CN106834541A - 用于皮肤型人乳头瘤病毒分型检测的核酸序列及其应用 - Google Patents

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CN106834541A CN201710081809.5A CN201710081809A CN106834541A CN 106834541 A CN106834541 A CN 106834541A CN 201710081809 A CN201710081809 A CN 201710081809A CN 106834541 A CN106834541 A CN 106834541A
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Abstract

本发明属于微生物检测领域，尤其涉及用于皮肤型人乳头瘤病毒分型检测的核酸序列及其应用。所述的30对引物可用于制备快速检测皮肤型HPV型别的诊断产品，例如试剂盒等。该核苷酸序列可以快速的、精确的检测出皮肤型HPV的型别，能够满足临床上对皮肤型HPV分型检测的需要。

Description

用于皮肤型人乳头瘤病毒分型检测的核酸序列及其应用
技术领域
本发明属于微生物病原检测领域，尤其涉及用于皮肤型人乳头瘤病毒分型检测的核酸序列及其应用。
背景技术
人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是球形DNA病毒，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。表现为寻常疣、生殖器疣（尖锐湿疣）等症状。随着性病中尖锐湿疣的发病率急速上升和宫颈癌、肛门癌等的增多，人乳头瘤病毒（HPV）感染，越来越引起人们的关注。
HPV广泛的存在于自然环境之中，与人类的健康息息相关，人们开始探索越来越多的HPV相关疾病。目前已分离出200多种HPV，不同的型别能够引起不同的临床表现，不同的HPV型别所导致的疾病不同，疾病的预后也不同，甚至同一疾病的临床表现，也因感染型别不同而略有区别，检测出患者感染的具体型别，对于疾病的筛选和诊断、疾病的治疗和预后有着极大的帮助。
HPV与多种皮肤黏膜疾病相关，其中包括良性和恶性的增生病变。可引起数种皮肤型疾病，例如良性皮肤疣，日光性角化病（AKs）和非黑素瘤皮肤癌（NMSCs）。在健康人的皮肤上也常常检出皮肤HPV型别，皮肤型HPV感染中最常见的疾病即为皮肤疣类疾病，可分为寻常疣、跖疣和扁平疣这三大类，不同的HPV型别感染可导致不同的皮肤疣疾病的发生。寻常疣多由HPV1、2、4型感染引起，HPV2型别可能是引起人群手、足寻常疣的最常见型别；扁平疣则多由HPV3、10、28引起；不同的HPV型别引起的皮肤疣临床表现都略有不同，例如角化程度的不同；HPV的感染具有显著的地域差异，通过对本地区患者HPV感染型别的检测，结合对治疗效果的分析，从而对推动皮肤疣个体化治疗方案的实施提供分子流行病学依据。但是目前绝大部分的HPV检测方法是针对黏膜型HPV，缺乏一种成熟的可应用于临床的皮肤型HPV检测方法和核酸序列。
综上所述，为了满足临床中对HPV的分型检测需要，亟需研究一种实用、准确、特异和灵敏的检测方法。
发明内容
针对上述问题，本发明提供用于皮肤型人乳头瘤病毒分型检测的核酸序列及其应用，该核苷酸序列可以快速的、精确的检测出皮肤型HPV的型别，能够满足临床上对皮肤型HPV分型检测的需要。
为了实现上述目的，本发明提供的用于分型检测皮肤型人乳头瘤病毒的核酸序列具体为可用于分型检测30种皮肤型别的人乳头瘤病毒的30对引物核酸序列。
设计并筛选引物核酸序列：首先对各皮肤型别HPV的 L1区段进行对比，选取差异较大的部分进行设计引物核酸序列，每一型别设计3-10对候选引物；然后分别以本团队人工合成的标准病毒核酸(Genbank 序列号，见表1)，以及大量HPV感染的临床生物样本为模板，使用上述多对候选引物进行大量反复的多聚酶链反应，对得到的产物进行测序，验证扩增的特异性与灵敏性；最终得到特异性与灵敏性俱佳的30对引物，引物的核苷酸序列如SEQID No：1至 SEQ ID No：60。
所述的30对引物的核苷酸序列及其对应检测的HPV型别，见表2。
表1 标准病毒核酸序列的Genbank 序列号。
表2 30种检测皮肤HPV型别的引物核苷酸序列。
基因的ID号 用于检测HPV性别 引物 核甘酸序列
SEQ ID No:1 HPV1 正向引物 GCTGTACTCCTGCTTCAG
SEQ ID No:2 反向引物 TGCATGTTGCTTGAACAAC
SEQ ID No:3 HPV2 正向引物 CTGCCAGTTTACAGGATACC
SEQ ID No:4 反向引物 AGACACGGTAGGCATAGC
SEQ ID No:5 HPV3 正向引物 TGGGTTGTACCCCACCTATG
SEQ ID No:6 反向引物 GCAGGTGGTCTGGCAAAT
SEQ ID No:7 HPV4 正向引物 CCTGCAATAGGTGAACATTG
SEQ ID No:8 反向引物 GGCCATTTACAAACTGTGG
SEQ ID No:9 HPV5 正向引物 GATCCAAATGTTTATTGTAGGATG
SEQ ID No:10 反向引物 ATTGACGATGTCTAAACTGAC
SEQ ID No:11 HPV7 正向引物 GAGTGTTTAGAGTACGCTTG
SEQ ID No:12 反向引物 CAGACGAGTTTTCCACATCT
