WO2013125691A1 - テスト体液サンプルの分類方法 - Google Patents

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WO2013125691A1
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hsa
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body fluid
chronic hepatitis
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村上善基
落谷孝広
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住友ベークライト株式会社
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Definitions

  • the present disclosure classifies test body fluid samples into one of two groups selected from four groups consisting of chronic hepatitis C, chronic hepatitis B, non-alcoholic steatohepatitis (NASH), and normal liver.
  • the present invention relates to a method, a kit or a microarray used in the method or use thereof, and a data set used in the method.
  • MicroRNA is deeply related to the pathology of chronic liver disease, that is, from chronic hepatitis to hepatocellular carcinoma (Patent Document 1, Non-Patent Documents 1 and 2). Also disclosed is a method for diagnosing and detecting cancer using exosome-derived microRNA as a biomarker (Patent Document 2).
  • the test body fluid sample is selected from four groups consisting of chronic hepatitis C, chronic hepatitis B, non-alcoholic steatohepatitis (NASH), and normal liver 2. Provide a way to classify into one of two groups.
  • the peripheral blood sample is selected from four groups consisting of chronic hepatitis C, chronic hepatitis B, non-alcoholic steatohepatitis (NASH), and normal liver 2. It relates to a method of classifying into one of two groups. Measuring the expression level of one or more non-coding RNAs in the test body fluid sample.
  • the test body fluid sample is selected from four groups consisting of chronic hepatitis C, chronic hepatitis B, non-alcoholic steatohepatitis (NASH), and normal liver 2. Can be classified into one of two groups.
  • the present disclosure includes the following aspects: [1] Method for classifying a test body fluid sample into one of two groups selected from four groups consisting of chronic hepatitis C, chronic hepatitis B, non-alcoholic steatohepatitis (NASH), and normal liver A method comprising measuring the expression level of one or more non-coding RNAs in the test body fluid sample; [2] The method according to [1], wherein the one or more non-coding RNAs include hsa-miR-451a; [3] Furthermore, using the expression level of the one or more non-coding RNAs in the test body fluid sample and the specimen data information obtained from the two groups of specimen body fluid samples, the test body fluid sample is The method according to [1] or [2], comprising determining which of the two groups belongs; [4] A method for classifying a test body fluid sample into non-alcoholic steatohepatitis (NASH) or normal liver, comprising measuring the expression level of one or more non-coding RNAs in the test body fluid sample The
  • non-coding RNA includes microRNA and tRNA.
  • microRNA / miRNA refers to a kind of small non-coding RNA, and has the usual meaning used in the art.
  • the microRNA referred to herein using ID can refer to a database. Unless otherwise stated, the microRNA names and accession numbers in this specification refer to the data of Release 18 (November 2011) of miRBase (http://www.miRbase.org/). In addition, in the present specification, the microRNA refers to a mature 16- to 25-base microRNA unless otherwise specified.
  • body fluid includes body fluid containing exosomes, and in one or more embodiments, may include blood, lymph, ascites, pleural fluid, saliva, urine, and breast milk. Peripheral blood is preferable as the blood from the viewpoint of ease of collection and reduction of burden on the subject to be collected.
  • a “body fluid sample” can include the body fluid or a sample that can be obtained from the body fluid.
  • the body fluid sample includes plasma and serum forms.
  • the body fluid sample is isolated or purified from the form of a fraction in which exosomes in the body fluid are concentrated or roughly purified (hereinafter also referred to as “exosome rich fraction”).
  • Exosome form may also be used.
  • the body fluid sample is preferably in the form of an exosome-rich fraction or an isolated or purified exosome from the viewpoint of reproducibility of detecting the expression level of non-coding RNA or microRNA.
  • Preparation of an exosome rich fraction and / or isolation or purification of exosomes can be performed using a known method, a commercially available kit, or the like, and can be performed according to the description of Examples described later.
  • the body fluid sample The exosome-rich fraction prepared from peripheral blood plasma or serum is preferred.
  • test body fluid sample refers to a body fluid sample classified by a classification method.
  • specimen body fluid sample refers to a body fluid obtained from an individual known to belong to any of chronic hepatitis C, chronic hepatitis B, non-alcoholic steatohepatitis (NASH), or normal liver. Say a sample.
  • body fluid sample may include the test body fluid sample and the specimen body fluid sample.
