400MHz，D2O)：3.80(t，J＝6.8Hz，2H)，3.82(s，2H)，4.32(t，J＝6.8Hz，2H)，7.58-7.64(m，2H)，7.67-7.73(m，1H)，7.73-7.79(m，1H)，7.87-7.95(m，3H)，7.97(dd，J＝7.1，1.5Hz，1H)，9.14(s，1H)。
将邻苯二甲酸酐(10B，140g，945mmol)与4-氨基-1-丁醇(10A)混合并且热至140℃持续3小时。在反应过程中，无色悬浮液变为澄清的淡黄色液体。允许将混合物冷却至80℃并且倾倒在3kg碎冰上。将冰混合物萃取三次，每次用2L二氯甲烷。将合并的有机相用2L饱和水性NaHCO3洗涤，用2L水洗涤两次，并且然后用2L盐水洗涤。将有机层经MgSO4干燥并浓缩，以给出195g呈米色固体的10C(889mmol，95％)。将此材料不经进一步纯化而用于下一步骤。1H NMR(400MHz,乙腈-d3):1.48-1.58(m,2H),1.67-1.78(m,2H),2.37(t,J＝5.3Hz,1H),3.50-3.57(m,2H),3.66(t,J＝7.3Hz,2H),7.75-7.85(m,4H)。
在氩下，将邻苯二甲酰亚胺10C(193g，880mmol)溶解于2.5L吡啶中。然后经10min分四部分添加4,4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(DMT-Cl，328g，968mmol)。使反应混合物温度从23℃升至26℃并且黄色溶液变红，然后再次回至黄色。将溶液在环境温度下搅拌过夜。为了淬灭反应，添加200mL甲醇(200ml)并且随后将反应混合物蒸发。将残余物溶解于5L乙酸乙酯中并且用5L 5％水性柠檬酸萃取两次，用5％水性NaHCO3萃取一次并且最后用5L盐水萃取。将水层用2L乙酸乙酯再萃取。将合并的有机层经MgSO4干燥并蒸发至干燥。将粗产物(495g的棕色油状物)通过硅胶层析纯化(庚烷/乙酸乙酯4:1至3:1)。获得产率81％的受DMT保护的接头10D(381g，730mmol)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):1.48-1.60(m,2H),1.62-1.74(m,2H),3.01(t,J＝6.1Hz,2H),3.56(t,J＝7.1Hz,2H),3.73(s,6H),6.82-6.88(m,4H),7.16-7.25(m,5H),7.25-7.31(m,2H),7.32-7.37(m,2H),7.78-7.87(m,4H)。
将邻苯二甲酰亚胺10D(302g，579mmol)在50℃下溶解于7L乙醇中并且添加320mL(327g，3.57mol)水合肼。将反应混合物加热至50℃持续5h。将无色悬浮液冷却至室温并且用15L水稀释。将所得乳液萃取两次，每次用6L叔丁基甲基醚。将有机相用4L 5％水性NaHCO3洗涤两次，然后用4L盐水洗涤。将合并的醚层经MgSO4干燥并蒸发，以给出226g(578mmol)呈浅黄色油状物的10，将其不经另外的纯化而用于下一步骤。1H NMR(400MHz,乙腈-d3):1.42-1.54(m,2H),1.56-1.66(m,2H),2.61(t,J＝7.1Hz,2H),3.06(t,J＝6.6Hz,2H),3.78(s,6H),6.84-6.90(m,4H),7.19-7.26(m,1H),7.28-7.35(m,6H),7.41-7.47(m,2H)。
在氩下将喹啉乙酸9(92g，279mmol)溶解于1.5L DMF中并且添加1L DMF中的128g(327mmol)受DMT保护的氨基丁醇10的溶液，随后添加146mL(108g，838mmol)乙基二异丙胺。最后，将138g(363mmol)HATU添加至浅黄色混浊溶液中，得到放热反应。通过冰浴冷却将温度保持在25℃以下。将反应混合物在室温下搅拌6h并且然后用3L水性NaHCO3稀释。将此混合物萃取两次，每次用3L叔丁基甲基醚。将有机层用盐水洗涤，合并，干燥，并且蒸发。将粗产物(180g浅棕色油状物)通过硅胶层析纯化(二氯甲烷/甲醇/三乙胺98:2:0.25)，以给出134g(197mmol，70％)呈无色泡沫的11。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):1.35-1.57(m,4H),2.97(t,J＝6.3Hz,4H),3.34-3.48(m,4H),3.73(s,6H),3.76-3.83(m,2H),4.54(t,J＝5.3Hz,1H),6.84-6.90(m,4H),7.15-7.32(m,10H),7.34-7.41(m,3H),7.42-7.53(m,3H),7.58(dd,J＝6.8,1.3Hz,1H),7.62(t,J＝4.8Hz,1H),8.83(s,1H)。
在氩下，将醇11(43.8g，64.4mmol)和N,N-二甲基氨基吡啶(DMAP，7.87g，64.4mmol)溶解于600mL吡啶中。然后添加12.9g(128mmol)琥珀酸酐(12)并且将反应混合物在室温下搅拌20h。将反应通过添加10mL水淬灭并且继续搅拌30min。将反应混合物用1200mL二氯甲烷稀释并且用600mL冰冷10％水性柠檬酸洗涤并且用600mL水洗涤两次。将水层用600mL二氯甲烷再萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥并蒸发。将粗产物与100mL甲苯共蒸发两次并且然后通过硅胶层析纯化(二氯甲烷/甲醇/三乙胺97:2:1至94:5:1)，以给出57.5g(定量的)呈灰白色泡沫的13。1H NMR(400MHz,CDCl3):1.17(t,J＝7.3Hz,9H),1.46-1.60(m,4H),2.52(t,J＝7.2Hz,2H),2.61(t,J＝7.0Hz,2H),2.82(q,J＝7.3Hz,6H),3.06(t,J＝5.8Hz,2H),3.16(q,J＝6.3Hz,2H),3.49(s,2H),3.64(t,J＝6.8Hz,2H),3.80(s,6H),4.53(t,J＝7.5Hz,2H),5.38(t br.,1H),6.08(s br.,1H),6.80-6.84(m,4H),7.20(t,J＝7.3Hz,1H),7.26-7.38(m,10H),7.41-7.52(m,5H),7.59(d,J＝6.3Hz,1H),8.92(s,1H)。
2.E.X067琥珀酸酯的合成
方案1：6的合成概述
向250mL圆底烧瓶中添加2-(4-溴苯基)乙醇1(1.00g，4.97mmol)、吡啶(25mL)和4,4'-(氯(苯基)亚甲基)双(甲氧基苯)(DMT-Cl)(1.69g，4.97mmol)。将溶液在室温下搅拌2h。添加1mL MeOH，并且将溶液在室温下搅拌10min。然后将溶液在真空下浓缩，溶解于250mLEtOAc中，并且用100mL饱和水性NaHCO3、100mL水和100mL盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，在真空下浓缩，并且通过硅胶层析纯化(庚烷/乙酸乙酯/NEt3)，以给出呈泡沫状固体的2(2.35g，94％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):2.80(t,J＝6.6Hz,2H),3.12(t,J＝6.6Hz,2H),3.72(s,6H),6.81-6.87(m,4H),7.12-7.22(m,7H),7.26(d,J＝4.0Hz,4H),7.44-7.50(m,2H)。
向带有橡胶隔片的40mL玻璃小瓶中添加2(0.70g，1.39mmol)、4-(羟基甲基)苯基硼酸3(0.25g，1.67mmol)、Pd(PPh3)4(80mg，0.070mmol)、2M(水性)Na2CO3(2.1mL，4.17mmol)和1,4-二噁烷(7mL)。将内容物短暂地放置在真空下，并且然后放置在氮气氛下。将小瓶密封并且在90℃下加热16h。冷却至室温之后，添加EtOAc并且将混合物用饱和水性NaHCO3和盐水洗涤。将有机部分用硫酸钠干燥，在真空下浓缩，并且通过硅胶层析纯化(庚烷/乙酸乙酯/NEt3)，以给出呈泡沫状固体的3(0.64g，87％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):2.86(t,J＝6.6Hz,2H),3.16(t,J＝6.6Hz,2H),3.72(s,6H),4.52(d,J＝6.1Hz,2H),5.19(t,J＝5.8Hz,1H),6.81-6.87(m,4H),7.18(d,J＝9.1Hz,4H),7.20-7.22(m,1H),7.24-7.33(m,6H),7.38(d,J＝8.6Hz,2H),7.57(d,J＝8.1Hz,2H),7.60(d,J＝8.1Hz,2H)。
在氩下，向35mL干吡啶中的3.68g(6.93mmol)4和847mg(6.93mmol)N,N-二甲基氨基吡啶(DMAP)的溶液中添加1.39g(13.9mmol)琥珀酸酐(5)。将反应混合物在室温下搅拌16h并且然后添加2.5mL水。继续搅拌30min。将反应混合物吸收进300mL二氯甲烷中并且用150mL冰冷10％水性柠檬酸和水(2x 150mL)洗涤。将水层用150mL二氯甲烷再萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥并蒸发。将剩余的油状物与甲苯共蒸发两次并且将粗产物通过硅胶层析纯化(二氯甲烷/甲醇/三乙胺97:2:1)，以给出4.68g(6.39mmol，92％)呈灰白色泡沫的6。1H NMR(400MHz,CDCl3):1.14(t,J＝7.4Hz,9H),2.51(t,J＝6.8Hz,2H),2.60(t,J＝6.5Hz,2H),2.82-2.90(m,8H),3.24(t,J＝6.8Hz,2H),3.70(s,6H),5.08(s,2H),6.69-6.73(m,4H),7.08-7.21(m,9H),7.28-7.35(m,4H),7.42(d,J＝8.1Hz,2H),7.48(d,J＝8.0Hz,2H),8.04(s br.,1H)。
2.F.X069琥珀酸酯的合成
方案1：琥珀酸酯7的合成概述
根据欧洲有机化学杂志(Eur.J.Org.Chem)，2002，19，3326-3335制备化合物2。在250mL圆底烧瓶中添加3-溴苯甲醛1(10.0g，54.0mmol)和EtOH(25mL)。将溶液在冰-水浴中冷却至0℃，添加硼氢化钠(1.11g，29.5mmol)，并且将混合物在0℃下搅拌1h。添加十水硫酸钠，并且将反应在室温下搅拌1h，以淬灭硼氢化物。添加二乙醚，并且将混合物用水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥并在真空下浓缩，以给出呈澄清油状物的2(9.50g，94％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):2.34(br.s,1H),4.61(br.s,2H),7.13-7.33(m,2H),7.40(d,J＝7.6Hz,1H),7.49(s,1H)。
向500mL圆底烧瓶中添加2(9.50g，50.8mmol)、4,4'-(氯(苯基)亚甲基)双(甲氧基苯)(DMT-Cl)(17.2g，50.8mmol)、DMAP(0.310g，0.050mmol)和吡啶(200mL)。将溶液放置在氮气氛下，并且在室温下搅拌过夜。添加EtOAc，并且将溶液用饱和水性NaHCO3洗涤。将有机层在真空下浓缩，并且通过硅胶层析纯化(庚烷/乙酸乙酯/NEt3)，以给出呈泡沫状固体的3(23.3g，94％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):3.74(s,6H),4.12(s,2H),6.92(dd,J＝8.0Hz,4H),7.21-7.48(m,13H)。
向带有橡胶隔片的40mL玻璃小瓶中添加3(1.00g，2.04mmol)、4-乙炔基苄基4(0.405g，3.06mmol)、PdCl2(PPh3)2(86mg，0.123mmol)、CuI(39mg，0.204mmol)、iPr2EtN(1.06g，8.17mmol)和THF(7mL)。将内容物短暂地放置在真空下，并且然后放置在氮气氛下。将小瓶密封并且在70℃下加热16h。冷却至室温之后，将混合物通过硅藻土过滤，用EtOAc洗涤，并且将滤液在真空下浓缩。将残余物通过硅胶层析纯化(庚烷/乙酸乙酯/NEt3)，以给出呈泡沫状固体的5(0.680g，62％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):3.74(s,6H),4.12(s,2H),4.53(d,J＝4.0Hz,2H),5.29(t,J＝4.0Hz,1H),6.93(dd,J＝8.0Hz,4H),7.19-7.58(m,17H)。
在氩下，向42mL干吡啶中的4.55g(8.42mmol)5和1.03g(8.42mmol)N,N-二甲基氨基吡啶(DMAP)的溶液中添加1.68g(16.8mmol)琥珀酸酐(6)。将反应混合物在室温下搅拌16h并且然后添加2.5mL水。继续搅拌30min。将反应混合物吸收进300mL二氯甲烷中并且用150mL冰冷10％水性柠檬酸和水(2x 150mL)洗涤。将水层用150mL二氯甲烷再萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥并蒸发。将剩余的油状物与甲苯共蒸发两次并且将粗产物通过硅胶层析纯化(二氯甲烷/甲醇/三乙胺97:2:1)，以给出5.81g(7.83mmol，93％)呈灰白色粘性泡沫的7。1H NMR(400MHz,CDCl3):1.14(t,J＝7.4Hz,9H),2.50(t,J＝6.5Hz,2H),2.60(t,J＝6.6Hz,2H),2.86(q,J＝7.3Hz,6H),3.72(s,6H),4.09(s,2H),5.05(s,2H),5.95(s br.,1H),6.75-6.79(m,4H),7.15(tt,J＝7.3,1.5Hz,1H),7.21-7.36(m,11H),7.42-7.45(m,5H)。
2.G.用于用PAZ配体琥珀酸酯高密度装载可控孔度玻璃支持物的通用程序
在锥形瓶中，将1.00mmol PAZ配体琥珀酸盐1在氩下溶解于50mL干乙腈中。向此溶液中添加353mg(1.10mmol)O-(1H-苯并-1,2,3-三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基-四氟硼酸脲(TBTU)并且将溶液振荡10min。然后添加10g长链烷基胺可控孔度玻璃(LCAA/CNA-600-CPG，普赖姆合成(PrimeSynthesis)，2)并且将反应混合物轻轻搅拌5min。最后，添加0.685mL(517mg，4.00mmol)胡宁氏碱并且将烧瓶在定轨摇床上轻轻振荡24h。通过将CPG的等分部分脱三苯甲基化来评估装载密度(将3-5mg CPG用乙腈洗涤，在真空中干燥，添加至二氯甲烷中的25mL 3％二氯乙酸(v/v)中，在504nm下测定吸光度)。如果装载密度在所希望的范围(60-90微摩尔/g)内，则将CPG滤出并且用乙腈充分洗涤。通过用乙酸酐/2,6-二甲基吡啶/THF1:1:8(v/v/v)的混合物和THF中的1-甲基咪唑的溶液16:84(v/v)各自x mL处理CPG来为未衍生化的氨基基团加帽。将混合物在室温下轻轻振荡15min。然后将CPG滤出，用乙腈洗涤并且在真空下干燥过夜。如上再次测定装载密度。实例1-6中的琥珀酸酯的装载产率在64-75微摩尔/g的范围内。
2.H.X050、X059、X061、X062、X065、X068醇和琥珀酸酯的合成按与X027类似的方式制备
X050醇：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 3.73(s,6H)4.19(s,2H)4.51(d,J＝5.56Hz,2H)5.17(s,2H)5.21(t,J＝5.81Hz,1H)6.89-6.95(m,4H)7.01(dd,J＝8.08,2.02Hz,1H)7.19-7.30(m,4H)7.30-7.40(m,9H)7.40-7.49(m,5H)7.53(s,1H)7.57(d,J＝7.58Hz,1H)。MS(ESI-)m/z:C42H38O5计算值622.3；发现值667.9[MH-+甲酸]。
X059醇：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 3.74(s,6H)4.10(s,2H)4.52(s,2H)5.15(s,2H)5.22(br.s.,1H)6.90-6.96(m,4H)7.07-7.13(m,2H)7.22-7.30(m,2H)7.30-7.38(m,8H)7.39-7.48(m,5H)7.60(d,J＝8.08Hz,4H)。MS(ESI-)m/z:C42H38O5计算值622.3；发现值621.1[MH-]。
X061醇：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 3.74(s,6H)4.17(s,2H)4.63(d,J＝5.05Hz,2H)5.17-5.22(m,3H)6.93(d,J＝8.59Hz,4H)7.11(d,J＝8.59Hz,2H)7.22-7.37(m,10H)7.40-7.52(m,7H)7.58(d,J＝8.59Hz,2H)。MS(ESI-)m/z:C42H38O5计算值622.3；发现值667.6[MH-+甲酸]。
X062醇：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 3.74(s,6H)4.16(s,2H)4.52(d,J＝6.06Hz,2H)5.14(s,2H)5.19-5.23(m,1H)6.90-6.95(m,4H)7.07-7.12(m,2H)7.21-7.29(m,2H)7.30-7.38(m,9H)7.39-7.48(m,5H)7.49-7.53(m,1H)7.55-7.60(m,2H)。MS(ESI-)m/z:C42H38O5计算值622.3；发现值667.7[MH-+甲酸]。
