ES2929381T3 - Ensayos y métodos para determinar la resistencia microbiana - Google Patents
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Abstract
Ensayos y métodos para detectar la resistencia a los antibióticos betalactámicos, incluida la detección de múltiples dianas genéticas específicas de la familia de las β-lactamasas mediante la reacción en cadena de la polimerasa o microarrays. Uno o más kits que incluyen cebadores y/o sondas para la identificación de genes de β-lactamasa seleccionados del grupo que consta de uno o más de los siguientes: similar a MOX, similar a FOX, similar a ACC, similar a ACT/MIR, similar a CMY- 2, similar a DHA, similar a CTX-M-14, similar a CTX-M-15, similar a VIM, similar a NDM, similar a IMP, similar a KPC y similar a OXA-48, OXA-51 -similar, similar a OXA-143, similar a OXA-58, similar a OXA-23, similar a OXA-24/40, similar a TEM y similar a SHV. Un kit también puede incluir uno o más cebadores y/o sondas para la identificación de una familia de genes no betalactamasa que confiere resistencia a los antibióticos, como el gen MCR-1. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Ensayos y métodos para determinar la resistencia microbiana
CAMPO
[0001] Las presentes enseñanzas se refieren a ensayos y métodos para detectar la resistencia a antibióticos. Las presentes enseñanzas facilitan la detección de dianas genéticas específicas de familia, incluidas las p-lactamasas AmpC, las metalo-p-lactamasas, las carbapenemasas y las p-lactamasas de espectro ampliado mediante la reacción en cadena de la polimerasa multiplex en tiempo real.
ANTECEDENTES
[0002] La resistencia bacteriana a los antibióticos es un importante problema de salud pública. Esta resistencia no solo presenta importantes limitaciones a la capacidad de controlar y tratar la infección, sino que también es difícil de identificar y caracterizar en el laboratorio. El aumento significativo de la resistencia de las bacterias patógenas en los últimos 20 años provoca largos periodos de hospitalización, una elevada morbilidad y altas tasas de mortalidad.
[0003] La inactivación enzimática es la causa más común de resistencia en términos de número de especies y de antibióticos involucrados. Como un ejemplo, las p-lactamasas son enzimas expresadas por algunas bacterias. Tales enzimas son capaces de hidrolizar el enlace C-N de la estructura del anillo p-lactámico de un antibiótico p-lactámico, inactivando efectivamente el antibiótico. A pesar de la existencia de diversos inhibidores de p-lactamasas, la constante exposición de las cepas a los antibióticos da lugar a una evolución constante de las p-lactamasas.
[0004] En consecuencia, resulta esencial poder identificar tales microorganismos resistentes y sus mecanismos de resistencia lo antes posible. Típicamente, las muestras biológicas pueden someterse a ensayos de resistencia a los antibióticos, pero muchos protocolos de ensayo requieren mucho tiempo y/o son limitados en cuanto a los tipos de resistencia que son capaces de identificar. Por lo tanto, sería beneficioso proporcionar un protocolo de ensayo para la identificación simplificada de la resistencia para todas las principales p-lactamasas.
[0005] Un enfoque para la identificación de p-lactamasas ha sido emplear cebadores oligonucleótidos específicos para el ácido nucleico característico de ciertas p-lactamasas con la reacción en cadena de la polimerasa para identificar ácido nucleico característico de enzimas p-lactamasas con especificidad de familia en las muestras. Véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses n° 6.893.846 y 7.476.520. Otro enfoque ha consistido en emplear cebadores oligonucleótidos específicos para el ácido nucleico característico de ciertas p-lactamasas AmpC con la reacción en cadena de la polimerasa multiplex para detectar la presencia o ausencia de un gen de p-lactamasa AmpC e identificar el ácido nucleico característico de los genes de p-lactamasas AmpC en las muestras. La reacción en cadena de la polimerasa multiplex se refiere al uso de la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar varias secuencias de ADN diferentes simultáneamente en reacciones únicas o múltiples. Véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses n° 7.045.291 y 7.521.547.
[0006] Sin embargo, tales cebadores han sido limitados con respecto al número de familias de genes de p-lactamasas o el número de dianas genéticas que se pueden identificar. Además, tales cebadores se han empleado principalmente con la reacción en cadena de la polimerasa convencional, que requiere típicamente geles de agarosa para detectar y analizar el o los productos de la PCR. El uso de métodos de detección en geles de agarosa basados en la discriminación por tamaño puede dar lugar a una resolución deficiente y a dificultades en la interpretación de los datos. La reacción en cadena de la polimerasa convencional también carece de la sensibilidad para detectar la variabilidad del punto final de una muestra a otra muestra y no puede automatizarse. La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real permite controlar los productos de la reacción a medida que estos se forman.
[0007] La detección de p-lactamasas utilizando la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real y un único conjunto de cebadores puede limitarse a la detección de una única familia de genes de p-lactamasas. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente de Estados Unidos 2007/0248954. Se ha diseñado la reacción en cadena de la polimerasa multiplex en tiempo real para la identificación de muchas p-lactamasas AmpC simultáneamente. Véase Geyer CN, Reisbig MD, Hanson ND. Development of a TaqMan® Multiplex PCR Assay for Detection of Plasmid-Mediated AmpC p-lactamase Genes. Journal of clinical microbiology. 2012 ago 15:JCM-02038. Sin embargo, las combinaciones de cebador/sonda de este estudio se han dirigido únicamente a las p-lactamasas AmpC y están limitadas en cuanto al número de dianas genéticas que pueden identificarse. Javier Pérez-Pérez et al. (2002), J Clin Microbiol 40(6):2153-2162 desvela la detección de genes de beta-lactamasas AmpC mediadas por plásmidos mediante PCR multiplex.
[0008] Cuando se diseña una reacción en cadena de la polimerasa que funcione, se deben considerar múltiples factores, como el diseño del cebador y la sonda, las condiciones de reacción y la selección de la enzima. Esta complejidad se agrava en la PCR multiplex, en la que se detectan simultáneamente múltiples dianas en el mismo tubo. Equilibrar las concentraciones de cebadores, sondas y vectores de control suministrados como mezclas compuestas
de "PCR multiplex" para un ensayo es un aspecto complejo. Es extremadamente difícil equilibrar estas proporciones, ya que un cambio de concentración de cualquiera de estos reactivos, correspondiente a una sola de las dianas genéticas, puede afectar de forma negativa a la detección de cualquier otra diana multiplex en la mezcla de reacción. Si estas concentraciones no están equilibradas, cabría esperar una reducción de la eficacia, la sensibilidad y la especificidad. Esto reduciría la confianza en la eficacia del ensayo para identificar correctamente las familias de genes identificadas mediante los kits descritos.
[0009] Por lo tanto, se requiere una cantidad significativa de tiempo y conocimientos técnicos para desarrollar estos ensayos para dar un método fiable. Por ejemplo, la mezcla maestra de PCR, con ADN polimerasa, es una formulación personalizada que permite el funcionamiento del ensayo final. Es posible que sea necesario ajustar las concentraciones de ADN polimerasa y de magnesio. Las concentraciones y los intervalos específicos que rodean a la ADN polimerasa y al magnesio son necesarios para que el ensayo funcione con éxito. Además de determinar las concentraciones de todos los reactivos, se debe identificar un protocolo de ciclado de PCR que sea compatible con todas las condiciones de reacción y que facilite la reacción en cadena de la polimerasa multiplex en tiempo real.
[0010] La detección precisa y rápida de la resistencia a los antibióticos es esencial para la vigilancia, el seguimiento epidemiológico, la terapia de los pacientes y el control de las infecciones. Por lo tanto, un ensayo de diagnóstico basado en la PCR multiplex debe proporcionar una caracterización genotípica completa de las p-lactamasas y ser versátil, además de proporcionar resultados rápidos. Las presentes enseñanzas permiten analizar una muestra para la presencia de microorganismos resistentes a los antibióticos mediante la identificación de cualquiera de las principales p-lactamasas en una sola prueba. Las presentes enseñanzas facilitan la detección de múltiples dianas genéticas de p-lactamasas específicas de familia, incluyendo, pero sin limitación, las metalo-p-lactamasas, las carbapenemasas, las p-lactamasas de espectro ampliado, las p-lactamasas AmpC cromosómicas y/o las plactamasas AmpC mediadas por plásmidos mediante la reacción en cadena de la polimerasa multiplex en tiempo real.
[0011] Las presentes enseñanzas facilitan un kit o kits que incluyen uno o más cebadores y/o sondas para la identificación de genes de p-lactamasas seleccionados del grupo que consiste en uno o más de los siguientes: similar a MOX (MOX-like), similar a FOX, similar a ACC, similar a ACT/m Ir -, similar a CMY-2, similar a DHA, similar a CTX-M-14, similar a c Tx -M-15, similar a VIM, similar a NDM, similar a IMP, similar a KPC y similar a OXA-48, similar a OXA-51, similar a OXA-143, similar a OXA-58, similar a OXA-23, similar a OXA-24/40, similar a TEM y similar a SHV. El kit o los kits de las presentes enseñanzas pueden proporcionar material de control para los genes de p-lactamasas antes mencionados. Las presentes enseñanzas proporcionan uno o más de lo siguiente: cebadores, sondas, controles, proceso de ensayo y estrategia de detección para una o más de las siguientes p-lactamasas: p-lactamasas de espectro ampliado (ESBL), metalo-p-lactamasas (MBL), enterobacterias resistentes a carbapenémicos (CRE), y carbapenemasas dependientes de serina y p-lactamasas ampC mediadas por plásmidos. Un kit también puede incluir uno o más cebadores y/o sondas para la identificación de genes de resistencia a la colistina movilizada (MCR), una familia de genes no beta-lactamasas que confiere resistencia a los antibióticos. Las presentes enseñanzas proporcionan ensayos de PCR multiplex que pueden probar cualquier combinación de los mismos o están dirigidos a la identificación de un grupo específico. Las presentes enseñanzas proporcionan ensayos con sensibilidad clínica y especificidad analítica de detección mejoradas. Los cebadores, las sondas y las secuencias de ADN de control de las presentes enseñanzas proporcionan una ventaja tanto analítica como comercial, ya que permiten mejorar la capacidad de cribado para la detección de un mayor número de variantes genéticas asociadas a los genes que confieren resistencia a los antibióticos en las bacterias gramnegativas.
SUMARIO
[0012] La invención se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Las presentes enseñanzas proporcionan un kit que incluye uno o más cebadores y/o sondas para la identificación por reacción en cadena de la polimerasa, micromatriz (microarray), enriquecimiento de diana basado en NGS y/o caracterización por espectrometría de masas de uno o más genes de p-lactamasas seleccionados del grupo que consiste en: CMY, CTX-M, OXA, IMP, VIM, DHA, KPC, MOX, ACC, FOX, EBC, NDM, TEM y SHV. Las presentes enseñanzas facilitan uno o más kits que incluyen cebadores y/o sondas para la identificación de genes de p-lactamasas seleccionados del grupo que consiste en uno o más de lo siguiente: similar a MOX, similar a FOX, similar a ACC, similar a EBC, similar a CMY-2, similar a DHA, similar a CTX-M-14, similar a CTX-M-15, similar a VIM, similar a NDM, similar a IMP, similar a KPC y similar a OXA-48, similar a OXA-51, similar a OXA-143, similar a OXA-58, similar a OXA-23, similar a OXA-24/40, similar a TEM y similar a SHV. Un kit también puede incluir uno o más cebadores y/o sondas para la identificación de una familia de genes que no son beta-lactamasas que confiere resistencia a los antibióticos. Un kit puede incluir uno o más cebadores y/o sondas para la identificación por reacción en cadena de la polimerasa o micromatriz de variantes de gen de MCR. Los cebadores y las sondas también pueden hacerse compatibles con la secuenciación de nueva generación y con la espectrometría de masas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0013]
La figura 1 representa un gráfico de amplificación de una mezcla ilustrativa 1 de un kit que incluye dianas genéticas de ampC.
La figura 2 representa un gráfico de amplificación de una mezcla ilustrativa 2 de un kit que incluye dianas genéticas de ampC.
La figura 3 representa un gráfico de amplificación de una mezcla ilustrativa 1 de un kit que incluye dianas genéticas de p-lactamasa.
La figura 4 representa un gráfico de amplificación de una mezcla ilustrativa 2 de un kit que incluye dianas genéticas de p-lactamasa.
La figura 5 representa un gráfico de amplificación de una mezcla ilustrativa 3 de un kit que incluye dianas genéticas de p-lactamasa.
La Figura 6 representa un gráfico de amplificación de una mezcla de control interno ilustrativa de un kit que incluye dianas genéticas de MCR.
La Figura 7 representa un gráfico de amplificación de una mezcla ilustrativa 1 de un kit que incluye dianas genéticas de OXA.
La Figura 8 representa un gráfico de amplificación de una mezcla ilustrativa 2 de un kit que incluye dianas genéticas de OXA.
La Figura 9 representa un gráfico de amplificación de una mezcla de control interno ilustrativa de un kit que incluye dianas genéticas de SHV-TEM.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0014] Las explicaciones e ilustraciones presentadas en el presente documento están destinadas a familiarizar a otros expertos en la técnica con las enseñanzas, sus principios y su aplicación práctica. Los expertos en la técnica pueden adaptar y aplicar las enseñanzas en sus numerosas formas, según se adapte mejor a los requisitos de un uso particular. En consecuencia, las realizaciones específicas de las presentes enseñanzas según se establecen no están destinadas a ser exhaustivas o limitantes de las enseñanzas. Por tanto, el alcance de las enseñanzas no debería determinarse con referencia a la descripción anterior, sino que debería determinarse con referencia a las reivindicaciones adjuntas.
[0015] La resistencia bacteriana a los antibióticos supone una amenaza mundial para la salud pública y en los últimos años ha mostrado un aumento de las tasas de mortalidad y el potencial de propagación entre la población. De estos mecanismos de resistencia, las p-lactamasas son enzimas que escinden los anillos de los p-lactámicos haciendo que la familia de antibióticos p-lactámicos sea ineficaz para el tratamiento de las infecciones bacterianas gramnegativas de importancia clínica. En concreto, las p-lactamasas confieren resistencia a las penicilinas, las cefamicinas y, en algunos casos, a los carbapenémicos. Los organismos gramnegativos resistentes a los p-lactámicos, que producen p-lactamasas múltiples o mediadas por plásmidos, son difíciles de identificar fenotípicamente y requieren métodos de detección más específicos para identificar las p-lactamasas de importancia clínica. La identificación genética de estos mecanismos de resistencia es fundamental para una vigilancia activa y el control de la infección. Dado que estos antibióticos se seleccionan a menudo para el tratamiento y la prevención de enfermedades infecciosas, la presencia y las características de las p-lactamasas específicas desempeñan un papel fundamental en la selección de la terapia antibiótica adecuada.
[0016] Las p-lactamasas AmpC son cefalosporinasas de importancia clínica que son resistentes a la mayoría de los antibióticos p-lactámicos. Las enzimas AmpC están codificadas cromosómicamente en muchas especies bacterianas y pueden ser inducibles y sobreexpresarse como consecuencia de una mutación. La sobreexpresión puede conducir a la resistencia a la mayoría de los antibióticos p-lactámicos. La aparición de plásmidos transmisibles con genes adquiridos para las p-lactamasas AmpC suele dar lugar a una mayor producción de p-lactamasas en comparación con los genes ampC expresados cromosómicamente. Además, las p-lactamasas AmpC mediadas por plásmidos pueden aparecer en organismos que carecen de un gen ampC cromosómico o que presentan una baja expresión del mismo. La resistencia debida a las enzimas AmpC mediadas por plásmidos puede ser de amplio espectro y con frecuencia difícil de detectar. Por ello, es clínicamente útil detectar y discriminar entre las p-lactamasas AmpC mediadas por plásmidos y las expresadas cromosómicamente.
[0017] Las presentes enseñanzas se refieren a ensayos y métodos para detectar bacterias gramnegativas resistentes a antibióticos beta-lactámicos a partir de una muestra biológica. Los antibióticos p-lactámicos son todos los agentes antibióticos que contienen un anillo p-lactámico en sus estructuras moleculares. Los antibióticos p-lactámicos incluyen las penicilinas, cefalosporinas, carbapenémicos y monobactámicos. Los organismos resistentes a los antibióticos
pueden producir una o más enzimas conocidas como p-lactamasas que proporcionan resistencia a los antibióticos plactámicos. Las p-lactamasas pueden conferir resistencia a los antibióticos por parte de las bacterias, que está mediada por plásmidos y/o expresada cromosómicamente, lo que dificulta su detección.
[0018] Las p-lactamasas pueden clasificarse según su estructura molecular. Las cuatro clases principales incluyen de la A la D. Las p-lactamasas de clase A, C y D están basadas en serina. Las p-lactamasas de clase B, también conocidas como metalo-beta-lactamasas, están basadas en el cinc.
[0019] Las p-lactamasas de espectro extendido (ESBL) son enzimas que confieren resistencia bacteriana a ciertas categorías de antibióticos, como las cefalosporinas de tercera generación y los monobactámicos. La presencia de un organismo productor de ESBL en una infección clínica puede hacer fracasar el tratamiento si se utiliza una de las anteriores clases de fármacos. La detección de ESBL puede ser difícil, ya que tienen diferentes niveles de actividad contra varias cefalosporinas. Por lo tanto, la identificación genética de la enzima exacta puede facilitar la selección del agente antimicrobiano óptimo, lo que es fundamental para determinar la respuesta más eficaz al tratamiento.
[0020] Las cefalosporinas de primera generación incluyen cefalexina, cefaloridina, cefalotina, cefazolina, cefadroxilo, cefazedona, cefatrizina, cefapirina, cefradina, cefacetrilo, cefrodaxina y ceftezol. Las cefalosporinas de segunda generación incluyen cefoxitina, cefuroxima, cefamandol, cefaclor, cefotetan, cefonicida, cefotiam, loracarbef, cefmetazol, cefprozil y ceforanida. Las cefalosporinas de tercera generación incluyen cefotaxima, ceftazidima, cefsulodina, ceftriaxona, cefmenoxima, latamoxef, ceftizoxima, cefixima, cefodizima, cefetamet, cefpiramida, cefoperazona, cefpodoxima, ceftibuten, cefdinir, cefditoren, ceftriaxona, cefbuperazona. Las cefalosporinas de cuarta generación incluyen cefepima y cefpirom.