  • an “exosome” is one of membrane vesicles secreted from cells, and is generally observed to have a diameter of 30 to 100 nm by electron microscope observation, and has a density by density gradient ultracentrifugation. Is distributed in a fraction around 1.13 g / ml. A cell wraps unnecessary proteins and amino acids in the cytoplasm in a membrane structure (exosome) and then transports it outside the cell. Exosomes are known to circulate in body fluids. In addition, it has recently been reported that exosomes are involved in cell liver signal transduction. In addition, it has become clear that cancer cells encapsulate and secrete their own microRNAs in exosomes (for example, Patent Document 2 above).
  • the individual to which the body fluid is provided includes a human or a non-human animal.
  • the non-human animal include mammals in one or more embodiments, and among them, primates and rodents.
  • chronic hepatitis C is also called chronic hepatitis C, and is generally infected with hepatitis C virus (HCV), and abnormal liver function (hepatitis) continues (generally). Refers to a disease that lasts more than 6 months).
  • chronic hepatitis C may be referred to as “CHC”.
  • chronic hepatitis B is also called chronic hepatitis B, and is generally infected with hepatitis B virus (HBV), and abnormal liver function (hepatitis) continues (generally). Refers to a disease that lasts more than 6 months).
  • chronic hepatitis B may be expressed as “CHB”.
  • Chronic hepatitis is said to progress gradually to liver cirrhosis and further to liver cancer.
  • Chronic hepatitis C and chronic hepatitis B are usually based on information such as blood test for C / B hepatitis virus infection and detection of hepatitis (abnormal liver function), ultrasonography, CT / MRI, etc. Diagnosed by A liver biopsy may be done to find out more about the disease and the degree of progression.
  • AST also called aspartate aminotransferase, GOT (glutamate oxaloacetate transaminase)
  • ALT alanine aminotransferase
  • GPT glutamate pyruvate transferase
  • non-alcoholic steatohepatitis refers to accumulation of fat, mainly neutral fat, in stem cells, and is related to non-drinkers (for example, less than 20 g per day in terms of ethanol). It refers to diseases in which pathological findings similar to alcoholic liver damage are observed. Traditionally, fatty liver has been thought to be an amphoteric reversible disease, but it has been found that some fatty livers, like NASH, can progress to cirrhosis and liver cancer. The importance is recognized as one of the diseases.
  • NASH The diagnosis of NASH is generally required to satisfy the following three conditions: 1) Non-drinker (for example, less than 20 g per day in terms of ethanol) 2) Liver tissue findings are steatohepatitis (large droplets) 3) Exclusion of liver diseases due to other causes, such as fat deposition, inflammatory cell infiltration, balloon-like swelling of hepatocytes).
  • the present disclosure provides a test body fluid sample that is treated with chronic hepatitis C, chronic hepatitis B, non-based based on the expression level or expression pattern of one or more non-coding RNAs in the test body fluid sample. Based on the finding that alcoholic steatohepatitis (NASH) and two groups selected from four groups consisting of normal liver can be classified.
  • NASH alcoholic steatohepatitis
  • normal liver refers to a liver that is not diagnosed with chronic hepatitis C, chronic hepatitis B, non-alcoholic steatohepatitis (NASH), and in one or more embodiments, a blood test (eg, , AST and ALT measurement) refers to a liver in which hepatitis or liver function abnormality is not detected.
  • a blood test eg, , AST and ALT measurement
  • NL a blood test
  • the present disclosure may select the test fluid sample from four groups consisting of chronic hepatitis C, chronic hepatitis B, non-alcoholic steatohepatitis (NASH), and normal liver 2
  • the present invention relates to a method of classification into one of the two groups (hereinafter also referred to as “classification method of the present disclosure”).
  • the classification method of the present disclosure is an objective or statistical classification method, and does not correspond to diagnosis or does not include diagnosis.
  • the result of the classification method of the present disclosure may be the data on which the diagnosis is based.
  • a classification method of the first embodiment there is a method of classifying a test body fluid sample into non-alcoholic steatohepatitis (NASH) or normal liver.
  • a classification method of the second embodiment there is a method of classifying a test body fluid sample into non-alcoholic steatohepatitis (NASH) or chronic hepatitis C.
  • a classification method of the third embodiment there is a method of classifying a test body fluid sample into non-alcoholic steatohepatitis (NASH) or chronic hepatitis B.
  • a classification method of the fourth embodiment there is a method of classifying a test body fluid sample into chronic hepatitis C or normal liver.
  • classification method of the fifth embodiment there is a method of classifying a test body fluid sample into chronic hepatitis B or normal liver.
  • classification method of the sixth embodiment there is a method of classifying a test body fluid sample into chronic hepatitis B or chronic hepatitis C.