SEQ ID No:13 HPV8 正向引物 TGTTTTAGCACAAATCAATGC
SEQ ID No:14 反向引物 CATTCCAGAAGTTAAACTTTGC
SEQ ID No:15 HPV9 正向引物 ACCGTTTGCTAACAGTGG
SEQ ID No:16 反向引物 GCCTATTTCAATACCTCTACAG
SEQ ID No:17 HPV10 正向引物 CATATTAAAGAGCAACGGTGG
SEQ ID No:18 反向引物 TCAGAAGGAACACACAAGC
SEQ ID No:19 HPV12 正向引物 CTCAAATAACTATGCCACAGG
SEQ ID No:20 反向引物 GTCACCATCTTCAATGAAAGTG
SEQ ID No:21 HPV14 正向引物 AGGTATAGAAATAGGCAGAGG
SEQ ID No:22 反向引物 TTCTACACATGGCAAGGC
SEQ ID No:23 HPV27 正向引物 CCAATAGGTCTGATGTTCCTT
SEQ ID No:24 反向引物 GGTCCGAGATAGTGGTACT
SEQ ID No:25 HPV28 正向引物 CACAACAGGGAGATTGCC
SEQ ID No:26 反向引物 AACATGCTGTCGCCATAC
SEQ ID No:27 HPV29 正向引物 ACAGAGTCTCAACCGTTG
SEQ ID No:28 反向引物 CGTGTCTTCCAAGCTAGTG
SEQ ID No:29 HPV41 正向引物 TACTTTCCTCCATGCTGC
SEQ ID No:30 反向引物 AACCTCAATCCCACGAAT
SEQ ID No:31 HPV48 正向引物 GAGACTCTGTCTTCTTTTTTGG
SEQ ID No:32 反向引物 CGTCTAAGCCAATAAGGCC
SEQ ID No:33 HPV49 正向引物 CCTGCAGCAAGTCAACAG
SEQ ID No:34 反向引物 GCCATCCGTACTTACACTA
SEQ ID No:35 HPV50 正向引物 GGATGCTGATATATTAGCTCATCT
SEQ ID No:36 反向引物 TTTCTGTAAGGTTGACATTCC
SEQ ID No:37 HPV57 正向引物 CCGGATGAGCTATATGTCAAG
SEQ ID No:38 反向引物 ACAAAGAGACATTTGTGCTG
SEQ ID No:39 HPV63 正向引物 TTCCTACCCAACCGATCA
SEQ ID No:40 反向引物 TTATCTCCAAAGGCAAATCG
SEQ ID No:41 HPV65 正向引物 CCATTGGATGTAGTTGCTAC
SEQ ID No:42 反向引物 ATCCTGACCTTCTTGAGC
SEQ ID No:43 HPV75 正向引物 CCTTAAAATGGCCAATGACA
SEQ ID No:44 反向引物 CGTGGGAACATAAATAGAGTTG
SEQ ID No:45 HPV76 正向引物 TCCTTACTGTAGGCCACC
SEQ ID No:46 反向引物 ACCTCTACAGGCCCAAAC
SEQ ID No: 47 HPV77 正向引物 TACTACCCCAGGAGACTG
SEQ ID No:48 反向引物 AAACAGTTGTTCCCGACG
SEQ ID No:49 HPV94 正向引物 GACTTCACTGCATTACAGTT
SEQ ID No:50 反向引物 CCAACGTTTTGGTCACCA
SEQ ID No:51 HPV95 正向引物 TTCTTCTTTGGCCGAAGG
SEQ ID No:52 反向引物 CGGTTAAAAAGCTGAGATTCAC
SEQ ID No:53 HPV115 正向引物 ACATACAAAGGACTGACATCT
SEQ ID No:54 反向引物 GTAGTATCTACCAATGCAAACC
SEQ ID No:55 HPV117 正向引物 CTAGTTCTGTTGGGGACG
SEQ ID No:56 反向引物 CCACCACAGTCACAAACA
SEQ ID No:57 HPV125 正向引物 CCTGATTATTTGGGCATGG
SEQ ID No:58 反向引物 GTGTAGGACAATATACAGCAC
SEQ ID No:59 HPV160 正向引物 TAGGCCTCAGTGGTCATC
SEQ ID No:60 反向引物 CAATCACCTGACGTGGAT
所述的30对引物可用于制备快速检测皮肤型HPV型别的诊断产品，例如试剂盒等。
为了实现上述目的，本发明还提供一种用于检测皮肤型HPV型别的试剂盒，具体包括以下组分：所述30对引物中的一对引物，SYBR Green I，dNTPs，pfu DNA聚合酶，10×pfuBuffer。
本发明的有益效果。
本发明提供的一系列用于皮肤型人乳头瘤病毒（HPV）分型检测的核酸序列灵敏度高，特异性强，能够满足临床上对皮肤型HPV分型检测的需要。由于皮肤型HPV大部分为Beta属，小部分属Alpha属、Gamma属、Mu属或Nu属，属间的HPV L1区段同源性均在60%以上，甚至部分需分型检测的HPV型别同源性高达89%，使得皮肤型HPV间的分型检测困难较大，根据现有技术对本发明的30种HPV型别筛选到特异性和灵敏性均合适的引物核酸序列较为困难，而本发明通过大量的实验检测，筛选出了灵敏性和特异性俱佳的引物，实现了临床上对皮肤型HPV分型检测；为了寻找到适宜的核酸引物序列，投入了两年多的研究精力和近百万的研究经费，设计并筛选引物核酸序列，对其进行测序，验证扩增的特异性与敏感性，结果表明这一系列引物核酸序列的检测结果准确性与灵敏性均高。