[0021] Las bacterias productoras de p-lactamasas pueden incluir bacterias gramnegativas como las que se encuentran en los siguientes géneros: Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Campylobacter, Haemophilus, Morganella, Vibrio, Yersinia, Acinetobacter, Branhamella, Neisseria, Burkholderia, Citrobacter, Hafnia, Edwardsiella, Aeromonas, Moraxella, Pasteurella, Providencia y Legionella.
[0022] Por resistencia a los antibióticos se entiende cualquier tipo de mecanismo que permita a un microorganismo hacer que un tratamiento sea parcial o totalmente ineficaz en el microorganismo, garantizando su supervivencia. Por resistencia a los antibióticos p-lactámicos se entiende cualquier tipo de mecanismo basado en la p-lactamasa que permite a un microorganismo hacer que un tratamiento sea parcial o totalmente ineficaz en el microorganismo, garantizando su supervivencia. Por ejemplo, en donde el mecanismo está relacionado con la expresión de una enzima perteneciente al grupo de las p-lactamasas, incluida la p-lactamasa de espectro ampliado, o de una enzima perteneciente al grupo de las cefalosporinasas de clase C.
[0023] Por muestra biológica se entiende una muestra clínica, obtenida de un espécimen de fluido biológico, o una muestra de alimento, obtenida de cualquier tipo de alimento o bebida, o de una fuente agrícola, como animales, suelo, agua o aire, o de una superficie como con una biopelícula. Por lo tanto, esta muestra puede ser líquida o sólida. Por ejemplo, la muestra biológica puede ser una muestra clínica de sangre, plasma, orina o heces, o de muestras de recto, nariz, garganta, piel, heridas o líquido cefalorraquídeo.
[0024] Las presentes enseñanzas se refieren a ensayos y métodos para detectar la resistencia a los antibióticos betalactámicos. Las presentes enseñanzas pueden detectar dianas génicas de p-lactamasa codificadas cromosómicamente y/o mediadas por plásmidos. Las presentes enseñanzas facilitan la detección de dianas genéticas específicas de familia relacionadas con los genes de las p-lactamasas, incluyendo las p-lactamasas AmpC. Los genes de p-lactamasa detectados con las presentes enseñanzas pueden incluir los clasificados en los grupos moleculares A D. Los genes de p-lactamasa detectados con las presentes enseñanzas pueden incluir los clasificados en los grupos funcionales 1 a 3.
[0025] Las presentes enseñanzas se refieren a ensayos y métodos para detectar la resistencia de una o más familias de genes de beta-lactamasas que incluyen genes similares. Un gen similar puede ser una beta-lactamasa que tenga uno o más de lo siguiente: secuencia de aminoácidos similar, función similar y perfiles de susceptibilidad a los antibióticos similares. Un gen similar puede considerarse como el gen diana detectado con las presentes enseñanzas. Por ejemplo, las enzimas tipo OXA-48 pueden incluir: OXA-48, OXA-48b, OXA-162, OXA-163, OXA-181, OXA-199, OXA-204, OXA-232, OXA-244, OXA-245 y OXA-24.
[0026] Las presentes enseñanzas proporcionan uno o más cebadores y/o sondas para la identificación de uno o más genes de p-lactamasas seleccionados del grupo que consiste en:
CMY, CTX-M, OXA, IMP, VIM, DHA, KPC, MOX, ACC, FOX, EBC, NDM, TEM y SHV. Las presentes enseñanzas proporcionan uno o más cebadores y/o sondas para la identificación de genes de p-lactamasas seleccionados del grupo que consiste en uno o más de lo siguiente: similar a MOX, similar a FOX, similar a ACC, similar a EBC, similar a CMY-2, similar a DHA, similar a CTX-M-14, similar a CTX-M-15, similar a VIM, similar a NDM, similar a IMP, similar a KPC y similar a OXA-48, similar a OXA-51, similar a OXA-143, similar a OXA-58, similar a OXA-23, similar a OXA-24/40, similar a TEM y similar a SHV. Las presentes enseñanzas proporcionan uno o más cebadores y/o sondas para
la identificación de una familia de genes no beta-lactamasas que confieren resistencia a los antibióticos. Por ejemplo, uno o más cebadores y/o sondas para la identificación de variantes de gen MCR.
[0027] Los cebadores y/o las sondas de las presentes enseñanzas pueden incluirse en uno o más kits. El uno o más kits pueden ser utilizados para la identificación con cualquiera de los siguientes: reacción en cadena de la polimerasa, micromatriz, enriquecimiento de dianas a base de NGS y/o caracterización por espectrometría de masas.
[0028] En la Tabla 1 se muestran secuencias ilustrativas de cebadores y sondas para las presentes enseñanzas.
[SEQ. ID NO. 67-260] Los cebadores y/o las sondas pueden estar degenerados en cualquier posición nucleotídica. Los cebadores y/o las sondas pueden no estar degenerados en ninguna posición nucleotídica. Puede utilizarse cualquier combinación adecuada de fluoróforo y/o inactivador y secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, una sonda puede estar marcada con un marcador fluorescente en un extremo y un inactivador fluorescente en el otro. Por ejemplo, se pueden incluir dos inactivadores fluorescentes en un extremo o dentro de la secuencia de la sonda. Se contempla que las secuencias de sonda de las presentes enseñanzas pueden ser marcadas con cualquier combinación adecuada de fluoróforo e inactivador. Por ejemplo, cualquier fluoróforo de las presentes enseñanzas puede unirse a cualquier secuencia de ADN de sonda de las presentes enseñanzas.
Tabla 1
[0029] Las presentes enseñanzas proporcionan un ensayo molecular. Las presentes enseñanzas pueden proporcionar un ensayo molecular cualitativo (es decir, de punto final) para la detección de dianas genéticas KPC, ESBL, MBL y ampC con especificidad de familia. Las presentes enseñanzas pueden proporcionar un ensayo molecular cualitativo (es decir, de punto final) para la detección de genes de p-lactamasa AmpC mediada por plásmidos con especificidad de familia. Las presentes enseñanzas pueden proporcionar un ensayo molecular cualitativo (es decir, de punto final) para la detección de dianas genéticas de OXA. Para la detección pueden utilizarse sondas de ADN marcadas con fluorescencia. El ensayo de las presentes enseñanzas puede facilitar la diferenciación entre un gen de p-lactamasa ampC mediado por plásmido de un gen de p-lactamasa ampC cromosómico; siempre que los dos genes no sean del mismo origen cromosómico. El ensayo puede implicar la extracción de ADN de las células bacterianas. El ensayo puede incluir una amplificación posterior por PCR. El ensayo puede incluir la detección basada en el gel.
[0030] En contraste con los métodos fenotípicos tradicionales que requieren 24-48 horas para obtener datos, las presentes enseñanzas pueden facilitar la generación de datos en solo horas o una hora. El tiempo total requerido para la extracción del ADN, la preparación de la PCR, la amplificación y el análisis puede ser de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas. La sensibilidad del ensayo puede ser de aproximadamente el 100 %. La especificidad del ensayo puede ser de aproximadamente el 100 %. Por lo tanto, las presentes enseñanzas proporcionan una detección rápida y fiable. La implementación de estos ensayos rápidos tiene un impacto positivo para el control de la infección y la atención al paciente.
[0031] Las presentes enseñanzas permiten la detección de múltiples familias de genes de p-lactamasas. Las plactamasas pueden incluir todas las p-lactamasas principales, incluyendo los tipos ampC. Por ejemplo, las presentes enseñanzas pueden permitir la identificación de hasta seis a nueve familias de genes de p-lactamasas. Las familias de genes de p-lactamasas pueden incluir CMY, CTX-M, DHA, IMP, KPC, NDM, OXA y VIM. Las familias de genes de p-lactamasas AmpC pueden incluir MOX, ACC, FOX, DHA, CMY y EBC.
[0032] Las presentes enseñanzas proporcionan un kit que permite identificar al menos nueve familias de genes de plactamasas. Las familias de genes pueden incluir: similar a IMP-1, similar a NDM, similar a OXA-48, similar a CTX-M-14, similar a CTX-M-15, similar a CMY-2, similar a DHA, similar a VIM y similar a KPC. El kit también puede incluir un control interno (CI) endógeno dirigido a una región conservada común en las bacterias gramnegativas para reducir los falsos negativos debidos a la inhibición de la PCR, a la degradación del ADN o a una mala extracción. Se contempla que el control interno endógeno discrimine las muestras de falsos negativos de las muestras de verdaderos negativos que se deben a una o más de la inhibición de la PCR, la degradación del ADN y/o una mala extracción. El kit puede utilizar pares de cebadores específicos de la secuencia para la amplificación por PCR de cada grupo diana. El kit puede utilizar sondas de ADN específicas de la diana, marcadas con fluorescencia, para su detección mediante PCR en tiempo real.
[0033] El kit puede incluir una o más mezclas de cebador-sonda multiplex que contienen uno o más cebadores y una o más sondas. La mezcla de cebador-sonda multiplex puede ser una mezcla de PCR 10X. En un ejemplo, el kit incluye tres viales de mezcla de cebador-sondas multiplex. Los viales de mezcla pueden facilitar la amplificación simultánea de todas las dianas por PCR en tiempo real entre tres tubos de reacción. La mezcla 1 de PCR puede amplificar un primer conjunto de tres familias de genes. Por ejemplo, CMY-2, CTX-M-14 y CTX-M-15. La mezcla 2 de p Cr puede amplificar un segundo conjunto de tres familias de genes. Por ejemplo, OXA-48, IMP y VIM. La mezcla 3 de PCR puede amplificar un tercer conjunto de familias de genes. Por ejemplo, DHA, KPC y NDM. La mezcla múltiplex también puede incluir un control interno (CI) en cada mezcla. El kit puede incluir tres viales de control de ADN externo o un primer vial de mezcla de control, un segundo vial de mezcla de control y un tercer vial de mezcla de control. El vial de mezcla de control de ADN puede contener plantillas de ADN sintético de las correspondientes dianas multiplex. Las mezclas de control de ADN pueden servir como control positivo para cada reacción multiplex. La mezcla de control de ADN puede contener bacterias estabilizadas con elementos genéticos cromosómicos o transmisibles en una matriz de muestra similar a la de un paciente.
[0034] Las presentes enseñanzas proporcionan un kit que permite la identificación de al menos seis familias de genes ampC mediadas por plásmidos. Las familias de genes pueden incluir: similar a MOX, similar a DHA, similar a ACC, similar a EBC, similar a FOX y similar a CMY-2. El kit también puede incluir un control interno (CI) endógeno dirigido a una región conservada común en las bacterias gramnegativas para reducir los falsos negativos debidos a la inhibición de la PCR, a la degradación del ADN o a una mala extracción. Se contempla que el control interno endógeno discrimine las muestras de falsos negativos de las muestras de verdaderos negativos que se deben a una o más de la inhibición de la PCR, la degradación del ADN y/o una mala extracción. El kit puede utilizar pares de cebadores específicos de la secuencia para la amplificación por PCR de cada familia. El kit puede utilizar sondas de ADN específicas de la diana, marcadas con fluorescencia, para su detección mediante PCR en tiempo real.
[0035] El kit puede incluir una o más mezclas de cebador-sonda multiplex que contienen uno o más cebadores y una o más sondas. La mezcla de cebador-sonda multiplex puede ser una mezcla de PCR 10X. En un ejemplo, el kit incluye dos viales de mezcla de cebador-sondas multiplex. Los viales de mezcla pueden facilitar la amplificación simultánea de todas las dianas por PCR en tiempo real entre dos tubos de reacción. La mezcla 1 de PCR puede amplificar un primer conjunto de tres familias de genes. Por ejemplo, MOX, ACC y FOX. La mezcla 2 de PCR puede amplificar un segundo conjunto de tres familias de genes. Por ejemplo, DHA, EBC y CMY-2. La mezcla múltiplex también puede incluir un control interno (CI) en cada mezcla. El kit puede incluir dos viales de control de ADN externo o un primer vial de mezcla de control y un segundo vial de mezcla de control. El vial de mezcla de control de ADN puede contener plantillas de ADN sintético de las correspondientes dianas multiplex. Las mezclas de control de ADN pueden servir como control positivo para cada reacción multiplex.
[0036] Las presentes enseñanzas proporcionan un kit que permite la identificación de al menos seis familias de genes de carbapenemasa OXA. Las familias de genes pueden incluir: OXA-23, OXA-24/40, OXA-48, OXA-51, OXA-58 y OXA-143. Las familias de genes pueden incluir familias de genes similares. El kit también puede incluir un control interno (CI) endógeno dirigido a una región conservada común en las bacterias gramnegativas para reducir los falsos negativos debidos a la inhibición de la PCR, a la degradación del ADN o a una mala extracción. Se contempla que el control interno endógeno discrimine las muestras de falsos negativos de las muestras de verdaderos negativos que se deben a una o más de la inhibición de la PCR, la degradación del ADN y/o una mala extracción. El kit puede utilizar pares de cebadores específicos de la secuencia para la amplificación por PCR de cada familia. El kit puede utilizar sondas de ADN específicas de la diana, marcadas con fluorescencia, para su detección mediante PCR en tiempo real.
[0037] El kit puede incluir una o más mezclas de cebador-sonda multiplex que contienen uno o más cebadores y una o más sondas. La mezcla de cebador-sonda multiplex puede ser una mezcla de PCR 10X. En un ejemplo, el kit incluye dos viales de mezcla de cebador-sondas multiplex. Los viales de mezcla pueden facilitar la amplificación simultánea de todas las dianas por PCR en tiempo real entre dos tubos de reacción. La mezcla 1 de PCR puede amplificar un primer conjunto de tres familias de genes. Por ejemplo, OXA 143, OXA 23 y OXA 51. La mezcla 2 de p Cr puede amplificar un segundo conjunto de tres familias de genes. Por ejemplo, OXA 24/40, OXA-48 y OXA-58. La mezcla múltiplex también puede incluir un control interno (CI) en cada mezcla. El kit puede incluir dos viales de control de ADN externo o un primer vial de mezcla de control y un segundo vial de mezcla de control. El vial de mezcla de control de ADN puede contener plantillas de ADN sintético de las correspondientes dianas multiplex. Las mezclas de control de ADN pueden servir como control positivo para cada reacción multiplex.
[0038] Además, las presentes enseñanzas contemplan que el kit o los kits de las presentes enseñanzas pueden facilitar la detección de una familia de genes no beta-lactamasas. El kit o los kits pueden facilitar la detección de mecanismos de resistencia a los antibióticos mediados por plásmidos para uno o más tipos/categorías de antibióticos. Por ejemplo, el kit también puede facilitar la detección del gen de MCR-1 que confiere resistencia a la polimixina. El kit o los kits pueden incluir secuencias de cebadores, secuencias de sondas y una secuencia de control para la detección de una o más familias de genes no beta-lactamasas, además de los genes de betalactamasas. Por ejemplo, un kit puede facilitar la detección de las familias de genes ampC y una familia de genes MCR-1.
[0039] Además, las presentes enseñanzas permiten ampliar la detección de otras familias de genes de p-lactamasas,
incluyendo TEM y SHV. Las familias de genes pueden incluir familias de genes similares. El kit también puede incluir un control interno (CI) endógeno dirigido a una región conservada común en las bacterias gramnegativas para reducir los falsos negativos debidos a la inhibición de la PCR, a la degradación del ADN o a una mala extracción. Se contempla que el control interno endógeno discrimine las muestras de falsos negativos de las muestras de verdaderos negativos que se deben a una o más de la inhibición de la PCR, la degradación del ADN y/o una mala extracción. El kit puede utilizar pares de cebadores específicos de la secuencia para la amplificación por PCR de cada familia. El kit puede utilizar sondas de ADN específicas de la diana, marcadas con fluorescencia, para su detección mediante p Cr en tiempo real.
[0040] El kit o los kits de las presentes enseñanzas pueden incluir cebadores de oligonucleótidos de ADN sintético, sondas de ADN específicas de la diana y controles de ADN para las dianas genéticas especificadas suspendidas en tampón TE, pH 8,0. El contenido del kit puede estar incluido en viales. Por ejemplo, la o las mezclas de PCR 10X pueden estar compuestas por 275 jl. Por ejemplo, la una o más mezclas de control pueden estar compuestas por 14 |jl. Por ejemplo, el contenido del kit puede ser suficiente para aproximadamente 100 reacciones en total y aproximadamente 12 reacciones de la mezcla de ADN de control.
[0041] La detección de cada diana se basa en la fluorescencia óptica del fluoróforo conjugado con cada sonda de ADN específica de diana. Puede utilizarse cualquier combinación adecuada de fluoróforo y secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, los fluoróforos pueden seleccionarse del grupo que consiste en: FAM, h Ex , TEX615 y TYE665.
[0042] Las presentes enseñanzas proporcionan ensayos para la detección de familias de genes de p-lactamasas de una muestra biológica. Los ensayos pueden estar incluidos en un kit o kits. El kit puede facilitar la detección de plactamasas mediante diversas tecnologías y plataformas de biología molecular. El kit puede incluir uno o más cebadores y/o sondas para la identificación por reacción en cadena de la polimerasa o micromatriz de uno o más genes de p-lactamasas seleccionados del grupo que consiste en: CMY, CTX-M, OXA, IMP, VIM, DHA, KPC, MOX, ACC, FOX, EBC, NDM, TEM y SHV.
[0043] El kit puede incluir uno o más cebadores y/o sondas para la identificación por reacción en cadena de la polimerasa o micromatriz de una familia de genes no beta-lactamasas que confieren resistencia a los antibióticos. El kit puede incluir uno o más cebadores y/o sondas para la identificación por reacción en cadena de la polimerasa o micromatriz de uno o más genes MCR. El kit puede incluir uno o más cebadores y/o sondas para la identificación por reacción en cadena de la polimerasa o micromatriz de un gen MCR-1.
[0044] El kit puede facilitar la detección de dianas específicas a partir de muestras biológicas sin procesar como sangre, orina, plasma, heces, esputo, etc. El kit puede facilitar la detección de dianas específicas directamente desde o extraídas directamente de muestras biológicas sin procesar, incluyendo pero sin limitación sangre, cultivos de sangre, orina, plasma, heces, hisopos fecales, hisopos peri-rectales/peri-anales, esputo y cultivos bacterianos.