X065醇：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 3.75(s,6H)4.16(s,2H)4.52(d,J＝6.06Hz,2H)5.17(s,2H)5.21(t,J＝5.81Hz,1H)6.93(d,J＝8.59Hz,4H)7.12(d,J＝9.09Hz,2H)7.22-7.39(m,10H)7.41-7.47(m,3H)7.78(dd,J＝8.34,2.27Hz,1H)7.85-7.90(m,1H)8.03(d,J＝9.09Hz,2H)8.55(d,J＝1.52Hz,1H)。MS(ESI+)m/z:C41H37NO5计算值623.3；发现值624.7[MH+]。
X068醇：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 2.87(t,J＝6.57Hz,2H)3.16(t,J＝6.57Hz,2H)3.72(s,6H)4.51(d,J＝5.56Hz,2H)5.17(s,2H)5.21(t,J＝5.81Hz,1H)6.85(d,J＝8.59Hz,4H)6.99(dd,J＝8.08,1.52Hz,1H)7.18(d,J＝9.09Hz,4H)7.20-7.38(m,13H)7.43(s,1H)7.59(d,J＝8.59Hz,2H)。MS(ESI+)m/z:C43H40O5计算值636.3；发现值659.7[M+Na]。
2.I.X060和X064醇和琥珀酸酯的合成
按与X067类似的方式制备
X060醇：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 3.75(s,6H)4.12(s,2H)4.57(d,J＝5.56Hz,2H)5.20-5.26(m,1H)6.90-6.96(m,4H)7.22-7.28(m,1H)7.29-7.38(m,7H)7.39-7.48(m,5H)7.53(d,J＝8.08Hz,1H)7.60(s,1H)7.64(d,J＝8.08Hz,2H)。MS(ESI+)m/z:C35H32O4计算值516.2；发现值303.4[DMT+]。
X064醇：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 3.75(s,6H)4.18(s,2H)4.56(d,J＝5.56Hz,2H)5.24(t,J＝5.81Hz,1H)6.93(d,J＝9.09Hz,4H)7.25(t,J＝7.33Hz,1H)7.32(d,J＝9.09Hz,4H)7.34-7.39(m,2H)7.44(t,J＝8.08Hz,4H)7.82(dd,J＝8.34,2.27Hz,1H)7.93(d,J＝8.08Hz,1H)8.04(d,J＝8.08Hz,2H)8.59(d,J＝2.02Hz,1H)。MS(ESI+)m/z:C34H31NO4计算值517.2；发现值518.8[MH+]。
2.J.X063琥珀酸酯的合成
将3-(羟基甲基)苯酚(1，6.21g，50.0mmol)溶解于吡啶(100mL)中并且冷却至0℃。添加DMT-Cl(16.9g，50mmol)并且溶液在室温下搅拌2h。添加500mL EtOAc，将溶液用400mL饱和水性NaHCO3、水和盐水各洗涤一次。将有机部分用Na2SO4干燥，过滤，并且在真空下浓缩。将混合物重新溶解于丙酮/甲苯中并浓缩，将此过程重复4次。然后将残余物在真空下浓缩过夜，以给出呈泡沫状固体的2(20.9g，98％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 3.74(s,6H)3.97(s,2H)6.66(dd,J＝8.08,1.52Hz,1H)6.72(d,J＝7.58Hz,1H)6.83(d,J＝1.52Hz,1H)6.89-6.95(m,4H)7.12(t,J＝7.83Hz,1H)7.17(d,J＝7.58Hz,1H)7.27-7.32(m,4H)7.34(t,J＝7.58Hz,2H)7.40-7.46(m,2H)9.37(s,1H)。
向丙酮(145mL)中的化合物2(17.2g，36.3mmol)中添加4-溴-3-(溴甲基)苯甲酸甲酯(3，11.7g，38.1mmol)和K2CO3(30.1g，218mmol)。将烧瓶抽空/N2回填两次，并且在N2气氛下在回流下加热过夜。冷却至室温之后，将混合物过滤，用CH2Cl2洗涤，并且浓缩。然后将残余物重新溶解于CH2Cl2中，用Na2SO4干燥，过滤，并且浓缩。以给出呈泡沫状固体的4(24.8g，99％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 3.74(s,6H)3.84(s,3H)4.07(s,2H)5.20(s,2H)6.88-6.92(m,4H)6.94-6.98(m,2H)6.99(d,J＝1.52Hz,1H)7.21-7.26(m,1H)7.26-7.30(m,5H)7.30-7.35(m,2H)7.38-7.43(m,2H)7.85(s,2H)8.11(s,1H)
向二甲氧基乙烷(350mL)中的化合物4(24.8g，35.8mmol)中添加Bu4NBr(17.3g，53.7mmol)、Cs2CO3(17.5g，53.7mmol)和Pd(OAc)2(2.01g，8.96mmol)。将烧瓶用两个循环的真空/N2回填进行脱气并且在N2气氛下加热至回流过夜。冷却至室温之后，将混合物通过硅藻土过滤，用THF洗脱，并且浓缩。将残余物溶解于500mL EtOAc中，用400mL饱和水性NaHCO3、2x 400mL水和400mL盐水洗涤。将有机级分用Na2SO4干燥，过滤，并且在真空下浓缩。将残余物通过硅胶层析纯化(CH2Cl2/三乙胺))，从而给出呈泡沫状固体的5(15.1g，68％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 3.74(s,6H)3.87(s,3H)4.11(s,2H)5.23(s,2H)6.89-6.96(m,4H)7.01(d,J＝1.52Hz,1H)7.08(dd,J＝8.08,1.52Hz,1H)7.22-7.27(m,1H)7.29-7.33(m,4H)7.33-7.38(m,2H)7.41-7.46(m,2H)7.88-7.93(m,2H)7.93-7.99(m,2H)
在0℃下，将氢化铝锂(THF中的43.4mL 1.0M悬浮液，43.4mmol)添加至THF(150mL)中的化合物5(12.0g，19.3mmol)的溶液中。在0℃下2小时之后，将反应混合物通过滴加20mLEtOAc淬灭，同时在0℃下搅拌10min。依次添加1.65mL H2O、1.65mL 20％水性NaOH和4.95mLH2O。然后将混合物在室温下搅拌1h，用Na2SO4干燥，通过硅藻土过滤，并且在真空下浓缩。将残余物通过硅胶层析纯化(乙酸乙酯/庚烷/三乙胺)，从而给出呈泡沫状固体的6(8.47g，81％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 3.75(s,6H)4.07(s,2H)4.52(d,J＝5.56Hz,2H)5.13(s,2H)5.21-5.25(m,1H)6.89-6.95(m,4H)6.96(d,J＝1.52Hz,1H)7.03(dd,J＝8.08,1.52Hz,1H)7.22(s,1H)7.23-7.28(m,1H)7.29-7.33(m,4H)7.33-7.38(m,3H)7.41-7.46(m,2H)7.76(d,J＝7.58Hz,1H)7.81(d,J＝8.08Hz,1H)。MS(ESI+)m/z:C36H32O5计算值544.2；发现值545.2[MH+]。
在氩下，在室温下将二甲基氨基吡啶(0.124g，1.02mmol)添加至化合物6(0.554g，1.02mmol)在吡啶(5mL)中的溶液中。添加琥珀酸酐7(0.204g，2.03mmol)并且将溶液在室温下搅拌6h。添加0.5mL H2O，并且将溶液搅拌30min。添加100mL CH2Cl2，并且将溶液用50mL冷10％水性柠檬酸洗涤一次并用每次50mL水洗涤两次。将水性级分用1x 50mL CH2Cl2再萃取。将合并的有机级分用Na2SO4干燥，过滤，在真空下浓缩并且然后用甲苯稀释/浓缩两次。将残余物通过硅胶层析纯化(二氯甲烷/甲醇/三乙胺)(49:1/1％)，从而给出呈泡沫状固体的8(0.78g，103％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 1.45(t,J＝7.20Hz,2.5H)2.52-2.60(m,2H)2.65-2.71(m,2H)3.60(q,J＝7.33Hz,1.7H)3.79(s,6H)4.16(s,2H)5.12(s,2H)5.13(s,2H)6.82-6.87(m,4H)7.03(dd,J＝8.08,1.26Hz,1H)7.08(s,1H)7.17(s,1H)7.19-7.25(m,1H)7.28-7.33(m,2H)7.33-7.37(m,1H)7.38-7.44(m,4H)7.49-7.54(m,2H)7.66(t,J＝7.83Hz,2H)
2.K.X066琥珀酸酯的合成
向带有隔片的40mL小瓶中添加4-溴-3-(溴甲基)苯酚(1，0.360g，1.25mmol)、3-(溴甲基)苯甲酸甲酯(2，0.856g，3.74mmol)、K2CO3(0.516g，3.74mmol)和丙酮(6mL)。将小瓶抽空/N2回填两次，并且在50℃下加热20h。冷却至室温之后，将混合物过滤，用CH2Cl2洗涤，并且在真空下浓缩。将残余物通过硅胶层析纯化(乙酸乙酯/庚烷)，从而给出呈白色固体的3(0.391g，62％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 3.88(s,3H)4.67(s,2H)5.21(s,2H)6.98(dd,J＝8.59,3.03Hz,1H)7.35(d,J＝3.03Hz,1H)7.52-7.58(m,2H)7.72(d,J＝8.08Hz,1H)7.91-7.95(m,1H)8.05(s,1H)
化合物4的合成描述于X063的合成中。向带有隔片的40mL小瓶中添加化合物3(0.390g，0.763mmol)、4(0.390g，0.915mmol)、K2CO3(0.316g，2.29mmol)和丙酮(4mL)。将小瓶密封并且将内容物抽空/N2回填两次。然后将小瓶在60℃下加热17h。冷却至室温之后，将混合物过滤，用CH2Cl2洗涤，并且在真空下浓缩。将残余物通过硅胶层析纯化(乙酸乙酯/庚烷/三乙胺)，从而给出呈泡沫状固体的5(0.448g，77％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm3.74(s,6H)3.85(s,3H)4.10(s,2H)5.08(s,2H)5.20(s,2H)6.87-6.92(m,4H)6.92-7.02(m,4H)7.19-7.26(m,3H)7.26-7.35(m,7H)7.39-7.45(m,2H)7.50(t,J＝7.83Hz,1H)7.56(d,J＝8.59Hz,1H)7.68(d,J＝7.58Hz,1H)7.90(d,J＝7.58Hz,2H)8.02(s,1H)
向带有隔片的小瓶中的化合物5(0.540g，0.569mmol)中添加二甲氧基乙烷(5.7mL)、Bu4NBr(0.275g，0.853mmol)、Cs2CO3(0.278g，0.853mmol)和Pd(OAc)2(0.026g，0.11mmol)。将小瓶密封，用两个循环的真空/N2回填进行脱气，并且在90℃下加热过夜。17h之后通过LCMS观察到约33％转化。添加另外0.100g Pd(OAc)2(0.44mmol)，并且使反应再继续24h。冷却至室温之后，将混合物通过硅藻土过滤，用EtOAc洗脱。然后将溶液用水性饱和NaHCO3、水和盐水各洗涤一次。将有机部分用Na2SO4干燥，过滤，并且在真空下浓缩。将残余物通过硅胶层析纯化(乙酸乙酯/庚烷/三乙胺)，从而给出呈泡沫状固体的6(0.105g，27％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 3.75(s,6H)3.87(s,3H)4.08(s,2H)5.09(s,2H)5.24(s,2H)6.88-6.95(m,5H)6.95-7.00(m,2H)7.05(dd,J＝8.34,2.78Hz,2H)7.21-7.26(m,2H)7.29-7.36(m,6H)7.39-7.46(m,2H)7.55(t,J＝7.83Hz,1H)7.69-7.77(m,3H)7.92(d,J＝8.08Hz,1H)8.05(s,1H)
将THF(2mL)中的化合物6(0.135g，0.199mmol)在N2气氛下冷却至0℃。滴加THF中的LAH的1M悬浮液(0.477mL，0.477mmol)，并且将溶液在0℃下搅拌3h。滴加1mL EtOAc，并且将溶液在0℃下搅拌20min。依次添加0.018mL H2O、0.018mL 20％水性NaOH和0.054mL H2O，并且将混合物在室温下搅拌1h。将混合物用Na2SO4干燥，通过用EtOAc洗涤的硅藻土过滤，并且在真空下浓缩。将残余物通过硅胶层析纯化(乙酸乙酯/庚烷/三乙胺)，从而给出呈泡沫状固体的7(0.110g，85％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 3.75(s,6H)4.08(s,2H)4.52(d,J＝5.56Hz,2H)5.04(t,J＝5.81Hz,1H)5.08(s,2H)5.14(s,2H)6.89-6.94(m,5H)6.95(d,J＝2.53Hz,1H)6.98(dd,J＝8.08,1.52Hz,1H)7.03(dd,J＝8.59,2.53Hz,1H)7.24(t,J＝7.33Hz,1H)7.26-7.37(m,9H)7.40-7.46(m,3H)7.72(d,J＝8.08Hz,2H)。MS(ESI+)m/z:C43H38O6计算值650.3；发现值303.4[DMT+]。
在氩下，在室温下将二甲基氨基吡啶(0.019g，0.157mmol)添加至化合物7(0.102g，0.157mmol)在吡啶(3mL)中的溶液中。添加琥珀酸酐8(0.031g，0.313mmol)，并且将溶液在室温下搅拌16h。添加0.5mL H2O并且将溶液搅拌30min。添加50mL CH2Cl2，将溶液用25mL冷10％水性柠檬酸洗涤一次并用每次25mL水洗涤两次。将水性级分用1x 25mLCH2Cl2再萃取。将有机级分用Na2SO4干燥，过滤，在真空下浓缩，并且用甲苯稀释/浓缩两次。将残余物通过硅胶层析纯化(二氯甲烷/甲醇/三乙胺)(49:1/1％)，从而给出呈油状物的9(0.10g，76％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 1.46(t,J＝7.33Hz,2.1H)2.57(t,J＝6.82Hz,2H)2.68(t,J＝6.82Hz,2H)3.61(q,J＝7.16Hz,1.4H)3.80(s,6H)4.15(s,2H)5.09(s,2H)5.09(s,2H)5.15(s,2H)6.78(d,J＝2.53Hz,1H)6.82-6.88(m,4H)6.95-7.04(m,2H)7.06(s,1H)7.18-7.25(m,1H)7.28-7.36(m,3H)7.36-7.46(m,7H)7.50-7.55(m,2H)7.61(dd,J＝8.34,2.27Hz,2H)
2.L.X051琥珀酸酯的合成
化合物1的合成描述于X063的合成中。将化合物1(6.70g，12.3mmol)溶解于THF(123mL)中，抽空/N2吹扫两次，并且冷却至0℃。添加矿物油中的NaH的60％分散体(0.886g，36.9mmol)，并且将混合物在0℃下搅拌20min。然后添加3-(溴甲基)苯甲酸甲酯(2，3.38g，14.8mmol)，并且将混合物在室温下搅拌20h。然后将反应混合物用400mL EtOAc稀释并且用400mL饱和水性NaHCO3洗涤一次。将水层用200mL EtOAc反萃取，并且将合并的有机层用400mL水和盐水各洗涤一次。将有机部分用Na2SO4干燥，过滤，并且在真空下浓缩。将残余物通过硅胶层析纯化(乙酸乙酯/庚烷/三乙胺)，从而给出呈泡沫状固体的3(6.55g，77％)。产物含有约13％的相应的乙酯，将其作为等效前体转至下一步骤。甲酯：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.32(t,J＝7.07Hz,0.38H)3.74(s,6H)3.86(s,2.52H)4.08(s,2H)4.32(q,J＝7.07Hz,0.25H)4.58(s,2H)4.64(s,2H)5.14(s,2H)6.93(d,J＝8.59Hz,4H)6.97(d,J＝1.52Hz,1H)7.04(dd,J＝8.08,1.52Hz,1H)7.25(t,J＝7.33Hz,1H)7.28(s,1H)7.31(d,J＝9.09Hz,4H)7.33-7.41(m,3H)7.44(d,J＝7.58Hz,2H)7.53(t,J＝7.83Hz,1H)7.66(d,J＝8.08Hz,1H)7.80(d,J＝8.08Hz,1H)7.83(d,J＝8.08Hz,1H)7.90(d,J＝7.58Hz,1H)7.97(s,1H)
