CN110195128B - 基于恒温核酸扩增技术的皮肤型hpv分型检测引物核苷酸序列及应用 - Google Patents
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- C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
Abstract
本发明涉及DNA扩增和生物样本检测领域，具体涉及到基于恒温核酸扩增技术的8种用于皮肤型类乳头瘤病毒分型检测的引物。所述的8对引物可用于制备快速检测皮肤型HPV型别的诊断产品，例如试剂盒等。本发明所涉及HPV分型鉴定引物均由精密设计，并经过大量实验筛选后确定，具备极高的反应灵敏性和特异性，最后通过临床样本扩增检验合格，是基于CAMP技术下此8型HPV分型检测引物的极佳选择。该核苷酸序列可以快速的、精确的检测出皮肤型HPV的型别，能够满足临床上对皮肤型HPV分型检测的需要。
Description
技术领域
本发明涉及DNA扩增和生物样本检测领域，具体涉及到基于恒温核酸扩增技术的8种用于皮肤型类乳头瘤病毒分型检测的引物。
背景技术
人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一种以双链环状DNA为遗传物质的小型病毒，其基因组属约由8000个碱基对构成。HPV病毒颗粒直径大约50nm，属于多瘤空泡病毒科。临床上根据HPV病毒的感染组织类别，可大致上将HPV分为两种主要类别，即皮肤型和黏膜型，具体分型以其基因组晚期基因L1的序列进行区分，目前已有鉴定到超过200种HPV型别，且新的HPV型别也在不断被发现。临床上，HPV感染可以造成多种类型的疾病，其中良性疾病包括皮肤疣、疣状表皮发育不良、宫颈CIN等；恶性疾病包括日光性角化、非黑素瘤皮肤癌、头颈部鳞癌、宫颈癌等。由HPV感染造成的疾病在临床上十分常见，且不同分型HPV可以造成的疾病类型不尽相同，如低危型HPV一般仅造成良性并表，而高危型则可造成癌症等恶性疾病。此外，HPV病毒感染还具备一定的潜伏期。因此，对患者进行HPV感染的筛查和型别鉴定对指导HPV相关临床疾病诊断和治疗具备重要的意义。HPV感染在不同地区也存在一定的差异，对HPV的快速筛查也有利于我们掌握HPV感染相关的分子流行病学数据，从而为疾病防控与疫苗开发等工作提供精确的依据。然而，目前临床可使用的商品化HPV检测试剂盒比较欠缺，且多是基于黏膜型HPV进行检测，尚缺乏一种高效、准确的皮肤型HPV分型检测试剂。
目前对HPV的检测主要策略是根据其基因组L1基因序列进行DNA鉴定分型，采用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reactions, PCR）技术进行DNA扩增，以HPV型别特异性引物进行扩增DNA的分型鉴定。但是该方法也存在较为明显的弊端，主要表现在：1）PCR反应仅使用2条特异性引物（上、下游DNA引物）进行扩增，而HPV型别总量巨大，普通的PCR分型反应的特异性有限，很容易发生假阳性反应。2）PCR反应需要精确的温度控制系统，以满足其变温反应条件的控制，且PCR扩增结果的读取和解读需要专业的荧光检测设备和具备专业技术的人员储备，这都极大地增加了PCR分型鉴定的设备和人员成本，不利于技术的推广和应用。3）PCR分型反应需要时间周期较长（样本处理、DNA提取、PCR反应总体用时可超过5-6个小时），不利于临床快速检测HPV的分型的需求。
综上所述，为了满足临床中对HPV的分型检测，亟需研究一种实用、准确、高特异性和灵敏的检测方法。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本发提供基于恒温核酸扩增技术的皮肤型HPV分型检测引物序列及应用，所述的引物是基于反向平行结构的竞争性互补配对结构基础和竞争性互补配对的核酸恒温扩增技术（Compettive annealing mediated isothermalamplification of nucleic acids, CAMP）而设计的特异性HPV分型鉴定引物。该引物核苷酸序列可以快速的、精确的检测出皮肤型HPV的型别，能够满足临床上对皮肤型HPV分型检测的需要。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
基于恒温核酸扩增技术用于皮肤型HPV分型检测引物的核酸序列具体为可用于分型检测8种皮肤型HPV的16个引物核苷酸序列。
