具体实施方式
本发明公开了长链非编码RNAs中CCAT2、LINC00511和LINC01133的应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明所述应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明通过从患者血清或者血浆中提取RNA,利用polyA加尾法逆转录,反转录cDNA,然后再通过实时定量PCR反应扩增CCAT2、LINC00511和LINC01133并检测其在血清中的含量,与正常血清相比,相对含量高于正常血清值即可诊断为宫颈癌,其中所涉及的步骤如下(SCC检测采用本领域常规方法):
A.血清总RNA的提取
1)取-80℃冰箱保存的血清250mL,加入750ml Trizol LS,取移液器将其混匀,于室温放置5分钟裂解。
2)加入200μL三氯甲烷,加速RNA相的分离,来回摇晃EP管15秒,室温静止15分钟后,于12000rpm离心10分钟。
3)取上清液体400μL加入等体积异丙醇,室温静置10分钟后,12000rpm离心10分钟。
4)加入用RNase-free去离子水配制的预冷75%乙醇清洗沉淀,8000rpm离心5分钟后,室温晾干。
5)加26μL RNase-free的水溶解沉淀,-80℃保存。
B.长链非编码RNAs的逆转录
cDNA第一条链的合成按照Reverse Transcriptase M-MLV for First StrandcDNA试剂盒说明书进行。具体操作如下:
1.取用RNase free的PCR管,依次加入下列试剂:
DNA-free Total RNA 12μL
Random primer(25μm) 2μL
混匀并离心。
2.70℃保温10min后迅速在冰上急冷2min以上,离心数秒。
3.在上述PCR管中配制下列反转录反应液:
上述模板RNA/引物变性溶液 14μL
5×M-MLV Buffer 4μL
dNTPs(10mM) 1μL
RnaseInhibitor(40U/μL) 0.5μL
Rnase M-MLV(RnaseH-) 0.5μL
Rnase free ddH2O补足至 10μL
30℃孵育10分钟后,42℃保温一小时。
4.70℃保温15min后冰上冷却,灭活逆转录酶。
5.向cDNA产物中添加RNaseFree ddH2O补足至100ul,存于-20℃或者-80℃冰箱中,备用。取2ul稀释液进行下一步Real time PCR反应。
C.实时定量PCR反应
以上述cDNA为模板,用
Premix Ex TaqTM试剂盒(TakaRa),在ViiATM7荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)上进行操作。以GAPDH为内参(GAPDH上下游引物如SEQID No.10-11所示),定量方法选用2-ΔΔCt法。具体操作如下:
1)反应体系
表1
试剂 |
体积(μL) |
上游引物(10μM) |
0.8 |
下游引物(10μM) |
0.8 |
模板cDNA |
2 |
SYBR Premix Ex TaqⅡ(2x) |
10 |
ROX Reference Dye(50x) |
0.4 |
去离子水 |
6 |
总体积 |
20 |
2)RT-qPCR引物
表2
Official Symbol |
Primer(5’-3’) |
CCAT2-F |
CCCTGGTCAAATTGCTTAACCT |
CCAT2-R |
TTATTCGTCCCTCTGTTTTATGGAT |
LINC00511-F |
TCCTCACAGGGGGTAGTAGG |
LINC00511-R |
CCCTTCTCCCTCGGTCATTT |
LINC01133-F |
GCTGTGGTGGAGAGAATGGA |
LINC01133-R |
CCCCAGCTTTCCAGATCCAAA |
GAPDH-F |
CCTGGTATGACAACGAATTTG |
GAPDH-R |
CAGTGAGGGTCTCTCTCTTCC |
3)反应条件:95℃预变性30秒,然后95℃15秒,60℃30秒,45个循环;
4)融解曲线反应:在上述循环结束后,进行融解曲线绘制,条件为95℃15秒,60℃1分钟,95℃15秒。每个样品均重复三次取平均值,以保证定量精确。
以下就本发明所提供的长链非编码RNAs中CCAT2、LINC00511和LINC01133的应用做进一步说明。
实施例1:实时定量PCR对血清non coding RNA的水平检测
血清样本来自于115例宫颈鳞癌(CESC)患者和101例正常对照者,所有研究对象均为汉族且无直系亲属关系。宫颈鳞癌患者为2016年至2017年在中国医学科学院肿瘤医院进行治疗的患者。病人的纳入标准是以病理检查为依据。全部的样本均经组织病理学或细胞学确认,采血前未经放疗、化疗及手术治疗法;既往有其它肿瘤病史的患者排除在外。正常对照者随机选自同一时期在中国医学科学院肿瘤医院进行体格检查的正常人群。正常对照组纳入标准为:无肿瘤病史和临床体征,性别和年龄与宫颈鳞癌组匹配。每个研究对象均签订知情同意书。经问卷或病历记录提供详细的人口学资料。
随机选取30例正常健康人血清和30例CESC患者血清进行了筛选试验。与正常对照组相比,CCAT2、LINC00511和LINC01133在CESC血清中明显升高,且差异显著。为了进一步验证其结果的可靠性,本发明进一步一步扩大了样本量,又随机选取71例正常对照与85例CESC患者血清进行了检测,得到了相似的结果。
与正常对照组相比,CCAT2、LINC00511和LINC01133平均升高的倍数分别为2.70、1.57与3.15倍。秩和检验计算出此3种长链非编码RNAs的表达差异,p值分别为0.000、0.005与0.000。数据经内参校正后的相对表达水平作图(见图1)。
实施例2:3种长链非编码RNAs作为CESC血清标志物的ROC分析