将THF中的化合物3冷却至0℃并且放置在N2气氛下。滴加THF中的LAH的1M悬浮液(22.5mL，22.5mmol)，并且将溶液在0℃下搅拌2h。滴加1mL EtOAc，并且将溶液在0℃下搅拌20min。然后依次添加0.86mL H2O、0.86mL 20％水性NaOH和2.58mL H2O。将混合物在室温下搅拌1h，用Na2SO4干燥，通过硅藻土过滤(用EtOAc洗涤)，并且在真空下浓缩。将残余物通过硅胶层析纯化(乙酸乙酯/庚烷/三乙胺)，从而给出呈泡沫状固体的4(5.98g，96％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 3.74(s,6H)4.08(s,2H)4.50(d,J＝6.06Hz,2H)4.55(s,2H)4.55(s,2H)5.14(s,2H)5.18(t,J＝5.81Hz,1H)6.93(d,J＝8.59Hz,4H)6.97(d,J＝1.01Hz,1H)7.01-7.06(m,1H)7.21-7.28(m,4H)7.28-7.33(m,5H)7.33-7.40(m,4H)7.41-7.46(m,2H)7.80(d,J＝8.08Hz,1H)7.83(d,J＝8.08Hz,1H)。MS(ESI+)m/z:C44H40O6计算值664.3；发现值665.3[MH+]。
在氩下，在室温下将二甲基氨基吡啶(0.37g，3.01mmol)添加至化合物4(2.00g，3.01mmol)在吡啶(15mL)中的溶液中。添加琥珀酸酐7(0.60g，6.02mmol)，并且将溶液在室温下搅拌17h。添加1mL H2O并且将溶液搅拌1h。添加100mL CH2Cl2，并且将溶液用50mL冷10％水性柠檬酸洗涤一次并用每次50mL水洗涤两次。将水性级分用1x 50mL CH2Cl2再萃取。将合并的有机级分用Na2SO4干燥，过滤，在真空下浓缩，并且用甲苯稀释/浓缩两次。将残余物通过硅胶层析纯化(二氯甲烷/甲醇/三乙胺)(39:1/1％)，从而给出呈油状物的6(2.48g，95％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 1.17(t,J＝7.33Hz,14.2H)2.56(t,J＝6.69Hz,2H)2.68(t,J＝7.45Hz,2H)2.84(q,J＝7.33Hz,9.5H)3.80(s,6H)4.16(s,2H)4.57(s,2H)4.58(s,2H)5.14(s,2H)5.14(s,2H)6.82-6.88(m,4H)7.01-7.05(m,1H)7.09(s,1H)7.18(s,1H)7.19-7.25(m,1H)7.28-7.34(m,5H)7.34-7.38(m,2H)7.39-7.44(m,4H)7.49-7.55(m,2H)7.68(dd,J＝7.96,4.42Hz,2H)
2.M.X097琥珀酸酯的合成
方案1：6的合成概述。
(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-溴苯基)甲醇(2)：
将吡啶(60mL)中的5-溴-1,3-二羟基甲基苯1(3.00g，13.8mmol)、4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(4.68g，13.8mmol)的溶液在室温下搅拌16h。将反应混合物分配在EtOAc与水之间。将EtOAc层经无水Na2SO4干燥并蒸发。将粗产物通过快速层析纯化(用5％-30％EtOAc/庚烷中的1％Et3N洗脱)，以提供2.57g(36％)的2。MS(ESI+)m/z:C29H27BrO4计算值518.1；发现值303.5[DMT]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.54-7.48(m,2H),7.47-7.37(m,6H),7.36-7.29(m,2H),7.27-7.21(m,2H),6.87(d,J＝8.8Hz,4H),4.67(d,J＝6.0Hz,2H),4.22(s,2H),3.82(s,6H),1.67(t,J＝6.0Hz,1H)。
(3'-(苄基氧基)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-[1,1'-联苯基]-3-基)甲醇(4)：
在氮气氛下，向在1,4-二噁烷(6mL)中的溴化物2(0.50g，0.963mmol)、3-苄基氧基苯硼酸3(0.263g，1.155mmol)和Pd(PPh3)4(0.111g，0.096mmol)的混合物中添加2M水性Na2CO3(1.44mL)。将混合物在回流下加热过夜。然后将反应冷却至室温并且分配在EtOAc与饱和水性NaHCO3之间。将有机层蒸发并且将粗产物通过快速层析纯化(用5％-30％EtOAc/庚烷中的1％Et3N洗脱)，以提供0.454g(70％)的4。MS(ESI+)m/z:C42H38O5计算值622.3；发现值303.5[DMT]+。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.52-7.43(m,5H),7.41-7.29(m,12H),7.27-7.16(m,3H),7.01(m,1H),6.95-6.86(m,4H),5.18(s,2H),5.07(t,J＝5.8Hz,1H),4.57(d,J＝5.8Hz,2H),4.18(s,2H),3.74(s,6H)。
在氩下，向5mL干吡啶中的452mg(0.726mmol)4和89mg(0.726mmol)N,N-二甲基氨基吡啶(DMAP)的溶液中添加145mg(1.45mmol)琥珀酸酐(5)。将反应混合物在室温下搅拌18h并且然后添加0.5mL水。继续搅拌30min。将反应混合物用100mL二氯甲烷稀释并且用50mL冰冷10％水性柠檬酸和水(2x 50mL)洗涤。将水层用50mL二氯甲烷再萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥并蒸发。将剩余的油状物与甲苯共蒸发两次并且将粗产物通过硅胶层析纯化(二氯甲烷/甲醇/三乙胺94:5:1)，以给出510mg(0.619mmol，85％)呈无色泡沫的6。1HNMR(400MHz,CDCl3):1.22(t,J＝7.3Hz,9H),2.57-2.59(m,2H),2.67-2.69(m,2H),2.97(q,J＝7.3Hz,6H),3.79(s,6H),4.24(s,2H),5.14(s,2H),5.18(s,2H),5.72(s br.,1H),6.84-6.88(m,4H),6.98(ddd,J＝0.7,2.2,8.2Hz,1H),7.19-7.54(m,20H)。
2.N.X098琥珀酸酯的合成
方案1：6的合成概述。
(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-溴苯基)甲醇(2)：
同如上所述
将吡啶(60mL)中的5-溴-1,3-二羟基甲基苯1(3.00g，13.8mmol)、4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(4.68g，13.8mmol)的溶液在室温下搅拌16h。将反应混合物分配在EtOAc与水之间。将EtOAc层经无水Na2SO4干燥并蒸发。将粗产物通过快速层析纯化(用5％-30％EtOAc/庚烷中的1％Et3N洗脱)，以提供2.57g(36％)的2。MS(ESI+)m/z:C29H27BrO4计算值518.1；发现值303.5[DMT]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.54-7.48(m,2H),7.47-7.37(m,6H),7.36-7.29(m,2H),7.27-7.21(m,2H),6.87(d,J＝8.8Hz,4H),4.67(d,J＝6.0Hz,2H),4.22(s,2H),3.82(s,6H),1.67(t,J＝6.0Hz,1H)。
(5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-[1,1'-联苯基]-3-基)甲醇(4)：
在氮气氛下，向在1,4-二噁烷(6mL)中的溴化物2(0.500g，0.960mmol)、苯硼酸3(0.141g，1.16mmol)和Pd(PPh3)4(0.111g，0.096mmol)的混合物中添加2M水性Na2CO3(1.44mL)。将混合物在回流下加热过夜。然后将反应冷却至室温并且分配在EtOAc与饱和水性NaHCO3之间。将有机层蒸发并且将粗产物通过快速层析纯化(用5％-30％EtOAc/庚烷中的1％Et3N洗脱)，以提供0.380g(76％)的4。MS(ESI+)m/z:C35H32O4计算值516.2；发现值303.5[DMT]+。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.61(dd,J＝8.3,1.3Hz,2H),7.51-7.42(m,5H),7.39-7.28(m,9H),7.27-7.20(m,1H),6.95-6.86(m,4H),5.08(t,J＝5.8Hz,1H),4.57(d,J＝5.8Hz,2H),4.19(s,2H),3.74(s,6H)。
在氩下，向5mL干吡啶中的380mg(0.736mmol)4和90mg(0.736mmol)N,N-二甲基氨基吡啶(DMAP)的溶液中添加147mg(1.47mmol)琥珀酸酐(5)。将反应混合物在室温下搅拌18h并且然后添加0.5mL水。继续搅拌30min。将反应混合物用100mL二氯甲烷稀释并且用50mL冰冷10％水性柠檬酸和水(2x 50mL)洗涤。将水层用50mL二氯甲烷再萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥并蒸发。将剩余的油状物与甲苯共蒸发两次并且将粗产物通过硅胶层析纯化(二氯甲烷/甲醇/三乙胺94:5:1)，以给出460mg(0.641mmol，87％)呈灰白色泡沫的6。1H NMR(400MHz,CDCl3):1.22(t,J＝7.2Hz,9H),2.59(t,J＝7.1Hz,2H),2.71(t,J＝7.1Hz,2H),2.94(q,J＝7.2Hz,6H),3.81(s,6H),4.26(s,2H),5.20(s,2H),6.04(s br.,1H),6.85-6.89(m,4H),7.22-7.55(m,15H),7.62(d,J＝7.9Hz,2H)。
2.O.与X109缀合的siRNA的合成
ss-siRNA＝缀合中使用的反义单链序列＝
U002pUpApApU004pU004pApU004pCpU004pApU004pU004pCpCpGpU005pA005pC027
其中C027是核糖醇
方案1：3的合成概述。
将DCM(4mL)中的1(100mg，0.361mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(83mg，0.721mmol)和DCC(149mg，0.721mmol)的混合物在室温下搅拌12h。将反应混合物用饱和水性NaHCO3(4mL)淬灭。将有机层与水层分离，并且用水(1mL)和盐水(1mL)洗涤。将有机溶剂真空下除去。将粗产物通过从甲醇中重结晶纯化，以给出产率21％的2(27.7mg，0.074mmol)。ESI MS(m/z,MH+):375.4；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 2.85(d,J＝5.52Hz,4H)2.89(s,3H)3.94(s,2H)7.31-7.48(m,4H)7.49-7.64(m,3H)7.71(t,J＝6.78Hz,1H)8.12(br.s.,1H)。
向DMSO(73.2uL)中的2(2.23mg，5.96umol)中添加新鲜制备的ss-siRNA-(CH2)3-NH2溶液(3.66mg，0.596umol，在73.2uL PBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和30min。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的5％-60％100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供产率27.5％的3(1.09mg，0.164umol)。TOF MS(ES-):6403。
2.P.与X110缀合的siRNA的合成
方案2：4的合成概述。
将甲醇(15mL)中的1(500mg，1.40mmol)、Pd(30％，在碳上，24.9mg，0.070mmol)和乙酸(80ul，1.40mmol)的混合物在H2(1atm)下在室温下搅拌12h。将反应混合物过滤以除去Pd/C。向溶液中添加水性1M NaOH(3mL)，并且将所得混合物在60℃下加热12h。将混合物冷却至室温并且用水性1M HCl中和，以给出形成沉淀。将沉淀通过真空过滤收集并且在烘箱中干燥，以给出产率45％的2(166mg，0.63mmol)。ESI MS(m/z,MH+):264.4。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 3.58(s,2H)7.18-7.39(m,3H)7.44-7.65(m,4H)7.75(ddd,J＝8.28,6.78,1.51Hz,1H)8.01-8.20(m,1H)8.91(s,1H)12.47(s,1H)。
将DCM(4mL)中的2(87.6mg，0.333mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(77.0mg，0.665mmol)和DCC(137mg，0.665mmol)的混合物在室温下搅拌12h。将反应混合物用饱和水性NaHCO3(4mL)淬灭。将有机层与水层分离，并且用水(1mL)和盐水(1mL)洗涤。将有机溶剂真空下除去。将粗产物通过从甲醇中重结晶纯化，以给出产率49％的3(27.7mg，0.074mmol)。ESI MS(m/z,MH+):361.2。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 2.79(br.s.,4H)4.05(s,2H)7.29-7.37(m,2H)7.40(s,1H)7.50-7.64(m,4H)7.80(s,1H)8.10(s,1H)9.02(s,1H)。
向DMSO(240uL)中的3(1.76mg，4.88umol)中添加新鲜的ss-siRNA-(CH2)3-NH2溶液(2mg，0.325umol，在40uL PBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和30min。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的5％-60％100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供产率25％的4(0.526mg，0.082umol)。TOF MS(ES-):6388。
2.Q.与X111缀合的siRNA的合成
1是商业的，但是合成在文献中是未知的
方案3：3的合成概述。
将DCM(4mL)中的1(81mg，0.308mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(70.8mg，0.615mmol)和DCC(127mg，0.615mmol)的混合物在室温下搅拌12h。将反应混合物用饱和水性NaHCO3(4mL)淬灭。将有机层与水层分离，并且用水(1mL)和盐水(1mL)洗涤。将有机溶剂真空下除去。将粗产物通过从甲醇中重结晶纯化，以给出产率39％的2(43.7mg，0.121mmol)。ESI MS(m/z,MH+):361.4。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm 2.82(s,4H)4.07(s,2H)7.36-7.42(m,2H)7.46-7.51(m,1H)7.55-7.64(m,3H)7.70-7.77(m,2H)8.20(dt,J＝4.52,2.26Hz,1H)9.29(s,1H)。
向DMSO(240uL)中的2(2.35mg，6.51umol)中添加新鲜的ss-siRNA-(CH2)3-NH2溶液(2mg，0.325umol，在80uL PBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和30min。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的5％-60％100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供产率33％的3(0.68mg，0.082umol)。TOF MS(ES-):6390。
2.R.与X112缀合的siRNA的合成
方案4：3的合成概述。
将DMF(4mL)中的1(100mg，0.325mmol)、叔丁基氯二甲基硅烷(108mg，0.716mmol)和咪唑(91mg，1.33mmol)的混合物在室温下搅拌48h。将反应混合物用水(4mL)淬灭并用乙酸乙酯(3x 5mL)萃取。将合并的有机层用水和盐水洗涤，并且经硫酸钠干燥。然后将有机溶剂真空下除去。将粗产物通过二氧化硅层析(用0-50％乙酸乙酯/庚烷)进行纯化，以给出产率40％的2(55mg，0.13mmol)。ESI MS(m/z,MH+):422.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.04(m,6H)0.88-0.93(m,9H)3.59(t,J＝6.78Hz,2H)3.71(s,2H)4.09(t,J＝6.78Hz,2H)7.28-7.45(m,4H)7.51-7.61(m,3H)7.63-7.68(m,1H)9.00(s,1H)。