CAMP引物的基本设计原则如图1所示，F1、R1和N（Nc）序列片段为CAMP引物（NF和NR）的三组基本序列，和模板DNA的对应互补配对模式如图1所示。其中，将N与F1线性连接（5’-N-F1-3’）构成NF引物，Nc与R1线性连接（5’-Nc-R1-3’）构成NR引物。并以此为基本原则设计出8种常见HPV的CAMP分型鉴定引物。全部CAMP引物所对应的HPV-L1基因序列均由NCBI-Nucleotide数据库查询并下载，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:16。
所述的CAMP引物的8对引物序列及其对应检测的HPV型别，见表1。
所述的8对引物可用于制备快速检测皮肤型HPV型别的诊断产品。
进一步，所述的快速检测皮肤型HPV型别的诊断产品为试剂盒。
与现有技术比，本发明具有以下有益效果。
1）本发明所涉及的8种最常见的HPV分型引物均为皮肤型，这可以填补目前临床HPV分型检测无皮肤型适用试剂或试剂盒的空白。
2）本发明涉及的的皮肤型HPV检测引物同时包括最常见的低危型和高危型HPV分型，可以满足临床对皮肤HPV感染性疾病的定性判读，可指导相关诊断和治疗。
3）本发明采用CAMP技术作为支持，该技术及配套试剂由合作团队发明，具备完全自主知识产权。
4）本发明所涉及HPV分型鉴定引物均由精密设计，并经过大量实验筛选后确定，具备极高的反应灵敏性和特异性，最后通过临床样本扩增检验合格，是基于CAMP技术下此8型HPV分型检测引物的极佳选择。
5）在PCR引物的基础上引入了反向平行的DNA二级结构，需要同时具备3组特异性序列互补配对才可以实现DNA扩增反应，因此相对比传统PCR法特异性更高，不容易出现假阳性反应。
6）本反应采用恒温DNA扩增技术，反应全程采用60-65℃恒温水浴即可进行，不需要传统PCR反应的反应温度变化环境。同时，恒温核酸扩增技术反应迅速，配合快速样本处理，使得采用本发明引物进行的HPV分型鉴定耗时大大下降（仅需1-2个小时），这极大地节约了临床HPV鉴定的时间成本。
7）在结果判定上，基于CAMP技术的HPV分型引物扩增后可产生焦磷酸镁白色沉淀，通过向反应体系中加入镁离子指示剂，仅通过肉眼观察反应体系颜色变化即可实现对鉴定结果的描述和解读。因此，本发明无需精密控温设备、荧光检测系统和专业技术人员即可开展，十分适合全国推广（尤其是偏远落后地区）和大范围筛查。
附图说明
图1是CAMP引物设计的基本原则。
图2是CAMP引物阳性模拟样本检测结果。
图3是CAMP引物反应灵敏性检测结果。
图4是CAMP引物反应特异性检测结果（以HPV-1示例）。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明，以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。在实施例中未作特殊说明的操作方法均为本技术领域常规操作方法。
实施例1引物核酸序列设计与筛选。
1.引物核酸序列设计方法：CAMP引物的基本结构如图1所示，CAMP引物的三组基本引物和模板DNA的互补配对模式如图1所示。其中将N与F1连接（5’-N-F1-3’）构成NF引物，Nc与R1连接（5’-Nc-R1-3’）构成NR引物。并以此为基本原则设计出8种常见HPV的CAMP分型鉴定引物。全部CAMP引物所对应的HPV-L1基因序列均由NCBI-Nucleotide数据库查询并下载。
2. 引物核酸序列具体的筛选方法包括以下步骤。
1）引物核酸序列的筛选方法：汇总全部常见的皮肤型HPV的L1基因序列，并进行多序列比对分析。目标HPV的CAMP引物设计应当以全部常见皮肤型HPV-L1基因序列的非保守区为模板，但须同时规避目标HPV所有亚型序列的非保守区域，以保证对目标HPV所有亚型的通用性。对目标HPV所设计出的全部满足上述条件的F1和R1引物序列进行NCBI-PrimerBlast搜库验证（检索Non-Redundant数据库），筛选出仅能特异性识别目标HPV分型的引物序列。并在筛选出的序列中优选NF和NR引物中二级结构较少，无3’端互补配对，且3’末端自由能< -4 kJ/mol的引物作为初步筛选合格引物，并开展后续验证试验。
2）引物核酸序列的检测方法：对上步中筛选出来的引物（NF和NR）进行恒温核酸扩增反应，反应温度为63℃，反应时间1个小时，反应设备为荧光实时定量PCR仪，反应体系配置方法详见表3所述。
首先以目标HPV-L1基因序列标准质粒（人工化学合成）作为待测DNA样本进行扩增鉴定，实验组每反应加入1 μl（DNA含量1 ng）标准质粒样本，对照组加入1 μl无核酸酶水。在最终结果中，实验组可于1个小时内产生肉眼可见的底物颜色改变，而对照组不产生任何肉眼可见的颜色改变者视为合格，并进行进一步筛选检测。
提取转染有目标HPV标准质粒的大肠杆菌基因组DNA样本（阳性模拟样本），并以此作为待测DNA样本进行HPV引物的扩增鉴定，实验组和对照组设置同前。在最终结果中，实验组可于1个小时内产生肉眼可见的底物颜色改变，而对照组不产生任何肉眼可见的颜色改变者视为合格，并进行进一步筛选检测。对应结果如图2所示。
