CN115198014A - 一种用于胰腺癌早期诊断的外泌体miRNA标志物组合及检测试剂盒 - Google Patents
一种用于胰腺癌早期诊断的外泌体miRNA标志物组合及检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物医药、分子生物学领域，具体涉及一种用于胰腺癌早期诊断的外泌体标志物组合、试剂盒及其应用。本发明提供的检测试剂盒能够简单、快速、无创的对胰腺癌进行早期诊断。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药、分子生物学领域，具体涉及一种用于胰腺癌早期诊断的外泌体标志物组合、试剂盒及其应用。
背景技术
据最新研究数据显示，胰腺癌发病率居于全球肿瘤的第9位，死亡率居于全球肿瘤的第4位，且患者术后5年的生存率低于5% 。而我国每年胰腺癌新发病例已超过9万例，其中死亡病例接近90%。目前，针对胰腺癌的治疗策略包括手术、化疗、放射治疗以及靶向治疗都没有显著的治疗效果，不能显著延长胰腺癌术后生存率。因此，寻找胰腺癌早期特异性基因及分子标记物，实现对胰腺癌早期诊断、治疗及判断预后已成为当前研究的热点。此外，miRNA是一类具有调控作用的内源性非编码RNA，通过复杂的基因网络调控影响肿瘤的发生和进展，与肿瘤的发生、进展、诊断和预后密切相关。随着分子生物学技术的蓬勃发展，越来越多的证据显示miRNA在胰腺癌发生进展的过程中起着重要的调控作用。因此，对miRNA的功能和作用机制的研究越来越引起科研工作者的重视。在过去的几十年中，miRNA作为与人类和其他生物体中基因表达调控相关的重要分子而出现，从而扩大了可用于诊断和处理多种疾病的策略。到目前为止，miRNA约占人类基因组的3%，在生理条件下，miRNA在控制组织动态平衡和细胞信号传导中起关键作用，是基因表达的转录后机制。这些分子的协调功能与其他机制相关，可避免异常细胞增殖的发生，调节细胞分化并响应检测到的内分泌激素和其他刺激（例如细胞因子，趋化因子，感染性或应激性条件）而对mRNA进行精细调节。并控制人类中>60％的蛋白质编码基因的表达。自从在慢性淋巴细胞性白血病中报道了miR-15和miR-16的异常表达以来，越来越多的证据表明miRNA突变或错表达与多种人类癌症有关，并表明miRNA可以充当肿瘤抑制因子或致癌基因。它们充当基因表达的调节剂，从而在调节广泛的细胞过程（包括生长，分化，增殖和凋亡）中发挥关键作用。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种胰腺癌早期诊断的外泌体miRNA标志物组合、试剂盒及其应用，本发明提供的检测试剂盒能够简单、快速、无创的对胰腺癌进行早期诊断。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于胰腺癌早期诊断的外泌体miRNA标志物组合，所述外泌体miRNA标志物组合包括以下九种miRNA：hsa-miR-21-5p 、hsa-miR-375-3p 、hsa-miR-217-5p 、hsa-miR-100-5p、 hsa-miR-148a-5p 、hsa-miR-199a-5p 、hsa-miR-130b-3p 、hsa-miR-218-5p 、hsa-miR-511-5p。
进一步的，所述的用于胰腺癌早期诊断的外泌体miRNA标志物组合在胰腺癌诊断中的应用。
进一步的，所述的用于胰腺癌早期诊断的外泌体miRNA标志物组合在胰腺癌诊断检测试剂或者方法中的应用。
进一步的，所述的用于胰腺癌早期诊断的外泌体miRNA标志物组合在胰腺癌诊断检测试剂盒中的应用。
一种用于胰腺癌早期诊断的检测试剂盒，包括所述的胰腺癌早期诊断的外泌体miRNA标志物组合的9种miRNA的qPCR引物、反转录酶、缓冲液等试剂及qPCR扩增。
进一步的，所述的qPCR引物序列如SEQ ID NO. 所示。
进一步的，所述的试剂为poly-A加尾法反转录试剂和qPCR检测试剂。
进一步的，所述的胰腺癌早期诊断检测试剂盒包括阳性对照样品、阴性对照样品、cel-miR-39-3p外参标准品、逆转录酶、dNTP、缓冲液、超纯水、DNA聚合酶、SYBR Green荧光染料中的至少一种。
本发明对待检测样品中的miRNA进行poly-A加尾反转录方法，由于内参无法满足要求，因此独创性的加入cel-miR-39-3p外参标准品以达到精确计算待测样品中9种miRNA标志物的绝对定量。
与现有胰腺癌检测方法相比，本发明的优势效果如下：
1）本发明提供的胰腺癌早期诊断外泌体miRNA标志物组合属于液体活检，与临床上的组织活检有明显优势，可以实现无创、灵敏度高、检出时间提前、特异性高、检测效率高等特点进行胰腺癌的早期诊断。
2）本发明提供的胰腺癌早期诊断外泌体miRNA标志物组合的检测方式采用poly-A加尾法，一次性可以将所有的待检测样品中的miRNA进行加尾和反转录，提高了检测效率，很好的避免了常规的茎环法多次反应带来的实验误差。在实际应用中已经有多种验证，具有高灵敏度等特点。
3）本发明提供的胰腺癌早期诊断外泌体miRNA标志物组合通过53例临床疾病组和正常组样本进行的验证实验，在胰腺癌和正常人群中存在显著差异，是一种理想的、可靠的、有效的胰腺癌早期诊断标志物组合。