将DMSO(200uL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(2.73mg，0.024mmol)、2(5.0mg，0.012mmol)和DIC(2mg，0.325umol)的混合物在室温下搅拌12h。将10uL反应混合物用190uLDMSO稀释。向所得溶液中添加新鲜的ss-siRNA-(CH2)3-NH2溶液(2.19mg，0.356umol，在80ulPBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和2h。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的10％-40％100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供产率35％的3(0.79mg，0.123umol)。TOFMS(ES-):6435。
2.S.与X113缀合的siRNA的合成
1是商业的并且合成在文献中是已知的。张燕(Zhang,Yan)等人的PCT国际申请2010083384，2010年7月22日。
方案5：2的合成概述。
将DMSO(200uL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(6.18mg，0.054mmol)、1(5.0mg，0.027mmol)和DIC(6.77mg，0.054mmol)的混合物在室温下搅拌12h。将10uL反应混合物用190uL DMSO稀释。向所得溶液中添加新鲜的ss-siRNA-(CH2)3-NH2溶液(2.46mg，0.401umol，在80uL PBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和2h。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的10％-40％100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供产率10％的2(0.24mg，0.038umol)。TOF MS(ES-):6315。
2.S.1.用于用PAZ配体琥珀酸酯高密度装载可控孔度玻璃支持物的通用程序
在锥形瓶中，将1.00mmol PAZ配体琥珀酸盐1在氩下溶解于50mL干乙腈中。向此溶液中添加353mg(1.10mmol)O-(1H-苯并-1,2,3-三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基-四氟硼酸脲(TBTU)并且将溶液振荡10min。然后添加10g长链烷基胺可控孔度玻璃(LCAA/CNA-600-CPG，普赖姆合成(PrimeSynthesis)，2)并且将反应混合物轻轻搅拌5min。最后，添加0.685mL(517mg，4.00mmol)胡宁氏碱并且将烧瓶在定轨摇床上轻轻振荡24h。通过将CPG的等分部分脱三苯甲基化来评估装载密度(将3-5mg CPG用乙腈洗涤，在真空中干燥，添加至二氯甲烷中的25mL 3％二氯乙酸(v/v)中，在504nm下测定吸光度)。如果装载密度在所希望的范围(60-90微摩尔/g)内，则将CPG滤出并且用乙腈充分洗涤。通过用乙酸酐/2,6-二甲基吡啶/THF1:1:8(v/v/v)的混合物和THF中的1-甲基咪唑的溶液16:84(v/v)各自x mL处理CPG来为未衍生化的氨基基团加帽。将混合物在室温下轻轻振荡15min。然后将CPG滤出，用乙腈洗涤并且在真空下干燥过夜。如上再次测定装载密度。实例1-6中的琥珀酸酯的装载产率在64-75微摩尔/g的范围内。
2.T.与X1011缀合的siRNA的合成
方案1：2的合成概述。
将DMSO(200uL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(2.489mg，0.022mmol)、1(3.0mg，0.011mmol)和DIC(2.73mg，0.022mmol)的混合物在室温下搅拌12h。将10uL反应混合物用190uL DMSO稀释。向所得溶液中添加新鲜的ss-siRNA-(CH2)4-NH2溶液(2.00mg，0.325umol，在80uL PBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和2h。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的10％-40％100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供2。TOF MS(ES-):6418。
2.U.与X1012和X1018缀合的siRNA的合成
方案2：3的合成概述。
将甲醇(15mL)中的1(500mg，1.40mmol)、Pd(30％，在碳上，24.9mg，0.070mmol)和乙酸(80ul，1.40mmol)的混合物在H2(1atm)下在室温下搅拌12h。将反应混合物过滤以除去Pd/C。向溶液中添加水性1M NaOH(3mL)，并且将所得混合物在60℃下加热12h。将混合物冷却至室温并且用水性1M HCl中和，以给出形成沉淀。将沉淀通过真空过滤收集并且在烘箱中干燥，以给出产率45％的2(166mg，0.63mmol)。ESI MS(m/z,MH+):264.4。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 3.58(s,2H)7.18-7.39(m,3H)7.44-7.65(m,4H)7.75(ddd,J＝8.28,6.78,1.51Hz,1H)8.01-8.20(m,1H)8.91(s,1H)12.47(s,1H)。
将DMSO(200uL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(2.489mg，0.022mmol)、2(2.85mg，0.011mmol)和DIC(2.73mg，0.022mmol)的混合物在室温下搅拌12h。将10uL反应混合物用190uL DMSO稀释。向所得溶液中添加新鲜的ss-siRNA-(CH2)4-NH2溶液(2.00mg，0.325umol，在80uL PBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和2h。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的10％-40％100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供3。ESI MS(ES+):6405。
2.U.与X1018缀合的siRNA的合成
方案3：4的合成概述
将DMSO(200uL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(2.483mg，0.022mmol)、2(2.84mg，0.011mmol)和DIC(2.72mg，0.022mmol)的混合物在室温下搅拌12h。将10uL反应混合物用190uL DMSO稀释。向所得溶液中添加新鲜的ss-siRNA-(CH2)5-NH2溶液(2.00mg，0.325umol，在80uL PBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和2h。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的10％-40％100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供4。
2.V.与X1013缀合的siRNA的合成
方案4：2的合成概述。
将DMSO(200uL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(2.489mg，0.022mmol)、2(2.85mg，0.011mmol)和DIC(2.73mg，0.022mmol)的混合物在室温下搅拌12h。将10uL反应混合物用190uL DMSO稀释。向所得溶液中添加新鲜的ss-siRNA-(CH2)4-NH2溶液(2.00mg，0.325umol，在80uL PBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和2h。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的10％-40％100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供2。TOF MS(ES-):6404。
2.W.与X1019缀合的siRNA的合成
方案5：3的合成概述。
将DMF(4mL)中的1(100mg，0.325mmol)、叔丁基氯二甲基硅烷(108mg，0.716mmol)和咪唑(91mg，1.33mmol)的混合物在室温下搅拌48h。将反应混合物用水(4mL)淬灭并用乙酸乙酯(3x 5mL)萃取。将合并的有机层用水和盐水洗涤，并且经硫酸钠干燥。然后将有机溶剂真空下除去。将粗产物通过二氧化硅层析(用0-50％乙酸乙酯/庚烷)进行纯化，以给出产率40％的2(55mg，0.13mmol)。ESI MS(m/z,MH+):422.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.04(m,6H)0.88-0.93(m,9H)3.59(t,J＝6.78Hz,2H)3.71(s,2H)4.09(t,J＝6.78Hz,2H)7.28-7.45(m,4H)7.51-7.61(m,3H)7.63-7.68(m,1H)9.00(s,1H)。
将DMSO(200uL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(2.48mg，0.022mmol)、2(4.55mg，0.011mmol)和DIC(2.72mg，0.022mmol)的混合物在室温下搅拌12h。将10uL反应混合物用190uL DMSO稀释。向所得溶液中添加新鲜的ss-siRNA-(CH2)3-NH2溶液(2mg，0.324umol，在80ul PBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和2h。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的10％-40％ 100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供3。TOF MS(ES-)：6462。
2.X.与X1015缀合的siRNA的合成
方案6：2的合成概述。
将DMSO(200uL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(2.49mg，0.022mmol)、1(2.02mg，0.011mmol)和DIC(2.73mg，0.022mmol)的混合物在室温下搅拌12h。将10uL反应混合物用190uL DMSO稀释。向所得溶液中添加新鲜的ss-siRNA-(CH2)4-NH2溶液(2mg，0.325umol，在80uL PBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和2h。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的10％-40％100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供2。TOF MS(ES-)：6327。
2.Y.与X1020缀合的siRNA的合成
方案7：2的合成概述。
将DMSO(200uL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(2.48mg，0.022mmol)、1(2.02mg，0.011mmol)和DIC(2.72mg，0.022mmol)的混合物在室温下搅拌12h。将10uL反应混合物用190uL DMSO稀释。向所得溶液中添加新鲜的ss-siRNA-(CH2)5-NH2溶液(2mg，0.324umol，在80uL PBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和2h。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的10％-40％100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供2。TOF MS(ES-)：6341。
2.Z.与X1009缀合的siRNA的合成
方案7：8的合成概述。
在N2下，向AlCl3(1.19g，8.93mmol，40ml甲苯溶液)中滴加4-甲氧基苯胺(1g，8.12mmol，10ml甲苯溶液)。随后将BCl3(8.12ml，8.12mmol，1M溶液，在CH2Cl2中)和苯甲腈(2.51g，24.36mmol)添加至以上混合物中。将所得混合物在室温下搅拌1h，然后在110℃下加热6hr。将反应混合物冷却至室温，向其中添加水性HCl(1M，13ml)。然后将溶液在80℃下加热1h。将溶液冷却至室温，并且将有机层与水层分离。将水层用乙酸乙酯(3x 50mL)萃取。将合并的有机层用水和盐水洗涤，并且经硫酸钠干燥。然后将有机溶剂真空下除去。将粗产物通过二氧化硅层析用0-40％乙酸乙酯/庚烷纯化，以给出产率15％的1(273mg，1.2mmol)。ESI MS(m/z,MH+)：227.3。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 3.66(s，3H)6.80(d，J＝8.84Hz，1H)6.93-7.05(m，2H)7.40-7.49(m，2H)7.49-7.58(m，1H)7.63-7.72(m，2H)。
将DCM(10ml)中的1(269mg，1.18mmol)和4-氯-4-氧代丁酸乙酯(214mg，1.3mmol)的混合物在60℃下加热1h。将反应混合物冷却并用水性1M NaOH(5ml)淬灭。将有机层与水层分离。将水层用二氯甲烷(3x5ml)萃取。将合并的有机层用水和盐水洗涤，并且经硫酸钠干燥。然后将有机溶剂真空下除去。将粗产物通过二氧化硅层析(用0-60％乙酸乙酯/庚烷)进行纯化，以给出产率73％的2(305mg，0.86mmol)。ESI MS(m/z，MH+)：355.5。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 1.26(t，J＝7.28Hz，3H)2.74(s，4H)3.77(s，3H)4.16(q，J＝7.03Hz，2H)7.06(d，J＝3.01Hz，1H)7.14(dd，J＝9.03，3.01Hz，1H)7.48-7.55(m，2H)7.60-7.66(m，1H)7.73-7.79(m，2H)8.50(d，J＝9.03Hz，1H)10.45(br.s.，1H)。
将乙醇(10ml)中的2(305mg，0.86mmol)和氢化钠(343mg，8.58mmol)的混合物在80℃下加热2h。将反应混合物冷却至室温并用水(5ml)淬灭，然后用水性1M HCl(2ml)中和。将所得溶液用乙酸乙酯(3x10mL)萃取。将合并的有机层用水和盐水洗涤，并且经硫酸钠干燥。然后将有机溶剂在真空下除去，以给出产率94％的3(250mg，0.81mmol)。ESI MS(m/z，MH+)：309.3。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 3.38(s，2H)3.63(s，3H)6.51(d，J＝2.51Hz，1H)7.20(dd，J＝9.03，3.01Hz，1H)7.28-7.47(m，3H)7.52-7.63(m，3H。
将POCl3(10ml)中的3(250mg，0.81mmol)的溶液在室温下搅拌2h。将POCl3在真空下除去，将所得残余物用乙醇(20ml)淬灭。将溶液在室温下搅拌1h，然后将乙醇在真空下除去。向残余物中添加二氯甲烷(30ml)和水性1M NaOH(20ml)。将有机层与水层分离。将水层用二氯甲烷(2x 20ml)萃取。将合并的有机层用水、盐水洗涤并经硫酸钠干燥。将有机溶剂在真空下除去，以给出产率99％的4(270mg，0.8mmol)。ESI MS(m/z，MH+)：338.2。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 1.23-1.27(m，3H)3.48(s，2H)3.66(s，3H)4.04-4.22(m，2H)6.55(d，J＝2.51Hz，1H)7.09-7.15(m，1H)7.24(d，J＝9.03Hz，1H)7.29-7.34(m，2H)7.44-7.64(m，3H)10.49(br.s.，1H)。
将POCl3(10ml)中的4(270mg，0.8mmol)的溶液在110℃下加热12h。将POCl3在真空下除去。向残余物中添加二氯甲烷(20ml)和水性1M NaOH(20ml)。将有机层与水层分离。将水层用二氯甲烷(2x 20ml)萃取。将合并的有机层用水、盐水洗涤并经硫酸钠干燥。将有机溶剂在真空下除去，以给出产率92％的5(265mg，0.75mmol)。ESI MS(m/z，MH+)：356.1。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δppm 1.22-1.27(m，3H)3.70(s，5H)4.17(q，J＝7.03Hz，2H)6.62(d，J＝3.01Hz，1H)7.20-7.34(m，2H)7.38(dd，J＝9.03，2.51Hz，1H)7.46-7.63(m，3H)8.01(d，J＝9.03Hz，1H)。
将乙醇(20ml)中的5(265mg，0.745mmol)、三乙胺(1.28g，12.66mmol)和Pd/C(10％，79mg，0.745mmol)的混合物在H2(1atm)下在室温下搅拌12h。将反应混合物过滤以除去Pd/C。将有机溶剂在真空下除去，以给出产率76％的6(182mg，0.57mmol)。ESI MS(m/z，MH+)：322.1。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 1.12(t，J＝7.15Hz，3H)3.51(s，2H)3.62(s，3H)4.01(q，J＝7.19Hz，2H)6.61(d，J＝2.76Hz，1H)7.18-7.31(m，3H)7.39-7.50(m，3H)7.97(d，J＝9.29Hz，1H)8.68(s，1H)。