分别按照宫颈鳞癌癌患者与正常人血清中实时定量PCR的结果,根据-△△ct求值并做起相应的ROC曲线,观察曲线下面积及95%置信区间的范围来确定其灵敏性和特异性;ROC曲线下的面积值在1.0和0.5之间,在AUC>0.5的情况下,AUC越接近于1,说明诊断效果越好。AUC在0.5~0.7时有较低准确性;AUC在0.7~0.9时有一定准确性;AUC在0.9以上时有较高准确性;AUC=0.5时,说明诊断方法完全不起作用,无诊断价值;AUC<0.5不符合真实情况,在实际中极少出现。
如图2所示,CCAT2、LINC00511和LINC01133的AUC值分别为0.789、0.615、0.806;而联合3种长链非编码RNAs与SCC绘制ROC曲线,敏感性与特异性分别为81.6%与97.1%,约登指数为0.787,并且AUC值达到了0.94(95%可信区间IC:0.907-0.972)。本发明还分析了目前临床上常用来作为宫颈癌诊断的血清标记物SCC的曲线下面积,AUC值为0.756(95%可信区间IC:0.688-0.824),敏感性与特异性分别为52.6%与90.4%,约登指数为0.430。研究结果表明,与SCC相比,多个长链非编码RNAs与SCC的联合诊断效率更高,敏感性与特异性更强。虽然SCC作为宫颈鳞癌诊断的特异性比较高,但是灵敏度太差,尤其是对早期宫颈癌的诊断。因此,基于三种长链非编码RNAs与SCC联合建立的诊断模型的诊断价值高于SCC对宫颈鳞癌的诊断。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 遵义医学院附属医院
中国医学科学院肿瘤医院
<120> 长链非编码 RNAs的应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1752
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgaggtgat caggtggact ttcctggatg ttctgggtct tgacctgatt gctgaaaaat 60
gaatacaaat tcagagaaga agaaagctag tatgagacta ccaaatgatc atcagacatt 120
tcttgaacac caattaaatt gctaggtatg ctaaagtttg caaaactggt atagacacca 180
agagggaggt atcaacagag actccccaag agctaagagg aaaccacctt ggactggaag 240
tcaagagcca aaattctaga ctctactctg taattaacta cctatttgaa tttggaaaaa 300
tcaccatcaa ctttcccagc ctcgttctct gcatctggga aatgaaggcg tcgtccaaat 360
gattacaagc ttcttttcct gctcttattg catgattcca cttccacagc cctccagcat 420
tttttagcag ctgcatcgct ccatagagcc tgcagagggc actagactgg gaattagaaa 480
acctgatttc ccttccagct ccacctctga ccaattgcct gaccctggtc aaattgctta 540
acctcttcct atctcagctc cctatccata aaacagaggg acgaataaac tctcctccta 600
ccactaagag gtgtagccag agttaatacc ctcatcgtcc tttgagctca gcagatgaaa 660
ggcactgaga aaagtacaaa gaatttttat gtgctattga ctttatttta ttttatgtgg 720
gggagggagc cggccccagc tggaaagctg ctttctctga atcaaagggc aggaacccag 780
caagtttctc aggattgggg ccttagactg ggctgtgtat acagacagtg ccagccaacc 840
ccacagttca gtttccttta acctggtgct ccaggcaata actgtgcaac tctgcaattt 900
aacaatgtgt tctttgtccc acaactgttc tcgtttctca actgcccagg taatatgttt 960
gggcctgtag gaagagtcaa atagttaata agggaagggt ttggcatgcc ctacgtaagt 1020
tctaccagca agtcccaaca agaaggcatt ctgtgtctcc tgattcctga cctaccccca 1080
aaatgtacaa atgtacaagg aatgagccca ctttcccagc aggctgtaat accagtttgg 1140
cctatatcaa tgcattggtg agctgtgttt tgtttatggt tttatgccat ctattttccc 1200
atggatatta tgttttctaa agagccctta agtttacgtc agcttttaaa gctaccagca 1260
gcaccatttc agttcatatt aagcccttaa tatggtatga ataggagagc tattagacta 1320
aagagccata atcatccctg aggaaaacat ccatcaccaa catttatgtg gtccctgaac 1380
ttctaaaagg tgtcatctct ctggggtgta tctggtgaga gctttctctg ggagatgcca 1440
