CN114107534A - 用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的lamp引物组及应用 - Google Patents

用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的lamp引物组及应用 Download PDF

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CN114107534A CN202210098660.2A CN202210098660A CN114107534A CN 114107534 A CN114107534 A CN 114107534A CN 202210098660 A CN202210098660 A CN 202210098660A CN 114107534 A CN114107534 A CN 114107534A
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Abstract

本发明公开用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的LAMP引物组及应用，LAMP引物组包括两条外引物，两条内引物和两条环引物，序列如SEQ ID NO.1‑6所示。本发明所设计的LAMP引物组能够用于扩增68种KPC亚型，可检测范围广泛，最低检测限可达到10 CFU/μL；能够用于肺炎克雷伯菌等革兰氏阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的鉴定，具有灵敏度高、特异性强，操作简单便捷等优点。

Description

用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的LAMP引物组及 应用
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，尤其是涉及一种用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的LAMP引物组及应用。
背景技术
碳青霉烯类抗生素是用来对抗产超广谱β-内酰胺酶 (Extended-Spectrum β-Lactamases，ESBLs)细菌的有效抗菌剂，ESBL感染的高频发生使得碳青霉烯抗生素的广泛使用，而这又引起碳青霉烯酶耐药肠杆菌(CRE)的流行率迅速增加，目前已对公众健康造成严重威胁。对碳青霉烯类的耐药性涉及多种分子机制，包括由外膜蛋白丢失导致渗透性的改变、外排泵系统表达上调或AmpC等一类β-内酰胺酶的过表达等。而碳青霉烯酶的产生耐药性的主要机制。目前，肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶2型(KPC-2)是临床上最主要的丝氨酸碳青霉烯酶，占所有产碳青霉烯酶分离株的70%，其在国际上的迅速传播已成为严重的公共健康威胁。KPC最早在20世纪90年代末美国一个肺炎克雷伯菌分离株中发现，目前已经在众多革兰氏阴性菌中都发现了KPC酶基因，包括肠杆菌科和非发酵菌（如铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌）。到目前为止，在NCBI上可查询到73种不同的KPC变体。
实验室检测碳青霉烯酶的方法主要包括表型试验（如改良Hodge试验、Carba NP试验、改良碳青霉烯灭活试验等）和分子生物学方法（如PCR，qPCR）。但这些方法或操作过程繁琐、周期长或需要特殊仪器设备。日本学者Notomi于2000年发明的环介导等温扩增方法（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）可以利用Bst酶和多对引物在60-65℃的恒温条件下实现核酸扩增。从2000年开始，由日本荣研化学研发建立的用于基因诊断的恒温核酸扩增技术。环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）主要是针对靶基因不同的六个区域，设计6条引物（两条外引物、两条内引物和两条环引物），一般在恒温条件40min以内，完成核酸扩增反应，因为其成本低、操作便捷、时间短、灵敏度高等优点，目前已被广泛地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病以及体外诊断中去。本发明针对碳青霉烯酶基因（Klebsiella pneumoniae carbapenemase, KPC）的保守区设计特异的LAMP引物，以便能更敏感特异的检测出相应的基因片段。
近年来已经有多项专利提出了利用LAMP法检测KPC基因，申请号201310545991.7公布了可识别14个KPC亚型的引物组，申请号 201911087644 .8同样提出了一组引物用于扩增11个亚型的KPC基因。但是，其能够扩增的KPC基因亚型数量还是较少。