本发明构建了30组用于皮肤型HPV型别分型检测的核酸序列，检测的型别涵盖了临床所需，可填补应用于临床的皮肤型HPV分型检测方法这一领域的空白。
附图说明
图1引物筛选曲线。
图2引物灵敏性与特异性检测反应曲线。
图3 PCR产物电泳条带；其中，条带1：样本1；条带2：样本2；条带3：样本3；条带4：样本4；条带5：样本5；条带6：样本6；条带7：样本7；条带8：样本8；条带9：样本9。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。在实施例中未作特殊说明的操作方法均为本技术领域常规操作方法。
实施例1。
设计并筛选引物核酸序列：首先对各皮肤型别HPV的 L1区段进行对比，选取差异较大的部分进行设计引物核酸序列，每一型别设计多对候选引物；然后分别以本团队人工合成的标准病毒核酸以及大量HPV感染的临床生物样本为模板，使用上述多对候选引物进行大量反复的多聚酶链反应，对得到的产物进行测序，验证扩增的特异性与灵敏性；最终得到特异性与灵敏性俱佳的30对引物，引物的核苷酸序列如SEQ ID No：1至 SEQ ID No：60。
具体的筛选方法包括以下步骤。
（1）随机挑选一组候选引物对，在离心管中进行扩增反应，反应体系为25 μl，反应体系具体为正向引物和反向引物各0.2 μM，SYBR Green I，dNTP 0.8 μM，pfu DNA聚合酶2.5 U，10×pfu Buffer 5 μl，1 ng/μl质粒DNA；同时设置一组阴性对照，将上述反应体系中质粒DNA用ddH2O代替，其余成分相同；将离心管放入ABI Step One real time PCR 仪中反应，设置温度为94℃，预变性5min，进入如下循环94℃ 50s，49℃ 50s，72℃ 1min，40cycles，72℃ 5min；从所获得扩增曲线或者琼脂糖凝胶电泳图片观察是否有符合的产物存在，可以明确样本中HPV类型，进而采用该方法初步筛选出核苷酸序列如SEQ ID No：1至SEQ ID No：60的引物。
（2）检测筛选出的30种HPV型别引物对的灵敏性及相互间特异性：将一种HPV型别的引物核酸序列，分别与该型别不同浓度的质粒DNA以及其余HPV型别的质粒DNA进行反应；观察反应速率以及是否有交叉反应，每一种HPV型别的引物验证需8个反应体系，反应体系与步骤1中的反应体系相同，其中3个反应体系中加入该型别不同浓度的质粒DNA1 μL，浓度分别为1 ng/μl、质粒DNA稀释10倍以及质粒DNA稀释220倍，4个反应体系中加入其余HPV型别的质粒DNA1 ng/μl，1个反应体系中加入ddH2O代替质粒DNA作为阴性对照组；在荧光PCR仪中进行反应，观察扩增情况，筛选出可被该型别不同浓度质粒DNA扩增，又无交叉反应的最佳引物，即特异性、灵敏性具佳的引物，在保证30种HPV型别的相互间无交叉反应的基础上，同时保证引物核酸序列具有较高的扩增效率。
实施例2。
使用检测HPV1型别的候选引物核酸序列检测的方法。
（1）随机挑选一组HPV1型别候选引物对，在离心管中进行扩增反应，反应体系为25μl，反应体系具体为正向引物和反向引物各0.2 μM，SYBR Green I，dNTP 0.8 μM，pfu DNA聚合酶2.5 U，10×pfu Buffer 5 μl，1 ng/μl质粒DNA；同时设置一组阴性对照，将上述反应体系中质粒DNA用ddH2O代替，其余成分相同；将离心管放入荧光PCR中反应，设置温度为94 ℃，预变性5 min，然后进入如下循环94 ℃ 50 s，49 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，40cycles，72 ℃ 5 min；再挑取3组候选引物重复扩增反应，从所获得扩增曲线，引物筛选曲线如图1，其中线1：HPV1型别第一组引物扩增曲线。线2：HPV1型别第二组引物扩增曲线。线3：HPV1型别第三组引物扩增曲线。线4：HPV1型别第四组引物扩增曲线。线5：无质粒DNA的阴性对照组；可以明确样本中HPV1类型，进而筛选出核苷酸序列如SEQ ID No：1和 SEQ IDNo：2的引物。
（2）检测筛选出的HPV1型别引物的灵敏性及相互间特异性：将一种HPV型别的引物核酸序列分别与该型别不同浓度的质粒DNA以及其余HPV型别的质粒DNA进行反应；观察反应速率以及是否有交叉反应，每一种HPV型别的引物验证需8个反应体系，反应体系与步骤1中的反应体系相同，其中3个反应体系中加入该型别不同浓度的质粒DNA，浓度分别为1 ng/μl、质粒DNA稀释10倍以及质粒DNA稀释220倍，4个反应体系中分别加入其余HPV型别的质粒DNA为1 ng/μl，1个反应体系中加入ddH2O代替质粒DNA作为阴性对照组，在荧光PCR仪中进行反应，观察扩增情况，筛选出可被该型别不同浓度质粒DNA扩增，又无交叉反应的最佳引物，即特异性、灵敏性具佳的引物，在保证30种HPV型别的相互间无交叉反应的基础上，同时保证引物核酸序列具有较高的扩增效率。