aaaagccaat gcattagatg aagcttagaa gggcattttc taaccattac aaattgccta 1500
gtctagcatc tcaatttcat ctacgtgaag agccttaatt aaatttgttg gggtttgatc 1560
ctttatcccc agatgtggcg ctgacagaga ttgcttacat aaataatgtg tgctccaagt 1620
gcttgccagg ctcctggctc agctgggaca gctgtagctt tttgaatgtc attcccaaga 1680
tatcctgcag gtgttcagct tcccctgttc tactctggga agagagccgt gggcaacatc 1740
agcccagaag ac 1752
<210> 2
<211> 2265
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaggggcgat gcgccccgga gggggaggga cgcaaggggc gactactgtt acctcgcttg 60
gagataccaa ggccggtcgg accccccgct ggccgaatgt ggggagcgag cagatccagc 120
ctgtttggac gtggtgagga cccagccgtg gggtttaagg ccaagttagc ctctcccttc 180
actgattaca agagccattg ttacaggtgc tcacatgcca ggagaaataa gctggtgatt 240
tatgtggcac agcaccatcg atcgacctac aaaggaagct tcagtgcagc cgtgttgcta 300
tacagacctc tctcaccaag gcgtcatgaa ctgaagggct gggagaggcc tcgtggagga 360
ggaagagttt cgctcagctg cttgggtgtg ggactgaatg tggttccaga actggtcgct 420
gccttcaccc gctgactctg gtctcggcga tgacaagccc atggaacaga cttacggcgt 480
atgacctcat cggagacttg tacatggggc caacccccat tttcccacag gaaacccaca 540
ctctaattaa gggctgaccc tgaacttgaa tctgagtctt ctctttcttc aacagagagc 600
catctctcca gcccagctgg caaggagaca ggtgatgtta caggaaaaaa tacacagctt 660
gtgcccttgg aattaccaga gttcaaagcc tgttcagcat ctacccacca tgtgacccgg 720
gtcgaattct tcagtttctc taagcccatt ttctcatctg taagatgggg aagtgtaatc 780
agttctgaac ccacatatac ctcactgggc ttgaacaggc ctgagcaggc atgtggggct 840
ttactagcta gccatccttt ctgccgctct ccctcattct ccttcaagcc ccccaaagtc 900
cttggtggag gaggaagtgg agacagaacg tttggtgttg ggtgaggtac gtgaggaggc 960
tgatttcaga acctccagga aacaaagctt tagtgttccg agggcagtgc ccgcctgtgc 1020
ctcctcctca cagggggtag taggagtggg gtggggccga ggcatttccc agcacagctc 1080
aatcacatct cctgcgcctg cccttgtgac ctgctcactg gaaaggaaga aatgaccgag 1140
ggagaaggga gggcatttga ggggagaaga agaggatgga gaaaaaaact ggatcatctc 1200
gtgacatgga aagaaaggtc tgagctctga cgatcccctc acgtgattat aggcatgagg 1260
actcactctt cgaattgttt gaaaattgaa tggactggct cacaccttct gaaatttctt 1320
ggaagctctg gagtaactat tccactaaag aacagcgtgt ttttggctga aatctgtgac 1380
tgtttgtttt tgagttattt taatctctgt gtcaagcatg aaaacctcag cagcctggga 1440
tttataatta gatcccactg gcatgccctc tcacctctca aacatgccac agtgctttgg 1500
ctctctcctt gtgcaaacct ccctttgata tttttggata tcgataccaa gtgtatctgc 1560
atattttaac caactgatat gcatatcctg tgatctgagg cattcgctca atgtggggca 1620
tcaggccagc tgtgaacttc ctttaaaatt tattttgtgt caaatgattc cctaatgcta 1680
tagctccctt gaactgctag atttatgaaa attctgcaca acacatagct cagagaaaaa 1740
aaaaaaagag tgttgcaaga ccagatatag gatatcattt gatttgttta aaacactctg 1800