3）引物灵敏性及特异性验证实验：对上述筛选实验均合格的CAMP引物进行扩增质量检查，包括对CAMP引物（NF和NR）的灵敏性和特异性进行探究。
灵敏性检测中，对目标HPV-L1基因序列标准质粒进行10倍梯度稀释，分别得到1 ng/μl，0.1 ng/μl，0.01 ng/μl，0.001 ng/μl，0.0001 ng/μl，0.00001 ng/μl，0.000001 ng/μl浓度的标准质粒样本。以无核酸酶水替代标准质粒样本作为阴性对照，使用筛选出的CAMP引物分别对上述浓度梯度的目标HPV-L1标准质粒样本进行扩增，得到不同HPV分型CAMP引物的扩增灵敏性数据，如图3所示。
在特异性检测中，首先在引物设计环节保证CAMP引物（F1和R1）的理论特异性，具体方法如上所述。在实际检验方面，使用目标HPV的CAMP分型检测引物同时对全体常见皮肤型HPV-L1标准质粒（含目标HPV在内的30种常见皮肤型HPV-L1质粒）进行扩增鉴定。具体检测反应体系配置方法同前所述。反应条件除将反应时间延长至80分钟外，其余均相同。在最终结果中，将仅对目标HPV-L1标准质粒产生扩增反应（判断方法同上），而不对其他29种HPV-L1标准质粒产生扩增反应者视为合格，并最终纳入目标HPV分型检测引物待选名单，进行后续临床样本检验。以HPV-1 CAMP引物特异性结果为例展示，如图4所示。
实施例2 对临床样本进行HPV型别检测。
刮取临床跖疣或寻常疣患者皮损处皮屑，提取皮屑样本的总DNA，并以此作为待测DNA样本进行引物扩增鉴定。实验组与对照组设置同前，同时使用本发明所涉及的8种皮肤型HPV所筛选出的CAMP引物对同一样本进行检测，记录不同临床样本的CAMP引物扩增结果。同时，对应皮损DNA样本使用HPV通用引物进行PCR扩增和测序，以明确样本具体HPV感染型别。对比同一样本的CAMP扩增结果和HPV测序结果，判断所筛选出的引物在实际临床检验中的准确性。
使用本发明8种皮肤型HPV分型检测CAMP引物对29例临床患者（寻常疣或跖疣）皮屑样本进行检测验证证实，与分型鉴定金标准（PCR测序法）对比，本发明的HPV分型引物的检测准确率达到100%。指的注意的是，使用本发明的HPV分型鉴定引物可以检测出部分患者存在多重感染，这是金标准PCR测序法不具备的优势。具体分型检测结果如表2所示。
使用本发明进行皮肤型HPV分型鉴定反应，可以配合使用由中科芯瑞（苏州）生物科技有限公司提供的CAMP核酸恒温扩增反应试剂盒进行操作，或也可以采用市售标准LAMP（环介导恒温扩增技术， Loop-mediated isothermal amplification methods, LAMP）核酸扩增试剂盒替代（具体用法用量根据对应产品使用说明操作），具体使用方法如表3所示（每反应/test）。
其中待测样本DNA可以由患者疣体或其他皮损皮屑样本提取，建议最低检测DNA浓度应不低于0.01 ng/μl。
上述样本配置完毕后，移液于PCR管中进行核酸扩增反应。如使用配套CAMP扩增试剂盒，因本品同时包含荧光染料和变色染料，可以选择使用荧光定量PCR仪或恒温水浴锅进行反应，反应温度60-65℃（推荐63℃），反应时间60分钟。反应结果可分别使用荧光量或肉眼判读来确定。若使用肉眼判读结果，则以反应混合液颜色由原始紫罗兰色转变为天蓝色为阳性。
序列表
＜110＞中国医科大学附属第一医院，中科芯瑞（苏州）生物科技有限公司
＜120＞基于恒温核酸扩增技术的皮肤型HPV分型检测引物核苷酸序列及应用
＜160＞16
＜210＞1
＜211＞36
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV-01正向引物
＜400＞1
gttcggacat cctttctgaa atgtccagaa caggcg 36
＜210＞2
＜211＞36
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV-01反向引物
＜400＞2
cagaaaggat gtccgaacgt ggaactagta gcagta 36
＜210＞3
＜211＞36
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV-02正向引物
＜400＞3
ttgcagccca gaatgaacag ctgatgatgg caggga 36
＜211＞36
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV-02反向引物
＜400＞4
gttcattctg ggctgcaaga agacccatta caggtg 36
＜210＞5
＜211＞48