将二噁烷(1ml)中的6(50mg，0.16mmol)、水性1M LiOH(0.17ml，0.17mmol)的混合物在室温下搅拌48hr。将来自反应混合物的沉淀过滤并干燥，以给出产率69％的作为锂盐的7(32mg，0.107mmol)。ESI MS(m/z，MH+)：294.2。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 3.48(s，2H)3.63-3.73(m，3H)6.75(d，J＝2.51Hz，1H)7.28-7.43(m，3H)7.48-7.64(m，3H)7.94(d，J＝9.03Hz，1H)8.73(s，1H)。
将DMSO(200uL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(2.49mg，0.022mmol)、7(3.18mg，0.011mmol)和DIC(2.74mg，0.022mmol)的混合物在室温下搅拌12h。将10uL反应混合物用190uL DMSO稀释。向所得溶液中添加新鲜的ss-siRNA-(CH2)3-NH2溶液(2mg，0.325umol，在80uL PBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和2h。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的10％-40％100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供8。TOF MS(ES-)：6422。
2.AA.与X1016缀合的siRNA的合成
方案8：9的合成概述。
将DMSO(200uL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(2.49mg，0.022mmol)、7(3.18mg，0.011mmol)和DIC(2.74mg，0.022mmol)的混合物在室温下搅拌12h。将10uL反应混合物用190uL DMSO稀释。向所得溶液中添加新鲜的ss-siRNA-(CH2)4-NH2溶液(2mg，0.325umol，在80uL PBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和2h。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的10％-40％100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供9。TOF MS(ES-)：6434。
2.BB.与X1021缀合的siRNA的合成
方案9：10的合成概述。
将DMSO(200uL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(2.48mg，0.022mmol)、7(3.16mg，0.011mmol)和DIC(2.72mg，0.022mmol)的混合物在室温下搅拌12h。将10uL反应混合物用190uL DMSO稀释。向所得溶液中添加新鲜的ss-siRNA-(CH2)5-NH2溶液(2mg，0.325umol，在80uL PBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和2h。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的10％-40％100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供10。TOF MS(ES-):6448。
2.CC.与X1010缀合的siRNA的合成
方案10：10的合成概述。
在N2下，向BCl3(10.74ml，10.74mmol，1M溶液，在CH2Cl2中)中滴加苯胺(1g，10.74mmol，10ml甲苯溶液)。随后将3-甲氧基苯甲腈(4.29g，32.2mmol)和AlCl3(1.575g，11.81mmol，40ml甲苯溶液)添加至以上混合物中。将所得混合物在室温下搅拌1h，然后在110℃下加热6hr。将反应混合物冷却至室温，向其中添加水性HCl(1M，13ml)。然后将溶液在80℃下加热1h。将溶液冷却至室温，并且将有机层与水层分离。将水层用乙酸乙酯(3x50mL)萃取。将合并的有机层用水和盐水洗涤，并且经硫酸钠干燥。然后将有机溶剂真空下除去。将粗产物通过二氧化硅层析(用0-40％乙酸乙酯/庚烷)进行纯化，以给出产率36％的1(875mg，3.85mmol)。ESI MS(m/z,MH+):227.9。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 3.74(s,3H)6.00(br.s.,2H)6.44-6.56(m,1H)6.63(dd,J＝8.53,1.00Hz,1H)6.93-7.00(m,1H)7.04-7.11(m,2H)7.14-7.31(m,2H)7.37(dd,J＝8.03,1.51Hz,1H)。
将DCM(20ml)中的1(570mg，2.51mmol)和4-氯-4-氧代丁酸乙酯(454mg，2.76mmol)的混合物在60℃下加热1h。将反应混合物冷却并用水性1M NaOH(5ml)淬灭。将有机层与水层分离。将水层用二氯甲烷(3x15ml)萃取。将合并的有机层用水和盐水洗涤，并且经硫酸钠干燥。然后将有机溶剂在真空下除去，以给出产率92％的2(824mg，2.32mmol)。ESI MS(m/z,MH+):355.4。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.25-1.48(m,3H)2.73-3.01(m,4H)3.88(s,3H)4.18(q,J＝7.07Hz,2H)7.05-7.20(m,2H)7.22-7.30(m,2H)7.37-7.45(m,1H)7.53-7.64(m,2H)8.64(d,J＝8.59Hz,1H)10.90(br.s.,1H)。
将乙醇(20ml)中的2(824mg，2.32mmol)和氢化钠(927mg，23.19mmol)的混合物在80℃下加热2h。将反应混合物冷却至室温并用水(5ml)淬灭，然后用水性1M HCl(2m1)中和。将所得溶液用乙酸乙酯(3x 10mL)萃取。将合并的有机层用水和盐水洗涤，并且经硫酸钠干燥。然后将有机溶剂在真空下除去，以给出产率81％的3(583mg，0.81mmol)。ESI MS(m/z，MH+)：310.1。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 3.49-3.64(m，2H)3.83-3.89(m，3H)6.83-6.96(m，2H)7.00-7.28(m，4H)7.37-7.56(m，4H)12.02-12.32(m，2H)。
将POCl3(10ml)中的3(583mg，1.89mmol)的溶液在室温下搅拌2h。将POCl3在真空下除去，将所得残余物用乙醇(20ml)淬灭。将溶液在室温下搅拌1h，然后将乙醇在真空下除去。向残余物中添加二氯甲烷(30ml)和水性1M NaOH(20ml)。将有机层与水层分离。将水层用二氯甲烷(2x20ml)萃取。将合并的有机层用水、盐水洗涤并经硫酸钠干燥。将有机溶剂在真空下除去，以给出产率120％的4(760mg，2.25mmol)。ESI MS(m/z，MH+)：338.1。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 1.26(t，J＝7.07Hz，3H)3.44-3.64(m，2H)3.85(s，3H)4.17(q，J＝7.16Hz，2H)6.85-6.93(m，2H)7.03(ddd，J＝8.46，2.65，1.01Hz，1H)7.11(ddd，J＝8.21，6.95，1.01Hz，1H)7.17(dd，J＝8.21，1.39Hz，1H)7.32-7.39(m，1H)7.40-7.52(m，2H)11.43(br.s.，1H)
将POCl3(10ml)中的4(760mg，2.25mmol)的溶液在110℃下加热12h。将POCl3在真空下除去。向残余物中添加二氯甲烷(20ml)和水性1M NaOH(20ml)。将有机层与水层分离。将水层用二氯甲烷(2x 20ml)萃取。将合并的有机层用水、盐水洗涤并经硫酸钠干燥。将有机溶剂在真空下除去，以给出产率97％的5(650mg，1.83mmol)。ESI MS(m/z，MH+)：355.4。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δppm 1.25(t，J＝7.28Hz，3H)3.75(d，J＝1.00Hz，2H)3.85(s，3H)4.18(q，J＝7.03Hz，2H)6.78-6.92(m，2H)6.97-7.13(m，1H)7.39-7.60(m，3H)7.76(d，J＝2.01Hz，1H)8.15(d，J＝8.53Hz，1H)。
将乙醇(20ml)中的5(650mg，1.83mmol)、三乙胺(3.14g，31.1mmol)和Pd/C(10％，194mg，1.827mmol)的混合物在H2(1atm)下在室温下搅拌12h。将反应混合物过滤以除去Pd/C。将有机溶剂在真空下除去，以给出产率78％的6(460mg，1.43mmol)。ESI MS(m/z，MH+)：321.5。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm1.20-1.26(m，3H)1.44(t，J＝7.53Hz，9H)3.12(qd，J＝7.28，4.77Hz，6H)3.65(s，2H)3.79-3.93(m，3H)4.12(q，J＝7.19Hz，2H)6.82-6.92(m，2H)7.06(ddd，J＝8.53，2.51，1.00Hz，1H)7.39-7.58(m，3H)7.72(ddd，J＝8.41，6.65，1.51Hz，1H)8.19(d，J＝8.53Hz，1H)8.93(s，1H)12.20(br.s.，3H)。
在-78℃下，向在DCM(15ml)中的6(400mg，1.245mmol)的溶液中添加BBr3(1M，在DCM中，3.73ml，3.73mmol)。将反应混合物在2h内加温至室温。将混合物冷却至-78℃，并且用乙醇淬灭。将有机溶剂真空下除去。向所得残余物中添加乙酸乙酯(15ml)和水(15ml)。将有机层与水层分离。将水层用乙酸乙酯(3x 15ml)萃取。将合并的有机层用水、盐水洗涤并经硫酸钠干燥。将有机溶剂真空下除去。将粗品通过从二氯甲烷中重结晶纯化，以给出产率74％的7(282mg，0.92mmol)。ESI MS(m/z,MH+):308.2。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.11(t,J＝7.03Hz,3H)3.68(s,2H)3.91-4.11(m,2H)6.50-6.70(m,2H)6.81-6.97(m,1H)7.30-7.48(m,2H)7.51-7.63(m,1H)7.78(ddd,J＝8.53,7.03,1.51Hz,1H)8.08(d,J＝8.03Hz,1H)8.93(s,1H)9.75(br.s.,1H)。
将DMF(500ul)中的7(20mg，0.065mmol)、苄基溴(16.69mg，0.098mmol)和碳酸铯(42.4mg，0.13mmol)的混合物在室温下搅拌12hr。将反应混合物过滤以除去不溶性材料。将粗产物通过HPLC(用5％-95％乙腈/水中的5％NH4OH)进行纯化，以给出产率26.7％的8(6.9mg，0.017mmol)。ESI MS(m/z,MH+):398.3。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.22(t,J＝7.03Hz,3H)3.64(s,2H)4.12(q,J＝7.03Hz,2H)5.11(s,2H)6.76-7.02(m,2H)7.13(ddd,J＝8.53,2.51,1.00Hz,1H)7.31-7.56(m,8H)7.71(ddd,J＝8.28,6.78,2.01Hz,1H)8.17(d,J＝8.53Hz,1H)8.92(s,1H)。
将二噁烷(0.5ml)中的8(6.9mg，0.017mmol)、水性1M LiOH(0.019ml，0.019mmol)的混合物在室温下搅拌12hr。将有机溶剂在真空下除去，以给出产率92％的作为锂盐的9(6mg，0.016mmol)。ESI MS(m/z,MH+):370.2。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm 3.42-3.60(m,2H)5.07-5.19(m,2H)6.94(dt,J＝7.53,1.25Hz,1H)7.06(dd,J＝2.51,1.51Hz,1H)7.14(ddd,J＝8.53,2.51,1.00Hz,1H)7.25-7.42(m,3H)7.42-7.53(m,2H)7.70(ddd,J＝8.41,4.64,3.51Hz,2H)8.04(d,J＝8.03Hz,1H)8.56(s,2H)8.88(s,1H)。
将DMSO(200uL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(2.49mg，0.022mmol)、9(4.08mg，0.011mmol)和DIC(2.74mg，0.022mmol)的混合物在室温下搅拌12h。将10uL反应混合物用190uL DMSO稀释。向所得溶液中添加新鲜的ss-siRNA-(CH2)3-NH2溶液(2mg，0.325umol，在80uL PBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和2h。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的10％-40％100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供10。TOF MS(ES-):6495。
2.DD.与X1017缀合的siRNA的合成
方案11：11的合成概述。
将DMSO(200uL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(2.49mg，0.022mmol)、9(4.07mg，0.011mmol)和DIC(2.73mg，0.022mmol)的混合物在室温下搅拌12h。将10uL反应混合物用190uL DMSO稀释。向所得溶液中添加新鲜的ss-siRNA-(CH2)4-NH2溶液(2mg，0.325umol，在80uL PBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和2h。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的10％-40％100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供11。TOF MS(ES-)：6510。
2.EE.与X1022缀合的siRNA的合成
方案12：12的合成概述。
将DMSO(200uL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(2.48mg，0.022mmol)、9(4.06mg，0.011mmol)和DIC(2.72mg，0.022mmol)的混合物在室温下搅拌12h。将10uL反应混合物用190uL DMSO稀释。向所得溶液中添加新鲜的ss-siRNA-(CH2)5-NH2溶液(2mg，0.325umol，在80uL PBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和2h。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的10％-40％100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供12。TOF MS(ES-)：6524。
2.FF.与X1024缀合的siRNA的合成
方案13：2的合成概述。
将DMSO(200uL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(2.5mg，0.0522mmol)、1(2.5mg，0.013mmol)和DIC(2.74mg，0.022mmol)的混合物在室温下搅拌12h。将10uL反应混合物用190uL DMSO稀释。向所得溶液中添加新鲜的ss-siRNA-(CH2)3-NH2溶液(2.0mg，0.325umol，在80uL PBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和2h。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的10％-40％100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供2。TOF MS(ES-)：6315。
2.GG.与X1026缀合的siRNA的合成
方案14：2的合成概述。