[0045] El kit puede utilizarse para la detección de dianas específicas a partir de muestras de ácido nucleico purificadas. El kit puede utilizarse para cualquier metodología de amplificación de ácidos nucleicos. El kit puede utilizarse con la reacción en cadena de la polimerasa convencional. El kit puede utilizarse con la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real. El kit puede utilizarse con la reacción en cadena de la polimerasa en gota digital. El kit puede utilizarse con la detección por tecnología de micromatriz. El kit puede utilizarse con productos químicos de detección basados en sondas de fluorescencia y/o infrarrojos. El kit puede utilizarse con productos químicos de detección basados en colorantes de intercalación. El kit puede utilizarse para la detección de amplicones de la reacción en cadena de la polimerasa del ácido nucleico que van desde 25 pares de bases hasta 2000 pares de bases.
[0046] El kit puede incluir varios reactivos. Los distintos reactivos pueden estar contenidos en varios viales. El kit puede incluir un conjunto o conjuntos de cebadores. El conjunto o conjuntos de cebadores pueden estar marcados o no marcados con un colorante de seguimiento o fluoróforo. El kit puede incluir sondas. El kit puede incluir una mezcla de cebador-sonda. El kit puede incluir controles. El kit puede incluir cloruro de magnesio. El kit puede incluir dNTP. El kit puede incluir la ADN polimerasa. El kit puede incluir un tinte de seguimiento. El kit puede incluir una composición que contenga un colorante de seguimiento. El kit puede incluir un protocolo escrito. El kit puede incluir una mezcla maestra personalizada en un solo tubo, dos tubos, tres tubos o cuatro tubos que contienen todos los productos químicos y enzimas necesarios para realizar el ensayo de PCR descrito en el presente documento. El kit puede incluir reactivos desecados por congelación o liofilizados en un solo tubo de ensayo o en múltiples tubos de ensayo. El kit puede facilitar la detección de ácido nucleico y los reactivos del kit pueden proporcionarse en cualquier forma líquida, mezcla de reacción agrupada o formato liofilizado, desecado por congelación o crioconservado.
[0047] El kit puede incluir un conjunto de cebadores. El conjunto de cebadores puede incluir al menos un par de cebadores. Un par de cebadores puede incluir un cebador directo y un cebador inverso. El conjunto de cebadores puede incluir un par de cebadores. El conjunto de cebadores puede incluir más de un par de cebadores. El conjunto de cebadores puede incluir dos pares de cebadores. El conjunto de cebadores puede incluir tres pares de cebadores. El conjunto de cebadores puede incluir de uno a seis pares de cebadores. El conjunto de cebadores puede incluir de uno a diez pares de cebadores. El conjunto de cebadores puede incluir hasta 30 pares de cebadores. El conjunto de
cebadores puede incluir hasta 50 pares de cebadores. El conjunto de cebadores puede incluir hasta 100 pares de cebadores.
[0048] El kit puede incluir una mezcla de cebador-sonda. La mezcla de cebador-sonda puede incluir un conjunto de cebadores. La mezcla de cebador-sonda puede incluir una o más sondas. Cada par de cebadores del conjunto de cebadores puede incluir una sonda o conjunto de sondas. La mezcla de cebador-sonda puede incluir un par de cebadores de control interno. El par de cebadores de control interno puede incluir un cebador directo y un cebador inverso. La mezcla de cebador-sonda puede incluir una sonda de control interno.
[0049] Por ejemplo, una mezcla de cebador-sonda puede incluir uno o más pares de cebadores, una sonda asociada por cada par de cebadores y controles internos que incluyan un par de cebadores y una sonda. Preferiblemente, la mezcla de cebador-sonda es una mezcla multiplex que incluye más de un par de cebadores, una sonda para cada par de cebadores y controles internos. La mezcla multiplex puede utilizarse para la identificación de más de una familia de genes de p-lactamasas. Cada par de cebadores y sonda puede detectar una familia de genes de p-lactamasas diferente. Por ejemplo, pueden utilizarse tres pares de cebadores y sus tres sondas asociadas para la detección de tres familias diferentes de genes de p-lactamasas.
[0050] El intervalo de concentración de ADN de cada conjunto de cebadores en una PCR puede ser de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 10 pM (10.000 nM). Uno o más cebadores pueden estar marcados con un marcador fluorescente como una sonda. La concentración de ADN de cada sonda en una PCR puede ser de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 10.000 nM. La concentración de ADN de cada sonda en una PCR puede ser de aproximadamente 10 a aproximadamente 500 nM.
[0051] El kit puede incluir al menos un control. El kit puede incluir uno, dos, tres o cuatro controles. El kit puede incluir uno o más controles negativos. El control negativo puede incluir ácido nucleico que se sabe que expresa un gen de resistencia distinto del gen diana de interés. El kit puede incluir uno o más controles positivos. Los uno o más controles positivos pueden ser controles internos. El control positivo puede incluir ácido nucleico que se sabe que expresa o contiene el gen de la resistencia. El kit puede incluir un control interno endógeno para reducir los falsos negativos debidos a la inhibición de la PCR, a la degradación del ADN y/o a una mala extracción. Se contempla que el control interno endógeno discrimine las muestras de falsos negativos de las muestras de verdaderos negativos que se deben a una o más de la inhibición de la PCR, la degradación del ADN y/o una mala extracción. El control interno endógeno puede dirigirse a una secuencia de nucleótidos conservada o a secuencias comunes al genoma de las bacterias gramnegativas. Por ejemplo, el control interno puede detectar el gen(s) del ARNr 16S y/o del ARNr 23S. El control interno puede detectar el gen del ARNr 16S y/o 23S para E. coli, Pseudomonas, Acinetobacter, Klebsiella y Salmonella.
[0052] El kit puede incluir el vector de control en el vial de control. Pueden añadirse uno o más pl del control del vector a una reacción de 25 pl para obtener la concentración de trabajo. Las concentraciones de ADN para cada vector de control pueden ser equivalentes a entre 0,1 y 2000 copias o entre 0,0000243 pg/ul y 0,0455 pg/ul. Las concentraciones de ADN para cada vector de control pueden ser equivalentes a entre 10 y 5000 copias o entre 0,001 pg/ul y 0,5 pg/ul. Las concentraciones del vector de control pueden ser de hasta 1x10(9) copias y cualquier dilución de las mismas.
[0053] Los ensayos de las presentes enseñanzas pueden incluir el uso de cloruro de magnesio. El kit puede incluir cloruro de magnesio. El ensayo puede utilizarse con una concentración de MgCh de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 7 mM. Preferiblemente, la concentración es de MgCh de aproximadamente 3,0 mM a aproximadamente 5,5 mM. Más preferiblemente, la concentración es de MgCh 5,0 mM para un ensayo de detección de genes de p-lactamasas. Más preferiblemente, la concentración es de MgCh 5,0 mM para un ensayo de detección de genes de p-lactamasas ampC. Más preferiblemente, la concentración es de MgCh 5 mM para un ensayo de detección de genes OXA.
[0054] Los ensayos de las presentes enseñanzas pueden incluir el uso de ADN polimerasa. El kit puede incluir la ADN polimerasa. El ensayo puede utilizarse con una concentración de aproximadamente 0,25 U/25 ul de reacción a aproximadamente 3 U/25 ul de reacción de ADN polimerasa. Preferiblemente, la concentración es de 1,25 U/25 pl de reacción de ADN polimerasa para un ensayo de detección de genes de p-lactamasas. Preferiblemente, la concentración es de 1,25 U/25 pl de ADN polimerasa para un ensayo de detección de genes de p-lactamasas ampC. Por ejemplo, las presentes enseñanzas pueden utilizar la ADN polimerasa PhilisaFAST®.
[0055] Los ensayos y métodos de las presentes enseñanzas pueden incluir un protocolo de ciclado de PCR. En un ejemplo, el protocolo de ciclado comprende (1) 95 °C durante 30 s; (2) 95 °C durante 1 s; (3) 55 °C durante 10 s; (4) 68 °C durante 20 s; y la repetición de los pasos (2) a (4) durante 40 ciclos. En un ejemplo, el protocolo de ciclado comprende (1) 95 °C durante 30 s; (2) 95 °C durante 6 s; (3) 66 °C durante 10 s; y la repetición de los pasos (2) a (3) durante 40 ciclos. En un ejemplo, el protocolo de ciclado incluye un inicio en caliente de 98 °C durante 30 s y 30 ciclos de: 98 °C durante 5 s, 60 °C durante 10 s y 72 °C durante 20 s. En un ejemplo, el protocolo de ciclado incluye el uso de 98 °C durante 30 s, seguido de 30 ciclos de 98 °C durante 5 s, 60 °C durante 10 s y 72 °C durante 25 s. En un ejemplo, los protocolos de PCR incluyen un paso de detección en el que se mide la señal fluorescente.
[0056] El kit puede incluir uno o más de los siguientes: cebador, sonda y control. Una mezcla de uno o más de los siguientes: cebador, sonda y control interno puede incluirse en un recipiente. Una mezcla de uno o más de los siguientes: cebador, sonda y control interno puede estar incluida en más de un recipiente. El recipiente puede ser un vial. En un ejemplo, el kit incluye 3 viales de control de ADN y 3 viales de mezcla de cebador/sonda 10X. Con los viales se pueden identificar nueve familias de genes de resistencia a los antibióticos y un control interno. En un ejemplo, el kit incluye 2 viales de control de ADN y 2 viales de mezcla de cebador/sonda 10X. Con los viales se pueden identificar seis familias de genes de resistencia a los antibióticos y un control interno.
[0057] Las presentes enseñanzas permiten la detección de la familia de gen CMY-2 de p-lactamasa a partir de una muestra biológica. Las presentes enseñanzas proporcionan un kit que incluye uno o más cebadores y/o sondas para la identificación por reacción en cadena de la polimerasa multiplex en tiempo real de genes de p-lactamasa, incluyendo la familia de genes similares a CMY-2. La muestra biológica puede incluir bacterias gramnegativas tales como Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Serratia marcescens, Citrobacter freundii y otras especies de Citrobacter. Los genes similares a CMY-2 detectados pueden incluir CMY-2, CMY-4, CMY-6, CMY-7, CMY-12, CMY-14, CMY-15, CMY-16, CMY-18, CMY-21, CMY-22, CMY-23, CMY-24, CMY-25, CMY-26, CMY-27, CMY-28, CMY-29, CMY-30, CMY-31, CMY-32, CMY-33, CMY-34, CMY-35, CMY-37, CMY-38, CMY-39, CMY-40, CMY-41, CMY-42, CMY-43, CMY-44, CMY-45, CMY-46, CMY-47, CMY-48, CMY-49, CMY-50, CMY-51, CMY-53, CMY-54, CMY-55, CMY-56, CMY-57, CMY-58, CMY-59, CMY-60, CMY-61, CMY-62, CMY-63, CMY-64, CMY-65, CMY-66, CMY-67, CMY-68, CMY-69, CMY-71, CMY-72, CMY-73, CMY-75, CMY-76, CMY-77, CMY-78, CMY-79, CMY-80, CMY-81, CMY-84, CMY-85, CMY-86, CMY-87, CMY-89, CMY-90, CMY-96, CMY-97, CMY-99, CMY-102, CMY-103, CMY-104, CMY-105, CMY-107, CMY-108, CMY-110, CMY-111, CMY-112, CMY-113, CMY-114, CMY-115, CMY-116, CMY-117, CMY-118, CMY-119, CMY-121, CMY-122, CMY-124, CMY-125, CMY-126, CMY-127, CMY-128, CMY-129, CMY-130, CMY-131, CMY-132, CMY-133 y CMY-135.
[0058] Las presentes enseñanzas permiten la detección de la familia de gen de p-lactamasa CTX-M a partir de una muestra biológica. Las presentes enseñanzas proporcionan un kit que incluye uno o más cebadores y/o sondas para la identificación por reacción en cadena de la polimerasa multiplex en tiempo real de genes de p-lactamasa, incluyendo la familia de genes similares a CTX-M-14. La muestra biológica puede incluir bacterias gramnegativas tales como Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Salmonella enterica, Proteus mirabilis y especies de Shigella. Los genes similares a CTX-M-14 detectados pueden incluir CTX-M-9, CTX-M-13, CTX-M-14, CTX-M-16, CTX-M-17, CTX-M-19, CTX-M-21, CTX-M-24, CTX-M-27, CTX-M-38, CTX-M-51, CTX-M-64, CTX-M-65, CTX-M-67, CTX-M-82, CTX-M-83, CTX-M-84, CTX-M-85, CTX-M-86, CTX-M-90, CTX-M-93, CTX-M-98, CTX-M-99, CTX-M-102, CTX-M-104, CTX-M-105, CTX-M-110, CTX-M-111, CTX-M-112, CTX-M-113, CTX-M-121, CTX-M-122, CTX-M-123, CTX-M-125, CTX-M-129, CTX-M-130, CTX-M-132, CTX-M-134, CTX-M-147, CTX-M-148 y CTX-M-159.
[0059] Las presentes enseñanzas permiten la detección de la familia de gen de p-lactamasa CTX-M a partir de una muestra biológica. Las presentes enseñanzas proporcionan un kit que incluye uno o más cebadores y/o sondas para la identificación por reacción en cadena de la polimerasa multiplex en tiempo real de genes de p-lactamasa, incluyendo la familia de genes similares a CTX-M-15. La muestra biológica puede incluir bacterias gramnegativas tales como Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, especies de Shigella y Proteus mirabilis. Los genes similares a CTX-M-15 detectados pueden incluir CTX-M-1, CTX-M-3, CTX-M-10, CTX-M-15, CTX-M-22, CTX-M-28, CTX-M-29, CTX-M-30, CTX-M-32, CTX-M-37, CTX-M-55, CTX-M-64, CTX-M-71, CTX-M-103, CTX-M-117, CTX-M-123, CTX-M-132, CTX-M-136, CTX-M-138, CTX-M-142, CTX-M-144, CTX-M-155, CTX-M-156, CTX-M-157, CTX-M-158, CTX-M-163, CTX-M-164, CTX-M-166 y CTX-M-172.
[0060] Las presentes enseñanzas permiten la detección de la familia de gen de p-lactamasa DHA a partir de una muestra biológica. Las presentes enseñanzas proporcionan un kit que incluye uno o más cebadores y/o sondas para la identificación por reacción en cadena de la polimerasa multiplex en tiempo real de genes de p-lactamasa, incluyendo la familia de genes similares a DHA. La muestra biológica puede incluir bacterias gramnegativas tales como Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Proteus mirabilis y Citrobacter koseri. Los genes similares a DHA detectados pueden incluir DHA-1, DHA-2, DHA-5, DHA-6, DHA-7, DHA-9, DHA-10, DHA-12, DHA-13, DHA-14, DHA-15, DHA-16, DHA-17, DHA-18, DHA-19, DHA-20, DHA-21 y DHA-22.
[0061] Las presentes enseñanzas permiten la detección de la familia de gen de p-lactamasa IMP a partir de una muestra biológica. Las presentes enseñanzas proporcionan un kit que incluye uno o más cebadores y/o sondas para la identificación por reacción en cadena de la polimerasa multiplex en tiempo real de genes de p-lactamasa, incluyendo la familia de genes similares a IMP. La muestra biológica puede incluir bacterias gramnegativas tales como Serratia marcescens, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa. Los genes similares a IMP detectados pueden incluir IMP-1, IMP-2, IMP-3, IMP-4, IMP-5, IMP-6, IMP-7, IMP-8, IMP-9, IMP-10, IMP-13, IMP-14, IMP-15, IMP-16, IMP-18, IMP-19, IMP-20, IMP-22, IMP-24, IMP-25, IMP-26, IMP-27, IMP-28, IMP-30, IMP-32, IMP-33, IMP-34, IMP-37, IMP-38, IMP-40, IMP-42, IMP-45, IMP-48, IMP-49, IMP-51 e IMP-52.
[0062] Las presentes enseñanzas permiten la detección de la familia de gen de p-lactamasa KPC a partir de una muestra biológica. Las presentes enseñanzas proporcionan un kit que incluye uno o más cebadores y/o sondas para la identificación por reacción en cadena de la polimerasa multiplex en tiempo real de genes de p-lactamasa, incluyendo
la familia de genes similares a KPC. La muestra biológica puede incluir bacterias gramnegativas tales como Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Enterobacter cloacae y otras especies de Enterobacter, Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii. Los genes similares a KPC detectados pueden incluir KPC-1, KPC-2, KPC-3, KPC-4, KPC-5, KPC-6 KPC-7, KPC-8, KPC-9, KPC-10, KPC-11, KPC-13, KPC-14, KPC-15, KPC-16, KPC-17 KPC-18, KPC-19, KPC-21, KPC-22, KPC-47, KPC-56, KPC-63, KPC-272, KPC-484, KPC-629, KPC-727 y KPC-860.
[0063] Las presentes enseñanzas permiten la detección de la familia de gen de p-lactamasa NDM a partir de una muestra biológica. Las presentes enseñanzas proporcionan un kit que incluye uno o más cebadores y/o sondas para la identificación por reacción en cadena de la polimerasa multiplex en tiempo real de genes de p-lactamasa, incluyendo la familia de genes similares a NDM. La muestra biológica puede incluir bacterias gramnegativas tales como Escherichia coli, Acinetobacter baumannii, Enterobacter cloacae y Klebsiella pneumoniae. Los genes similares a NDM detectados pueden incluir NDM-1, NDM-2, NDM-3, NDM-4, NDM-5, NDM-6, NDM-7, NDM-8, NDM-9, NDM-10, NDM-11, NDM-12, NDM-13, NDM-15, NDM-16 y NDM-32.
[0064] Las presentes enseñanzas permiten la detección de la familia de gen de p-lactamasa OXA a partir de una muestra biológica. Las presentes enseñanzas proporcionan un kit que incluye uno o más cebadores y/o sondas para la identificación por reacción en cadena de la polimerasa multiplex en tiempo real de genes de p-lactamasa, incluyendo la familia de genes similares a OXA-48. La muestra biológica puede incluir bacterias gramnegativas tales como Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Shewanella xiamenensis, Escherichia coli y Serratia marcescens. Los genes similares a OXA-48 detectados pueden incluir OXA-48, OXA-162, OXA-163, OXA-181, OXA-199, OXA-204, OXA-232, OXA-244, OXA-245, OXA-247, OXA-370, OXA-405, OXA-416, OXA-438 y OXA-439.