环介导等温扩增技术是一种近年来发展较快的核酸恒温扩增技术，它能够在恒定温度下对靶基因序列进行扩增，进而实现目的基因的快速检测，目前，LAMP结果的读取主要分为浊度检测、琼脂糖凝胶电泳检测和荧光/可视化染料检测等3类方法。但由于浊度检测和电泳检测都依赖于仪器并需要较复杂操作，因而可视化染料检测方法越来越受到专家学者的青睐。该方法只需在LAMP反应开始前于反应体系中加入染料，反应后，阴性反应试剂和阳性反应试剂即会呈现出明显的颜色差异，从而实现反应结果的快速判读。
现有的显色剂存在一个极大的弊端，就是阴性和阳性结果之间颜色差异不够明显，或者需要仪器辅助判读结果，过程复杂。尤其是在自然光下，当目标基因浓度过低时，弱阳性结果与阴性结果难以区分，从而导致结果判读不准确。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的LAMP引物组及应用。
本发明采用的技术方案是：用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的LAMP引物组，其特征在于：包括两条外引物，两条内引物和两条环引物；
外引物F3序列如SEQ ID NO.1所示，外引物B3序列如SEQ ID NO.2所示；
SEQ ID NO.1 F3： TCGAACAGGACTTTGGCG
SEQ ID NO.2 B3： AACCAGCGCATTTTTGCC
内引物FIP序列如SEQ ID NO.3所示，内引物BIP序列如SEQ ID NO.4所示；
SEQ ID NO.3 FIP： CCTCAGCGCGGTAACTTACAGTTTTTCTCCATCGGTGTGTACGC
SEQ ID NO.4 BIP： TCAAGGGCTTTCTTGCTGCCGTTTTACGGATGGGTGTGTCCAG
环引物LoopF序列如SEQ ID NO.5所示，环引物LoopB序列如SEQ ID NO.6所示；
SEQ ID NO.5 LoopF： GCCTGAGCCGGTATCCAT
SEQ ID NO.6 LoopB：CCAGCAGCAGGCCGGCTT
用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的试剂盒，包括LAMP引物组。
优选地，还包括指示剂，指示剂为荧光指示剂或混合染料显色剂。
优选地，荧光指示剂为SYBR Green i或Calcein；
或者，混合染料显色剂为钙黄绿素染料和羟基萘酚蓝染料的混合物。
优选地，混合染料显色剂包括试剂A和试剂B，试剂A和试剂B体积比为1:1-2；
试剂A中含有钙黄绿素和氯化锰，钙黄绿素的浓度为500μM，氯化锰浓度为10mM；
试剂B中含有羟基萘酚蓝，羟基萘酚蓝浓度为0.32mM。
优选地，还包括缓冲液、DNA Bst聚合酶、阳性对照和阴性对照。
优选地，缓冲液为10×反应缓冲液，包括：200mM Tris-HCl，100mM (NH4)2SO4，600mM KCl，25mM MgSO4和1%Tween 20。
优选地，阳性对照为KPC基因阳性的DNA模板，序列如SEQ ID NO.7所示；阴性对照为灭菌双蒸水；
SEQ ID NO.7
CTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTAAACTCGAACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCGCAACTGTAAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTCTTGCTGCCGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCCGTTACGGCAAAAATGCGCTGGTT
用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的LAMP引物组或用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的试剂盒在检测革兰氏阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因中的应用。
优选地，检测肺炎克雷伯菌中碳青霉烯酶基因。
优选地，指示剂为荧光指示剂，荧光定量PCR后通过荧光曲线形状判定待测样品中是否含有碳青霉烯酶基因。
优选地，若荧光指示剂为SYBR Green i，当荧光曲线出现S型曲线，则判断待测样品中含有碳青霉烯酶基因；
或者，若荧光指示剂为Calcein，当荧光曲线出现V型曲线，则判断待测样品中含有碳青霉烯酶基因。
优选地，指示剂为混合染料显色剂，比对LAMP扩增反应前后反应体系颜色，判断待测样本中是否含有碳青霉烯酶基因。
优选地，LAMP扩增前，反应体系呈灰蓝色；
LAMP扩增结束后，阳性反应液为天蓝色，阴性反应也为紫罗兰色。
优选地，反应体系至于透明载体中，反应结束后直接通过载体透明外壁观测体系颜色。
本发明具有的优点和积极效果是：本方案所设计的LAMP引物组能够用于扩增68种KPC亚型，检测范围较宽，检测灵敏，最低检测限可达到10 CFU/μL；能够用于肺炎克雷伯菌等革兰氏阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的鉴定，具有灵敏度高、特异性强，操作简单便捷等优点；
