CN110628926A

CN110628926A - 一种检测碳青霉烯类抗生素kpc耐药基因的环介导等温扩增引物组及检测方法

Info

Publication number: CN110628926A
Application number: CN201911087644.8A
Authority: CN
Inventors: 张国军; 张岩; 郑光辉; 李方强; 徐婷; 陈燕旌; 边素莹; 李国歌; 史一君; 钱玲烨; 吕虹; 陈柯霖; 康熙雄
Original assignee: Beijing Tiantan Hospital
Current assignee: Beijing Tiantan Hospital
Priority date: 2019-11-08
Filing date: 2019-11-08
Publication date: 2019-12-31

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因的环介导等温扩增引物组和检测方法。所述的引物组包括下述引物：外引物KPC77‑F3：SEQ ID NO:1，外引物KPC77‑B3：SEQ ID NO:2，内引物KPC77‑FIP：SEQ ID NO:3，内引物KPC77‑BIP：SEQ ID NO:4，环引物KPC77‑LF1‑2：SEQ ID NO:5，环引物KPC77‑LB1‑2：SEQ ID NO:6。该引物组的特异性强、覆盖度广、且能准确快速检测碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因的目前所发现的所有亚型。

Description

一种检测碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因的环介导等温扩增引物组及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测碳青霉烯类抗生素KPC 耐药基因的环介导等温扩增引物组和检测方法。该引物组的特异性强、覆盖度广、且能准确快速检测碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因的目前所发现的所有亚型。

背景技术

感染性疾病一直以来都对人类健康和生命构成很大的威胁，感染性疾病在治疗上对抗生素的不合理使用和滥用，使得细菌耐药率不断上升。近年来，碳青霉烯类抗生素耐药肠杆菌科细菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)的出现不断增多，该类药物的临床应用受到严峻的挑战。据上海地区和CHINET全国细菌耐药性检测结果显示，肠杆菌科细菌占所有革兰氏阴性菌的60％～70％。碳青霉烯类抗生素是抗菌谱最广，抗菌活性最强的非典型β-内酰胺抗生素，因其具有对β-内酰胺酶稳定以及毒性低等特点，已经成为治疗严重细菌感染最主要的抗菌药物之一。肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制是产生碳青霉烯酶，其中尤以KPC型 (Klebsiella pneumonia carbapenemase,KPC)碳青霉烯酶(以下简称KPC型酶) 为最常见。目前已发现的KPC型酶有11种亚型，分别为从KPC-1型酶至KPC11 型酶。KPC耐药基因是指能产生KPC型酶的基因。因此，快速、准确鉴定碳青霉烯类抗生素耐药基因KPC所有亚型对于控制医院流行病菌具有重要意义。

常见检测细菌耐药基因的方法主要有：聚合酶链式反应、PCR-限制性片段长度多态性分析、PCR-单链构象多态性分析、生物芯片技术、自动DNA 测序等。传统的基因鉴定方法为PCR法和DNA测序法，其中传统的PCR法检测周期较长，通常需要3-4个小时；SangerDNA测序法对引物特异性要求较高，且价格较昂贵，后期数据分析较复杂，不适合临床推广使用。

环介导等温核酸扩增(loop-mediated isotherm amplification，LAMP，简称环介导等温扩增)技术是Notomi T.于2000年开发等温核酸扩增方法，其原理是利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)和多对特异性引物，特异地识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件下完成核酸扩增反应。近年来，该技术已逐步应用于病原微生物的检测，如《一种检测甲型副伤寒沙门氏菌的LAMP试剂盒》(中国专利申请公布号CN 102643901 A，申请日2012 年8月22日)，但目前尚未见该方法用于碳青霉烯类抗生素耐药基因KPC所有亚型的检测，更无合适高效的引物用于该领域的环介导等温扩增检测。

发明内容

为了解决检测碳青霉烯类抗生素耐药基因KPC亚型的传统的PCR法检测周期较长的问题，本发明提供一种检测耐碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因的环介导等温扩增引物组及检测方法。发明内容涉及碳青霉烯类抗生素耐药基因KPC所有亚型的特异性引物组，和利用该引物组建立的检测方法。本发明提供的引物组的特异性好。本发明提供的检测方法检测碳青霉烯类抗生素耐药基因KPC所有亚型的速度快、灵敏度高、特异性强。