将DMSO(200uL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(2.49mg，0.022mmol)、1(2.02mg，0.011mmol)和DIC(2.73mg，0.022mmol)的混合物在室温下搅拌12h。将10uL反应混合物用190uL DMSO稀释。向所得溶液中添加新鲜的ss-siRNA-(CH2)4-NH2溶液(2mg，0.325umol，在80uL PBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和2h。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的10％-40％100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供2。TOF MS(ES-)：6327。
2.HH.与X1025缀合的siRNA的合成
方案15：2的合成概述。
将DMSO(200uL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(2.49mg，0.022mmol)、1(2.84mg，0.01mmol)和DIC(2.74mg，0.022mmol)的混合物在室温下搅拌12h。将10uL反应混合物用190uL DMSO稀释。向所得溶液中添加新鲜的ss-siRNA-(CH2)3-NH2溶液(2.0mg，0.325umol，在80uL PBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和2h。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的10％-40％100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供2。TOF MS(ES-)：6390。
2.II.与X1027缀合的siRNA的合成
方案16：2的合成概述。
将DMSO(200uL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(2.49mg，0.022mmol)、1(2.84mg，0.011mmol)和DIC(2.73mg，0.022mmol)的混合物在室温下搅拌12h。将10uL反应混合物用190uL DMSO稀释。向所得溶液中添加新鲜的ss-siRNA-(CH2)4-NH2溶液(2mg，0.325umol，在80uL PBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和2h。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的10％-40％100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供2。TOF MS(ES-)：6404。
2.JJ.与X1028缀合的siRNA的合成
方案17：2的合成概述。
将DMSO(200uL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(2.48mg，0.022mmol)、1(2.90mg，0.011mmol)和DIC(2.72mg，0.022mmol)的混合物在室温下搅拌12h。将10uL反应混合物用190uL DMSO稀释。向所得溶液中添加新鲜的ss-siRNA-(CH2)5-NH2溶液(2mg，0.324umol，在80uL PBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和2h。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的10％-40％100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供2。TOF MS(ES-)：6417。
2.KK.与X1062缀合的siRNA的合成
方案1：10的合成概述。
在N2下，向甲苯(200ml)中的AlCl3(7.88g，59.1mmol)中滴加苯胺(5g，53.7mmol，4.59ml，在50ml甲苯中)。随后将3-溴苯甲腈(29.3g，161mmol)添加至以上混合物中。将所得混合物在室温下搅拌1h，然后在110℃下加热6hr。将反应混合物冷却至室温，向其中添加水性HCl(1M，3ml)。然后将溶液在80℃下加热1h。将溶液冷却至室温，并且将有机层与水层分离。将水层用乙酸乙酯(3x 100mL)萃取。将合并的有机层用水和盐水洗涤，并且经硫酸钠干燥。然后将有机溶剂真空下除去。将粗产物通过二氧化硅层析(用0-40％乙酸乙酯/庚烷)进行纯化，以给出产率29％的1(4.31g，15.6mmol)。ESI MS(m/z,MH+):278.1 1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm6.16(br.s.,2H)6.64(t,J＝7.53Hz,1H)6.76(d,J＝8.53Hz,1H)7.29-7.49(m,3H)7.56(d,J＝7.53Hz,1H)7.67(d,J＝8.03Hz,1H)7.74-7.84(m,1H)
将DCM(60ml)中的1(1.02g，3.69mmol)和4-氯-4-氧代丁酸乙酯(0.669g，4.06mmol)的混合物在60℃下加热1h。将反应混合物冷却并用水性1M NaOH(15ml)淬灭。将有机层与水层分离。将水层用二氯甲烷(3x 50ml)萃取。将合并的有机层用水和盐水洗涤，并且经硫酸钠干燥。然后将有机溶剂在真空下除去，以给出产率96％的2(1.44g，3.56mmol)。ESI MS(m/z,MH+):406.2。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ10.88(s,1H),8.65(d,J＝8.4Hz,1H),7.86(d,J＝1.8Hz,1H),7.74(d,J＝8.0Hz,1H),7.65-7.51(m,3H),7.39(t,J＝7.8Hz,1H),7.12(t,J＝7.7Hz,1H),4.17(q,J＝7.1Hz,2H),2.77(dt,J＝10.3,5.2Hz,4H),1.27(t,J＝7.1Hz,4H)。
将乙醇(20ml)中的2(1.44g，3.56mmol)和氢化钠(1.425g，35.6mmol)的混合物在80℃下加热2h。将反应混合物冷却至室温并用水(5ml)淬灭，然后用水性1M HCl(2ml)中和。将所得溶液用乙酸乙酯(3x 50mL)萃取。将合并的有机层用水和盐水洗涤，并且经硫酸钠干燥。然后将有机溶剂在真空下除去，以给出产率94％的3(1.2g，3.63mmol)。ESI MS(m/z，MH+)：360.2。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ11.71-11.63(m，1H)，11.55-11.42(m，3H)，11.37(d，J＝8.3Hz，1H)，11.30-11.22(m，1H)，11.12(td，J＝7.6，7.0，1.2Hz，1H)，11.00(dd，J＝8.2，1.4Hz，1H)，7.33(d，J＝3.5Hz，2H)，4.87-4.82(m，2H)。
将POCl3(15ml)中的3(1.2g，1.89mmol)的溶液在室温下搅拌2h。将POCl3在真空下除去，将所得残余物用乙醇(50ml)淬灭。将溶液在室温下搅拌2h，然后将乙醇在真空下除去。向残余物中添加二氯甲烷(50ml)和水性1M NaOH(20m1)。将有机层与水层分离。将水层用二氯甲烷(2x 50ml)萃取。将合并的有机层用水、盐水洗涤并经硫酸钠干燥。将有机溶剂在真空下除去，以给出产率136％的4(1.76mg，4.56mmol)。ESI MS(m/z，MH+)：388.2。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.65(dt，J＝8.2，1.4Hz，1H)，7.54-7.46(m，2H)，7.45-7.37(m，2H)，7.27(dt，J＝7.8，1.5Hz，1H)，7.17-7.04(m，2H)，4.18-4.16(m，2H)，3.50(d，J＝1.5Hz，2H)，1.27(h，J＝3.7Hz，3H)。
将POCl3(10ml)中的4(1.76g，4.56mmol)的溶液在110℃下加热12h。将POCl3在真空下除去。向残余物中添加二氯甲烷(50ml)和水性1M NaOH(20ml)。将有机层与水层分离。将水层用二氯甲烷(2x 50ml)萃取。将合并的有机层用水、盐水洗涤并经硫酸钠干燥。将有机溶剂在真空下除去，以给出产率32.5％的5(440mg，1.09mmol)。ESI MS(m/z，MH+)：406.0。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δ8.14-8.05(m，1H)，7.76(ddd，J＝8.4，6.9，1.4Hz，1H)，7.69(ddd，J＝8.0，1.9，1.0Hz，1H)，7.53-7.41(m，3H)，7.36(dd，J＝8.3，1.3Hz，1H)，7.26(dt，J＝7.7，1.3Hz，1H)，4.19(q，J＝7.1Hz，2H)，3.72(s，2H)，1.27(t，J＝7.1Hz，3H)。
将TFA(1ml)中的5(50mg，0.124mmol)、锌粉(40.4mg，0.618mmol)的混合物在40℃下加热12h。将反应混合物用NaOH(1M，1ml)淬灭。将有机层用二氯甲烷(2x 10ml)萃取。将合并的有机层用水、盐水洗涤并经硫酸钠干燥。将有机溶剂真空下除去。将粗产物通过二氧化硅快速层析(用洗脱液0-50％EtOAc/庚烷)进行纯化，以给出产率85％的6(39mg，0.105mmol)。ESI MS(m/z，MH+)：372.1。1H NMR(400MHz，氯仿-d)ppm1.24(t，J＝7.15Hz，3H)3.63(s，2H)4.02-4.27(m，2H)7.12-7.33(m，1H)7.37-7.61(m，4H)7.61-7.71(m，1H)7.75(t，J＝1.51Hz，1H)8.21(d，J＝8.53Hz，1H)8.94(s，1H)。
将在2-Me THF(500uL)和DMF(500uL)中的4-(2-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧硼戊环-2-基)乙基)-1，3-二氧戊环-2-酮)(255mg，1.05mmol)、6(39mg，0.105mmol)、(Brettphos)钯(II)氯化苯乙胺(4.21mg，5.27umol)和1M水性K3PO4(421uL，0.421mmol)的混合物在80℃下加热12h。将反应混合物过滤以除去不溶性材料。将有机溶剂真空下除去。将粗品通过HPLC(用5％-95％乙腈/水中的5％TFA)进行纯化，以给出产率37.5％的7(15mg，0.04mmol)。ESI MS(m/z，MH+)：380.4。1H NMR(400MHz，氯仿-d)ppm 1.22(td，J＝7.15，2.26Hz，3H)1.73-1.92(m，2H)2.72-2.98(m，2H)3.49(dd，J＝11.04，7.53Hz，1H)3.56-3.84(m，4H)4.04-4.20(m，2H)7.15(d，J＝7.53Hz，1H)7.13(d，J＝8.78Hz，1H)7.37(d，J＝7.53Hz，1H)7.43-7.56(m，3H)7.74(br.s.，1H)8.22(br.s.，1H)8.94(br.s.，1H)。
将二噁烷(200ul)中的7(15mg，0.04mmol)和水性1M LiOH(87uL/ml，0.087mmol)的混合物在室温下搅拌12hr。将有机溶剂在真空下除去，以给出产率100％的作为锂盐的8(14.17mg，0.04mmol)。ESI MS(m/z，MH+)：352.4。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.62-1.80(m，1H)1.80-1.98(m，1H)2.78(ddd，J＝13.33，6.76，3.16Hz，1H)2.84-2.99(m，1H)3.46-3.55(m，3H)3.55-3.68(m，3H)6.98-7.25(m，2H)7.31-7.59(m，4H)7.74(ddd，J＝8.40，6.38，1.89Hz，1H)8.06(d，J＝8.34Hz，1H)8.86(s，1H)。
将DMF(4ml)中的8(14mg，0.039mmol)、TBDMSCl和咪唑(43.6mg，0.641mmol)的混合物在室温下搅拌24hr。将反应混合物用水(1ml)淬灭。将有机层用乙酯(3x 5ml)萃取。将合并的有机层用水、盐水洗涤并经硫酸钠干燥。将有机溶剂真空下除去。将粗产物通过二氧化硅快速层析(用洗脱液0-50％EtOAc/庚烷)进行纯化，以给出产率63.2％的9(15.9mg，0.025mmol)。ESI MS(m/z，MH+)：580.6。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm-0.12-0.13(m，8H)0.69-0.98(m，12H)1.17-1.36(m，5H)2.60-2.90(m，2H)3.38-3.62(m，6H)3.73(d，J＝4.55Hz，1H)7.02-7.15(m，2H)7.24-7.38(m，1H)7.39-7.47(m，3H)7.64-7.74(m，1H)7.98-8.06(m，1H)8.68-8.89(m，1H)。
将DMSO(200uL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(2.49mg，0.022mmol)、9(6.26mg，0.011mmol)和DIC(2.74mg，0.022mmol)的混合物在室温下搅拌12hr。将10uL反应混合物用190uL DMSO稀释。向所得溶液中添加新鲜的ss-siRNA-(CH2)3-NH2溶液(2mg，0.325umol，在80uL PBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和2h。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的10％-40％ 100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供10。TOF MS(ES-)：6478。
2.LL.与X1063缀合的siRNA的合成
方案2：11的合成概述。
将DMSO(200uL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(2.49mg，0.022mmol)、9(6.26mg，0.011mmol)和DIC(2.73mg，0.022mmol)的混合物在室温下搅拌12h。将10uL反应混合物用190uL DMSO稀释。向所得溶液中添加新鲜的ss-siRNA-(CH2)4-NH2溶液(2mg，0.325umol，在80uL PBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和2h。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的10％-40％ 100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供11。TOF MS(ES-)：6492。
2.MM.与X1064缀合的siRNA的合成
方案3：12的合成概述。
将DMSO(200uL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(2.48mg，0.022mmol)、9(6.26mg，0.011mmol)和DIC(2.72mg，0.022mmol)的混合物在室温下搅拌12h。将10uL反应混合物用190uL DMSO稀释。向所得溶液中添加新鲜的ss-siRNA-(CH2)5-NH2溶液(2mg，0.325umol，在80uL PBS 8.5缓冲液中)。将反应混合物在室温下涡旋并饱和2h。将粗产物通过HPLC(用乙腈/水中的10％-40％100mM乙酸三乙铵)进行纯化，以提供12。TOF MS(ES-)：6506。
实例3.PAZ配体缀合物3’端帽体外和体内活性以及结构
在X射线晶体和NMR结构研究中将PAZ配体缀合物作为7-mer RNA缀合物结构的一部分进行研究(数据未示出)。
还分析了包含不同3’端帽的双链体的RNA干扰活性；研究了体外和体内效力，如实例3A(体外数据)和3B(体内数据)所示的。
实例3A.包含3’端帽(PAZ配体)的RNAi剂的体外效力
研究了HAMP siRNA-PAZ配体缀合物的效力。
按3个剂量研究了HuH-7细胞中的铁调素mRNA下调。
两个测试序列：hs_HAMP_400和402
亲本茎形式：A106S42(2’-OMe化学
引导(反义)链上的19个PAZ配体+/-核糖醇间隔子，+/-MOE夹(其中该MOE夹是从5’向3’数每条链上的最后两个碱基配对核苷酸中每者上的2’-MOE修饰)。
测定了Huh-7细胞中的体外剂量-应答。
结果示于图5A和5B和7以及下表5中。
图5A和5B示出了由在引导(反义)链上包含以下3’端帽的不同RNAi剂介导的体外RNA干扰或KD(敲低)：BP(联苯基)、C6、X027、X038、X050、X051、X052、X058、X059、X060、X061、X062、X063、X064、X065、X066、X067、X068和X069。测试了两个序列(hs_HAMP_400和_402)，其中400是在人类HAMP(铁调素)基因的位置400处开始的序列并且402是在位置402处开始的重叠序列。
将这些序列与(Rib)和不与(-)核糖醇间隔子一起测试；并且与(MOE)和不与(-)2’-MOE夹一起测试(如图示于图6A和6B中)。不同hs_HAMP 400和402描绘于图6A(引导或反义链)和6B(相应的正义链)中。
数据提供于图5A和5B中。图5A和5B中圈出的数据点表示hs_HAMP_400的最有效力形式和hs_HAMP_402的最有效力形式。