LAMP引物具有高度特异性，KPC基因的检测需要6个区域的引物均匹配，方可进行扩增，保证了检测结果的可靠性，并能够快速准确用于肺炎克雷伯菌等革兰氏阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的鉴定，对于及时发现并进一步控制碳青霉烯酶基因在肠杆菌科细菌中传播导致的暴发流行具有重要的临床意义；
采用了可视化混合染料呈现阴性阳性结果，灵敏度高、特异性强，不需要特殊仪器辅助判断实验结果，操作简单便捷，结果直观；可视化混合染料检测限可达到100 CFU/反应。
附图说明
图1是本发明实施例1不同浓度菌数量与SYBR Green i荧光曲线关系图；
图2是本发明实施例1扩增结果核酸电泳图；
图3是本发明实施例2不同浓度菌数量与Calcein荧光曲线关系图；
图4是本发明实施例2扩增结果核酸电泳图；
图5是本发明实施例3 LAMP扩增前新型混合染料显色；
图6是本发明实施例3 LAMP扩增后新型混合染料显色；
图7是本发明实施例3核酸电泳图；
图8是本发明实施例4 LAMP扩增前新型混合染料显色；
图9是本发明实施例4 LAMP扩增后新型混合染料显色；
图中：1：106 CFU /μL，2：105 CFU /μL，3：104 CFU /μL，4：103 CFU /μL，5：102 CFU/μL，6：101 CFU /μL，7：1 CFU /μL，NTC：0 CFU /μL；
一号：1号菌株DNA；二号：2号菌株DNA；三号：3号菌株DNA。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例做出说明。
本发明提出了一个KPC基因扩增引物组，具体为用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的LAMP引物组，可以覆盖目前已知的68种KPC亚型。根据对KPC基因的各种亚型进行同源序列比对，选取234bp保守核酸片段为特征靶序列，序列如SEQ ID NO.7所示。针对这段序列设计引物（F3-KPC、B3-KPC、FIP-KPC、BIP-KPC、LF-KPC、LB-KPC）；其中，所有的引物及含有KPC特征核酸序列的DNA质粒模板均由苏州金唯智生物科技有限公司代为合成。
该LAMP引物包括两条外引物，两条内引物和两条环引物。
外引物F3序列如SEQ ID NO.1所示，外引物B3序列如SEQ ID NO.2所示；
SEQ ID NO.1 F3： TCGAACAGGACTTTGGCG
SEQ ID NO.2 B3： AACCAGCGCATTTTTGCC
内引物FIP序列如SEQ ID NO.3所示，内引物BIP序列如SEQ ID NO.4所示；
SEQ ID NO.3 FIP： CCTCAGCGCGGTAACTTACAGTTTTTCTCCATCGGTGTGTACGC
SEQ ID NO.4 BIP： TCAAGGGCTTTCTTGCTGCCGTTTTACGGATGGGTGTGTCCAG
环引物LoopF序列如SEQ ID NO.5所示，环引物LoopB序列如SEQ ID NO.6所示；
SEQ ID NO.5 LoopF： GCCTGAGCCGGTATCCAT
SEQ ID NO.6 LoopB：CCAGCAGCAGGCCGGCTT
检测肺炎克雷伯菌等革兰氏阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的荧光LAMP方法，具体操作步骤包括：以肺炎克雷伯菌DNA为模板，以碳青霉烯酶（KPC）基因构建的重组质粒为阳性对照，以无菌水为阴性对照，用上述引物对其进行LAMP扩增，采集荧光信号；若待测样本与阳性对照标准品能扩增出特征荧光信号，而阴性对照扩增不出信号，则表明待测样本含有碳青霉烯酶（KPC）基因，若待测样本和阴性对照扩增不出荧光信号，而阳性标准品能扩增出荧光信号，则表明待测样本不含有碳青霉烯酶（KPC）基因。
根据上述引物，可制作一种用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的试剂盒，包括序列如SEQ ID NO.1-6所示的LAMP引物组、缓冲液、DNA Bst聚合酶、指示剂、阳性对照和阴性对照。其中，指示剂为荧光指示剂或混合染料显色剂。
其中，缓冲液为10×反应缓冲液，包括：200mM Tris-HCl，100mM (NH4)2SO4，600mMKCl，25mM MgSO4，1%Tween 20；阳性对照为KPC基因阳性的DNA模板；阴性对照为灭菌双蒸水；荧光指示剂为SYBR Green i或Calcein。
荧光定量PCR后通过荧光曲线形状判定待测样品中是否含有碳青霉烯酶基因。在本发明某些实施例中，荧光指示剂为SYBR Green i，当荧光曲线出现S型曲线，则判断待测样品检测结果为阳性，待测样本中含有碳青霉烯酶基因；如无S型曲线，则判定为阴性，待测样本中不含碳青霉烯酶基因。
荧光指示剂还可以为Calcein；现有技术中，通常采用肉眼观测体系颜色变化，实现对检测结果阴性和阳性的判定，但是由于其颜色变化并不十分明显，尤其样本DNA含量较低时，更是难以通过颜色变化准确判断。本发明某些实施例中，当荧光指示剂为Calcein时，检测其荧光曲线，如果待测样本中含有碳青霉烯酶基因，其荧光曲线会出现V型特征曲线，且随着样本DNA数目的降低，V型荧光曲线的“峰谷”时间逐渐增加；因此，只需要观察其荧光曲线形状就能够准确判定待测样本中是否含有碳青霉烯酶基因，实验发现，其最低检测限可达到10 CFU/μL。