[0065] Las presentes enseñanzas proporcionan un kit que incluye uno o más cebadores y/o sondas para la identificación por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real múltiple de genes de p-lactamasas que incluyen uno o más de los siguientes: similar a OXA-143, similar a OXA-23, similar a OXA-51, similar a OXA-48, similar a OXA-58 y similar a OXA24/40. Los genes similares a OXA-143 detectados pueden incluir los siguientes: OXA-143, OXA-182, OXA-231, OXA-253 y OXA-255. Los genes similares a OXA-23 detectados pueden incluir los siguientes: OXA-23, OXA-27, OXA-49, OXA-73, OXA-102, OXA-103, OXA-105, OXA-133, OXA-134, OXA-146, OXA-165, OXA-166, OXA-167, OXA-168, OXA-169, OXA-170, OXA-171, OXA-225 y OXA-239. Los genes similares a OXA-51 detectados pueden incluir los siguientes: OXA-51, OXA-64, OXA-65, OXA-66, OXA-67, OXA-68, OXA-69, OXA-70, OXA-71, OXA-75, OXA-76, OXA-77, OXA-78, OXA-79, OXA-80, OXA-82, OXA-83, OXA-84, OXA-86, OXA-87, OXA-88, OXA-89, OXA-90, OXA-91, OXA-92, OXA-93, OXA-94 OXA-95, OXA-98, OXA-99, OXA-100, OXA-104, OXA-106, OXA-107, OXA-108, OXA-109, OXA-110, OXA-111, OXA-112, OXA-113, OXA-115, OXA-116, OXA-117, OXA-120, OXA-121, OXA-122, OXA-123, OXA-124, OXA-125, OXA-126, OXA-127, OXA-128, OXA-130, OXA-131, OXA-132, OXA-138, OXA-144, OXA-148, OXA-149, OXA-150, OXA-172, OXA-173, OXA-174, OXA-175, OXA-176, OXA-177, OXA-178, OXA-179, OXA-180, OXA-194, OXA-195, OXA-196, OXA-197, OXA-200, OXA-201, OXA-202, OXA-203, OXA-206, OXA-208, OXA-216, OXA-217, OXA-219, OXA-223, OXA-241, OXA-242, OXA-248, OXA-249, OXA-250 y OXA-254. Los genes similares a OXA-48 detectados pueden incluir los siguientes: OXA-48, OXA-48b, OXA-162, OXA-163, OXA-181, OXA-199, OXA-204, OXA-232, OXA-244, OXA-245 y OXA-247. Los genes similares a OXA-58 pueden incluir los siguientes: OXA-58, OXA-96, OXA-97 y OXA-164. Los genes similares a OXA-40 pueden incluir los siguientes: OXA-40, OXA-25, OXA-26, OXA-72, OXA-139, OXA-160 y OXA-207.
[0066] Las presentes enseñanzas permiten la detección de la familia de gen de p-lactamasa VIM a partir de una muestra biológica. Las presentes enseñanzas proporcionan un kit que incluye uno o más cebadores y/o sondas para la identificación por reacción en cadena de la polimerasa multiplex en tiempo real de genes de p-lactamasa, incluyendo la familia de genes similares a VIM. La muestra biológica puede incluir bacterias gramnegativas tales como Klebsiella oxytoca, Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Enterobacter cloacae. Los genes similares a VIM detectados pueden incluir VIM-1, VIM-2, VIM-3, VIM-4, VIM-5, VIM-6, VIM-8, VIM-9, VIM-10, VIM-11, VIM-12, VIM-13, VIM-14, VIM-15, VIM-16, VIM-17, VIM-18, VIM-19, VIM-20, VIM-23, VIM-24, VIM-25, VIM-26, VIM-27, VIM-28, VIM-31, VIM-33, VIM-34, VIM-35, VIM-36, VIM-37, VIM-38, VIM-39, VIM-40, VIM-41, VIM-42, VIM-43, VIM-44, VIM-45 y VIM-46.
[0067] Las presentes enseñanzas permiten la detección de la familia de gen de p-lactamasa AmpC MOX de una muestra biológica. Las presentes enseñanzas proporcionan un kit que incluye uno o más cebadores y/o sondas para la identificación por reacción en cadena de la polimerasa multiplex en tiempo real de genes de p-lactamasa, incluyendo la familia de genes similares a MOX. La muestra biológica puede incluir bacterias gramnegativas tales como Klebsiella pneumoniae, Aeromonas punctata/Aeromonas caviae y otras especies de Aeromonas y Escherichia coli. Los genes similares a MOX detectados pueden incluir MOX-1, MOX-2, MOX-3, MOX-4, MOX-5, MOX-6, MOX-7, MOX-8, MOX-10, CMY-1, CMY-8, CMY-9, CMY-10, CMY-11 y CMY-19.
[0068] Las presentes enseñanzas permiten la detección de la familia de gen de p-lactamasa AmpC ACC a partir de una muestra biológica. Las presentes enseñanzas proporcionan un kit que incluye uno o más cebadores y/o sondas para la identificación por reacción en cadena de la polimerasa multiplex en tiempo real de genes de p-lactamasa, incluyendo la familia de genes similares a ACC. La muestra biológica puede incluir bacterias gramnegativas tales como Salmonella enterica, Escherichia coli, Hafnia alvei y Proteus mirabilis. Los genes similares a ACC detectados pueden
incluir ACC-1, ACC-2, ACC-4, ACC-5 y ACC-6.
[0069] Las presentes enseñanzas permiten la detección de la familia de gen de p-lactamasa AmpC FOX a partir de una muestra biológica. Las presentes enseñanzas proporcionan un kit que incluye uno o más cebadores y/o sondas para la identificación por reacción en cadena de la polimerasa multiplex en tiempo real de genes de p-lactamasa, incluyendo la familia de genes similares a FOX. La muestra biológica puede incluir bacterias gramnegativas tales como Klebsiella pneumoniae y Aeromonas punctata. Los genes similares a FOX detectados pueden incluir FOX-1, FOX-2, FOX-3, FOX-4, FOX-5, FOX-6, FOX-7, FOX-8, FOX-9, FOX-10 y FOX-12.
[0070] Las presentes enseñanzas permiten la detección de la familia de gen de p-lactamasa AmpC DHA a partir de una muestra biológica. Las presentes enseñanzas proporcionan un kit que incluye uno o más cebadores y/o sondas para la identificación por reacción en cadena de la polimerasa multiplex en tiempo real de genes de p-lactamasa, incluyendo la familia de genes similares a DHA. La muestra biológica puede incluir bacterias gramnegativas tales como Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Escherichia coli y Enterobacter cloacae. Los genes similares a DHA detectados pueden incluir DHA-1, DHA-2, DHA-5, DHA-6, DHA-7, DHA-9, DHA-10, DHA-12, DHA-13, DHA-14, DHA-15, DHA-16, DHA-17, DHA-18, DHA-19, DHA-20, DHA-21 y DHA-22.
[0071] Las presentes enseñanzas permiten la detección de la familia de gen de p-lactamasa AmpC CMY-2 a partir de una muestra biológica. Las presentes enseñanzas proporcionan un kit que incluye uno o más cebadores y/o sondas para la identificación por reacción en cadena de la polimerasa multiplex en tiempo real de genes de p-lactamasa, incluyendo la familia de genes similares a CMY-2. La muestra biológica puede incluir bacterias gramnegativas tales como Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Escherichia coli y Enterobacter cloacae. Los genes similares a CMY-2 detectados incluyen CMY-2, CMY-4, CMY-6, CMY-7, CMY-12, CMY-14, CMY-15, CMY-16, CMY-18, CMY-21, CMY-22, CMY-23, CMY-24, CMY-25, CMY-26, CMY-27, CMY-28, CMY-29, CMY-30, CMY-31, CMY-32, CMY-33, CMY-34, CMY-35, CMY-37, CMY-38, CMY-39, CMY-40, CMY-41, CMY-42, CMY-43, CMY-44, CMY-45, CMY-46 CMY-47, CMY-48, CMY-49, CMY-50, CMY-51, CMY-53, CMY-54, CMY-55, CMY-56, CMY-57, CMY-58, CMY-59, CMY-60, CMY-61, CMY-62, CMY-63, CMY-64, CMY-65, CMY-66, CMY-67, CMY-68, CMY-69, CMY-71, CMY-72, CMY-73, CMY-75, CMY-76, CMY-77, CMY-78, CMY-79, CMY-80, CMY-81, CMY-84, CMY-85 CMY-86, CMY-87, CMY-89, CMY-90, CMY-96, CMY-97, CMY-99, CMY-102, CMY-103, CMY-104 CMY-105, CMY-107, CMY-108, CMY-110, CMY-111, CMY-112, CMY-113, CMY-114, CMY-115 CMY-116, CMY-117, CMY-118, CMY-119, CMY-121, CMY-122, CMY-124, CMY-125, CMY-126, CMY-127, CMY-128, CMY-129, CMY-130, CMY-131 CMY-132, CMY-133 y CMY-135.
[0072] Las presentes enseñanzas permiten la detección de la familia de gen de p-lactamasa AmpC EBC a partir de una muestra biológica. Las presentes enseñanzas proporcionan un kit que incluye uno o más cebadores y/o sondas para la identificación por reacción en cadena de la polimerasa multiplex en tiempo real de genes de p-lactamasas que incluyen la familia similar a EBC, como ACT y MIR. La muestra biológica puede incluir bacterias gramnegativas tales como Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter asburiae, Enterobacter kobei y otras especies de Enterobacter. Los genes similares a EBC detectados pueden incluir ACT-1, ACT-2, ACT-5, ACT-8, ACT-13, ACT-14, ACT-15, ACT-16, ACT-17, ACT-18, ACT-20, ACT-21, ACT-23, ACT-24, ACT-25, ACT-27, ACT-29, ACT-30, ACT-31, ACT-32, ACT-33, ACT-34, ACT-35, ACT-36, ACT-37, ACT-38, MIR-1, MIR-2, MIR-3, MIR-4, MIR-6, MIR-7, MIR-8, MIR-9, MIR-10, MIR-11, MIR-12, MIR-13, MIR-14, MIR-15, MIR-16, MIR-17 y MIR-18.
[0073] Las presentes enseñanzas pueden permitir la detección de la familia de gen de p-lactamasa TEM a partir de una muestra biológica. Las presentes enseñanzas proporcionan un kit que incluye uno o más cebadores y/o sondas para la identificación por reacción en cadena de la polimerasa multiplex en tiempo real de genes de p-lactamasa, incluyendo la familia de genes similares a TEM. La muestra biológica puede incluir bacterias gramnegativas tales como Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Shewanella xiamenensis, Escherichia coli y Serratia marcescens. Los genes similares a TEM detectados pueden incluir TEM-1, TEM-2, TEM-3, TEM-15, TEM-20, TEM-32, TEM-40, TEM-52, TEM-88, TEM-91, TEM-97, TEM-98, TEM-106, TEM-107, TEM-112, TEM-120, TEM-126, TEM-135, TEM-141, TEM-150, TEM-153, TEM-163, TEM-168, TEM-170, TEM-171, TEM-206, TEM-214 y TEM-220.
[0074] Las presentes enseñanzas pueden permitir la detección de la familia de gen de p-lactamasa SHV a partir de una muestra biológica. Las presentes enseñanzas proporcionan un kit que incluye uno o más cebadores y/o sondas para la identificación por reacción en cadena de la polimerasa multiplex en tiempo real de genes de p-lactamasa, incluyendo la familia de genes similares a SHV. La muestra biológica puede incluir bacterias gramnegativas tales como Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Shewanella xiamenensis, Escherichia coli y Serratia marcescens. Los genes similares a SHV detectados pueden incluir SVH-1, SHV-2, SHV-3, SHV-5, SHV-7, SHV-8, SHV-9, SHV-11, SHV-12, SHV-13, SHV-14, SHV-15, SHV-16, SHV-18, SHV-24, SHV-25, SHV-26, SHV-27, SHV-28, SHV-29, SHV-30, SHV-31, SHV-32, SHV-33, SHV-34, SHV-35, SHV-36, SHV-37, SHV-38, SHV-40, SHV-41, SHV-42, SHV-43, SHV-44, SHV-45, SHV-46, SHV-48, SHV-49, SHV-50, SHV-51, SHV-52, SHV-53, SHV-55, SHV-56, SHV-57, SHV-59, SHV-60, SHV-61, SHV-62, SHV-63, SHV-64, SHV-65, SHV-66, SHV-67, SHV-69, SHV-70, SHV-71, SHV-72, SHV-73, SHV-74, SHV-75, SHV-76, SHV-77, SHV-78, SHV-79, SHV-80, SHV-81, SHV-82, SHV-85, SHV-86, SHV-89, SHV-92, SHV-93, SHV-94, SHV-95, SHV-96, SHV-97, SHV-98, SHV-99, SHV-100, SHV-101, SHV-102, SHV-103, SHV-104, SHV-105, SHV-106, SHV-107, SHV-109, SHV-110, SHV-111, SHV-119, SHV-120, SHV-121, SHV-122, SHV-123, SHV124, SHV-125, SHV-126, SHV-127, SHV-128, SHV-129, SHV-132, SHV-133, SHV-134, SHV-135, SHV-136, SHV-137, SHV-140, SHV-141, SHV-142, SHV-143, SHV-144, SHV-145, SHV-146, SHV-147, SHV-148, SHV-149, SHV-150, SHV-151, SHV-152, SHV-153, SHV-154, SHV-155, SHV-156, SHV-157, SHV-158, SHV-159, SHV-160, SHV-161, SHV-162, SHV-163, SHV-164, SHV-165, SHV-168, SHV-172, SHV-173, SHV-178, SHV-179, SHV-180, SHV-182, SHV-183, SHV-185, SHV-186, SHV-187, SHV-188, SHV-189, SHV-190, SHV-191, SHV-193, SHV-194, SHV-195, SHV-196 y SHV-197.
[0075] Las presentes enseñanzas pueden permitir la detección de la familia de genes MCR a partir de una muestra biológica. Las presentes enseñanzas proporcionan un kit que incluye uno o más cebadores y/o sondas para la identificación por reacción en cadena de la polimerasa multiplex en tiempo real de genes MCR, incluyendo la familia de genes similares a MCR. Los genes similares a MCR detectados pueden incluir MCR-1, MCR-1.2, Mc R-1.3, MCR-1.4, MCR-1.5, MCR-1.6, MCR-1.7, MCR-1.8, MCR-1.9 y MCR-2.
[0076] El kit de las presentes enseñanzas puede incluir una mezcla de al menos un cebador y/o al menos una sonda. Los cebadores y/o las sondas pueden estar degenerados en cualquier posición nucleotídica. Los cebadores y/o las sondas pueden no estar degenerados en ninguna posición nucleotídica. Se puede diseñar una sonda de hidrólisis y/o hibridación para la detección de una secuencia específica de ácido nucleico. Se pueden marcar múltiples sondas con un fluoróforo de diferente color. La sonda puede estar marcada con un marcador fluorescente en un extremo y un inactivador fluorescente en el otro. Se pueden incluir dos inactivadores fluorescentes en un extremo o dentro de la secuencia de la sonda. Por ejemplo, los fluoróforos pueden seleccionarse del grupo que consiste en fluoresceína, hexaclorofluoresceína, TEX 615 y TYE™ 665. Los fluoróforos pueden excitar entre 450 nm y 763 nm y emitir entre 500 nm y 800 nm. Por ejemplo, los inactivadores pueden ser seleccionados del grupo que consiste en los inactivadores Iowa Black® y Black Hole Quenchers®. El pico de absorbancia de cada inactivador puede estar en 531 nm, 534 nm, 578 nm o 656 nm.
[0077] Se pueden añadir múltiples sondas de hidrólisis y/o hibridación a la misma reacción de amplificación de ácido nucleico. La selección de los marcadores fluorescentes puede depender del tipo de sonda de hidrólisis y/o hibridación utilizada, del número de dianas que se va a detectar y del tipo de termociclador utilizado. Las combinaciones preferibles de fluoróforos e inactivadores para las reacciones múltiplex requieren longitudes de onda de excitación apropiadas y poco o ningún solapamiento en sus espectros de emisión, así como la reducción de la fluorescencia de fondo. Se contempla que las secuencias de sonda de las presentes enseñanzas pueden ser marcadas con cualquier combinación adecuada de fluoróforo e inactivador. Por ejemplo, cualquier fluoróforo de las presentes enseñanzas puede unirse a cualquier secuencia de ADN de sonda de las presentes enseñanzas.