引物灵敏性与特异性检测反应曲线，见图2；其中线1：HPV1质粒浓度为1 ng/μl时，HPV1核酸引物序列的扩增曲线；线2：HPV1质粒DNA浓度稀释2倍时，HPV1核酸引物序列的扩增曲线；线3; HPV1质粒浓度稀释220倍时，HPV1核酸引物序列的扩增曲线；线4：加入HPV2、HPV3、HPV4、HPV5、HPV7、HPV8、HPV9质粒DNA时，HPV1核酸引物序列的扩增曲线；线5：加入HPV10、HPV12、HPV14、HPV27、HPV28、HPV29、HPV41质粒DNA时，HPV1核酸引物序列的扩增曲线；线6：加入HPV48、HPV49、HPV50、HPV57、HPV63、HPV65、HPV75质粒DNA时，HPV1核酸引物序列的扩增曲线；线7：加入HPV76、HPV77、HPV94、HPV95、HPV 115、HPV117、HPV125、HPV160质粒DNA时，HPV1核酸引物序列的扩增曲线；线8：无质粒DNA的阴性对照组。
一、对临床样本进行HPV型别检测。
使用筛选出的引物核酸序列检测皮肤疣临床样本型别。
样本来自中国医科大学附属第一医院皮肤科门诊皮肤疣病人，收集30例皮肤疣临床样本，使用质粒小量DNA提取试剂盒提取样本DNA，反应体系中加入约1ng临床样本DNA，反应体系同实施例1中的步骤1；使用通用皮肤型HPV引物核酸序列对样本进行测序检测，如图3，其中条带1：样本1扩增产物电泳带；条带2：样本2扩增产物电泳带；条带3：样本3扩增产物电泳带；条带4：样本4扩增产物电泳带；条带5：样本5扩增产物电泳带；条带6：样本6扩增产物电泳带；条带7：样本7扩增产物电泳带；条带8：样本8扩增产物电泳带；条带9：样本9扩增产物电泳带。两种检测方法测出样本的HPV型别，对比结果，可看出本发明核酸序列的检测正确率为100%，且灵敏性更高，检测结果见表3。
表3两种检测方法结果对比。
检测结果显示，本发明的核酸序列检测结果比通用引物检测结果准确。
序列表
＜110＞中国医科大学附属第一医院，中国科学院过程工程研究所，中科芯瑞（苏州）生物科技有限公司
＜120＞用于皮肤型人乳头瘤病毒分型检测的核酸序列及其应用
＜160＞60
＜210＞1
＜211＞18
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV1正向引物
＜400＞1
gctgtactcc tgcttcag 18
＜210＞2
＜211＞19
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV1反向引物
＜400＞2
tgcatgttgc ttgaacaac 19
＜210＞3
＜211＞20
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV2正向引物
＜400＞3
ctgccagttt acaggatac c 20
＜210＞4
＜211＞18
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV2反向引物
＜400＞4
agacacggta ggcatagc 18
＜210＞5
＜211＞20
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV3正向引物
＜400＞5
tgggttgtac cccacctatg 20
＜210＞6
＜211＞18
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV3反向引物
＜400＞6
gcaggtggtc tggcaaat 18
＜210＞7
＜211＞20
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV4正向引物
＜400＞7
cctgcaatag gtgaacattg 20
＜210＞8
＜211＞19
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV4反向引物
＜400＞8
ggccatttac aaactgtgg 19
＜210＞9
＜211＞24
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV5正向引物
＜400＞9
gatccaaatg tttattgtag gatg 24
＜210＞10
＜211＞21
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV5反向引物
＜400＞10
attgacgatg tctaaactga c 21
＜210＞11
＜211＞20
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV7正向引物
＜400＞11
gagtgtttag agtacgcttg 20
＜210＞12
＜211＞20
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV7反向引物
＜400＞12
cagacgagtt ttccacatct 20
＜210＞13
＜211＞21
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV8正向引物
＜400＞13
tgttttagca caaatcaatg c 21
＜210＞14
＜211＞22
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV8反向引物
＜400＞14
cattccagaa gttaaacttt gc 22
＜210＞15
＜211＞18
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV9正向引物