本发明某些实施例中，指示剂可以为混合染料显色剂，使用混合染料显色剂后可通过观察体系颜色变化直观的进行判断，混合染料显色剂具有可视性，只需要通过颜色变化对样本扩增结果的阴性和阳性做出判断。
可视化混合染料显色剂，包括试剂A和试剂B，试剂A和试剂B体积比为1:1-2；试剂A中含有钙黄绿素和氯化锰，用去核酸酶水溶解，钙黄绿素的浓度为500μM，氯化锰浓度为10mM；试剂B中含有羟基萘酚蓝，用去核酸酶水溶解，羟基萘酚蓝浓度为0.32mM。这种可视化混合染料显色剂能够应用在LAMP检测中，在LAMP反应前预先加入到LAMP反应体系中，反应结束后，可根据体系颜色直接判断结果为阳性或阴性；LAMP扩增前，反应体系呈灰蓝色；LAMP扩增结束后，阳性反应体系为天蓝色，阴性反应体系为紫罗兰色。
与目前常见可视化染料相比，该可视化混合染料使LAMP反应结果更容易判断，阴性和阳性结果间颜色差异更加明显，极大程度避免了结果的判断，而且不需要复杂的仪器设备来辅助检测实验结果；另外，该可视化混合染料预先添加于LAMP反应体系中，在LAMP反应后，不必再打开PCR管盖，避免了对实验室环境造成核酸污染；该可视化混合染料显色剂为非DNA嵌入型染料，对LAMP反应干扰小，不影响LAMP检测的灵敏度与特异性。
采用试剂盒检测肺炎克雷伯菌等革兰氏阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的LAMP方法，具体操作步骤包括：将待测样品与试剂盒试剂配置LAMP反应体系，LAMP扩增前，反应体系呈灰蓝色，经过LAMP扩增反应后，观察体系颜色，如果反应体系呈天蓝色，则待测样品中含有碳青霉烯酶基因，若反应体系呈紫罗兰色，则待测样品中不含碳青霉烯酶基因。
下面结合附图对本发明方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。
实施例1：
1.1 KPC -LAMP引物组的设计
选取234bp保守核酸片段为特征靶序列，序列如SEQ ID NO.7所示；
SEQ ID NO.7
CTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTAAACTCGAACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCGCAACTGTAAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTCTTGCTGCCGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCCGTTACGGCAAAAATGCGCTGGTT
设计LAMP特异性引物如下：
F3-KPC：TCGAACAGGACTTTGGCG（SEQ ID NO.1）
B3-KPC：AACCAGCGCATTTTTGCC（SEQ ID NO.2）
FIP-KPC：CCTCAGCGCGGTAACTTACAGTTTTTCTCCATCGGTGTGTACGC（SEQ ID NO.3）
BIP-KPC：TCAAGGGCTTTCTTGCTGCCGTTTTACGGATGGGTGTGTCCAG（SEQ ID NO.4）
LF-KPC：GCCTGAGCCGGTATCCAT（SEQ ID NO.5）
LB-KPC：CCAGCAGCAGGCCGGCTT（SEQ ID NO.6）
1.2 LAMP扩增反应
用本发明的KPC-LAMP引物组对KPC基因的阳性对照菌株进行检测。分别构建如下LAMP扩增反应体系，其25μL 的反应体系如下表；
Figure 772915DEST_PATH_IMAGE001
10×的反应缓冲液：200mM Tris-HCl，100mM (NH4)2SO4，600mM KCl，25mM MgSO4，1%Tween 20；
阳性对照：KPC基因阳性的DNA模板；阴性对照：灭菌双蒸水。提取阳性菌株基因组并调节初始浓度至106CFU/μL，然后进行10倍系列梯度稀释，命名反应管为1-8号管，按照次序向1-7号管中的LAMP扩增反应体系中加入不同浓度的KPC-DNA模板，浓度依次为1×106CFU/μL，1×105CFU/μL，1×104CFU/μL，1×103CFU/μL，1×102CFU/μL，1×101CFU/μL，1×100CFU/μL；8号管为阴性对照NTC管，加入相同体积去核酸酶水。
配置好反应体系后离心混匀，将8联排PCR管置于ABI7500荧光定量PCR仪，反应温度是65℃，反应时间60 min，于每1min读取一次荧光值。
结果如图1所示，随着LAMP扩增时间增加，出现特征“S”型曲线，反应达平台期后，荧光信号强度不再增加；且随着样本DNA数目的降低，荧光曲线起峰时间逐渐增加，通过图2所示电泳图结果进行进一步验证，与荧光曲线所示结果相同。
实施例2：
采用实施例1中设计的LAMP引物，以及实施例1中检测的待测样品和对照样品，构建如下LAMP扩增反应体系，其25μL 的反应体系如下表；
Figure 221214DEST_PATH_IMAGE002