[0078] Los uno o más cebadores y/o sondas pueden seleccionarse del grupo que consiste en: TGGCCAGAACTGACAGGCAAA, TTTCTCCTGAACGTGGCTGGC, 56-FAM/ACGCTAACT/ZEN/CCAGCATTGGTCTGT/3IABkFQ/, CCGTCACGCTGTTGTTAGG, GCTGTGTTAATCAATGCCACAC, 5HEX/AACTTGCCG/ZEN/AATTAGAGCRGCAGT/3IABkFQ, CGTTTCGTCTGGATCGCAC, GCTGGGTAAAATAGGTCACC, 5TEX615/TATCATTGGTGGTGCCGTAGTCGC/3IAbRQSp, GAGAGGATGAYCAGCCACAC, CGCCCATTGTSCAATATTCC, 5TYE665/TGAGACACGGTCCAGACTCCTACG/3lAbRQSp, AATCACAGGGCGTAGTTGTG, ACCCACCAGCCAATCTTAGG, 56-FAM/TAGCTTGAT/ZEN/CGCCCTCGATTTGGG/3IABkFQ/, GCGGAGTTAACTATTGGCTAG, GGCCAAGCTTCTATATTTGCG, 5HEX/TTRTTYGGT/ZEN/GGTTGYTTTRTTAA/3lABkFQ, GCGGAGTTARYTATTGGCTAG, GGCCAAGCYTCTAWATTTGCG, /5HEX/CCGGACGGT/ZEN/CTTGGTAATTTGGGT/3IABkFQ/, /5HEX/CCGTACGGT/ZEN/TTAGGCAATTTGGGT/3IABkFQ/, GGCGGCGTTGATGTCCTTCG, CCATTCAGCCAGATCGGCATC, 5TEX615/AGCTCTTCTATCCTGGTGCTGCG/3lAbRQSp, AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT, CCGTACGCATACTGGCTTTGC, 56-FAM/AAACCGGGC/ZEN/GATATGCGTCTGTAT/3IABkFQ/, GTATCGCCGTCTAGTTCTGC, CCTTGAATGAGCTGCACAGTGG, 5HEX/TCGTCGCGG/ZEN/AACCATTCGCTAAA/3IABkFQ/, GTTTGATCGTCAGGGATGGC, GGCGAAAGTCAGGCTGTG, 5TEX615/CATCAGGACAAGATGGGCGGTATG/3lAbRQSp, GCTGCTCAAGGAGCACAGGAT, CACATTGACATAGGTGTGGTGC, 56-FAM/AGGATGGCA/ZEN/AGGCCCACTATTTCA/3IABkFQ, AACAGCCTCAGCAGCCGGTTA, TTCGCCGCAATCATCCCTAGC, 5HEX/AGCCATTAC/ZEN/GTTCCAGAGTTGCGT/3IABkFQ, GCCGAGGCTTACGGGATCAAG, CAAAGCGCGTAACCGGATTGG, 5TEX615/TCTGCTGAAGTTTRYCGAGGCMAA/3lAbRQSp, AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT, CCGTACGCATACTGGCTTTGC, 56-FAM/AAACCGGGC/ZEN/GATATGCGTCTGTAT/3IABkFQ/, CTGGGTTCTATAAGTAAAACCTTCACCGG, CTTCCACTGCGGCTGCCAGTT, 5HEX/GATGCCATT/ZEN/GCYCGSGGTGAAAT/3IABkFQ, CCGAAGCCTATGGCGTGAAATCC, GCAATGCCCTGCTGGAGCG, 5TEX615/ATGTTGGCCTGAACCCAGCG/3lAbRQSp. Los cebadores y/o sondas incluidos en este grupo pueden o no estar degenerados en cualquier posición nucleotídica. [SEQ. ID NO. 67-118]
[0079] El kit puede incluir una o más mezclas multiplex de cebador-sonda. La mezcla multiplex de cebador-sonda
puede incluir uno o más controles internos. La mezcla multiplex de cebador-sonda y uno o más controles internos pueden estar incluidos en un recipiente, tal como un vial. La mezcla multiplex de cebador-sonda y uno o más controles internos pueden estar incluidos en más de un recipiente, tal como en viales.
[0080] Una mezcla de cebador-sonda puede incluir secuencias para detectar cualquier combinación de los siguientes genes: similar a CMY-2, similar a CTX-M-14, similar a CTX-M-15, similar a IMP, similar a VIM, similar a DHA, similar a KPC, similar a NDM, similar a MOX, similar a ACC, similar a FOX, similar a DHA, similar a EBC, similar a OXA-143, similar a OXA-23, similar a OXA-51, similar a OXA-48, similar a OXA-58 y similar a OXA-24/40.
[0081] Por ejemplo, el kit puede incluir una primera mezcla de cebador-sonda y uno o más controles internos en un primer vial y una segunda mezcla de cebador-sonda y uno o más controles internos en un segundo vial. Por ejemplo, el kit puede incluir una primera mezcla de cebador-sonda y uno o más controles internos en un primer vial, una segunda mezcla de cebador-sonda y uno o más controles internos en un segundo vial y una tercera mezcla de cebador-sonda y uno o más controles internos en un tercer vial. Cada vial puede contener diferentes mezclas. Cada vial puede contener la misma mezcla.
[0082] El kit puede incluir al menos una mezcla de ADN de control. El kit puede incluir una o más mezclas de control de ADN. El kit puede incluir exactamente dos mezclas de ADN de control. El kit puede incluir exactamente tres mezclas de ADN de control. La mezcla de control de ADN puede incluir al menos una secuencia de ADN correspondiente a al menos una familia de genes y al menos una secuencia de ADN de control interno. La mezcla de control de ADN puede estar incluida en un recipiente, tal como un vial. La mezcla de control de ADN puede estar incluida en más de un recipiente, tal como en viales.
[0083] Por ejemplo, el kit puede incluir una primera mezcla de control de ADN en un primer vial y una segunda mezcla de control de a Dn en un segundo vial. Por ejemplo, el kit puede incluir una primera mezcla de control de ADN en un primer vial, una segunda mezcla de control de ADN en un segundo vial y una tercera mezcla de control de ADN en un tercer vial. Cada vial puede contener diferentes mezclas. Cada vial puede contener la misma mezcla.
[0084] En un ejemplo, el kit incluye tres viales de mezcla multiplex de cebador-sonda que incluyen controles internos y tres viales de mezcla de control de ADN. Las tres mezclas multiplex de cebador-sonda pueden permitir la identificación de hasta nueve genes de resistencia a los antibióticos y controles internos. Una primera mezcla de cebador-sonda puede incluir secuencias para detectar familias de genes similares a CMY-2, similares a CTX-M-14, similares a CTX-M-15 y controles internos. Una segunda mezcla de cebador-sonda puede incluir secuencias para detectar familias de genes similares a OXA-48, similares a IMP, similares a VIM y controles internos. Una tercera mezcla de cebador-sonda puede incluir secuencias para detectar familias de genes similares a DHA, similares a KPC, similares a NDM y controles internos. La una o más mezclas de control de ADN pueden ser controles de plásmidos o vectores. Una primera mezcla de control de ADN puede incluir secuencias de ADN para CMY-2, CTX-M-14, CTX-M-15 y una secuencia de ADN de control interno. Una segunda mezcla de control de ADN puede incluir secuencias de ADN para OXA-48, IMP, VIM y una secuencia de ADN de control interno. Una tercera mezcla de control de ADN puede incluir secuencias de ADN para DHA, KPC, NDM y una secuencia de ADN de control interno.
[0085] Se contempla que la combinación de familias de genes puede variar. Por ejemplo, una mezcla de cebadorsonda puede incluir secuencias para detectar cualquier combinación de los siguientes genes: similar a CMY-2, similar a CTX-M-14, similar a CTX-M-15 y similar a OXA-48, similar a IMP, similar a VIM, similar a DHA, similar a KPC y similar a NDM. Se contempla además que pueden incluirse dianas genéticas de p-lactamasas adicionales en la mezcla o las mezclas de cebador-sonda.
[0086] La primera mezcla de cebador-sonda puede incluir uno o más cebadores y/o sondas seleccionados del grupo que consiste en: TGGCCAGAACTGACAGGCAAA, TTTCTCCTGAACGTGGCTGGC, 56FAM/ACGCTAACT/ZEN/CCAGCATTGGTCTGT/3IABkFQ/, CCGTCACGCTGTTGTTAGG, GCTGTGTTAATCAATGCCACAC, 5HEX/AACTTGCCG/ZEN/AATTAGAGCRGCAGT/3IABkFQ, CGTTTCGTCTGGATCGCAC, GCTGGGTAAAATAGGTCACC y 5TEX615/TATCATTGGTGGTGCCGTAGTCGC/3lAbRQSp. La primera mezcla de cebador-sonda puede incluir uno o más controles internos seleccionados del grupo que consiste en: GAGAGGATGAYCAGCCACAC, CGCCCATTGTSCAATATTCC y 5TYE665/TGAGACACGGTCCAGACTCCTACG/3lAbRQSp. Una mezcla de cebador-sonda puede incluir una combinación de uno o más de dichos grupos de cebadores y/o sondas y de uno o más de dichos grupos de controles internos. La mezcla de cebador-sonda, incluidos los controles internos, puede ser una mezcla multiplex. [SEQ. ID NO. 152-163]
[0087] El kit puede incluir una primera, segunda y tercera mezcla de cebadores y/o sondas, incluyendo la primera mezcla de cebadores y/o sondas uno o más cebadores y/o sondas seleccionados del grupo que consiste en: TGGCCAGAACTGACAGGCAAA, TTTCTCCTGAACGTGGCTGGC, 56-FAM/ACGCTAACT/ZEN/CCAGCATTGGTCTGT/3IABkFQ/, CCGTCACGCTGTTGTTAGG, GCTGTGTTAATCAATGCCACAC, 5HEX/AACTTGCCG/ZEN/AATTAGAGCRGCAGT/3IABkFQ, CGTTTCGTCTGGATCGCAC, GCTGGGTAAAATAGGTCACC,
5TEX615/TATCATTGGTGGTGCCGTAGTCGC/3IAbRQSp, GAGAGGATGAYCAGCCACAC, CGCCCATTGTSCAATATTCC y 5TYE665/TGAGACACGGTCCAGACTCCTACG/3IAbRQSp. Los cebadores y/o sondas incluidos en este grupo pueden o no estar degenerados en cualquier posición nucleotídica. [SEQ. ID NO. 152 163]
[0088] La segunda mezcla de cebador-sonda puede incluir uno o más cebadores y/o sondas seleccionados del grupo que consiste en: AATCACAGGGCGTAGTTGTG, ACCCACCAGCCAATCTTAGG, 56-FAM/TAGCTTGAT/ZEN/CGCCCTCGATTTGGG/3IABkFQ/, GCGGAGTTAACTATTGGCTAG, GGCCAAGCTTCTATATTTGCG, 5HEX/TTRTTYGGT/ZEN/GGTTGYTTTRTTAA/3lABkFQ, GCGGAGTTARYTATTGGCTAG, GGCCAAGCYTCTAWATTTGCG, /5HEX/CCGGACGGT/ZEN/CTTGGTAATTTGGGT/3IABkFQ/, /5HEX/CCGTACGGT/ZEN/TTAGGCAATTTGGGT/3IABkFQ, GGCGGCGTTGATGTCCTTCG, CCATTCAGCCAGATCGGCATC y 5TEX615/AGCTCTTCTATCCTGGTGCTGCG/3lAbRQSp. La segunda mezcla de cebador-sonda puede incluir uno o más controles internos seleccionados del grupo que consiste en: GAGAGGATGAYCAGCCACAC, CGCCCATTGTSCAATATTCC y 5TYE665/TGAGACACGGTCCAGACTCCTACG/3lAbRQSp. Una mezcla de cebador-sonda puede incluir una combinación de uno o más de dichos grupos de cebadores y/o sondas y de uno o más de dichos grupos de controles internos. La mezcla de cebador-sonda, incluidos los controles internos, puede ser una mezcla multiplex. [SEQ. ID NO.
164-179]
[0089] El kit puede incluir una primera, segunda y tercera mezcla de cebadores y/o sondas, incluyendo la segunda mezcla de cebadores y/o sondas uno o más cebadores y/o sondas seleccionados del grupo que consiste en: AATCACAGGGCGTAGTTGTG, ACCCACCAGCCAATCTTAGG, 56-FAM/TAGCTTGAT/ZEN/CGCCCTCGATTTGGG/13IABkFQ/, GCGGAGTTAACTATTGGCTAG, GGCCAAGCTTCTATATTTGCG, 5HEX/TTRTTYGGT/ZEN/GGTTGYTTTRTTAA/3lABkFQ, GCGGAGTTARYTATTGGCTAG, GGCCAAGCYTCTAWATTTGCG, /5HEX/CCGGACGGT/ZEN/CTTGGTAATTTGGGT/3IABkFQ/, /5HEX/CCGTACGGT/ZEN/TTAGGCAATTTGGGT/3IABkFQ, GGCGGCGTTGATGTCCTTCG, CCATTCAGCCAGATCGGCATC, 5TEX615/AGCTCTTCTATCCTGGTGCTGCG/3lAbRQSp, GAGAGGATGAYCAGCCACAC, CGCCCATTGTSCAATATTCC y 5TYE665/TGAGACACGGTCCAGACTCCTACG/3lAbRQSp. Los cebadores y/o sondas incluidos en este grupo pueden o no estar degenerados en cualquier posición nucleotídica. [SEQ. ID NO. 164-179]
[0090] La tercera mezcla de cebador-sonda puede incluir uno o más cebadores y/o sondas seleccionados del grupo que consiste en: AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT, CCGTACGCATACTGGCTTTGC, 56-FAM/AAACCGGGC/ZEN/GATATGCGTCTGTAT/3IABkFQ/, GTATCGCCGTCTAGTTCTGC, CCTTGAATGAGCTGCACAGTGG, 5HEX/TCGTCGCGG/ZEN/AACCATTCGCTAAA/3IABkFQ/, GTTTGATCGTCAGGGATGGC, GGCGAAAGTCAGGCTGTG y 5TEX615/CATCAGGACAAGATGGGCGGTATG/3IAbRQSp. La tercera mezcla de cebador-sonda puede incluir uno o más controles internos seleccionados del grupo que consiste en: GAGAGGATGAYCAGCCACAC, CGCCCATTGTSCAATATTCC y 5TYE665/TGAGACACGGTCCAGACTCCTACG/3lAbRQSp. Una mezcla de cebador-sonda puede incluir una combinación de uno o más de dichos grupos de cebadores y/o sondas y de uno o más de dichos grupos de controles internos. La mezcla de cebador-sonda, incluidos los controles internos, puede ser una mezcla multiplex. [SEQ. ID NO. 180-191]
[0091] El kit puede incluir una primera, segunda y tercera mezcla de cebadores y/o sondas, incluyendo la tercera mezcla de cebadores y/o sondas uno o más cebadores y/o sondas seleccionados del grupo que consiste en: AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT, CCGTACGCATACTGGCTTTGC, 56-FAM/AAACCGGGC/ZEN/GATATGCGTCTGTAT/3IABkFQ/, GTATCGCCGTCTAGTTCTGC, CCTTGAATGAGCTGCACAGTGG, 5HEX/TCGTCGCGG/ZEN/AACCATTCGCTAAA/3IABkFQ/, GTTTGATCGTCAGGGATGGC, GGCGAAAGTCAGGCTGTG, 5TEX615/CATCAGGACAAGATGGGCGGTATG/3lAbRQSp, GAGAGGATGAYCAGCCACAC, CGCCCATTGTSCAATATTCC y 5TYE665/TGAGACACGGTCCAGACTCCTACG/3lAbRQSp. Los cebadores y/o sondas incluidos en este grupo pueden o no estar degenerados en cualquier posición nucleotídica. [SEQ. ID NO. 180 191]
[0092] Una primera mezcla de control de ADN puede incluir una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en: TGGCCAGAACTGACAGGCAAACAGTGGCAGGGTATCCGCCTGCTGCACTTAGCCA CCTATACGGCAGGCGGCCTACCGCTGCAGATCCCCGATGACGTTAGGGATAAAGC CGCATTACTGCATTTTTATCAAAACTGGCAGCCGCAATGGACTCCGGGCGCTAAGC GACTTTACGCTAACTCCAGCATTGGTCTGTTTGGCGCGCTGGCGGTGAAACCCTC AGGAATGAGTTACGAAGAGGCAATGACCAGACGCGTCCTGCAACCATTAAAACTG GCGCATACCTGGATTACGGTTCCGCAGAACGAACAAAAAGATTATGCCTGGGGCT ATCGCGAAGGGAAGCCCGTACACGTTTCTCCGGGACAACTTGACGCCGAAGCCTA TGGCGTGAAATCCAGCGTTATTGATATGGCCCGCTGGGTTCAGGCCAACATGGAT
GCCAGCCACGTTCAGGAGAAA, CCGTCACGCTGTTGTTAGGAAGTGTGCCGCTGTATGCGCAAACGGCGGACGTACA GCAAAAACTTGCCGAATTAGAGCGGCAGTCGGGAGGCAGACTGGGTGTGGCATT GATTAACACAGC y CGTTTCGTCTGGATCGCACTGAACCTACGCTGAATACCGCCATTCCCGGCGACCC GAGAGACACCACCACGCCGCGGGCGATGGCGCAGACGTTGCGTCAGCTTACGCT GGGTCATGCGCTGGGCGAAACCCAGCGGGCGCAGTTGGTGACGTGGCTCAAAGG CAATACGACCGGCGCAGCCAGCATTCGGGCCGGCTTACCGACGTCGTGGACTGT GGGTGATAAGACCGGCAGCGGCGACTACGGCACCACCAATGATATTGCGGTGATC TGGCCGCAGGGTCGTGCGCCGCTGGTTCTGGTGACCTATTTTACCCAGC. La primera mezcla de control de ADN puede incluir la siguiente secuencia de control interno: GAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCG. Una mezcla de control de ADN puede incluir una combinación de uno o más de dichos grupos de secuencias y dicha secuencia de control interno. Una mezcla de control de ADN puede incluir cualquier combinación de secuencias de la primera mezcla de control, la segunda mezcla de control, la tercera mezcla de control y la secuencia de control interno. [SEQ. ID NO. 261-264]
[0093] Una segunda mezcla de control de ADN puede incluir una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en:
AATCACAGGGCGTAGTTGTGCTCTGGAATGAGAATAAGCAGCAAGGATTTACCAAT AATCTTAAACGGGCGAACCAAGCATTTTTACCCGCATCTACCTTTAAAATTCCCAAT AGCTTGATCGCCCTCGATTTGGGCGTGGTTAAGGATGAACACCAAGTCTTTAAGTG GGATGGACAGACGCGCGATATCGCCACTTGGAATCGCGATCATAATCTAATCACC GCGATGAAATATTCAGTTGTGCCTGTTTATCAAGAATTTGCCCGCCAAATTGGCGA GGCACGTATGAGCAAGATGCTACATGCTTTCGATTATGGTAATGAGGACATTTCGG GCAATGTAGACAGTTTCTGGCTCGACGGTGGTATTCGAATTTCGGCCACGGAGCA AATCAGCTTTTTAAGAAAGCTGTATCACAATAAGTTACACGTATCGGAGCGCAGCC AGCGTATTGTCAAACAAGCCATGCTGACCGAAGCCAATGGTGACTATATTATTCGG GCTAAAACTGGATACTCGACTAGAATCGAACCTAAGATTGGCTGGTGGGT, GCGGAGTTAGTTATTGGCTAGTTAAAAATAAAATTGAAGTTTTTTATCCCGGCCCGG GGCACACTCAAGATAACGTAGTGGTTTGGTTACCTGAAAAGAAAATTTTATTCGGT GGTTGTTTTGTTAAACCGGACGGTCTTGGTAATTTGGGTGACGCAAATTTAGAAGC TTGGCC y GGCGGCGTTGATGTCCTTCGGGCGGCTGGGGTGGCAACGTACGCATCACCGTCG ACACGCCGGCTAGCCGAGGTAGAGGGGAACGAGATTCCCACGCACTCTCTAGAA GGACTCTCATCGAGCGGGGACGCAGTGCGCTTCGGTCCAGTAGAACTCTTCTATC CTGGTGCTGCGCATTCGACCGACAACTTAGTTGTGTACGTCCCGTCTGCGAGTGT GCTCTATGGTGGTTGTGCGATTCATGAGTTGTCACGCACGTCTGCGGGGAACGTG GCCGATGCCGATCTGGCTGAATGG. La segunda mezcla de control de ADN puede incluir la siguiente secuencia de control interno: GAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCG. Una mezcla de control de ADN puede incluir una combinación de uno o más de dichos grupos de secuencias y dicha secuencia de control interno. Una mezcla de control de ADN puede incluir cualquier combinación de secuencias de la primera mezcla de control, la segunda mezcla de control, la tercera mezcla de control y la secuencia de control interno. [SEQ. ID NO. 265-268]
[0094] Una tercera mezcla de control de ADN puede incluir una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en: AACTTTCACAGGTGTGCTGGGTGCGGTTTCTGTGGCGAAAAAAGAGATGGCGCTG AATGATCCGGCGGCAAAATACCAGCCGGAGCTGGCTCTGCCGCAGTGGAAGGGG ATCACATTGCTGGATCTGGCTACCTATACCGCAGGCGGACTGCCGTTACAGGTGC CGGATGCGGTAAAAAGCCGTGCGGATCTGCTGAATTTCTATCAGCAGTGGCAGCC GTCCCGGAAACCGGGCGATATGCGTCTGTATGCAAACAGCAGTATCGGCCTGTTT GGTGCTCTGACCGCAAACGCGGCGGGGATGCCGTATGAGCAGTTGCTGACTGCA CGGATCCTGGCACCGCTGGGGTTATCTCACACCTTTATTACTGTGCCGGAAAGTG CGCAAAGCCAGTATGCGTACGG, GTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCATGGCCGCTGGCTGGCTTTTCTG CCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTAAACTCGAACAGGACTT TGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCGCAACTGTAAGT TACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGG y GTTTGATCGTCAGGGATGGCGGCCGCGTGCTGGTGGTCGATACCGCCTGGACCG ATGACCAGACCGCCCAGATCCTCAACTGGATCAAGCAGGAGATCAACCTGCCGGT CGCGCTGGCGGTGGTGACTCACGCGCATCAGGACAAGATGGGCGGTATGGACGC GCTGCATGCGGCGGGGATTGCGACTTATGCCAATGCGTTGTCGAACCAGCTTGCC CCGCAAGAGGGGATGGTTGCGGCGCAACACAGCCTGACTTTCGCC. La tercera mezcla de control de ADN puede incluir la siguiente secuencia de control interno: GAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCG. Una mezcla de control de ADN puede incluir una combinación de uno o más de dichos grupos de secuencias y dicha secuencia de control interno. Una mezcla de control de ADN puede
incluir cualquier combinación de secuencias de la primera mezcla de control, la segunda mezcla de control, la tercera mezcla de control y la secuencia de control interno. [SEQ. ID NO. 269-272]
[0095] En un ejemplo, el kit incluye dos viales de mezcla multiplex de cebador-sonda que incluyen controles internos y dos viales de mezcla de control de ADN. Las dos mezclas multiplex de cebador-sonda pueden facilitar la identificación de hasta seis genes de resistencia a los antibióticos y controles internos. Una primera mezcla de cebadorsonda puede incluir secuencias para detectar familias de genes similares a MOX, similares a ACC, similares a FOX y controles internos. Una segunda mezcla de cebador-sonda puede incluir secuencias para detectar familias de genes similares a DHA, similares a ACT/MIR, similares a CMY-2 y controles internos. Una primera mezcla de control de ADN puede incluir secuencias de ADN para MOX, ACC, FOX y una secuencia de ADN de control interno. Una segunda mezcla de control de ADN puede incluir secuencias de ADN para DHA, ACT/MIR, CMY-2 y una secuencia de ADN de control interno.