KPC耐药基因也描述为耐药基因KPC所有亚型。

本发明提供了一种检测碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因的环介导等温扩增引物组，所述引物组包括下述引物：

外引物KPC77-F3(简称F3)：5’-CTGACCAACCTCGTCGC-3(SEQ ID NO:1)，

外引物KPC77-B3(简称B3)：5’-GTGTGTCCAGCAAGCCG-3’(SEQ ID NO:2)，

内引物KPC77-FIP(简称FIP)：

5’-CGGTATCCATCGCGTACACACCAACCATTCGCTAAACTCGAACA-3’(SEQ ID NO:3)，

内引物KPC77-BIP(简称BIP)：

5’-GCTCAGGCGCAACTGTAAGCAGCAAGAAAGCCCTTGAA-3’(SEQ ID NO:4)，

环引物KPC77-LF1-2(简称LF)：5’-GATGGAGCCGCCAAAGTCC-3’ (SEQ ID NO:5)，

环引物KPC77-LB1-2(简称LB)：5’-AGGAGCGCTTCCCACTGT-3’ (SEQ ID NO:6)。

本发明的另一方面是提供一种检测碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因的环介导等温扩增检测方法，使用上述的环介导等温扩增引物组进行环介导等温扩增。

为了进一步优化上述的检测方法，本发明提供的技术方案还包括：

0.3mM的外引物F3和B3各0.12μL；2.4mM的内引物FIP和BIP各 0.96μL；1mM的环引物LF和LB各0.4μL；2×反应缓冲液10μL；2μL的模板DNA，加灭菌纯化水至20μL体系。

上述环介导等温扩增的检测反应条件为：60℃-65℃恒温50min。

优选地，上述环介导等温扩增(LAMP)检测反应条件为：65℃恒温 50min。

上述的环介导等温扩增检测方法中，检测结果通过观察实时荧光PCR 仪出峰时间。

本发明另一方面还提供一种碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因环介导等温扩增检测试剂盒，碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因的环介导等温扩增检测试剂盒中包含有上述的环介导等温扩增引物组。

进一步的，所述的碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因的环介导等温扩增检测试剂盒包括：0.3mM的外引物KPC77-F3和外引物KPC77-B3各0.12μL； 4.4mM的内引物KPC77-FIP和内引物KPC77-BIP各0.96μL；1mM的环引物KPC77-LF1-2和环引物KPC77-LB1-2各0.4μL；2×反应缓冲液10μL；2 μL的模板DNA，加灭菌纯化水至20μL体系。所述环介导等温扩增的检测反应条件为：60℃-65℃恒温50min。进一步的，所述环介导等温扩增检测反应条件为：65℃恒温50min。

现有的针对KPC耐药基因的环介导等温扩增引物，均是根据KPC1耐药基因的基因序列设计的；而本申请中所设计、检测KPC耐药基因的环介导等温扩增引物，是根据目前所有的KPC亚型的序列，进行比对、压缩后得到的共有序列(Consensus Sequence)设计的。

本发明针对的靶序列如下所示：

GCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCATGGCCGCTGGCTGGCTTT TCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTAAACTCG AACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCGCAACTGTAAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGC TCATTCAAGGGCTTTCTTGCTGCCGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGC AGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCCGTTACGGCAAAAACGCGCTGGT TCTGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAGGCATGACGGTG GCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA ATTTGTTGCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCAT GCGCTCTATCGGCGATACCACGTTCCGTCTGGACTGCTGGGAGCTGGAG ATGAACTCCGCTATCCCAGGCGATGCGCGCGATACCTCATCGCCGCGCGC CGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGGGCTCTGCACTGGCTGC GCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGACCGG CAACCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGA CAAAACCGGAACCTGCGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTC GTCTGGCCCACTGGGCGCGCACCTATTGTGTTGGCCGTCTACACCCGGG CGCCTAACAAGGATGACAAGTACAGCGAGGCCGTCATCGCCGCTGCGG CTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGC(SEQ ID NO:7)。