＜400＞15
accgtttgct aacagtgg 18
＜210＞16
＜211＞22
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV9反向引物
＜400＞16
gcctatttca atacctctac ag 22
＜210＞17
＜211＞21
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV10正向引物
＜400＞17
catattaaag agcaacggtg g 21
＜210＞18
＜211＞19
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV10反向引物
＜400＞18
tcagaaggaa cacacaagc 19
＜210＞19
＜211＞21
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV12正向引物
＜400＞19
ctcaaataac tatgccacag g 21
＜210＞20
＜211＞22
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV12反向引物
＜400＞20
gtcaccatct tcaatgaaag tg 22
＜210＞21
＜211＞21
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV14正向引物
＜400＞21
aggtatagaa ataggcagag g 21
＜210＞22
＜211＞18
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV14反向引物
＜400＞22
ttctacacat ggcaaggc 18
＜210＞23
＜211＞21
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV27正向引物
＜400＞23
ccaataggtc tgatgttcct t 21
＜210＞24
＜211＞19
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV27反向引物
＜400＞24
ggtccgagat agtggtact 19
＜210＞25
＜211＞18
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV28正向引物
＜400＞25
cacaacaggg agattgcc 18
＜210＞26
＜211＞18
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV28反向引物
＜400＞26
aacatgctgt cgccatac 18
＜210＞27
＜211＞18
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV29正向引物
＜400＞27
acagagtctc aaccgttg 18
＜210＞28
＜211＞19
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV29反向引物
＜400＞28
cgtgtcttcc aagctagtg 19
＜210＞29
＜211＞18
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV41正向引物
＜400＞29
tactttcctc catgctgc 18
＜210＞30
＜211＞19
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV41反向引物
＜400＞30
aacctcaat cccacgaat 19
＜210＞31
＜211＞22
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV48正向引物
＜400＞31
gagactctgt cttctttttt gg 22
＜210＞32
＜211＞19
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV48反向引物
＜400＞32
cgtctaagcc aataaggcc 19
＜210＞33
＜211＞18
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV49正向引物
＜400＞33
cctgcagcaa gtcaacag 18
＜210＞34
＜211＞19
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV49反向引物
＜400＞34
gccatccgta cttacacta 19
＜210＞35
＜211＞24
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV50正向引物
＜400＞35
ggatgctgat atattagctc atct 24
＜210＞36
＜211＞21
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV50反向引物
＜400＞36
tttctgtaag gttgacattc c 21
＜210＞37
＜211＞21