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV-04正向引物
＜400＞5
agtgttatct acaagagtaa caaacagagc tcagggtaca aataatgg 48
＜210＞6
＜211＞18
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV-04反向引物
＜400＞6
tttgttactc ttgtagataa cactttgtca ttagcaccat ctgacttc 48
＜210＞7
＜211＞36
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV-05正向引物
＜400＞7
tttgtgcacc tggaatgttc gtagggagca atgtta 36
＜210＞8
＜211＞36
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV-05反向引物
＜400＞8
acattccagg tgcacaaatt tgagcttggc catcag 36
＜210＞9
＜211＞36
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV-07正向引物
＜400＞9
ggagtacagc ctacaatatg gaacagtacc tggtca 36
＜210＞10
＜211＞36
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV-07反向引物
＜400＞10
tattgtaggc tgtactccac agtcaccagg agacac 36
＜210＞11
＜211＞39
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV-08正向引物
＜400＞11
atacagacat atctgccagt gaggttccca aagtatcgg 39
＜210＞12
＜211＞39
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV-08反向引物
＜400＞12
cactggcaga tatgtctgta tcctaatggt tgtccccta 39
＜210＞13
＜211＞21
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV-10正向引物
＜400＞13
tgcaaacagt tgttcccttt atttgggaat ggccgc 36
＜210＞14
＜211＞36
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV-10反向引物
＜400＞14
agggaacaac tgtttgcatg aaagtgtctg ggatgg 36
＜210＞15
＜211＞36
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV-27正向引物
＜400＞15
atgcagagga ggcagatatg cagccattgg acgatt 36
＜210＞16
＜211＞36
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV-27反向引物
＜400＞16
tatctgcctc ctctgcatac acaggcacat caacac 36
Claims (1)
1.基于恒温核酸扩增技术的皮肤型HPV分型检测的8对引物核苷酸序列在制备快速检测皮肤型HPV型别的诊断产品中的应用，其特征在于，所述的引物核苷酸序列具体为用于分型检测8种皮肤型别的人乳头瘤病毒的16个引物核酸序列，分别为：SEQ ID No:1和SEQ IDNo:2检测HPV-01型、SEQ ID No:3和SEQ ID No:4检测HPV-02型、SEQ ID No:5和SEQ ID No:6检测HPV-04型、SEQ ID No:7和SEQ ID No:8检测HPV-05型、SEQ ID No:9和SEQ ID No:10检测HPV-07型、SEQ ID No:11和SEQ ID No:12检测HPV-08型、SEQ ID No:13和SEQ ID No:14检测HPV-10型以及SEQ ID No:15和SEQ ID No:16检测HPV-27型；所述的诊断产品为试剂盒。
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| GR01 | Patent grant | ||
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