[0096] Se contempla que la combinación de familias de genes puede variar. Por ejemplo, una mezcla de cebadorsonda puede incluir secuencias para detectar cualquier combinación de los siguientes genes: similar a MOX, similar a ACC, similar a FOX, similar a d Ha , similar a ACT/MIR y similar a CMY-2. Se contempla además que pueden incluirse dianas genéticas de p-lactamasas adicionales en la mezcla o las mezclas de cebador-sonda.
[0097] La primera mezcla de cebador-sonda puede incluir uno o más cebadores y/o sondas seleccionados del grupo que consiste en: GCTGCTCAAGGAGCACAGGAT, CACATTGACATAGGTGTGGTGC, 56-FAM/AGGATGGCA/ZEN/AGGCCCACTATTTCA/3IABkFQ, AACAGCCTCAGCAGCCGGTTA, TTCGCCGCAATCATCCCTAGC, 5HEX/AGCCATTAC/ZEN/GTTCCAGAGTTGCGT/3IABkFQ, GCCGAGGCTTACGGGATCAAG, CAAAGCGCGTAACCGGATTGG y 5TEX615/TCTGCTGAAGTTTRYCGAGGCMAA/3lAbRQSp. La primera mezcla de cebador-sonda puede incluir uno o más controles internos seleccionados del grupo que consiste en: GAGAGGATGAYCAGCCACAC, CGCCCATTGTSCAATATTCC y 5TYE665/TGAGACACGGTCCAGACTCCTACG/3lAbRQSp. Una mezcla de cebador-sonda puede incluir una combinación de uno o más de dichos grupos de cebadores y/o sondas y de uno o más de dichos grupos de controles internos. La mezcla de cebador-sonda, incluidos los controles internos, puede ser una mezcla multiplex. [SEQ. ID NO. 192-203]
[0098] La segunda mezcla de cebador-sonda puede incluir uno o más cebadores y/o sondas seleccionados del grupo que consiste en: AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT, CCGTACGCATACTGGCTTTGC, 56-FAM/AAACCGGGC/ZEN/GATATGCGTCTGTAT/3IABkFQ, CTGGGTTCTATAAGTAAAACCTTCACCGG, CTTCCACTGCGGCTGCCAGTT, 5HEX/GATGCCATT/ZEN/GCYCGSGGTGAAAT/3IABkFQ, CCGAAGCCTATGGCGTGAAATCC, GCAATGCCCTGCTGGAGCG y 5TEX615/ATGTTGGCCTGAACCCAGCG/3lAbRQSp. La segunda mezcla de cebador-sonda puede incluir uno o más controles internos seleccionados del grupo que consiste en: GAGAGGATGAYCAGCCACAC, CGCCCATTGTSCAATATTCC y 5TYE665/TGAGACACGGTCCAGACTCCTACG/3lAbRQSp. Una mezcla de cebador-sonda puede incluir una combinación de uno o más de dichos grupos de cebadores y/o sondas y de uno o más de dichos grupos de controles internos. La mezcla de cebador-sonda, incluidos los controles internos, puede ser una mezcla multiplex. [SEQ. ID NO. 204-215]
[0099] El kit puede incluir exactamente dos mezclas de cebadores y/o sondas, incluyendo una primera mezcla de cebadores y/o sondas uno o más cebadores y/o sondas seleccionados del grupo que consiste en: GCTGCTCAAGGAGCACAGGAT, CACATTGACATAGGTGTGGTGC, 56-FAM/AGGAT GGCA/ZEN/AGGCCCACTATTTCA/3IABkFQ, AACAGCCTCAGCAGCCGGTTA, TTCGCCGCAATCATCCCTAGC, 5HEX/AGCCATTAC/ZEN/GTTCCAGAGTTGCGT/3IABkFQ, GCCGAGGCTTACGGGATCAAG, CAAAGCGCGTAACCGGATTGG, 5TEX615/TCTGCTGAAGTTTRYCGAGGCMAA/3IAbRQSp, GAGAGGATGAYCAGCCACAC, CGCCCATTGTSCAATATTCC y 5TYE665/TGAGACACGGTCCAGACTCCTACG/3lAbRQSp; e incluyendo una segunda mezcla de cebadores y/o sondas uno o más cebadores y/o sondas seleccionados del grupo que consiste en: AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT, CCGTACGCATACTGGCTTTGC, 56-FAM/AAACCGGGC/ZEN/GATATGCGTCTGTAT/3IABkFQ, CTGGGTTCTATAAGTAAAACCTTCACCGG, CTTCCACTGCGGCTGCCAGTT, 5HEX/GATGCCATT/ZEN/GCYCGSGGTGAAAT/3IABkFQ, CCGAAGCCTATGGCGTGAAATCC, GCAATGCCCTGCTGGAGCG, 5TEX615/ATGTTGGCCTGAACCCAGCG/3IAbRQSp, GAGAGGATGAYCAGCCACAC, CGCCCATTGTSCAATATTCC y 5TYE665/TGAGACACGGTCCAGACTCCTACG/3IAbRQSp. Los cebadores y/o sondas incluidos en este grupo pueden o no estar degenerados en cualquier posición nucleotídica. [SEQ. ID NO. 192 215]
[0100] Una primera mezcla de control de ADN puede incluir una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en:
GCTGCTCAAGGAGCACAGGATCCCGGGCATGGCGGTGGCCGTGCTCAAGGATGG CAAGGCCCACTATTTCAATTACGGGGTGGCCAACCGGGAGAGCGGGGCCAGCGT CAGCGAGCAGACCCTGTTCGAGATAGGATCCGTGAGCAAGACCCTGACTGCGACC
CTGGGGGCCTATGCGGTGGTCAAGGGAGCGATGCAGCTGGATGACAAGGCGAGC CGGCACGCGCCCTGGCTCAAGGGATCCGTCTTTGACAGCATCACCATGGGGGAG CTTGCCACCTACAGCGCCGGAGGCCTGCCACTGCAATTCCCCGAGGAGGTGGATT CATCCGAGAAGATGCGCGCCTACTACCGCCAGTGGGCCCCTGTCTATTCGCCGGG CTCCCATCGCCAGTACTCCAACCCCAGCATAGGGCTGTTCGGCCACCTGGCGGCG AGCAGCCTGAAGCAGCCATTTGCCCAGTTGATGGAGCAGACCCTGCTGCCCGGG CTCGGCATGCACCACACCTATGTCAATGTG, AACAGCCTCAGCAGCCGGTTACGGAAAATACGTTATTTGAAGTGGGTTCGCTGAGT AAAACGTTTGCTGCCACCTTGGCGTCCTATGCGCAGGTGAGCGGTAAGCTGTCTTT GGATCAAAGCGTTAGCCATTACGTTCCAGAGTTGCGTGGCAGCAGCTTTGACCAC GTTAGCGTACTCAATGTGGGCACGCATACCTCAGGCCTACAGCTATTTATGCCGGA AGATATTAAAAATACCACACAGCTGATGGCTTATCTAAAAGCATGGAAACCTGCCG ATGCGGCTGGAACCCATCGCGTTTATTCCAATATCGGTACTGGTTTGCTAGGGATG ATTGCGGCGAA y GCCGAGGCTTACGGGATCAAGACCGGCTCGGCGGATCTGCTGAAGTTTACCGAG GCCAACATGGGGTATCAGGGAGATGCCGCGCTAAAAACGCGGATCGCGCTGACC CATACCGGTTTCTACTCGGTGGGAGACATGACTCAGGGGCTGGGTTGGGAGAGCT ACGCCTATCCGTTGACCGAGCAGGCGCTGCTGGCGGGCAACTCCCCGGCGGTGA GCTTCCAGGCCAATCCGGTTACGCGCTTTG. La primera mezcla de control de ADN puede incluir la siguiente secuencia de control interno: GAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCG. Una mezcla de control de ADN puede incluir una combinación de uno o más de dichos grupos de secuencias y dicha secuencia de control interno. Una mezcla de control de ADN puede incluir cualquier combinación de secuencias de la primera mezcla de control, la segunda mezcla de control y la secuencia de control interno. [SEQ. ID NO. 273-276]
[0101] Una segunda mezcla de control de ADN puede incluir una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en:
AACTTTCACAGGTGTGCTGGGTGCGGTTTCTGTGGCGAAAAAAGAGATGGCGCTG AATGATCCGGCGGCAAAATACCAGCCGGAGCTGGCTCTGCCGCAGTGGAAGGGG ATCACATTGCTGGATCTGGCTACCTATACCGCAGGCGGACTGCCGTTACAGGTGC CGGATGCGGTAAAAAGCCGTGCGGATCTGCTGAATTTCTATCAGCAGTGGCAGCC GTCCCGGAAACCGGGCGATATGCGTCTGTATGCAAACAGCAGTATCGGCCTGTTT GGTGCTCTGACCGCAAACGCGGCGGGGATGCCGTATGAGCAGTTGCTGACTGCA CGGATCCTGGCACCGCTGGGGTTATCTCACACCTTTATTACTGTGCCGGAAAGTG CGCAAAGCCAGTATGCGTACGG, TCGGTAAAGCCGATGTTGCGGCGAACAAACCCGTCACCCCGCAAACCCTGTTTGA GCTGGGCTCTATAAGTAAAACCTTCACCGGCGTACTGGGCGGCGATGCCATTGCC CGGGGTGAAATAGCGCTGGGCGATCCGGTAGCAAAATACTGGCCTGAGCTCACG GGCAAGCAGTGGCAGGGCATTCGCATGCTGGATCTGGCAACCTATACCGCAGGC GGTCTGCCGTTACAGGTGCCGGATGAGGTCACGGATACCGCCTCTCTGCTGCGCT TTTATCAAAACTGGCAGCCGCAGTGGAAG y CCGAAGCCTATGGCGTGAAATCCAGCGTTATTGATATGGCCCGCTGGGTTCAGGC CAACATGGATGCCAGCCACGTTCAGGAGAAAACGCTCCAGCAGGGCATTGC. La segunda mezcla de control de ADN puede incluir la siguiente secuencia de control interno: GAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCG. Una mezcla de control de ADN puede incluir una combinación de uno o más de dichos grupos de secuencias y dicha secuencia de control interno. Una mezcla de control de ADN puede incluir cualquier combinación de secuencias de la primera mezcla de control, la segunda mezcla de control y la secuencia de control interno. [SEQ. ID NO. 277-280]
[0102] En un ejemplo, el kit incluye dos viales de mezcla multiplex de cebador-sonda que incluyen controles internos y dos viales de mezcla de control de ADN. Las dos mezclas multiplex de cebador-sonda pueden facilitar la identificación de hasta seis genes de resistencia a los antibióticos y controles internos. Una primera mezcla de cebadorsonda puede incluir secuencias para detectar familias de genes similares a OXA-143, similares a OXA-23, similares a OXA-51 y controles internos. Una segunda mezcla de cebador-sonda puede incluir secuencias para detectar familias de genes similares a OXA-48, similares a OXA-58, similares a OXA-24/40 y controles internos. Una primera mezcla de control de ADN puede incluir secuencias de ADN para OXA-143, OXA-23, OXA-51 y una secuencia de ADN de control interno. Una segunda mezcla de control de a Dn puede incluir secuencias de ADN para OXA-48, OXA-58 y OXA 24/40 y una secuencia de ADN de control interno.
[0103] Se contempla que la combinación de familias de genes puede variar. Por ejemplo, una mezcla de cebadorsonda puede incluir secuencias para detectar cualquier combinación de los siguientes genes: similar a OXA-143, similar a OXA-23, similar a OXA-51, similar a OXA-48, similar a OXA-58 y similar a OXA-24/40. Se contempla además que pueden incluirse dianas genéticas de p-lactamasas adicionales en la mezcla o las mezclas de cebador-sonda.
[0104] La primera mezcla de cebador-sonda puede incluir uno o más cebadores y/o sondas seleccionados del grupo
que consiste en: AGCACATACAGAATATGTCCCTGC, ACCTGTTAACCAACCTACTTGAGGG, /56-FAM/TTGCAAGACGGACTGGCTTAGACC/3BHQ_1/, CCTGATCGGATTGGAGAACC, CTACCTCTTGAATAGGCGTAACC, /5TEX615/ACGTCGCGCAAGTTCCTGATAGAC/3lAbRQSp/, TAGTGACTGCTAATCCAAATCACAG, GCACGAGCAAGATCATTACCATAGC, /5HEX/AGTTATCCAACAAGGCCAAACTCAACA/3BHQ_1/. [SEQ. ID NO. 119-127] La primera mezcla de cebadorsonda puede incluir uno o más controles internos seleccionados del grupo que consiste en: GAGAGGATGAYCAGCCACAC, CGCCCATTGTSCAATATTCC y 5TYE665/TGAGACACGGTCCAGACTCCTACG/3lAbRQSp. Una mezcla de cebador-sonda puede incluir una combinación de uno o más de dichos grupos de cebadores y/o sondas y de uno o más de dichos grupos de controles internos. La mezcla de cebador-sonda, incluidos los controles internos, puede ser una mezcla multiplex.
[0105] La segunda mezcla de cebador-sonda puede incluir uno o más cebadores y/o sondas seleccionados del grupo que consiste en: AATCACAGGGCGTAGTTGTG, ACCCACCAGCCAATCTTAGG, /5HEX/TAGCTTGATCGCCCTCGATTTGGG/3BHQ_1/, GTGGGATGGAAAGCCACG, CACTTGCGGGTCTACAGC, /56-FAM/TTACTTTGGGCGAAGCCATGCAAG/3BHQ_1 /, CACCTATGGTAATGCTCTTGC, CTGGAACTGCTGACAATGCC, /5TEX615/TGGGAGAAAGATATGACTTTAGGTGAGGCA/3lAbRQSp/. [SEQ. ID NO.