配置好反应体系后离心混匀，将8联排PCR管置于ABI7500荧光定量PCR仪，反应温度是65℃，反应时间60 min，于每1min读取一次荧光值。
由图3所示结果能够看出，随着LAMP扩增时间增加，出现V型特征曲线，且随着样本DNA数目的降低，V型荧光曲线的“峰谷”时间逐渐增加。图4为相应核酸电泳图，与荧光曲线显示了相同的判定结果。
如图1所示荧光曲线，通过曲线起峰现象对待测样本做出判断，当起峰时间较为靠后，且较为平缓时，难以说明其到底是阴性还是阳性。本实施例判定方法中，只需要观察其荧光曲线是否具有V型特征，即可判断测试结果是阴性还是阳性；判断方法更为直观，易于区分，并且其检测限更低，最低检测限可达到10 CFU/μL。
实施例3：
3.1 混合染料显色剂的制备
称取钙黄绿素粉末与氯化锰粉末置于同一容器内，用去核酸酶水溶解，使溶液中钙黄绿素浓度为500μM，氯化锰浓度为10mM，调节PH值至弱碱性，充分混匀，获得溶液为试剂A，即单一钙黄绿素储存液，4℃保存待用。
称取HNB粉末，用去核酸酶水溶解，使溶液中HNB的浓度为0.32mM，充分混匀，所得到的溶液为试剂B，即单一HNB染料储存液，4℃保存待用。
将试剂A和试剂B按照1:2体积充分混匀，获得的溶液即为新型混合染料，4℃保存待用。
3.2 LAMP扩增反应
采用实施例1中设计的LAMP引物，以及实施例1中检测的待测样品和对照样品，构建如下LAMP扩增反应体系，其25μL 的反应体系如下表；
Figure 532110DEST_PATH_IMAGE003
反应前体系如图5所示，体系呈灰蓝色，反映完成后体系如图6所示，阳性样本呈天蓝色，阴性样本呈紫罗兰色。所有结果与图7核酸电泳图结果保持一致。检测限可达到100CFU/反应。
本发明某些实施例中，不仅可使用荧光定量PCR，还可使用荧光PCR、水浴锅或金属浴，均能够达到相同目的。
实施例4：待测样本的检测
4.1 提取待检样本1号、2号和3号菌株DNA；提取三个菌株基因组并调节初始浓度至106CFU/μL，然后进行10倍系列梯度稀释，命名反应管为1-8号管，按照次序向1-7号管中的LAMP扩增反应体系中加入不同浓度的KPC-DNA模板，浓度依次为1×106CFU/μL，1×105CFU/μL，1×104CFU/μL，1×103CFU/μL，1×102CFU/μL，1×101CFU/μL，1×100CFU/μL；8号管为阴性对照NTC管，加入相同体积去核酸酶水。
4.2恒温扩增反应：配制反应体系：10×反应缓冲液2.5μL、甜菜碱5μL、DNA Bst聚合酶、引物组、混合染料显色剂1μL、样本DNA模板1μL、去核酸酶水或双蒸水补齐值25μL，同时设置阳性和阴性对照，离心混匀，将8联排PCR管置于ABI7500荧光定量PCR仪，65℃扩增反应60min。
4.3 反应结果：LAMP扩增前，3个加入待测样本的8联排PCR管反应体系呈灰蓝色，如图4；LAMP扩增结束后，一号和二号菌株基因组阳性反应液为天蓝色，阴性反应液也为紫罗兰色，三号菌株基因组阳性反应液和阴性反应液均为紫罗兰色，如图5。证明样本1号和2号带有KPC耐药基因，样本3号不含KPC耐药基因。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
序列表
<110> 天津喜诺生物医药有限公司
天津一瑞生物科技股份有限公司
一瑞（苏州）医药有限公司
<120> 用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的LAMP引物组及应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgaacagga ctttggcg 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaccagcgca tttttgcc 18
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctcagcgcg gtaacttaca gtttttctcc atcggtgtgt acgc 44
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcaagggctt tcttgctgcc gttttacgga tgggtgtgtc cag 43
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcctgagccg gtatccat 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccagcagcag gccggctt 18
<210> 7
<211> 234
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgaccaacc tcgtcgcgga accattcgct aaactcgaac aggactttgg cggctccatc 60
ggtgtgtacg cgatggatac cggctcaggc gcaactgtaa gttaccgcgc tgaggagcgc 120
ttcccactgt gcagctcatt caagggcttt cttgctgccg ctgtgctggc tcgcagccag 180