tccagggggt tttgacttgc taatttaaaa ataattctaa aattaggtac agttgaccct 1860
tagtatccat gggggattgg ttccaggatg ccctgtggat accagaatcc aaggatgctc 1920
aagttcctga cataaatggc ttagtgtttg catataacct actcccctct tcctatatac 1980
tttaaataat ctctagatta cttataatgc ctaacacaac gcctgtgcat cacttcattc 2040
atgtggattc aatgtagtac ttggtgtgaa gaaaatttaa gtcttgcttt ttggaacttt 2100
gtggattttt ttttctggaa tgtttttgat ctgcagttgg ttgaatccac aggtgcagaa 2160
ctatggacac agggggctga ctatgtatat ttatatccac ttgcaaaatt aagaataaaa 2220
ataatgtgca tcagcaggtg cagattctga tgctcggtgg acagt 2265
<210> 3
<211> 1154
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgatgtaac agccttggga aagaggttgc agtgaaaagc tggtcctgct gtggtggaga 60
gaatggagga aagataataa aaggccaaac ctttgctcca actttctcct tagcttccct 120
ttggatctgg aaagctgggg acccacacgg cagagccatg gtactggagg agccattaac 180
aaagctttca ataaacctct ctttcttgaa gttacctgag aatggatcca ttccctgcaa 240
ctgaagattc taaggaactg ggtttctcag tatacaatgg gaatggttgg gaggaggtaa 300
agagtagaag acagtatcaa gaatccagag cccagcacct gtagtcctaa ctattcagat 360
tccttgagcc caggagtttg agtccagcct ggacaacata ttgagacccc catctctcta 420
aaaaaaaaga gaaagaaaga aggaaagaaa aaaagaaaga aagaaagaaa gaaagaaaga 480
aagaaagaaa gaaagaaaga gaaagaaaga aggaaagaag gaaagaagga aagaaagaaa 540
gaaagagaaa gaaagaaaag aagattgtag ctagggggag agtaggtgaa aagatgaaca 600
acatgaccgg gaagatttcc taatctcacc acagcctggc tctaccttaa gtctttaata 660
aaagcttgac tgaaggtacc aaggtgtgct gaagtggaag caaagttctc caaagtccag 720
catggtagac atcagtggtg gtaaccaagg acagacccca aggcaaggtg aacctcaaaa 780
atggaacctc aagtctatgc agtccagctg ccctccccac cagaaagtcc ttgttccagc 840
ccaacatcag tgcctctgag tttgtttact agaaacaaag gaagaatttc cttgtaaaaa 900
tatagacaga gtagtccctg gctttctcct cttgcaggaa ggatggattc tcccattcca 960
taccatcttt cccccacact ggccccagaa atacttaatt caactatgtg aaaataaaga 1020
ttgtttttgg tttgagggca tagggatcca tttatcctta ttctttatga ggcactaaat 1080
tagctttgta tgttattaaa tgtgtctcgt caatgctgtt ggcattgttt cattttaaaa 1140
aaaaaaaaaa aaaa 1154
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccctggtcaa attgcttaac ct 22
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttattcgtcc ctctgtttta tggat 25
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcctcacagg gggtagtagg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccttctccc tcggtcattt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctgtggtgg agagaatgga 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccccagcttt ccagatccaa a 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cctggtatga caacgaattt g 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cagtgagggt ctctctcttc c 21