128-136] La segunda mezcla de cebador-sonda puede incluir uno o más controles internos seleccionados del grupo que consiste en: GAGAGGATGAYCAGCCACAC, CGCCCATTGTSCAATATTCC y 5TYE665/TGAGACACGGTCCAGACTCCTACG/3lAbRQSp. Una mezcla de cebador-sonda puede incluir una combinación de uno o más de dichos grupos de cebadores y/o sondas y de uno o más de dichos grupos de controles internos. La mezcla de cebador-sonda, incluidos los controles internos, puede ser una mezcla multiplex.
[0106] El kit puede incluir exactamente dos mezclas de cebadores y/o sondas, incluyendo una primera mezcla de cebadores y/o sondas uno o más cebadores y/o sondas seleccionados del grupo que consiste en: AGCACATACAGAATATGTCCCTGC, ACCTGTTAACCAACCTACTTGAGGG, /56-FAM/TTGCAAGACGGACTGGCTTAGACC/3BHQ_1/, CCTGATCGGATTGGAGAACC, CTACCTCTTGAATAGGCGTAACC, /5TEX615/ACGTCGCGCAAGTTCCTGATAGAC/3lAbRQSp/, TAGTGACTGCTAATCCAAATCACAG, GCACGAGCAAGATCATTACCATAGC, /5HEX/AGTTATCCAACAAGGCCAAACTCAACA/3BHQ_1/, GAGAGGATGAYCAGCCACAC, CGCCCATTGTSCAATATTCC y 5TYE665/TGAGACACGGTCCAGACTCCTACG/3lAbRQSp; incluyendo una segunda mezcla de cebadores y/o sondas uno o más cebadores y/o sondas seleccionados del grupo que consiste en: AATCACAGGGCGTAGTTGTG, ACCCACCAGCCAATCTTAGG, /5HEX/TAGCTTGATCGCCCTCGATTTGGG/3BHQ_1/, GTGGGATGGAAAGCCACG, CACTTGCGGGTCTACAGC, /56-FAM/TTACTTTGGGCGAAGCCATGCAAG/3BHQ_1 /, CACCTATGGTAATGCTCTTGC, CTGGAACTGCTGACAATGCC, /5TEX615/TGGGAGAAAGATATGACTTTAGGTGAGGCA/3lAbRQSp/, GAGAGGATGAYCAGCCACAC, CGCCCATTGTSCAATATTCC y 5TYE665/TGAGACACGGTCCAGACTCCTACG/3lAbRQSp. Los cebadores y/o sondas incluidos en este grupo pueden o no estar degenerados en cualquier posición nucleotídica. [SEQ. ID NO. 216-239]
[0107] Una primera mezcla de control de ADN puede incluir una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en:
AGCACATACAGAATATGTCCCTGCATCAACATTTAAGATGCTAAATGCCTTAATTGG ACTAGAAAATCATAAAGCTACAACAACTGAGATTTTCAAATGGGACGGTAAAAAGA GATCTTATCCCATGTGGGAAAAAGATATGACTTTAGGTGATGCCATGGCACTTTCA GCAGTTCCTGTATATCAAGAACTTGCAAGACGGACTGGCTTAGACCTAATGCAAAA AGAAGTTAAACGGGTTGGTTTTGGTAATATGAACATTGGAACACAAGTTGATAACTT CTGGTTGGTTGGCCCCCTCAAGATTACACCAATACAAGAGGTTAATTTTGCCGATG ATTTTGCAAATAATCGATTACCCTTTAAATTAGAGACTCAAGAAGAAGTTAAAAAAAT GCTTCTGATTAAAGAATTCAATGGTAGTAAAATTTATGCAAAAAGCGGCTGGGGAA TGGATGTAACCCCTCAAGTAGGTTGGTTAACAGGT, CCTGATCGGATTGGAGAACCAGAAAACGGATATTAATGAAATATTTAAATGGAAGG GCGAGAAAAGGTCATTTACCGCTTGGGAAAAAGACATGACACTAGGAGAAGCCAT GAAGCTTTCTGCAGTCCCAGTCTATCAGGAACTTGCGCGACGTATCGGTCTTGATC TCATGCAAAAAGAAGTAAAACGTATTGGTTTCGGTAATGCTGAAATTGGACAGCAG GTTGATAATTTCTGGTTGGTAGGACCATTAAAGGTTACGCCTATTCAAGAGGTAG y TAGTGACTGCTAATCCAAATCACAGCGCTTCAAAATCTGATGAAAAAGCAGAGAAA ATTAAAAATTTATTTAACGAAGTACACACTACGGGTGTTTTAGTTATCCAACAAGGC CAAACTCAACAAAGCTATGGTAATGATCTTGCTCGTGC. La primera mezcla de control de ADN puede incluir la siguiente secuencia de control interno: GAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCG. Una mezcla de control de ADN puede incluir una combinación de uno o más de dichos grupos de secuencias y dicha secuencia de control interno. Una mezcla de control de ADN puede incluir cualquier combinación de secuencias de la primera mezcla de control, la segunda mezcla de control y la secuencia de control interno. [SEQ. ID NO. 281-284]
[0108] Una segunda mezcla de control de ADN puede incluir una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en:
AATCACAGGGCGTAGTTGTGCTCTGGAATGAGAATAAGCAGCAAGGATTTACCAAT AATCTTAAACGGGCGAACCAAGCATTTTTACCCGCATCTACCTTTAAAATTCCCAAT AGCTTGATCGCCCTCGATTTGGGCGTGGTTAAGGATGAACACCAAGTCTTTAAGTG GGATGGACAGACGCGCGATATCGCCACTTGGAATCGCGATCATAATCTAATCACC GCGATGAAATATTCAGTTGTGCCTGTTTATCAAGAATTTGCCCGCCAAATTGGCGA GGCACGTATGAGCAAGATGCTACATGCTTTCGATTATGGTAATGAGGACATTTCGG GCAATGTAGACAGTTTCTGGCTCGACGGTGGTATTCGAATTTCGGCCACGGAGCA AATCAGCTTTTTAAGAAAGCTGTATCACAATAAGTTACACGTATCGGAGCGCAGCC AGCGTATTGTCAAACAAGCCATGCTGACCGAAGCCAATGGTGACTATATTATTCGG GCTAAAACTGGATACTCGACTAGAATCGAACCTAAGATTGGCTGGTGGGT, GTGGGATGGAAAGCCACGTTTTTTTAAAGCATGGGACAAAGATTTTACTTTGGGCG AAGCCATGCAAGCATCTACAGTGCCTGTATATCAAGAATTGGCACGTCGTATTGGT CCAAGCTTAATGCAAAGTGAATTGCAACGTATTGGTTATGGCAATATGCAAATAGG CACGGAAGTTGATCAATTTTGGTTGAAAGGGCCTTTGACAATTACACCTATACAAG AAGTAAAGTTTGTGTATGATTTAGCCCAAGGGCAATTGCCTTTTAAACCTGAAGTTC AGCAACAAGTGAAAGAGATGTTGTATGTAGAGCGCAGAGGGGAGAATCGTCTATA TGCTAAAAGTGGCTGGGGAATGGCTGTAGACCCGCAAGTG, CACTTGCGGGTCTACAGCCATTCCCCAGCCACTTTTAGCATATAGACGATTCTCCC CTCTGCGCTCTACATACAACATCTCTTTCACTTGTTGCTGAACTTCAGGTTTAAAAG GCAATTGCCCTTGGGCTAAATCATACACAAACTTTACTTCTTGTATAGGTGTAATTG TCAAAGGCCCTTTCAACCAAAATTGATCAACTTCCGTGCCTATTTGCATATTGCCAT AACCAATACGTTGCAATTCACTTTGCATTAAGCTTGGACCAATACGACGTGCCAATT CTTGATATACAGGCACTGTAGATGCTTGCATGGCTTCGCCCAAAGTAAAATCTTTGT CCCATGCTTTAAAAAAACGTGGCTTTCCATCCCAC y CACCTATGGTAATGCTCTTGCACGAGCAAATAAAGAATATGTCCCTGCATCAACATT TAAGATGCTAAATGCTTTAATCGGGCTAGAAAATCATAAAGCAACAACAAATGAGAT TTTCAAATGGGATGGTAAAAAAAGAACTTATCCTATGTGGGAGAAAGATATGACTTT AGGTGAGGCAATGGCATTGTCAGCAGTTCCAG. La segunda mezcla de control de ADN puede incluir la siguiente secuencia de control interno: GAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCG. Una mezcla de control de ADN puede incluir una combinación de uno o más de dichos grupos de secuencias y dicha secuencia de control interno de p-lactamasa adicional. Una mezcla de control de ADN puede incluir cualquier combinación de secuencias de la primera mezcla de control, la segunda mezcla de control y la secuencia de control interno. [SEQ. ID NO. 285-289]
[0109] En un ejemplo, el kit incluye un vial de mezcla multiplex de cebador-sonda que incluye el control interno y un vial de mezcla de control de ADN. Una mezcla de cebador-sonda puede incluir secuencias para detectar las familias de gen MCR y el control interno.
[0110] La mezcla de cebador-sonda puede incluir cebadores y/o sondas seleccionadas del grupo que consiste en: CCGTGTATGTTCAGCTAT, CTTATCCATCACGCCTTT, /5TEX615/TATGATGTCGATACCGCCAAATACCA/3IAbRQSp/, CTGTATGTCAGCGATCAT, GATGCCAGTTTGCTTATCC, /56-FAM/AAGTCTGGG/ZEN/TGAGAACGGTGTCTAT/3IABkFQ/, CAGTCAGTATGCGAGTTTC, AAAATTCGCCAAGCCATC y /5HEXlTGCATAAGC/ZEN/CAGTGCGTTTTTATAT/3IABkFQ/. La mezcla de cebador-sonda puede incluir uno o más controles internos seleccionados del grupo que consiste en: GAGAGGATGAYCAGCCACAC, CGCCCATTGTSCAATATTCC y 5TYE665/TGAGACACGGTCCAGACTCCTACG/3IAbRQSp. La mezcla de cebadorsonda puede incluir una combinación de uno o más de dichos grupos de cebadores y/o sondas y de uno o más de dichos grupos de controles internos. La mezcla de cebador-sonda, incluidos los controles internos, puede ser una mezcla multiplex. [SEQ. ID NO. 137-145]
[0111] Una mezcla de control de ADN puede incluir una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en ATGATGCAGCATACTTCTGTGTGGTACCGACGCTCGGTCAGTCCGTTTGTTCTTGT GGGAGTGTTGCCGTTTTCTTGACCGCGACCGCCAATCTTACCTTTTTTGATAAAATC AGCCAAACCTATCCCATCGCGGACAATCTCGGCTTTGTGCTGACGATCGCTGTCGT GCTCTTTGGCGCGATGCTACTGATCACCACGCTGTTATCATCGTATCGCTATGTGC TAAAGCCTGTGTTGATTTTGCTATTAATCATGGGCGCGGTGACCAGTTATTTTACTG ACACTTATGGCACGGTCTATGATACGACCATGCTCCAAAATGCCCTACAGACCGAC CAAGCCGAGACCAAGGATCTATTAAACGCAGCGTTTATCATGCGTATCATTGGTTT GGGTGTGCTACCAAGTTTGCTTGTGGCTTTTGTTAAGGTGGATTATCCGACTTGGG GCAAGGGTTTGATGCGCCGATTGGGCTTGATCGTGGCAAGTCTTGCGCTGATTTTA CTGCCTGTGGTGGCGTTCAGCAGTCATTATGCCAGTTTCTTTCGCGTGCATAAGCC GCTGCGTAGCTATGTCAATCCGATCATGCCAATCTACTCGGTGGGTAAGCTTGCCA GTATTGAGTATAAAAAAGCCAGTGCGCCAAAAGATACCATTTATCACGCCAAAGAC
GCGGTACAAGCAACCAAGCCTGATATGCGTAAGCCACGCCTAGTGGTGTTCGTCG TCGGTGAGACGGCACGCGCCGATCATGTCAGCTTCAATGGCTATGAGCGCGATAC TTTCCCACAGCTTGCCAAGATCGATGGCGTGACCAATTTTAGCAATGTCACATCGT GCGGCACATCGACGGCGTATTCTGTGCCGTGTATGTTCAGCTATCTGGGCGCGGA TGAGTATGATGTCGATACCGCCAAATACCAAGAAAATGTGCTGGATACGCTGGATC GCTTGGGCGTAAGTATCTTGTGGCGTGATAATAATTCGGACTCAAAAGGCGTGATG GATAAGCTGCCAAAAGCGCAATTTGCCGATTATAAATCCGCGACCAACAACGCCAT CTGCAACACCAATCCTTATAACGAATGCCGCGATGTCGGTATGCTCGTTGGCTTAG ATGACTTTGTCGCTGCCAATAACGGCAAAGATATGCTGATCATGCTGCACCAAATG GGCAATCACGGGCCTGCGTATTTTAAGCGATATGATGAAAAGTTTGCCAAATTCAC GCCAGTGTGTGAAGGTAATGAGCTTGCCAAGTGCGAACATCAGTCCTTGATCAATG CTTATGACAATGCCTTGCTTGCCACCGATGATTTCATCGCTCAAAGTATCCAGTGG CTGCAGACGCACAGCAATGCCTATGATGTCTCAATGCTGTATGTCAGCGATCATGG CGAAAGTCTGGGTGAGAACGGTGTCTATCTACATGGTATGCCAAATGCCTTTGCAC CAAAAGAACAGCGCAGTGTGCCTGCATTTTTCTGGACGGATAAGCAAACTGGCATC ACGCCAATGGCAACCGATACCGTCCTGACCCATGACGCGATCACGCCGACATTAT TAAAGCTGTTTGATGTCACCGCGGACAAAGTCAAAGACCGCACCGCATTCATCCG CTGA y ATGACATCACATCACTCTTGGTATCGCTATTCTATCAATCCTTTTGTGCTGATGGGT TTGGTGGCGTTATTTTTGGCAGCGACAGCGAACCTGACATTTTTTGAAAAAGCGAT GGCGGTCTATCCTGTATCGGATAACTTAGGCTTTATCATCTCAATGGCGGTGGCGG TGATGGGTGCTATGCTACTGATTGTCGTGCTGTTATCCTATCGCTATGTGCTAAAG CCTGTCCTGATTTTGCTACTGATTATGGGTGCGGTGACGAGCTATTTTACCGATAC TTATGGCACGGTCTATGACACCACCATGCTCCAAAATGCCATGCAAACCGACCAAG CCGAGTCTAAGGACTTGATGAATTTGGCGTTTTTTGTGCGAATTATCGGGCTTGGC GTGTTGCCAAGTGTGTTGGTCGCAGTTGCCAAAGTCAATTATCCAACATGGGGCAA AGGTCTGATTCAGCGTGCGATGACATGGGGTGTCAGCCTTGTGCTGTTGCTTGTG CCGATTGGACTATTTAGCAGTCAGTATGCGAGTTTCTTTCGGGTGCATAAGCCAGT GCGTTTTTATATCAACCCGATTACGCCGATTTATTCGGTGGGTAAGCTTGCCAGTAT CGAGTACAAAAAAGCCACTGCGCCAACAGACACCATCTATCATGCCAAAGACGCC GTGCAGACCACCAAGCCGAGCGAGCGTAAGCCACGCCTAGTGGTGTTCGTCGTC GGTGAGACGGCGCGTGCTGACCATGTGCAGTTCAATGGCTATGGCCGTGAGACTT TCCCGCAGCTTGCCAAAGTTGATGGCTTGGCGAATTTTAGCCAAGTGACATCGTGT GGCACATCGACGGCGTATTCTGTGCCGTGTATGTTCAGCTATTTGGGTCAAGATGA CTATGATGTCGATACCGCCAAATACCAAGAAAATGTGCTAGATACGCTTGACCGCT TGGGTGTGGGTATCTTGTGGCGTGATAATAATTCAGACTCAAAAGGCGTGATGGAT AAGCTACCTGCCACGCAGTATTTTGATTATAAATCAGCAACCAACAATACCATCTGT AACACCAATCCCTATAACGAATGCCGTGATGTCGGTATGCTTGTCGGGCTAGATGA CTATGTCAGCGCCAATAATGGCAAAGATATGCTCATCATGCTACACCAAATGGGCA ATCATGGGCCGGCGTACTTTAAGCGTTATGATGAGCAATTTGCCAAATTCACCCCC GTGTGCGAAGGCAACGAGCTTGCCAAATGCGAACACCAATCACTCATCAATGCCT ATGACAATGCGCTACTTGCGACTGATGATTTTATCGCCAAAAGCATCGATTGGCTA AAAACGCATGAAGCGAACTACGATGTCGCCATGCTCTATGTCAGTGACCACGGCG AGAGCTTGGGCGAAAATGGTGTCTATCTGCATGGTATGCCAAATGCCTTTGCACCA AAAGAACAGCGAGCTGTGCCTGCGTTTTTTTGGTCAAATAATACGACATTCAAGCC AACTGCCAGCGATACTGTGCTGACGCATGATGCGATTACGCCAACACTGCTTAAG CTGTTTGATGTCACAGCGGGCAAGGTCAAAGACCGCGCGGCATTTATCCAGTAA. La mezcla de control de ADN puede incluir la siguiente secuencia de control interno: GAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCG. Una mezcla de control de ADN puede incluir una combinación de uno o más de dichos grupos de secuencias y dicha secuencia de control interno. [SEQ. ID NO. 290-292]
[0112] En un ejemplo, el kit incluye un vial de mezcla multiplex de cebador-sonda que incluye el control interno y un vial de mezcla de control de ADN. Una mezcla de cebador-sonda puede incluir secuencias para detectar las familias de genes similares a TEM y similares a SHV y el control interno.
[0113] La mezcla de cebador-sonda puede incluir cebadores y/o sondas seleccionadas del grupo que consiste en: AGATCAGTTGGGTGCACG, TGCTTAATCAGTGAGGCACC, /56-FAM/ATGAAGCCA/ZEN/TACCAAACGACGAGC/3IABkFQ/, CTGGAGCGAAAGATCCACTA, ATCGTCCACCATCCACTG y /5HEX/CCAGATCGG/ZEN/CGACAACGTCACC/3IABkFQ/. La mezcla de cebadorsonda puede incluir uno o más controles internos seleccionados del grupo que consiste en: GAGAGGATGAYCAGCCACAC, CGCCCATTGTSCAATATTCC y 5TYE665/TGAGACACGGTCCAGACTCCTACG/3IAbRQSp. La mezcla de cebador-sonda puede incluir una combinación de uno o más de dichos grupos de cebadores y/o sondas y de uno o más de dichos grupos de controles internos. La mezcla de cebador-sonda, incluidos los controles internos, puede ser una mezcla multiplex. [SEQ. ID NO.