4）本发明提供的胰腺癌早期诊断外泌体miRNA标志物联合检测试剂盒，通过训练集对测试样品的检测结果显示，其灵敏度达到95%，特异性达到98%，对于未来临床上胰腺癌的早期诊断具有非常重大的意义。
附图说明
图1是本发明案例实施的流程图。
图2是本发明提供的9种外泌体miRNA联合诊断标志物的AUC曲线。
图3 是本发明提供的9种外泌体miRNA联合诊断标志物在53例临床样本中的表达差异情况。
具体实施方式
本发明实施例种所涉及的试剂均为市场销售产品，如无特殊说明，均可通过国内国外商业公司购买。在本发明的实施例中，通用的反转录引物和qPCR酶等都是通过上海生工生物购买合成。
一种用于胰腺癌早期诊断外泌体miRNA标志物组合，所述的外泌体miRNA标志物组合包括以下miRNA：hsa-miR-21-5p 、hsa-miR-375-3p 、hsa-miR-217-5p 、hsa-miR-100-5p、 hsa-miR-148a-5p 、hsa-miR-199a-5p 、hsa-miR-130b-3p 、hsa-miR-218-5p 、hsa-miR-511-5p。
本发明所涉及的hsa-miR-21-5p 、hsa-miR-375-3p 、hsa-miR-217-5p 、hsa-miR-100-5p、 hsa-miR-148a-5p 、hsa-miR-199a-5p 、hsa-miR-130b-3p 、hsa-miR-218-5p 、hsa-miR-511-5p的miRNA标志物序列见表1（SEQ ID: 1-9），所有miRNA标志物的qPCR序列见表2（SEQ ID: 10-18）.
本发明实施的流程图如图1所示，具体操作步骤如下：。
1、候选标志物筛选
通过NCBI-GEO数据库和来自宜昌市中心人民医院收集的10例胰腺癌和正常人群的血浆样品，进行高通量测序后联合分析，挖掘其中30个差异显著的外泌体miRNA标志物。利用poly-A加尾法进行反转录，qPCR检测30个miRNA在10例样品中的表达水平，检测时外参方法采用固定质量的cel-miR-39，最终确定以上所述的9个外泌体miRNA标志物作为胰腺癌早期诊断标志物的大规模验证内容。
2、以标准操作流程采集符合要求的血浆样品，收集完整的个人信息和临床数据，建立高通量数据库。
3、对另外收集的53例血浆样品，其中胰腺癌患者30例，正常人群23例，通过poly-A加尾法反转录以及qPCR的方法，检测9个外泌体miRNA标志物的表达水平，检测指标为：ΔCt值=CtmiRNA-Ctcel-miR-39。判定胰腺癌的结果为ΔCt值≥2.5。
4、利用AUC曲线，分析9个miRNA标志物在53例样本中的诊断效果，最终建立了标准的9种外泌体miRNA联合诊断标志物组合，并建立判定发病风险的阈值。
实施例
一、血浆样本收集标准及血浆样本准备
使用EDTA抗凝采血管采集2018-2020年宜昌市中心人民医院志愿者外周血样本，采集了基本的样本信息、健康状况以及所需的临床资料。将样本4℃冰箱放置3小时，4000xg，离心10分钟，将细胞碎片以及杂质等离心到管底，取其上清液转移到新的离心管中。
二、血浆样本分离外泌体
1、取上述分离好的血浆样本1ml，加入等体积外泌体分离试剂盒，颠倒混匀，是的亲水聚合物终浓度为80mg/ml，体积比为8%。混合后上下轻柔颠倒混匀，并放入4℃冰箱，低温聚合12小时以上。
2、将低温放置后的混合液，4℃离心机中10000xg离心1小时，去掉上清液，离心管底部沉淀即为外泌体。
3、用PBS重新悬浮外泌体，-80℃冰箱保存备用。
三、总RNA提取
将分离好的外泌体样本加入800μL TRizol，充分颠倒混匀后进行离心，吸取中间层，即其中含有外泌体中的总RNA，所得最终RNA的体积大于10μL，浓度大于3ng/μL。
四、反转录
使用poly-A加尾法反转录试剂盒，按照固定步骤进行miRNA反转录，反转录体系为
20μL，加入的总RNA量为30ng，反转录体系见下表。反转录实验是再37℃下放置1小时，然后
90℃灭活反转录酶。具体操作步骤参考的上海生工生物的miRNA First Strand cDNA
Synthesis (Tailing Reaction)：
| 体系构成 | 加入量（μL或ng） |
| 2×miRNA P-RT Solution mix | 10μL |
| miRNA P-RT Enzyme mix | 2μL |
| Total RNA/micro RNA | 30ng |
| RNase-free water | 定容至20μL |
五、荧光定量PCR（qPCR）
qPCR扩增反应使用的试剂盒为上海生工生物的2.5X SYBR Green Abstart One
Step RT-PCR Mix。具体体系构成和用量如表所述：
| 体系构成 | 加入量（μL） |
| SYBR Abstart One Step RT-PCR Mix | 0.8 |
| 2.5X SYBR One Step | 10 |
| RT-PCR buffer | 1 |
| 正向引物 | 0.4 |
| 通用引物 | 0.4 |