另外的数据提供于下表5中。此表指出了3’端帽及其DMT、琥珀酸酯和羧酸酯变体的别称(“寡聚物标识(Oligo Identifier)”)；羧酸酯Kd；在体外在5nM下由包含3’端帽(形式：S402+核糖醇+MOE夹)的铁调素RNAi剂介导的KD(敲低)；以及近似(approx.)IC50
表6.
图7示出了包含3’端帽的RNAi剂的不同剂量(范围是从1.57nM至15nM)之后在第72小时COS1细胞中的铁调素mm-报告子水平的残余基因活性(其中残余基因活性＝100％-KD)。指明了这些链的形式。正义链的3’端终止于2’MOE-夹-ribp(核糖醇间隔子)-C6。反义链的3’端终止于2’MOE-夹-ribp(核糖醇间隔子)-配体，其中使用的配体是3’端帽(X027、X058、X067等)。
这些数据示出了包含如下3’端帽的RNAi剂的效能，所述端帽是BP(联苯基)、C6、X027、X038、X050、X051、X052、X058、X059、X060、X061、X062、X063、X064、X065、X066、X067、X068或X069。
实例3B.包含3’端帽(PAZ配体)的RNAi剂的体内效力
实例3A示出了包含3’端帽的不同RNAi剂的体外效力。实例3B示出了包含3’端帽的不同RNAi剂的体内效力。
这些体内实验使用这些参数：
小鼠(n＝5/组)，经由静脉推注注射(尾静脉)：LNP569
·PBS
·LNP569-Hamp254-X052(SL52-49CE)-3mg/kg
·LNP569-Hamp254-X058(IL54-43-XE)-3mg/kg
·LNP569-Hamp254-X067(YL55-48RE)-3mg/kg
·LNP569-Hamp254-X038(CL51-55IE)-3mg/kg
·LNP569-Hamp254-X069(GA35-24OF)-3mg/kg
·LNP569-Hamp254-X027(ML59-39NE)-3mg/kg
·LNP569-Hamp254-C6对照-3mg/kg
LNP569是该RNAi剂的脂质纳米粒子制剂。
两个时间点-注射后48hr和168hr(均为3mg/kg)。
评估肝脏中的铁调素敲低(mRNA-qPCR)
询问以下关键问题：
PAZ结构域配体在体内有活性吗？(48小时时间点)。
PAZ结构域配体为敲低的持续时间提供益处吗？(168小时时间点)。
结果示于图8A和8B中。
图8A和8B显示在ABI Hamp1 Taqman测定(图8A)和Hamp1特异性Taqman测定(图8B)两者中，在以1x 3mg/kg剂量给药后48小时，所有的RNAi剂都能够在体内介导铁调素敲低。使用的3’端帽是：X052、X058、X067、X038、X069和X027，其中C6作为对照。
具有X052、X058、X067、X038、X069、X027或C6的3’端帽的RNAi剂仍能够在第48小时介导RNA干扰，这一发现指示这些3’端帽保护RNAi剂免于被降解或消化(例如，被血清中的核酸酶)。
图9A显示在Hamp1特异性Taqman测定中，包含X058 3’端帽的双链体在给药后168小时在体内仍能够介导RNA干扰(通过铁调素敲低测量的)。因此，在7天之后在单次给药的小鼠中观察到>50％敲低。
不受任何具体理论束缚，本披露指出由具有X058 3’端帽的RNAi剂介导的增加的效力和敲低持续时间可能归因于X058与Ago2的缔合增加。图9B示出了使用铁调素18-mer寡核苷酸的X058和C6Ago2下拉(Pulldown)实验。
简言之，Ago2的抗体被用来在包含X058或C6 3’端帽的RNAi剂或非靶向(NT)对照RNAi剂的给药之后72h从细胞中下拉Ago2。然后进行分析以确定RNAi剂的水平，如所示的。图9B显示，72hr之后，与具有C6的RNAi剂相比，具有X058的RNAi剂与Ago2的缔合要多得多。
因此，这些数据显示：
在引导链上具有X038、X052、X058、X067或X069PAZ配体的HAMP18-mer(254)siRNA在体内具有活性。
X058示出了令人信服的增加的效力和敲低持续时间。
另外的体内测试。
用以下不同化学形式进行另外的体内测试：(A160_S38，S42，S45&A161_S38，S42，S45)。
在反义链中：
A160_→2位中的F和ribC6突出端
A161_→2、5、6、7位中的F和ribC6突出端
在正义链中：
_S38→C6突出端
_S42→ribC6突出端
_S45→BP突出端
此实验中使用的参数是：
小鼠(n＝5/组)，经由静脉推注注射(尾静脉)：LNP569
·PBS
·LNP569-Hamp254A160_S38-3mg/kg
·LNP569-Hamp254A160_S42-3mg/kg
·LNP569-Hamp254A160_S45-3mg/kg
·LNP569-Hamp254A161_S38-3mg/kg
·LNP569-Hamp254A161_S42-3mg/kg
·LNP569-Hamp254A161_S45-3mg/kg
48小时时间点。
评估肝脏中的铁调素敲低(mRNA-qPCR)
结果示于图10中。图10示出了A160&A161形式[不同过客(正义)链突出端]的体内比较。此实验是以1x 3mg/kg剂量给药后48小时进行的。
这些数据示出了包含以下任何若干3’端帽的RNAi剂的体内效能：BP、C6、X052、X058、X067、X038、X069、X027。
实例4.显示出3’端帽的效能的另外的研究。
使用包含3’端帽的RNAi剂进行另外的研究。
图16A示出了RNAi剂的效能，其中3’端帽是X109、X110、X111、X112、X113、X058或C6。HuR是靶标。使用的剂量是：1nM、0.25nM、0.62nM和0.16nM。包含任何3’端帽的RNAi剂都能够介导RNA干扰，特别是在使用的最高剂量下。
具体而言，HuR-PAZ配体X110、X111和X112在效力方面显得与X058相似。
下表6提供了显示出具有不同3’端帽的18-mer形式RNAi剂的效能的另外的数据：X059、X050、X061、X051、X027、X062、X060、C6(X003)、X068、X065、X069、X097、X066、X098、X052、X063、BP(X014)、X038、X067、X058、X064和ribprib(X025)。
实例5.包含C8或C10 3’端帽的RNAi剂的效能
测试了包含C8或C10 3’端帽的RNAi剂。
测试了具有C8或C10突出端的19-mer SSB siRNA。
图18A和18B示出了结果，同时图17C图示了使用的不同3’端帽。
包含C8或C10 3’端帽的RNAi剂能够介导RNA干扰。
与21-mer阳性对照相比，具有C10突出端的19-mer SSB siRNA在3d给出效力更低的mRNA下调，但是具有更好的作用持续时间。
因此，C10修饰的19mer siRNA在初期时间点(第3天)不给出相同的最大靶标敲低，但是保持得更长(在第10天更有效的敲低)。C10 3’端帽因此提供了优秀的作用持续时间。
实验数据显示可以构建包含作为C6、C8或C10的3’端帽的有效的RNAi剂。此外，C103’端帽具有体内活性持续时间增加的优点。
实例6.包含硫代磷酸酯和/或RNA、DNA、2’-MOE、2’-F或LNA夹的RNAi剂。
制备了针对F7(因子VII)的RNAi剂的变体。
作为实例，这些变体包含作为硫代磷酸酯-C3(PS-C3)的3’端帽和/或夹。在该夹中，从5’向3’数最后两个碱基配对nt被修饰。
结果示于图20A-E中。
图20示出了包含不同修饰的3’端帽和夹的效能。图20A和20B示出了包含硫代磷酸酯-C3(PS-C3)的3’端帽的RNAi剂的效能。图20C、20D和20E示出了包含2’夹的RNAi剂的效能，其中从5’向3’数最后两个碱基配对nt是RNA、DNA、2’-MOE、2’-F或LNA。
对于图20D和20E中的RNAi剂而言，所有测试的RNAi剂都是有效的。应当指出的是百分比不表示敲低，而是相对于其他RNAi剂的敲低。例如，100％表示这些有效的RNAi剂的所有反义链的平均敲低。
因此，这些数据显示可以构建包含RNA、DNA、2’-MOE、2’-F或LNA的有效的RNAi剂，并且其中修饰的核苷间接头是硫代磷酸酯。
实例7.在3’端帽中包含C3、C4或C5接头的RNAi剂
此实例示出了包含3’端帽的RNAi剂的效能，该3’端帽是：
X109、X110、X111、X112、X113、X1009、X1010、X1024或X1025(图23A)；
X1011、X1012、X1013、X058、X1015、X1016、X1017、X1026、X1027(图23B)；或
X1018；X1019、X1020、X1021、X1022或X1028(图23C)。
示于图20A中的3’端帽包含C3；图20B中的3’端帽包含C4；并且图20C中的3’端帽包含C5。这些数据显示包含任何这些3’端帽的RNAi剂都是有效的。
使用了HuR RNAi剂。
在这些实验中，使用RNAiMax在96孔板格式中转染Huh-7细胞。转染后48小时分离RNA。将HuR mRNA归一化为PPIA内源性对照。基于先前分析的PAZ配体(3’端帽)的IC50数据选择3pM、10pM和30pM的RNAi剂浓度。对于X109至X113的数据，提供了两个先前数据集的平均值。
通常，3’端帽内接头的长度不显著影响任何3’端帽的效力。
在独立但相关的实验中，使用HuR RNAi剂在Huh-7细胞中测定若干3’端帽的IC50数据。下文示出了两项独立研究的数据点：
这些数据显示包含作为X058、X109、X110、X111、X112或X113的3’端帽的RNAi剂各自都是有效的。
实例8.在3’端帽中包含C3、C4或C5接头的另外的RNAi剂
此实例示出了包含3’端帽的不同RNAi剂的效能，该3’端帽是：
X110、X1012、X1018、X111、X1013、X112、X058、X1019、X1025、X1027或X1028。
这些不同3’端帽(展示于表1中)在R2与头基之间的接头(C3、C4或C5)的长度方面有变化。
作为澄清性注释，本披露指出，术语“C3”[-(CH2)3-]、“C4”[-(CH2)4-]和“C5”[-(CH2)5-]在此通常用于指定间隔子，类似术语(C3、C4、C5“接头”)还用于指定3’端帽的一部分。在图13中，不同接头用于区分不同3’端帽的部分。还应当指出的是，术语“C3”用于指定C3 3’端帽(例如，图15A)、C3间隔子(图21)和C3接头(图13)。
此实例的靶基因是HuR。使用RNAiMax转染试剂转染Huh-7细胞。以每孔40,000个细胞接种24孔板。以1nM RNAi剂/孔进行“反转染”，随后孵育大约18小时。设置一式两份板，针对RNA提取使用一个并且针对持续时间使用另一个。将转染培养基用新鲜的生长培养基(没有RNAi剂)代替并且将细胞再孵育2天，之后进行RNA分离或分裂用于持续时间实验。
细胞在转染后第3天和第7天分裂。在转染后第3、7和10天分离RNA用于HuR mRNA分析。
结果示于图24A和24B中。对照(NTC)是mFVII 21-mer RNAi剂。
在图24A中，配体LME844(X110、X1012和X1018)，接头长度看起来并不改变活性持续时间。对于配体PKF027-895(X111和X1013)，较短的接头(C3)和C4接头并不显著不同。
在图24B中，对于配体LPI230(X1025、X1027和X1028)，C3接头的持续时间优于较长的接头。在早至转染后第7天便有其证据。
对于配体LKS871(X112、X058和X1019)，较长的接头在稍后的时间点显得具有稍微更好的活性并且在第7天还有该“趋势”，尽管误差棒重叠并且它可能不显著。X058在第10天的活性比先前持续时间研究中展示的低约15％，但是将有研究来研究这些分析类型的变异性。
这些数据显示包含作为X112、X058、X1019、X1025、X1027或X1028的3’端帽的RNAi剂各自都是有效的。
实例9.另外的3’端帽的效能
当在RNAi剂上使用时，发现3’端帽X1062、X1063和X1064各自都是有效的。例如，这些端帽在如下HuR siRNA上是有效的，其中这些HuR siRNA是如在此所述的18-mer，其中每条链的3’端终止于磷酸酯并且按5’至3’方向进一步包含作为核糖醇的间隔子、第二磷酸酯和作为X1062、X1063或X1064的3’端帽。使用RNAi Max转染试剂用siRNA转染Huh7细胞；以每孔40,000个细胞接种24孔板；以1nM siRNA/孔进行反转染，并且将细胞孵育约18小时。将转染培养基替换(没有siRNA)，并且将细胞再孵育2天，之后进行RNA分离或分裂用于接种。细胞在转染后第3天和第7天分裂用于持续时间点。在转染后第3、7和10天分离RNA用于HuRmRNA分析。3、7或10天之后，具有作为X1062的3’端帽的HuR siRNA展示了89.0％、77.9％和32.7％的效能(敲低)。3、7和10天之后，具有作为X1063和X1064的3’端帽的HuR siRNA分别显示出89.6％、81.5％和43.7％；以及67.0％、30.9％和0.0％。
实施方案
1.一种具有化学式Ia的化合物：
其中：
X是H；OH，其中该羟基基团可以任选地被官能化为琥珀酸酯或附接至固体支持物；ODMT；羧酸；RNAi剂的链的3’端；或包含RNAi剂的链的分子的3’端，其中该链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子和第二磷酸酯或修饰的核苷间接头；
Y是CH或N；
m是0或1；
p是1、2或3；
R3是氢、2-(羟基-甲基)-苄基、3-(羟基-甲基)-苄基、琥珀酸酯或固体支持物；
其中该(CH2)m-O-R3部分附接至苯基环的3位或4位；
R4是氢；
R5是氢；或者
R4和R5连同R4和R5所附接的苯基环一起形成6H-苯并[c]色烯。
2.如实施方案1所述的化合物，选自以下各项：
3.一种具有化学式Ib的化合物：
其中：
X是H；OH，其中该羟基基团可以任选地被官能化为琥珀酸酯或附接至固体支持物；ODMT；羧酸；RNAi剂的链的3’端；或包含RNAi剂的链的分子的3’端，其中该链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子和第二磷酸酯或修饰的核苷间接头；
q是0、1或2；
R6是苯基，其未被取代或被选自苯甲氧基和3,4-二羟基丁基的基团取代；
R7是氢或羟基-乙基，其中如果R7是羟基-乙基，则该羟基可以任选地被官能化为琥珀酸酯或附接至固体支持物；
R8是氢或甲氧基；
Y1是CH或N；并且
Y2是N或CR9；其中R9选自氢和甲基。
4.如实施方案3所述的化合物，选自以下各项：
5.一种选自以下各项的化合物：
其中：
X是H；OH，其中该羟基基团可以任选地被官能化为琥珀酸酯或附接至固体支持物；ODMT；羧酸；RNAi剂的链的3’端；或包含RNAi剂的链的分子的3’端，其中该链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子和第二磷酸酯或修饰的核苷间接头，并且
q选自1和2。
6.一种用于为RNAi剂的链的3’端加帽的方法，该方法包括以下步骤：
使该RNAi剂与选自以下各项的化合物反应：
其中：
X选自H、OH、ODMT和羧酸酯，其中该羟基基团可以任选地被官能化为琥珀酸酯或附接至固体支持物；
使用固相合成方法用RNAi剂的链置换X；或者
在固体支持物上构建RNAi剂链；
使该链与该化合物反应，并且
从该固体支持物上切下该RNAi剂链。
7.一种具有化学式Ia的化合物，其中X是H、OH、ODMT或羧酸酯，其中该羟基基团可以任选地被官能化为琥珀酸酯或附接至固体支持物；并且R3是氢、2-(羟基-甲基)-苄基、3-(羟基-甲基)-苄基、琥珀酸酯或固体支持物。
8.一种包含RNAi剂的组合物，该RNAi剂包含第一链和第二链，其中至少一条链的3’-末端包含3’端帽，其中该3’端帽是如实施方案1至6中任一项所述的化合物，其中X是该第一链或第二链。
9.如实施方案8所述的组合物，其中该RNAi剂的第一链和/或第二链不超过约49个核苷酸长。
10.如实施方案8所述的组合物，其中该RNAi剂的第一链和/或第二链不超过约30个核苷酸长。
11.如实施方案8所述的组合物，其中该第一链和/或第二链是18个或19个核苷酸长。
12.如实施方案8所述的组合物，其中该第一链是反义链并且是18个或19个核苷酸长。
13.如实施方案8所述的组合物，其中该RNAi剂具有1个或2个平端。
14.如实施方案8所述的组合物，其中该RNAi剂在至少一个5’端或3’端上包含突出端。
15.如实施方案8所述的组合物，其中该RNAi剂在至少一个5’端或3’端上包含1至6核苷酸突出端。
16.如实施方案8所述的组合物，其中该RNAi剂包含间隔子。
17.如实施方案16所述的组合物，其中该间隔子是核糖醇。
18.如实施方案16所述的组合物，其中该间隔子是核糖醇、2’-脱氧-核糖醇、二核糖醇、2’-甲氧基乙氧基-核糖醇(具有2’-MOE的核糖醇)、C3、C4、C5、C6、或4-甲氧基丁烷-1,3-二醇。
19.如实施方案8所述的组合物，其中该RNAi剂的至少一个核苷酸被修饰。
20.如实施方案19所述的组合物，其中所述至少一个修饰的核苷酸选自2’烷氧基核糖核苷酸、2’烷氧基烷氧基核糖核苷酸或2’-氟核糖核苷酸。
21.如实施方案19所述的组合物，其中所述至少一个修饰的核苷酸选自2’-OMe、2’-MOE和2’-H。
22.如实施方案8所述的组合物，其中一个或多个核苷酸被修饰或者是DNA或者被肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、吗啉代核苷酸、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、阿拉伯糖核酸(ANA)、2′-氟阿拉伯糖核酸(FANA)、环己烯核酸(CeNA)、脱水己糖醇核酸(HNA)和/或解锁核酸(UNA)置换；和/或至少一个核苷酸包含修饰的核苷间接头(例如，其中核苷酸的至少一个磷酸酯被修饰的核苷间接头置换)，其中该修饰的核苷间接头选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酰胺酯、硼烷膦酸酯、酰胺接头以及具有化学式(I)的化合物