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV57正向引物
＜400＞37
ccggatgagc tatatgtcaa g 21
＜210＞38
＜211＞20
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV57反向引物
＜400＞38
acaaagagac atttgtgctg 20
＜210＞39
＜211＞18
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV63正向引物
＜400＞39
ttcctaccca accgatca 18
＜210＞40
＜211＞20
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV63反向引物
＜400＞40
ttatctccaa aggcaaatcg 20
＜210＞41
＜211＞20
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV65正向引物
＜400＞41
ccattggatg tagttgctac 20
＜210＞42
＜211＞18
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV65反向引物
＜400＞42
atcctgacct tcttgagc 18
＜210＞43
＜211＞20
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV75正向引物
＜400＞43
ccttaaaatg gccaatgaca 20
＜210＞44
＜211＞22
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV75反向引物
＜400＞44
cgtgggaaca taaatagagt tg 22
＜210＞45
＜211＞18
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV76正向引物
＜400＞45
tccttactgt aggccacc 18
＜210＞46
＜211＞18
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV76反向引物
＜400＞46
acctctacag gcccaaac 18
＜210＞47
＜211＞18
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV77正向引物
＜400＞47
tactacccca ggagactg 18
＜210＞48
＜211＞18
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV77反向引物
＜400＞48
aaacagttgt tcccgacg 18
＜210＞49
＜211＞20
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV94正向引物
＜400＞49
gacttcactg cattacagtt 20
＜210＞50
＜211＞18
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV94反向引物
＜400＞50
ccaacgtttt ggtcacca 18
＜210＞51
＜211＞18
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV95正向引物
＜400＞51
ttcttctttg gccgaagg 18
＜210＞52
＜211＞22
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV95反向引物
＜400＞52
cggttaaaaa gctgagattc ac 22
＜210＞53
＜211＞21
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV115正向引物
＜400＞53
acatacaaag gactgacatc t 21
＜210＞54
＜211＞22
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV115反向引物
＜400＞54
gtagtatcta ccaatgcaaa cc 22
＜210＞55
＜211＞18
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV117正向引物
＜400＞55
ctagttctgt tggggacg 18
＜210＞56
＜211＞18
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV117反向引物
＜400＞56
ccaccacagt cacaaaca 18
＜210＞57
＜211＞19
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV125正向引物
＜400＞57
cctgattatt tgggcatgg 19
＜210＞58
＜211＞21
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV125反向引物
＜400＞58
gtgtaggaca atatacagca c 21
＜210＞59
＜211＞18