本发明提供了一种快速检测碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因(即KPC所有亚型)的环介导等温扩增引物组和检测方法。使用环介导等温扩增技术在实时荧光PCR仪中实时检测样品中的碳青霉烯类抗生素耐药基因KPC 所有亚型。本发明筛选到的引物组灵敏度高、特异性强，建立的检测方法具有准确率高、检测时间短、结果可实时观测的优点，操作简单，比其它PCR 方法具有更高的特异性。1h内完成检测。同时，本发明首次设计、筛选到碳青霉烯类抗生素耐药基因KPC所有亚型的环介导等温扩增引物，并建立了碳青霉烯类抗生素耐药基因KPC所有亚型环介导等温扩增检测方法，填补了国内外在此环介导等温扩增技术检测领域的空白。

附图说明

图1a为对含有碳青霉烯类抗生素耐药基因KPC所有亚型基因组\质粒 DNA采用本发明的引物进行LAMP反应的实时荧光值与反应时间图(模板 DNA浓度为a：1000copies/μl)；

图1b为对含有碳青霉烯类抗生素耐药基因KPC所有亚型基因组\质粒 DNA采用本发明的引物进行LAMP反应的实时荧光值与反应时间图(模板 DNA浓度为b:100copies/μl)；

图1c为对含有碳青霉烯类抗生素耐药基因KPC所有亚型基因组\质粒 DNA采用本发明的引物进行LAMP反应的实时荧光值与反应时间图(模板 DNA浓度为c:10copies/μl)；

图2为对含有碳青霉烯类抗生素耐药基因KPC所有亚型基因组\质粒 DNA采用本发明的引物进行LAMP反应的实时荧光值与反应时间图，阴性对照；

图3为采用本发明的引物组进行环介导等温扩增反应的实时荧光值与反应时间图(其中，模板DNA浓度为b:100copies/μl，20次重复，平均Ct值： 23.8min)；

图4为采用KPC2组环介导等温扩增引物组进行环介导等温扩增检测的实时荧光值与反应时间图(其中，模板DNA浓度为b:100copies/μl)；

图5为采用KPC79组环介导等温扩增引物组进行环介导等温扩增检测的实时荧光值与反应时间图(其中，模板DNA浓度为b:100copies/μl)；

图6为采用本发明提供的KPC77组环介导等温扩增引物组检测碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因的实时荧光值与反应时间图(其中，模板DNA浓度为b:100copies/μl)；

图7为采用KPC292组环介导等温扩增引物组进行环介导等温扩增检测的实时荧光值与反应时间图(其中，模板DNA浓度为b:100copies/μl)；

图8为采用KPC19组环介导等温扩增引物组进行环介导等温扩增反应的实时荧光值与反应时间图(其中，模板DNA浓度为b:100copies/μl)。

具体实施方式

为了更易理解本发明的结构及所能达成的功能特征和优点，下文将本发明的较佳的实施例，并配合图式做详细。

图1a、图1b和图1c是不同浓度下的检测结果，每个浓度下有三次重复检测，是灵敏度实验。图1a和图1b中均有三条曲线，表示三次重复检测均显示为阳性，说明本发明提供的引物的灵敏度在该样品浓度下是稳定的。而图1c中只有两条曲线，表示三次重复检测只出现两次阳性结果，说明本发明提供的引物的灵敏度在该样品浓度下，已经不稳定，且出峰时间不一致，间隔较大。

图2说明的是本发明提供的引物是否存在非特异扩增，图2中出峰的是阳性对照(所用模板为浓度1000copies/μl的KPC质粒)，指控本次反应是否存在问题，而未出峰的直线为阴性对照(所用模板为灭菌水)。图2检测结果说明本发明提供的引物不存在非特异扩增。

图4至图8中，图内的3条曲线表示每个浓度下分别做三次重复实验，来指控本次实验的可靠性。

本发明提供了一种检测碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因的环介导等温扩增引物组，环介导等温扩增引物组由下列引物组成：