  • the classification methods of the first to sixth embodiments include “two groups out of four groups consisting of chronic hepatitis C, chronic hepatitis B, non-alcoholic steatohepatitis (NASH), and normal liver.
  • the “selecting step” may or may not be included.
  • a test body fluid sample is obtained from all or part of the results of the classification methods of the first to sixth embodiments, and chronic hepatitis C, chronic hepatitis B, non-alcoholic steatohepatitis is obtained. (NASH) and the method classified into either normal liver are mentioned.
  • the classification method of the present disclosure includes measuring the expression level of one or more non-coding RNAs in a test body fluid sample.
  • “measuring the expression level of non-coding RNA in a body fluid sample” means obtaining the amount of RNA of a predetermined sequence contained in the body fluid sample.
  • the amount of RNA may be an absolute value or a relative value with respect to an internal standard.
  • a method for measuring the amount of non-coding RNA may be a known method or a method developed in the future, and a commercially available kit can be used as appropriate.
  • non-coding RNA used in the classification method refers to one or a plurality of non-coding RNAs whose expression level is to be measured. In the classification method, the expression level of the (non) coding RNA is determined. It means measuring.
  • the classification method of the present disclosure further includes an expression level of the one or more non-coding RNAs in the test body fluid sample and specimen data obtained from the two groups of specimen body fluid samples. Using information to determine which of the two groups the test body fluid sample belongs to.
  • the specimen body fluid sample is a body fluid sample obtained from an individual known to belong to any group of chronic hepatitis C, chronic hepatitis B, non-alcoholic steatohepatitis (NASH), or normal liver.
  • Whether an individual belongs to the group can be based on a doctor's diagnosis.
  • individuals belonging to each group include individuals belonging to a plurality of groups, type 1 or type 2 HIV superinfection, decompensated liver disease, organ transplantation, immunosuppression, autoimmune disease, 20 g Individuals who fall under either alcohol consumption over / day or a history of intravenous drug abuse may not be included.
  • specimen data information refers to data on the expression level of one or more non-coding RNAs of a sample body fluid sample of a group to be classified and / or information obtained from the data in one or a plurality of embodiments.
  • the number of specimen body fluid samples that can be included in the specimen data information is 1 or more for each group, preferably 2 or more from the viewpoint of improving the accuracy of classification, more preferably 4 or more, more preferably 7 or more, The more it is, the better.
  • the upper limit of the number of specimen body fluid samples is not particularly limited, and may be a number that can be calculated for discrimination.
  • one or more non-coding RNAs of the test body fluid sample and one or more non-coding RNAs of the specimen body fluid sample are common.
  • the discrimination can be performed by discriminant analysis in one or a plurality of embodiments.
  • the discriminant analysis may be discrimination using a discriminant function, or may be discrimination based on distance.
  • the discriminant function may be a linear function or a non-linear function.
  • the discrimination based on the distance can use the Mahalanobis distance in one or a plurality of embodiments.
  • the discriminant analysis can be performed using statistical analysis software such as R in one or a plurality of embodiments.
  • sample data information is used in addition to, or in place of, the data of the type and expression level of non-coding RNA that provides the expression level as a variable of the discrimination analysis.
  • a discriminant function or a discriminant threshold value is used in addition to, or in place of, the data of the type and expression level of non-coding RNA that provides the expression level as a variable of the discrimination analysis.
  • the method for measuring the expression level of non-coding RNA in the test body fluid sample and the method for measuring the expression level of non-coding RNA included in or used for specimen data information should be the same. Is preferred.
  • the classification method of the present disclosure includes at least hsa-miR-451a as a non-coding RNA used for classification. Moreover, the classification method of this indication can be made into the non-coding RNA which uses all or one part of the non-coding RNA shown in following Table 1 for classification in one or some embodiment.
  • the non-coding RNA shown in Table 1 below, except for has-miR-1974, is a microRNA registered in the data of Release 18 (November 2011) of miRBase (http://www.miRbase.org/) It is. On the other hand, has-miR-1974 is currently considered to be a mitochondrial tRNA.
  • the classification method of the present disclosure includes, in one or more embodiments, “an embodiment using non-coding RNA” including has-miR-1974, and in one or more embodiments, has-miR. “Embodiment using microRNA” without using ⁇ 1974 is mentioned.