其中R3选自O-、S-、NH2、BH3、CH3、C1-6烷基、C6-10芳基、C1-6烷氧基和C6-10芳基-氧基，其中C1-6烷基和C6-10芳基未被取代或任选地独立地被独立地选自以下各项中的1至3个基团取代：卤素、羟基和NH2；并且R4选自O、S、NH或CH2。
23.如实施方案8所述的组合物，其中在该第一链和/或第二链的3’端上的前两个碱基配对核苷酸被修饰。
24.如实施方案8所述的组合物，其中在该第一链和/或第二链的3’端上的前两个碱基配对核苷酸是2’-MOE。
25.如实施方案8所述的组合物，其中该第一链和/或第二链的3’末端磷酸酯被修饰的核苷间接头置换。
26.如实施方案8所述的组合物，其中第一链和/或第二链是正义链，该正义链包含5’端帽，该5’端帽减少由该正义链介导的RNA干扰的量。
27.在不同实施方案中，该正义链包含选自以下项的5’端帽：缺乏5’磷酸酯或5’-OH的核苷酸；缺乏5’磷酸酯或5’-OH并且还包含2-OMe或2’-MOE修饰的核苷酸；5’-脱氧-2’-O-甲基修饰；5’-OME-dT；ddT；以及5’-OTr-dT。
28.一种包含RNAi剂的组合物，该RNAi剂包含第一链和第二链，其中至少一条链的3’-端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且进一步包含3’端帽，其中该3’端帽选自具有化学式Ia或Ib的化合物或选自在此的任何表中的化合物，其中X是该第一链或第二链，或者选自在此披露的任何3’端帽；并且其中：(a)该第一链和/或第二链是49-mer或更短，是约30个核苷酸长或更短，是19个核苷酸长，或在15个与49个核苷酸长之间；(b)任选地该RNAi剂具有1个或2个平端或该RNAi剂在至少一个5’端或3’端上包含突出端，任选地是1至6核苷酸突出端；(c)任选地一条链或两条链是RNA或任选地该RNAi剂的至少一个核苷酸被修饰，其中任选地所述至少一个修饰的核苷酸选自2’烷氧基核糖核苷酸、2’烷氧基烷氧基核糖核苷酸或2’-氟核糖核苷酸，并且任选地所述至少一个修饰的核苷酸选自2’-OMe、2’-MOE和2’-H；并且其中任选地在该第一链和/或第二链的3’端上的前两个碱基配对核苷酸被修饰，并且任选地在该第一链和/或第二链的3’端上的前两个碱基配对核苷酸是2’-MOE；并且其中任选地一个或多个核苷酸被修饰或者是DNA或者被肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、吗啉代核苷酸、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、阿拉伯糖核酸(ANA)、2′-氟阿拉伯糖核酸(FANA)、环己烯核酸(CeNA)、脱水己糖醇核酸(HNA)和/或解锁核酸(UNA)置换；(d)至少一个核苷酸包含修饰的核苷间接头，其中该修饰的核苷间接头选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酰胺酯、硼烷膦酸酯、酰胺接头以及具有化学式(I)的化合物；并且其中任选地该第一链和/或第二链的3’末端磷酸酯被修饰的核苷间接头置换；和/或(e)任选地该第一链或该第二链是正义链，该正义链包含5’端帽，该5’端帽减少由该正义链介导的RNA干扰的量，其中任选地该5’端帽选自缺乏5’磷酸酯或5’-OH的核苷酸；缺乏5’磷酸酯或5’-OH并且还包含2-OMe或2’-MOE修饰的核苷酸；5’-脱氧-2’-O-甲基修饰；5’-OME-dT；ddT；以及5’-OTr-dT。
29.一种包含RNAi剂的组合物，该RNAi剂包含第一链和第二链，其中至少一条链的3’-端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、第二磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，其中该3’端帽是在此披露的任何3’端帽或选自具有化学式Ia或Ib的化合物或选自在此的任何表中的化合物，其中X是该第一链或第二链，该第一链或第二链终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、第二磷酸酯或修饰的核苷间接头；并且其中：(a)该第一链和/或第二链是49-mer或更短，是约30个核苷酸长或更短，是19个核苷酸长，或在15个与49个核苷酸长之间；(b)任选地该RNAi剂具有1个或2个平端或该RNAi剂在至少一个5’端或3’端上包含突出端，任选地是1至6核苷酸突出端；(c)任选地一条链或两条链是RNA或任选地该RNAi剂的至少一个核苷酸被修饰，其中任选地所述至少一个修饰的核苷酸选自2’烷氧基核糖核苷酸、2’烷氧基烷氧基核糖核苷酸或2’-氟核糖核苷酸，并且任选地所述至少一个修饰的核苷酸选自2’-OMe、2’-MOE和2’-H；并且其中任选地在该第一链和/或第二链的3’端上的前两个碱基配对核苷酸被修饰，并且任选地在该第一链和/或第二链的3’端上的前两个碱基配对核苷酸是2’-MOE；并且其中任选地一个或多个核苷酸被修饰或者是DNA或者被肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、吗啉代核苷酸、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、阿拉伯糖核酸(ANA)、2′-氟阿拉伯糖核酸(FANA)、环己烯核酸(CeNA)、脱水己糖醇核酸(HNA)和/或解锁核酸(UNA)置换；(d)该间隔子是核糖醇、2’-脱氧-核糖醇、二核糖醇、2’-甲氧基乙氧基-核糖醇(具有2’-MOE的核糖醇)、C3、C4、C5、C6、或4-甲氧基丁烷-1,3-二醇；(e)至少一个核苷酸包含修饰的核苷间接头，其中该修饰的核苷间接头选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酰胺酯、硼烷膦酸酯、酰胺接头以及具有化学式(I)的化合物；并且其中任选地该第一链和/或第二链的3’末端磷酸酯被修饰的核苷间接头置换；和/或(f)任选地该第一链或该第二链是正义链，该正义链包含5’端帽，该5’端帽减少由该正义链介导的RNA干扰的量，其中任选地该5’端帽选自缺乏5’磷酸酯或5’-OH的核苷酸；缺乏5’磷酸酯或5’-OH并且还包含2-OMe或2’-MOE修饰的核苷酸；5’-脱氧-2’-O-甲基修饰；5’-OME-dT；ddT；以及5’-OTr-dT。
30.一种包含如实施方案25所述的RNAi剂和药学上可接受的载体的组合物。
31.一种包含如实施方案25所述的RNAi剂和药学上可接受的载体的组合物，用于用作药物。
32.一种用于抑制或降低细胞中的靶基因的水平和/或活性的方法，该方法包括向该细胞中引入一种或多种如实施方案25所述的RNAi剂的步骤。
除非另外定义，在此使用的技术和科学术语具有与熟悉本披露所属领域的技术人员通常理解的相同含义。
除非另外指明，没有详细地具体描述的所有方法、步骤、技术和操作可以并且已经按照本身已知的方式进行，这应是技术人员所清楚的。再次对例如在此提及的标准手册和普通背景技术和其中引用的另外的参考文献进行引用。除非另外指明，在此引用的每个参考文献都通过引用以其全文而结合。权利要求是非限制性的并且提供于下文中。
尽管在此已经详细披露了具体实施例和权利要求，但是这仅是出于说明的目的以举例方式来进行的，或者这并不旨在对所附权利要求的范围或任何相应的未来申请的权利要求主题的范围加以限制。具体而言，诸位发明人考虑到，在不脱离如由权利要求定义的本披露的精神和范围的情况下，可以对本披露进行多种替代、改变和修饰。核酸起始材料、感兴趣的克隆或文库类型的选择被认为对于具有在此所述的实施例的知识的本领域普通技术人员而言是常规的。其他实施例、优点和修饰被认为落入下列权利要求的范围内。使用不超过常规的实验，本领域的普通技术人员应认识到或能够确认在此所述的披露的具体实施例的很多等效物。此类等效物旨在为下列权利要求所涵盖。在今后提交的相应申请中重写权利要求的范围可能是由于不同国家专利法的限制，而不应当被理解为放弃权利要求的主题。

Claims (29)

1.一种具有化学式Ib的化合物：
其中：
X是OH，其中该羟基基团可以任选地被官能化为琥珀酸酯或附接至固体支持物；ODMT；羧酸；RNAi剂的链的3’端；或包含RNAi剂的链的分子的3’端，其中该链的3’端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子和第二磷酸酯或修饰的核苷间接头；
q是0、1或2；
R6是苯基，其未被取代或被苯甲氧基取代；
R7是氢或羟基-乙基，其中如果R7是羟基-乙基，则该羟基可以任选地被官能化为琥珀酸酯或附接至固体支持物；
R8是氢或甲氧基；
Y1是CH或N；并且
Y2是N或CR9；其中R9选自氢和甲基。
2.如权利要求1所述的化合物，选自以下各项：
3.一种用于为RNAi剂的链的3’端加帽的方法，该方法包括以下步骤：
使该RNAi剂与选自以下各项的化合物反应：
其中：
X选自OH、ODMT和羧酸酯，其中该羟基基团可以任选地被官能化为琥珀酸酯或附接至固体支持物；
使用固相合成方法用RNAi剂的链置换X；或者
在固体支持物上构建RNAi剂链；
使该链与该化合物反应，并且
从该固体支持物上切下该RNAi剂链。
4.一种包含RNAi剂的组合物，该RNAi剂包含第一链和第二链，其中至少一条链的3’-末端包含3’端帽，其中该3’端帽是如权利要求1或2所述的化合物，其中X是该第一链或第二链。
5.如权利要求4所述的组合物，其中该RNAi剂的第一链和/或第二链不超过约49个核苷酸长。
6.如权利要求4所述的组合物，其中该RNAi剂的第一链和/或第二链不超过约30个核苷酸长。
7.如权利要求4所述的组合物，其中该第一链和/或第二链是18或19个核苷酸长。
8.如权利要求4所述的组合物，其中该第一链是反义链并且是18或19个核苷酸长。
9.如权利要求4所述的组合物，其中该RNAi剂具有1个或2个平端。
10.如权利要求4所述的组合物，其中该RNAi剂在至少一个5’端或3’端上包含突出端。
11.如权利要求4所述的组合物，其中该RNAi剂在至少一个5’端或3’端上包含1至6核苷酸突出端。
12.如权利要求4所述的组合物，其中该RNAi剂包含间隔子。
13.如权利要求12所述的组合物，其中该间隔子是核糖醇。
14.如权利要求12所述的组合物，其中该间隔子是核糖醇、2’-脱氧-核糖醇、二核糖醇、2’-甲氧基乙氧基-核糖醇、C3、C4、C5、C6、或4-甲氧基丁烷-1,3-二醇，其中所述C3是1,3-丙烷-二醇；C4是1,4-丁烷-二醇；C5是1,5-戊烷-二醇；C6是1,6-己烷-二醇。
15.如权利要求4所述的组合物，其中该RNAi剂的至少一个核苷酸被修饰。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述至少一个修饰的核苷酸选自2’烷氧基核糖核苷酸、2’烷氧基烷氧基核糖核苷酸或2’-氟核糖核苷酸。
17.如权利要求15所述的组合物，其中所述至少一个修饰的核苷酸选自2’-OMe、2’-甲氧基乙氧基和2’-H。
18.如权利要求4所述的组合物，其中一个或多个核苷酸被修饰或者是DNA或者被肽核酸、锁核酸、吗啉代核苷酸、苏糖核酸、二醇核酸、阿拉伯糖核酸、2′-氟阿拉伯糖核酸、环己烯核酸、脱水己糖醇核酸和/或解锁核酸置换；和/或至少一个核苷酸包含修饰的核苷间接头，其中该修饰的核苷间接头选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酰胺酯、硼烷膦酸酯、酰胺接头以及具有化学式(I)的化合物
其中R3选自O-、S-、NH2、BH3、CH3、C1-6烷基、C6-10芳基、C1-6烷氧基和C6-10芳基-氧基，其中C1-6烷基和C6-10芳基未被取代或任选地独立地被独立地选自以下各项中的1至3个基团取代：卤素、羟基和NH2；并且R4选自O、S、NH或CH2。
19.如权利要求18所述的组合物，其中所述至少一个核苷酸包含修饰的核苷间接头是其中核苷酸的至少一个磷酸酯被修饰的核苷间接头置换。
20.如权利要求4所述的组合物，其中在该第一链和/或第二链的3’端上的前两个碱基配对核苷酸被修饰。
21.如权利要求4所述的组合物，其中在该第一链和/或第二链的3’端上的前两个碱基配对核苷酸是2’-甲氧基乙氧基。
22.如权利要求4所述的组合物，其中该第一链和/或第二链的3’末端磷酸酯被修饰的核苷间接头置换。
23.如权利要求4所述的组合物，其中第一链和/或第二链是正义链，该正义链包含5’端帽，该5’端帽减少由该正义链介导的RNA干扰的量。
24.如权利要求23所述的组合物，其中所述正义链包含选自以下项的5’端帽：缺乏5’磷酸酯或5’-OH的核苷酸；缺乏5’磷酸酯或5’-OH并且还包含2-OMe或2’-甲氧基乙氧基修饰的核苷酸；5’-脱氧-2’-O-甲基修饰；5’-OME-dT；ddT；以及5’-OTr-dT。
25.一种包含RNAi剂的组合物，该RNAi剂包含第一链和第二链，其中至少一条链的3’-端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且进一步包含3’端帽，其中该3’端帽选自权利要求1或2的化合物，其中X是该第一链或第二链，或者选自在此披露的任何3’端帽；并且其中：(a)该第一链和/或第二链是49-mer或更短，是约30个核苷酸长或更短，是19个核苷酸长，或在15个与49个核苷酸长之间；(b)任选地该RNAi剂具有1个或2个平端或该RNAi剂在至少一个5’端或3’端上包含突出端，任选地是1至6核苷酸突出端；(c)任选地一条链或两条链是RNA或任选地该RNAi剂的至少一个核苷酸被修饰，其中任选地所述至少一个修饰的核苷酸选自2’烷氧基核糖核苷酸、2’烷氧基烷氧基核糖核苷酸或2’-氟核糖核苷酸，并且任选地所述至少一个修饰的核苷酸选自2’-OMe、2’-甲氧基乙氧基和2’-H；并且其中任选地在该第一链和/或第二链的3’端上的前两个碱基配对核苷酸被修饰，并且任选地在该第一链和/或第二链的3’端上的前两个碱基配对核苷酸是2’-甲氧基乙氧基；并且其中任选地一个或多个核苷酸被修饰或者是DNA或者被肽核酸、锁核酸、吗啉代核苷酸、苏糖核酸、二醇核酸、阿拉伯糖核酸、2′-氟阿拉伯糖核酸、环己烯核酸、脱水己糖醇核酸和/或解锁核酸置换；(d)至少一个核苷酸包含修饰的核苷间接头，其中该修饰的核苷间接头选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酰胺酯、硼烷膦酸酯、酰胺接头以及具有化学式(I)的化合物；并且其中任选地该第一链和/或第二链的3’末端磷酸酯被修饰的核苷间接头置换；和/或(e)任选地该第一链或该第二链是正义链，该正义链包含5’端帽，该5’端帽减少由该正义链介导的RNA干扰的量，其中任选地该5’端帽选自缺乏5’磷酸酯或5’-OH的核苷酸；缺乏5’磷酸酯或5’-OH并且还包含2-OMe或2’-甲氧基乙氧基修饰的核苷酸；5’-脱氧-2’-O-甲基修饰；5’-OME-dT；ddT；以及5’-OTr-dT。
26.一种包含RNAi剂的组合物，该RNAi剂包含第一链和第二链，其中至少一条链的3’-端终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、第二磷酸酯或修饰的核苷间接头和3’端帽，其中该3’端帽是在此披露的任何3’端帽或选自权利要求1或2的化合物，其中X是该第一链或第二链，该第一链或第二链终止于磷酸酯或修饰的核苷间接头并且按5’至3’顺序进一步包含：间隔子、第二磷酸酯或修饰的核苷间接头；并且其中：(a)该第一链和/或第二链是49-mer或更短，是约30个核苷酸长或更短，是19个核苷酸长，或在15个与49个核苷酸长之间；(b)任选地该RNAi剂具有1个或2个平端或该RNAi剂在至少一个5’端或3’端上包含突出端，任选地是1至6核苷酸突出端；(c)任选地一条链或两条链是RNA或任选地该RNAi剂的至少一个核苷酸被修饰，其中任选地所述至少一个修饰的核苷酸选自2’烷氧基核糖核苷酸、2’烷氧基烷氧基核糖核苷酸或2’-氟核糖核苷酸，并且任选地所述至少一个修饰的核苷酸选自2’-OMe、2’-甲氧基乙氧基和2’-H；并且其中任选地在该第一链和/或第二链的3’端上的前两个碱基配对核苷酸被修饰，并且任选地在该第一链和/或第二链的3’端上的前两个碱基配对核苷酸是2’-甲氧基乙氧基；并且其中任选地一个或多个核苷酸被修饰或者是DNA或者被肽核酸、锁核酸、吗啉代核苷酸、苏糖核酸、二醇核酸、阿拉伯糖核酸、2′-氟阿拉伯糖核酸、环己烯核酸、脱水己糖醇核酸和/或解锁核酸置换；(d)该间隔子是核糖醇、2’-脱氧-核糖醇、二核糖醇、2’-甲氧基乙氧基-核糖醇、C3、C4、C5、C6、或4-甲氧基丁烷-1,3-二醇；(e)至少一个核苷酸包含修饰的核苷间接头，其中该修饰的核苷间接头选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酰胺酯、硼烷膦酸酯、酰胺接头以及具有化学式(I)的化合物；并且其中任选地该第一链和/或第二链的3’末端磷酸酯被修饰的核苷间接头置换；和/或(f)任选地该第一链或该第二链是正义链，该正义链包含5’端帽，该5’端帽减少由该正义链介导的RNA干扰的量，其中任选地该5’端帽选自缺乏5’磷酸酯或5’-OH的核苷酸；缺乏5’磷酸酯或5’-OH并且还包含2-OMe或2’-甲氧基乙氧基修饰的核苷酸；5’-脱氧-2’-O-甲基修饰；5’-OME-dT；ddT；以及5’-OTr-dT。
27.一种包含RNAi剂和药学上可接受的载体的组合物，其中所述RNAi剂包含第一链和第二链，其中至少一条链的3’-末端包含3’端帽，其中该3’端帽是如权利要求1或2所述的化合物，其中X是该第一链或第二链。
28.根据权利要求27所述的组合物，其用作药物。
29.权利要求4－22中任一项所述的包含RNAi剂的组合物的用途，用于制备抑制或降低细胞中的靶基因的水平和/或活性的药物。
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