外引物KPC77-F3：5’-CTGACCAACCTCGTCGC-3，

外引物KPC77-B3：5’-GTGTGTCCAGCAAGCCG-3’，

内引物KPC77-FIP：

5’-CGGTATCCATCGCGTACACACCAACCATTCGCTAAACTCGAACA-3’，

内引物KPC77-BIP：

5’-GCTCAGGCGCAACTGTAAGCAGCAAGAAAGCCCTTGAA-3’，

环引物KPC77-LF1-2：5’-GATGGAGCCGCCAAAGTCC-3’，

环引物KPC77-LB1-2：5’-AGGAGCGCTTCCCACTGT-3’。

同时本发明还提供了相应的环介导等温扩增检测方法和试剂盒，下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例1实验室检测方法的建立

1、引物的制备

所用引物序列由中国生工公司合成。针对靶序列(SEQ ID NO:7)设计6条引物，包括两条内引物(FIP和BIP)和两条外引物(F3和B3)和两条环引物(LF和LB)，所得引物组的核苷酸序列列于表1。

环介导等温扩增检测体系的具体配置为：0.3mM的外引物F3和B3各 0.12μL；2.4mM的内引物FIP和BIP各0.96μL；1mM的环引物LF和LB各 0.4μL；2×反应缓冲液10μL；2μL的模板DNA，加灭菌纯化水至20μL体系。

所述环介导等温扩增检测反应条件为：65℃恒温50min。

表1本发明提供的检测碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因的环介导等温扩增引物组中的引物信息

注：

1、表1中的序列为DNA序列。

2、KPC79引物组是由5条引物组成的，空缺的一条引物用灭菌水补足，保证终浓度不改变即可。

3、KPC19引物组是由5条引物组成的，空缺的一条引物用灭菌水补足，保证终浓度不改变即可。

上述表1中，SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO: 4，SEQ ID NO:5，和SEQ ID NO:6组成一个引物组，简称为KPC77组环介导等温扩增引物组。上述表1中，SEQ IDNO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO: 10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，和SEQ ID NO:13组成一个引物组，简称为KPC2组环介导等温扩增引物组。上述表1中，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，和SEQ ID NO:18组成一个引物组，简称为KPC79组环介导等温扩增引物组。上述表1中，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:23，和SEQ ID NO: 24组成一个引物组，简称为KPC292组环介导等温扩增引物组。上述表1中， SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28，和SEQ IDNO:29组成一个引物组，简称为KPC19组环介导等温扩增引物组。

如图4、图5、图6、图7和图8所示，图6所示KPC77组环介导等温扩增引物组进行环介导等温扩增反应，出峰时间最快，即KPC77组环介导等温扩增引物组检测碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因的速度最快，性能最优异。

本发明选择KPC77组环介导等温扩增引物组用于检测碳青霉烯类抗生素 KPC耐药基因。

图8中的3条曲线中有2条曲线出峰时间也较短，但与图6的结果相比，图8中的3次重复的出峰间隔较大，性能上不如图6所示曲线，所以最终选择图6所表征的引物组。

2、特异性试验

利用实施例1中得到的KPC77组环介导等温扩增引物组、反应体系和检测方法，通过对1株含碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因待检基因片段的质粒、3株含碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因的菌种和5种其他细菌菌种进行环介导等温扩增检测。

按下列原则判定环介导等温扩增反应结果。

结果判断为阳性反应的现象为：采用实时荧光PCR仪器进行扩增，观察实时荧光曲线，反应时间为50min，观察实时荧光曲线的出峰时间(Ct)。以灭菌纯化水做阴性对照试验，阴性对照试验结果应为阴性。见图2所示。

(1)若出现明显的S型曲线，并且Ct≤30，判定LAMP测试结果为阳性；

(2)若未出现明显的S型曲线，并且Ct＞45，未出现(1)中所述现象，判定LAMP测试结果为阴性；

(3)若30＜Ct≤45，出现或不出现明显的S型曲线，都判定LAMP测试结果为可疑，需要重新实验；

(4)对可疑结果重新实验后，若Ct≤45，出现明显的S型曲线，判定 LAMP测试结果为阳性，否则判断为阴性。

对其他未含有碳青霉烯类抗生素耐药基因KPC所有亚型的菌种在反应的50min时间内未检测出(无实时荧光曲线)，显示为阴性反应。表2检测结果表明本发明提供的检测碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因的环介导等温扩增引物组的特异性强。