| 模板（cDNA） | 0.8 |
| RNase Free-H2O | 定容至20μL |
扩增反应仪器采用ABI7500荧光定量PCR仪，所有操作方法都严格按照仪器使用
说明书进行，反应条件和时间如下表所述：
| 步骤 | 温度 | 时间 |
| 逆转录 | 50℃ | 15min |
| 预变性 | 95℃ | 2.5min |
| 变性 | 94℃ | 15s |
| 退火 | 56℃ | 30s |
| 延申 | 72℃ | 30s |
六、标志物敏感性和特异性分析。将全部样品53例进行AUC诊断效能判定，AUC最大诊断结果为1.0。结果显示9种外泌体miRNA单独检测效能为0.717到0.954，联合诊断效能达0.985，见图2。
序列表
<110> 武汉博越致和生物科技有限公司
<120> 一种用于胰腺癌早期诊断的外泌体miRNA标志物组合及检测试剂盒
<141> 2021-10-08
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 2
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<212> DNA/RNA
<213> 人(Homo sapiens)
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uuuguucguu cggcucgcgu ga 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 3
uacugcauca ggaacugauu gga 23
<210> 4
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<212> DNA/RNA
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aacccguaga uccgaacuug ug 22
<210> 5
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aaaguucuga gacacuccga cu 22
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aaaguucuga gacacuccga cu 22
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cagugcaaug augaaagggc au 22
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gcccagtgtt cagactacct gttc 24
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ggcagtgcaa tgatgaaagg gcat 24
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<213> 人(Homo sapiens)
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ucaccgggug uaaaucagcu ug 22
Claims (7)
1.一种用于胰腺癌早期诊断的外泌体miRNA标志物组合，其特征在于，所述的外泌体miRNA标志物组合包括以下miRNA：hsa-miR-21-5p 、hsa-miR-375-3p 、hsa-miR-217-5p 、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-148a-5p 、hsa-miR-199a-5p 、hsa-miR-130b-3p 、hsa-miR-218-5p 、hsa-miR-511-5p。
2.如权利要求1所述的用于胰腺癌早期诊断的外泌体miRNA标志物组合在胰腺癌诊断中的应用。
3.如权利要求1所述的用于胰腺癌早期诊断的外泌体miRNA标志物组合在制备胰腺癌早期检测试剂盒中的应用。
4.一种用于胰腺癌早期检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述外泌体miRNA标志物组合的qPCR扩增引物和试剂，进行反转录和qPCR扩增。
5.如权利要求4所述用于胰腺癌早期诊断检测试剂盒，其特征在于，所述的引物序列如SEQ ID 10-18 ,所述外参的qPCR引物序列如SEQ ID 19。
6.如权利要求4所述用于胰腺癌早期诊断检测试剂盒，其特征在于，所述试剂为poly-A加尾法反转录配套试剂和qPCR法检测试剂。
7.如权利要求4所述用于胰腺癌早期诊断检测试剂盒，其特征在于所述用于胰腺癌早期诊断检测试剂盒还包括阳性对照样品、阴性对照样品、cel-miR-39-3p外参标准品、逆转录酶、dNTP、缓冲液、超纯水、DNA聚合酶、SYBR Green荧光染料中的至少一种。
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