cagcaggccg gcttgctgga cacacccatc cgttacggca aaaatgcgct ggtt 234

Claims (15)

1.用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的LAMP引物组，其特征在于：包括两条外引物，两条内引物和两条环引物；
外引物F3序列如SEQ ID NO.1所示，外引物B3序列如SEQ ID NO.2所示；
内引物FIP序列如SEQ ID NO.3所示，内引物BIP序列如SEQ ID NO.4所示；
环引物LoopF序列如SEQ ID NO.5所示，环引物LoopB序列如SEQ ID NO.6所示。
2.用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的LAMP引物组。
3.根据权利要求2所述的用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的试剂盒，其特征在于：还包括指示剂，指示剂为荧光指示剂或混合染料显色剂。
4.根据权利要求3所述的用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的试剂盒，其特征在于：所述荧光指示剂为SYBR Green i或Calcein；
或者，所述混合染料显色剂为钙黄绿素染料和羟基萘酚蓝染料的混合物。
5.根据权利要求4所述的用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的试剂盒，其特征在于：混合染料显色剂包括试剂A和试剂B，试剂A和试剂B体积比为1:1-2；
试剂A中含有钙黄绿素和氯化锰，钙黄绿素的浓度为500μM，氯化锰浓度为10mM；
试剂B中含有羟基萘酚蓝，羟基萘酚蓝浓度为0.32mM。
6.根据权利要求2-5中任一所述的用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的试剂盒，其特征在于：还包括缓冲液、DNA Bst聚合酶、阳性对照和阴性对照。
7.根据权利要求6所述的用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的试剂盒，其特征在于：缓冲液为10×反应缓冲液，包括：200mM Tris-HCl，100mM (NH4)2SO4，600mM KCl，25mMMgSO4和1%Tween 20。
8.根据权利要求6所述的用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的试剂盒，其特征在于：阳性对照为KPC基因阳性的DNA模板，序列如SEQ ID NO.7所示；阴性对照为灭菌双蒸水。
9.权利要求1所述用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的LAMP引物组或权利要求2-8中任一所述的用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的试剂盒在检测革兰氏阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因中的应用。
10.根据权利要求9所述的在检测革兰氏阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因中的应用，其特征在于：检测肺炎克雷伯菌中碳青霉烯酶基因。
11.根据权利要求9所述的在检测革兰氏阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因中的应用，其特征在于：指示剂为荧光指示剂，荧光定量PCR后通过荧光曲线形状判定待测样品中是否含有碳青霉烯酶基因。
12.根据权利要求11所述的在检测革兰氏阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因中的应用，其特征在于：若荧光指示剂为SYBR Green i，当荧光曲线出现S型曲线，则判断待测样品中含有碳青霉烯酶基因；
或者，若荧光指示剂为Calcein，当荧光曲线出现V型曲线，则判断待测样品中含有碳青霉烯酶基因。
13.根据权利要求9所述的在检测革兰氏阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因中的应用，其特征在于：指示剂为混合染料显色剂，比对LAMP扩增反应前后反应体系颜色，判断待测样本中是否含有碳青霉烯酶基因。
14.根据权利要求13所述的在检测革兰氏阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因中的应用，其特征在于：LAMP扩增前，反应体系呈灰蓝色；
LAMP扩增结束后，阳性反应液为天蓝色，阴性反应也为紫罗兰色。
15.根据权利要求14所述的在检测革兰氏阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因中的应用，其特征在于：反应体系至于透明载体中，反应结束后直接通过载体透明外壁观测体系颜色。
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