表2、试验用菌种及环介导等温扩增检测结果

注：美国典型微生物菌种保藏中心ATCC、中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC、中国医学细菌保藏管理中心CMCC：其余含耐药基因KPC的菌种为中国食品药品检定院(简称中检院)赞助提供。

3、灵敏度试验

将含碳青霉烯类抗生素KPC待检基因片段的质粒菌种接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中(浓度比为：1:1000)，正常培养16h后，取含氨苄青霉素的LB培养的菌液1mL，按常规方法提取质粒DNA(采用康为世纪质粒DNA小提试剂盒)，采用NanoDrop 2000C超微量分光光度计测定质粒DNA 浓度及纯度。同时，使用Invitrogen Qubit 2.0荧光定量仪及Invitrogen Qubit 定量检测试剂盒对提取后的核酸DNA进行定量，并计算拷贝数。DNA模板拷贝数分别为a：1000copies/μl，b:100copies/μl，c:10copies/μl。最后使用本发明的环介导等温扩增组物组和检测方法对上述DNA模板进行测定。

当含有碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因组\质粒DNA的拷贝数为100 copies/μl时，反应阳性结果判读时间小于30min(实测Ct值＝23.8min，如图3 所示。

因此，本发明所采用的LAMP检测方法定性试验的检测灵敏度可以达到100copies/μL(DNA浓度)，即检测下限为100个拷贝每反应体系。本发明提供的检测碳青霉烯类抗生素耐药基因KPC所有亚型的LAMP引物组的灵敏度高，能快速、准确的检测碳青霉烯类抗生素耐药基因KPC耐药基因的存在。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡是根据本发明内容所做的均等变化与修饰，均涵盖在本发明的专利范围内。

序列表

<110> 首都医科大学附属北京天坛医院

<120> 一种检测碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因的环介导等温扩增引物组及检测方法