240-248]
[0114] Una mezcla de control de ADN puede incluir una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en: AGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAG ATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTT CTGCTATGTGGTGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTC GCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAG CATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAG TGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTA ACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACC GGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGACGCCTGCAGC AATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCC GGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCG CTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCAGTGAGCGT GGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCG TAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATC GCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCA y CTGGAGCGAAAGATCCACTATCGCCAGCAGGATCTGGTGGACTACTCGCCGGTCA GCGAAAAACACCTTGCCGACGGCATGACGGTCGGCGAACTCTGCGCCGCCGCCA TTACCATGAGCGATAACAGCGCCGCCAATCTGCTGCTGGCCACCGTCGGCGGCC CCGCAGGATTGACTGCCTTTTTGCGCCAGATCGGCGACAACGTCACCCGCCTTGA CCGCTGGGAAACGGAACTGAATGAGGCGCTTCCCGGCGACGCCCGCGACACCAC TACCCCGGCCAGCATGGCCGCGACCCTGCGCAAGCTGCTGACCAGCCAGCGTCT GAGCGCCCGTTCGCAACGGCAGCTGCTGCAGTGGATGGTGGACGAT. La mezcla de control de ADN puede incluir la siguiente secuencia de control interno: GAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCG. Una mezcla de control de ADN puede incluir una combinación de uno o más de dichos grupos de secuencias y dicha secuencia de control interno. [SEQ. ID NO. 293-295]
[0115] La mezcla multiplex de cebador-sonda puede comprender diferentes secuencias de oligonucleótidos. Se puede utilizar una secuencia de oligonucleótidos como cebador. Se puede utilizar una secuencia de oligonucleótidos como sonda. Se puede utilizar una secuencia de oligonucleótidos como secuencia de control interno. La concentración de oligonucleótidos de una secuencia de cebadores y/o sondas puede variar entre 0,05 pM y 60 pM. Por ejemplo, la concentración de oligonucleótidos de una secuencia de cebadores y/o sondas puede variar entre 3 pM y 8 pM. Por ejemplo, la concentración de oligonucleótidos de una secuencia de control interno puede variar entre 2 pM y 6 pM. Por ejemplo, la concentración de oligonucleótidos de una secuencia de control interno puede variar entre 2 pM y 8 pM. Las concentraciones de oligonucleótidos del vial pueden prepararse como una solución madre 10X.
[0116] El tamaño del gen sintético de una secuencia de control de ADN puede ser de aproximadamente 84 pb a aproximadamente 533 pb. La concentración de una secuencia de control de ADN puede ser de aproximadamente 25 ng/pl. La concentración de una secuencia de control de ADN puede ser de 0,033 ng/pl a aproximadamente 0,5 ng/pl.
[0117] Las presentes enseñanzas facilitan métodos para la detección de familias de genes de p-lactamasas a partir de una muestra biológica. Preferiblemente, la muestra incluye bacterias gramnegativas. El método puede incluir el procesamiento de la muestra. El método puede incluir la extracción de ADN de la muestra. El método puede incluir la extracción de ARN de la muestra. El método puede incluir el uso de ensayos de las presentes enseñanzas. Los ensayos pueden estar incluidos en un kit o kits. El método puede incluir el empleo del kit de las presentes enseñanzas para la detección de múltiples familias de genes de p-lactamasas de una muestra biológica.
[0118] El método puede incluir el empleo del kit para el análisis del ácido nucleico contenido en una muestra clínica. El método puede incluir el empleo del kit para el análisis del ADN extraído de una muestra clínica. El método puede incluir el empleo del kit para el análisis del ADN extraído de un cultivo bacteriano de una noche de una muestra clínica.
[0119] El método puede incluir la amplificación de una secuencia de ADN diana mediante una reacción de polimerasa en tiempo real. El método puede incluir la amplificación de varias secuencias de ADN diana mediante una reacción de polimerasa múltiple en tiempo real. El método puede incluir el análisis de las secuencias amplificadas o amplicones. El método puede incluir la detección de la presencia o ausencia de genes de p-lactamasas. El método puede incluir la detección de la presencia o ausencia de genes de p-lactamasas ampC. El método puede incluir la identificación de hasta seis familias de genes de p-lactamasas. El método puede incluir la identificación de hasta nueve familias de genes de p-lactamasas. El método puede incluir la identificación de hasta quince familias de genes de p-lactamasas. El método puede incluir la identificación de hasta veinte familias de genes de p-lactamasas. El método puede incluir la identificación de aproximadamente seis a aproximadamente treinta familias de genes de p-lactamasas. El método puede incluir el análisis de los datos recogidos.
[0120] En las figuras 1 a 9 se muestran ejemplos de curvas de amplificación de PCR en tiempo real obtenidas en el sistema ABI QS7 Flex-Real-Time para algunas de las mezclas multiplex descritas en el presente documento. La FIG.
1 representa un gráfico de amplificación de una mezcla ilustrativa 1 que incluye dianas genéticas de ampC. La FIG. 2 representa un gráfico de amplificación de una mezcla ilustrativa 2 que incluye dianas genéticas de ampC. La FIG. 3 representa un gráfico de amplificación de una mezcla ilustrativa 1 que incluye dianas genéticas de p-lactamasa. La FIG. 4 representa un gráfico de amplificación de una mezcla ilustrativa 2 que incluye dianas genéticas de p-lactamasa. La FIG. 5 representa un gráfico de amplificación de una mezcla ilustrativa 3 que incluye dianas genéticas de plactamasa. La FIG. 6 representa un gráfico de amplificación de una mezcla de control interno ilustrativa que incluye dianas genéticas de MCR. La FIG. 7 representa un gráfico de amplificación de una mezcla ilustrativa 1 que incluye dianas genéticas de OXA. La FIG. 8 representa un gráfico de amplificación de una mezcla ilustrativa 2 que incluye dianas genéticas de OXA. La FIG. 9 representa un gráfico de amplificación de una mezcla de control interno ilustrativa que incluye dianas genéticas de SHV-TEM.
[0121] El método puede incluir el uso de uno o más cebadores oligonucleótidos que son complementarios a al menos una parte de la secuencia de ácido nucleico de interés. El método puede incluir la hibridación de varios pares de cebadores con diferentes secuencias de ADN diana. El método puede incluir la hibridación de secuencias de cebador/sonda con secuencias de ácido nucleico bacterianas que comprenden variantes de la familia de genes resistentes a los antibióticos abordados de las p-lactamasas. Las secuencias de cebador y/o sonda se pueden hibridar con una especificidad del 100 % con las variantes del gen diana. Las secuencias de cebador y/o sonda se pueden hibridar con una especificidad de aproximadamente el 95 % con las variantes del gen diana. Las secuencias de cebador y/o sonda se pueden hibridar con una especificidad de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 100 % con las variantes del gen diana. Las secuencias de cebador y/o sonda se pueden hibridar con una especificidad de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 100 % con las variantes del gen diana.
[0122] El método puede incluir el uso de ADN polimerasa mediada por temperatura. El método puede incluir el uso de colorantes fluorescentes. El método puede incluir el uso de sondas de ADN específicas de la secuencia, incluyendo oligonucleótidos marcados con un indicador. El método puede incluir el uso de una micromatriz.
[0123] El método puede incluir el uso de un termociclador. Por ejemplo, el kit de las presentes enseñanzas puede utilizarse con los siguientes sistemas de PCR: Sistema de PCR Streck ZULU r T™, sistema de tiempo real QuantStudio 7 (QS7) Flex de Applied Biosystems (ABI), sistema de PCR en tiempo real ABI 7500, sistema de detección de PCR en tiempo real QIAg En Rotor-Gene® Q y CFX96 Touch™, instrumento de PCR en tiempo real de Applied Biosystems™ 7500 Fast Dx, Roche LightCycler®480 I y II y Cepheid SmartCycler®. Se contempla que cualquier sistema de detección capaz de detectar la señal fluorescente multiplex proporcionada en el kit de las presentes enseñanzas puede ser adecuado.
[0124] El método puede incluir la monitorización en tiempo real de los productos de la reacción qPCR. Las sondas pueden generar una señal cuando son hidrolizadas por la ADN polimerasa, lo que provoca la liberación de una señal fluorescente detectable. El método de seguimiento en tiempo real puede emplear la fluorescencia a diferentes longitudes de onda. El método puede incluir el uso de colorantes fluorescentes de intercalación de ADN. El método puede incluir el uso de una sonda nucleotídica específica de diana marcada con un marcador fluorescente en un extremo. El otro extremo de la sonda de hibridación puede estar marcado con un inactivador fluorescente. Las sondas de hibridación fluorescentes generan una señal de fluorescencia solo cuando se unen a su diana y permiten el seguimiento en tiempo real de los ensayos de amplificación de ácidos nucleicos.
[0125] Sorprendentemente, algunas dianas de ADN detectadas con estos kits permiten la amplificación de regiones de a Dn mucho más grandes que en el conocimiento convencional dentro del campo de la p Cr en tiempo real. Por ejemplo, la mayoría de los amplicones tienen tradicionalmente un tamaño de entre 50 y 150 pares de bases. Las presentes enseñanzas permiten amplificar con éxito amplicones de hasta 553 pares de bases por PCR en tiempo real.
[0126] Puede haber uno o más beneficios en la detección de amplicones más grandes. Los amplicones más grandes pueden, en algunos casos, proporcionar una mayor especificidad para una familia de genes de resistencia a antibióticos específica. La detección de amplicones más grandes puede permitir la detección de un mayor número de variantes genéticas dentro de una determinada familia de genes de resistencia. La detección de amplicones más grandes también puede permitir la confirmación mediante electroforesis en gel de agarosa, ya que los tamaños moleculares de cada gen detectado pueden separarse unos de otros.
[0127] La eficiencia de detección para cada diana en una serie de dilución puede medirse para amplicones entre 25 pares de bases y 2000 pares de bases. La eficiencia de la PCR para amplicones dentro de este intervalo de tamaño puede ser del 80 % al 110 %. Más concretamente, la eficacia de las reacciones puede ser del 90 % al 105%. El coeficiente de determinación puede ser de 0,98 a 1,1. Más concretamente, el coeficiente de determinación puede ser de 0,99 a 1,0. El límite de detección puede ser de 0,1 copias a 1 * 1010 copias.
[0128] Las secuencias alternativas para cebadores, sondas y controles de ADN para las dianas genéticas de plactamasas de las presentes enseñanzas se representan en la Tabla 2 y la Tabla 3. [SEQ. ID NO. 1-48 y SEQ. ID NO.
49-66]
[0129] Los cebadores y/o las sondas pueden estar degenerados en cualquier posición nucleotídica. Los cebadores y/o las sondas pueden no estar degenerados en ninguna posición nucleotídica. Puede utilizarse cualquier combinación adecuada de fluoróforo y/o inactivador y secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, una sonda puede estar marcada con un marcador fluorescente en un extremo y un inactivador fluorescente en el otro. Por ejemplo, una sonda puede estar marcada con un marcador fluorescente en un extremo y un inactivador fluorescente en el otro. Por ejemplo, se pueden incluir dos inactivadores fluorescentes en un extremo o dentro de la secuencia de la sonda. Se contempla que las secuencias de sonda de las presentes enseñanzas pueden ser marcadas con cualquier combinación adecuada de fluoróforo e inactivador. Por ejemplo, cualquier fluoróforo de las presentes enseñanzas puede unirse a cualquier secuencia de ADN de sonda de las presentes enseñanzas.
Tabla 2
Tabla 3
[0130] El listado de secuencias que incluye las SEQ ID NO. 1-295 se incorpora de este modo por referencia a todos los efectos.
[0131] A menos que se indique otra cosa, cualquiera de los valores numéricos enumerados en el presente documento incluye todos los valores desde el valor inferior hasta el valor superior en incrementos de una unidad, a condición de que exista una separación de al menos 2 unidades entre cualquier valor inferior y cualquier valor superior. Como ejemplo, si se indica que la cantidad de un componente, una propiedad o un valor de un proceso variable, tal como, por ejemplo, temperatura, presión, tiempo y similares es, por ejemplo, de 1 a 90, preferiblemente de 20 a 80, más preferiblemente de 30 a 70, se pretende que estén expresamente enumerados valores de intervalo intermedios (tales como por ejemplo de 15 a 85, de 22 a 68, de 43 a 51, de 30 a 32, etc.) en las enseñanzas de presente memoria descriptiva. Asimismo, los valores intermedios individuales también están dentro de las presentes enseñanzas. Para valores que son inferiores a uno se considera que una unidad es 0,0001,0,001,0,01 o 0,1 según sea adecuado. Estos son solo ejemplos de lo que se pretende específicamente y todas las posibles combinaciones de valores numéricos entre el valor inferior y el valor superior enumerados deben considerarse que están expresamente indicadas en la presente solicitud de una manera similar. Como puede verse, la enseñanza de las cantidades expresadas como "partes en peso" en este documento también contempla los mismos intervalos expresados en términos de porcentaje en peso. Así, una expresión en un intervalo en términos de "al menos 'x' partes en peso de la composición resultante" también contempla una enseñanza de intervalos de la misma cantidad indicada de "x" en porcentaje en peso de la composición resultante".
[0132] A menos que se indique otra cosa, todos los intervalos incluyen tanto los puntos finales como todos los números entre los puntos finales. El uso de "aproximado" o "aproximadamente" junto con un intervalo se aplica a ambos extremos del intervalo. Por tanto, "aproximadamente de 20 a 30" pretende cubrir "de aproximadamente 20 a aproximadamente 30", incluidos al menos los puntos finales especificados.
[0133] La expresión "que consiste esencialmente en" para describir una combinación incluirá los elementos, ingredientes, componentes o etapas identificadas, y otros elementos, ingredientes, componentes o etapas que no afecten materialmente a las características básicas y novedosas de la combinación. El uso de las expresiones "que comprende" o "que incluye" para describir combinaciones de elementos, ingredientes, componentes o etapas en el presente documento también contempla realizaciones que consisten en o que consisten esencialmente en los elementos, ingredientes, componentes o etapas.
[0134] Se pueden proporcionar varios elementos, ingredientes, componentes o etapas mediante un solo elemento
Claims (10)
1. Kit para la identificación por PCR en tiempo real de uno o más genes asociados con la resistencia a los antibióticos, en el que el uno o más genes se seleccionan del grupo que consiste en: genes CMY-2, DHA, MOX, ACC, FOX y ACT/MIR, y en donde el kit comprende:
una primera mezcla de cebadores y sondas que comprende los siguientes cebadores y sondas capaces de amplificar los genes MOX, ACC y FOX: GCTGCTCAAGGAGCACAGGAT, CACATTGACATAGGTGTGGTGC, 56-FAM/AGGATGGCA/ZEN/AGGCCCACTATTTCA/3IABkFQ, AACAGCCTCAGCAGCCGGTTA, TTCGCCGCAATCATCCCTAGC, 5HEX/AGCCATTAC/ZEN/GTTCCAGAGTTGCGT/3IABkFQ, GCCGAGGCTTACGGGATCAAG, CAAAGCGCGTAACCGGATTGG, 5TEX615/TCTGCTGAAGTTTRYCGAGGCMAA/3IAbRQSp, GAGAGGATGAYCAGCCACAC, CGCCCATTGTSCAATATTCC y 5TYE665/TGAGACACGGTCCAGACTCCTACG/3IAbRQSp [SEQ. ID NO. 192-203]; y
una segunda mezcla de cebadores y sondas que comprende los siguientes cebadores y sondas capaces de amplificar los genes DHA, ACT/MIR y CMY-2: AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT, CCGTACGCATACTGGCTTTGC, 56-FAM/AAACCGGGC/ZEN/GATATGCGTCTGTAT/3IABkFQ, CTGGGTTCTATAAGTAAAACCTTCACCGG, CTTCCACTGCGGCTGCCAGTT, 5HEX/GATGCCATT/ZEN/GCYCGSGGTGAAAT/3IABkFQ, CCGAAGCCTATGGCGTGAAATCC, GCAATGCCCTGCTGGAGCG, 5TEX615/ATGTTGGCCTGAACCCAGCG/3IAbRQSp, GAGAGGATGAYCAGCCACAC, CGCCCATTGTSCAATATTCC y 5TYE665/TGAGACACGGTCCAGACTCCTACG/3IAbRQSp [SEQ. ID NO. 204-215].
2. Kit de la reivindicación 1, que comprende un control interno endógeno para discriminar las muestras de falsos negativos de las muestras de verdaderos negativos que se deben a una o más de la inhibición de la PCR, la degradación del ADN y/o una mala extracción, preferiblemente en el que el control interno endógeno se dirige a una secuencia o secuencias de nucleótidos conservadas comunes a un genoma de bacterias gramnegativas.
3. Kit de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende al menos una mezcla de ADN de control.
4. Kit de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende exactamente dos mezclas de ADN de control.
5. Kit de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende exactamente tres mezclas de ADN de control.
6. Kit de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además una composición que contiene un colorante de seguimiento.
7. Método para identificar uno o más genes de p-lactamasa seleccionados del grupo que consiste en CMY, DHA, MOX, ACC, FOX y ACT/MIR por PCR en tiempo real, comprendiendo el método ensayar una muestra biológica utilizando el kit de cualquiera de las reivindicaciones precedentes para identificar el uno o más genes de p-lactamasa.
8. Método de la reivindicación 7, en el que se detectan de 0,1 copias a 10.000.000.000 copias de la secuencia de ADN diana.
9. Método de la reivindicación 7 u 8, en el que la muestra biológica es una muestra clínica de sangre, plasma, orina o heces, o de muestras de recto, nariz, garganta, piel, heridas o líquido cefalorraquídeo.
10. Método de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que el método detecta amplicones de reacción en cadena de la polimerasa de ácido nucleico que varían de 25 pares de bases a 2000 pares de bases.
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