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV160正向引物
＜400＞59
taggcctcag tggtcatc 18
＜210＞60
＜211＞18
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜220＞
＜221＞HPV160反向引物
＜400＞60
caatcacctg acgtggat 18

Claims (5)

1.用于皮肤型人乳头瘤病毒分型检测的核酸序列，其特征在于，所述的核酸序列具体为可用于分型检测皮肤型别的人乳头瘤病毒的30个引物核酸序列；所述引物的核酸序列如SEQ ID No：1至 SEQ ID No：60。
2.如权利要求1所述的30对引物核酸序列，其特征在于，可以用于制备快速检测皮肤型HPV型别的诊断产品。
3.如权利要求2所述的快速检测皮肤型HPV型别的诊断产品，其特征在于，所述的诊断产品为试剂盒。
4.如权利要求2所述的30对引物核酸序列，其特征在于，所述的试剂盒具体包括以下组分：所述30对引物中的一对引物，SYBR Green I，dNTPs，pfu DNA聚合酶，10×pfu Buffer。
5.如权利要求4所述的30对引物核酸序列，其特征在于，所述试剂盒中的组分具体为：所述引物对中的引物各0.2μm，SYBR 120μm，dNTP 0.8μm，pfuDNA聚合酶2.5U，10×pfuBuffer 5μl。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110195128A (zh) * 2019-03-13 2019-09-03 中国医科大学附属第一医院 基于恒温核酸扩增技术的皮肤型hpv分型检测引物核苷酸序列及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102168147A (zh) * 2010-02-26 2011-08-31 宁波基内生物技术有限公司 用于检测人乳头瘤病毒的引物组合物、试剂盒及方法
CN102428183A (zh) * 2009-05-07 2012-04-25 天主教大学产学协力团 人类乳头瘤病毒检测用引物、探针及使用它的人类乳头瘤病毒的检测方法
CN105018640A (zh) * 2014-04-17 2015-11-04 兰州安康伯乐生物技术有限公司 高危型人乳头瘤病毒hpv16、18荧光pcr检测试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102428183A (zh) * 2009-05-07 2012-04-25 天主教大学产学协力团 人类乳头瘤病毒检测用引物、探针及使用它的人类乳头瘤病毒的检测方法
CN102168147A (zh) * 2010-02-26 2011-08-31 宁波基内生物技术有限公司 用于检测人乳头瘤病毒的引物组合物、试剂盒及方法
CN105018640A (zh) * 2014-04-17 2015-11-04 兰州安康伯乐生物技术有限公司 高危型人乳头瘤病毒hpv16、18荧光pcr检测试剂盒

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARIA SATRA等: "Sequence-based genotyping HPV L1 DNA and RNA transcripts in clinical specimens", 《PATHOLOGY – RESEARCH AND PRACTICE》 *
MARKUS SCHMITT等: "Evaluation of a Novel Multiplex Human Papillomavirus (HPV) Genotyping Assay for HPV Types in Skin Warts", 《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》 *
SHIH-YEN CHAN等: "Analysis of Genomic Sequences of 95 Papillomavirus Types: Uniting Typing, Phylogeny, and Taxonomy", 《JOURNAL OF VIROLOGY》 *
YAN-JUN LEI等: "Development of a multiplex PCR method for detecting and typing human papillomaviruses in verrucae vulgaris", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 *
何泳洁: "132例皮肤疣组织HPV分型检测", 《2011年国家级医学继续教育项目论文集》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110195128A (zh) * 2019-03-13 2019-09-03 中国医科大学附属第一医院 基于恒温核酸扩增技术的皮肤型hpv分型检测引物核苷酸序列及应用
CN110195128B (zh) * 2019-03-13 2023-02-10 中国医科大学附属第一医院 基于恒温核酸扩增技术的皮肤型hpv分型检测引物核苷酸序列及应用

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