<130> 190068

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 1

ctgaccaacc tcgtcgc 17

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 2

gtgtgtccag caagccg 17

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 3

cggtatccat cgcgtacaca ccaaccattc gctaaactcg aaca 44

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 4

gctcaggcgc aactgtaagc agcaagaaag cccttgaa 38

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 5

gatggagccg ccaaagtcc 19

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 6

aggagcgctt cccactgt 18

<210> 7

<211> 854

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 7

gccgtctagt tctgctgtct tgtctctcat ggccgctggc tggcttttct gccaccgcgc 60

tgaccaacct cgtcgcggaa ccattcgcta aactcgaaca ggactttggc ggctccatcg 120

gtgtgtacgc gatggatacc ggctcaggcg caactgtaag ttaccgcgct gaggagcgct 180

tcccactgtg cagctcattc aagggctttc ttgctgccgc tgtgctggct cgcagccagc 240

agcaggccgg cttgctggac acacccatcc gttacggcaa aaacgcgctg gttctgtggt 300

cacccatctc ggaaaaatat ctgacaacag gcatgacggt ggcggagctg tccgcggccg 360

ccgtgcaata cagtgataac gccgccgcca atttgttgct gaaggagttg ggcggcccgg 420

ccgggctgac ggccttcatg cgctctatcg gcgataccac gttccgtctg gactgctggg 480

agctggagat gaactccgct atcccaggcg atgcgcgcga tacctcatcg ccgcgcgccg 540

tgacggaaag cttacaaaaa ctgacactgg gctctgcact ggctgcgccg cagcggcagc 600

agtttgttga ttggctaaag ggaaacacga ccggcaacca ccgcatccgc gcggcggtgc 660

cggcagactg ggcagtcgga gacaaaaccg gaacctgcgg agtgtatggc acggcaaatg 720

actatgccgt cgtctggccc actgggcgcg cacctattgt gttggccgtc tacacccggg 780

cgcctaacaa ggatgacaag tacagcgagg ccgtcatcgc cgctgcggct agactcgcgc 840

tcgagggatt gggc 854

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 8

gccgtctagt tctgctgtc 19

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 9

agcgcggtgg cagaaaag 18

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 10

aatggttccg cgacgaggtt ttgtctctca tggccgct 38

<210> 11

<211> 16

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 11

acagtgggaa gcgctc 16

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 12

gctccatcgg tgtgtacgc 19

<210> 13

<211> 44

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 13

gctaaactcg aacaggactt tggcctcagc gcggtaactt acag 44

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 14

ccgtgacgga aagcttac 18

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 15

gccagacgac ggcatag 17

<210> 16

<211> 44

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 16

ctttagccaa tcaacaaact gctgaaaact gacactgggc tctg 44

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 17

gcagactggg cagtcggatc atttgccgtg ccatac 36

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 18

aaccggaacc tgcggagt 18

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 19

aggataccaa tcttgcgg 18

<210> 20

<211> 17

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 20

tcaaggcggt gatggga 17

<210> 21

<211> 39

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 21

tctgtgaggg cgaaggttaa acggcgtgtt atgacgact 39

<210> 22

<211> 39

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 22

tcgcctcaaa tttagcgcca tttgcgtcag ttcagcatg 39

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 23

tggggcggct caaatgcac 19

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 24

gcagacgagc ttccactcg 19

<210> 25

<211> 17

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 25

tacatccggc cgctaca 17

<210> 26

<211> 17

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 26

gcgtacacac cgatgga 17

<210> 27

<211> 42

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 27

agcagaacta gacggcgata cacctagctc caccttcaaa ca 42

<210> 28

<211> 39

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 28

gtctctcatg gccgctgggt tcgagtttag cgaatggtt 39

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> human synthetic

<400> 29

tggcacggca aatgactatg 20

Claims

1.一种检测碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因的环介导等温扩增引物组，其特征在于，所述的引物组包括下述引物：

外引物KPC77-F3：5’-CTGACCAACCTCGTCGC-3，

外引物KPC77-B3：5’-GTGTGTCCAGCAAGCCG-3’，

内引物KPC77-FIP：

5’-CGGTATCCATCGCGTACACACCAACCATTCGCTAAACTCGAACA-3’，

内引物KPC77-BIP：

5’-GCTCAGGCGCAACTGTAAGCAGCAAGAAAGCCCTTGAA-3’，

环引物KPC77-LF1-2：5’-GATGGAGCCGCCAAAGTCC-3’，

环引物KPC77-LB1-2：5’-AGGAGCGCTTCCCACTGT-3’。

2.一种检测碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，使用权利要求1所述的环介导等温扩增引物组进行环介导等温扩增。

3.根据权利要求2所述的检测碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，环介导等温扩增的反应体系为：0.3mM的外引物KPC77-F3和外引物KPC77-B3各0.12μL；4.4mM的内引物KPC77-FIP和内引物KPC77-BIP各0.96μL；1mM的环引物KPC77-LF1-2和环引物KPC77-LB1-2各0.4μL；2×反应缓冲液10μL；2μL的模板DNA，加灭菌纯化水至20μL体系。

4.根据权利要求3所述的检测碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述环介导等温扩增的检测反应条件为：60℃-65℃恒温50min。

5.根据权利要求4所述的检测碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述环介导等温扩增检测反应条件为：65℃恒温50min。

6.根据权利要求2-5中任意一项所述的检测碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，检测结果通过观察实时荧光PCR仪出峰时间。

7.一种碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述碳检测试剂盒中包含有权利要求1所述的环介导等温扩增用引物组。

8.根据权利要求7所述的碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：0.3mM的外引物KPC77-F3和外引物KPC77-B3各0.12μL；4.4mM的内引物KPC77-FIP和内引物KPC77-BIP各0.96μL；1mM的环引物KPC77-LF1-2和环引物KPC77-LB1-2各0.4μL；2×反应缓冲液10μL；2μL的模板DNA，加灭菌纯化水至20μL体系。

9.根据权利要求8所述的碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述环介导等温扩增的检测反应条件为：60℃-65℃恒温50min。

10.根据权利要求8所述的碳青霉烯类抗生素KPC耐药基因的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述环介导等温扩增检测反应条件为：65℃恒温50min。