  • Embodiments using non-coding RNA in the method of classifying non-alcoholic steatohepatitis (NASH) or normal liver which is the classification method of the first embodiment, include hsa-miR-638, hsa-miR-762, hsa -miR-320c, hsa-miR-451a, hsa-miR-1974, hsa-miR-1246, hsa-miR-92a-3p, hsa-miR-486-5p, hsa-miR-630, hsa-miR-1225 -5p, hsa-miR-1275, hsa-miR-720, hsa-miR-1207-5p, hsa-miR-1202, hsa-miR-1915-3p, hsa-miR-320d, hsa-miR-1271-5p , Hsa
  • RNAs from the viewpoint of improving the accuracy of classification, it is preferable to use a plurality of the 20 non-coding RNAs, hsa-miR-638, hsa-miR-762, hsa-miR-451a, hsa-miR- It is more preferable to use 5 combinations of 1974 and hsa-miR-1246 or all 20 of them (see Table 3 below).
  • x 1, x 2, ⁇ x n, and combinations thereof combination in the, x 1, x 2, 2 is selected from the group consisting of ..., and x n ⁇ It is meant to include a combination of n elements.
  • Embodiments using microRNA in the classification method of the first embodiment include hsa-miR-451, hsa-miR-638, hsa-miR-762, hsa-miR-320c, hsa-miR-92a, hsa-miR- 486-5p, hsa-miR-630, hsa-miR-1246, hsa-miR-1225-5p, hsa-miR-1275, hsa-miR-720, hsa-miR-1202, hsa-miR-1207-5p, Examples include a method using a microRNA selected from the group consisting of hsa-miR-320d, hsa-miR-22, hsa-miR-1915, hsa-miR-1, hsa-miR-16, and combinations thereof. From the viewpoint of improving the accuracy of classification, it is
  • Embodiments using non-coding RNA in the method of classifying non-alcoholic steatohepatitis (NASH) or chronic hepatitis C, which is the classification method of the second embodiment, include hsa-miR-638 and hsa-miR-762.
  • Hsa-miR-320c Hsa-miR-320c, hsa-miR-451a, hsa-miR-1974, hsa-miR-1246, hsa-miR-92a-3p, hsa-miR-486-5p, hsa-miR-630, hsa-miR -1225-5p, hsa-miR-1275, hsa-miR-720, hsa-miR-1207-5p, hsa-miR-1202, hsa-miR-1915-3p, hsa-miR-320d, hsa-miR-483 -5p, hsa-miR-320b, hsa-miR-1268a, and a method using a non-coding RNA selected from the group consisting of these. From the viewpoint of improving the accuracy of classification, it is preferable to use
  • Embodiments using microRNA in the classification method of the second embodiment include hsa-miR-451, hsa-miR-638, hsa-miR-762, hsa-miR-320c, hsa-miR-92a, hsa-miR- 486-5p, hsa-miR-630, hsa-miR-1246, hsa-miR-1225-5p, hsa-miR-1275, hsa-miR-720, hsa-miR-1202, hsa-miR-1207-5p, A micro selected from the group consisting of hsa-miR-320d, hsa-miR-22, hsa-miR-1915, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-320b, hsa-miR-1268, and combinations thereof
  • Embodiments using non-coding RNA in the method of classifying non-alcoholic steatohepatitis (NASH) or chronic hepatitis B which is the classification method of the third embodiment, include hsa-miR-638 and hsa-miR-762. , Hsa-miR-320c, hsa-miR-451a, hsa-miR-1974, hsa-miR-1246, hsa-miR-92a-3p, hsa-miR-486-5p, hsa-miR-630, hsa-miR -720, and a method using a non-coding RNA selected from the group consisting of these. From the viewpoint of improving the accuracy of classification, it is preferable to use a plurality of the 10 non-coding RNAs, and it is more preferable to use all of them (see Table 3 below).
  • An embodiment using microRNA in the classification method of the third embodiment includes a method using hsa-miR-451 (see Table 6 below).
  • Embodiments using non-coding RNA in the method of classifying chronic hepatitis C or normal liver which is the classification method of the fourth embodiment, include hsa-miR-638, hsa-miR-762, hsa-miR-320c, selected from the group consisting of hsa-miR-451a, hsa-miR-1974, hsa-miR-1246, hsa-miR-1225-5p, hsa-miR-1275, hsa-miR-1207-5p, and combinations thereof And a method using non-coding RNA. From the viewpoint of improving the accuracy of classification, it is preferable to use a plurality of the nine non-coding RNAs, and it is more preferable to use all of them (see Table 3 below).
  • Embodiments using the microRNA in the classification method of the fourth embodiment include hsa-miR-451, hsa-miR-638, hsa-miR-762, hsa-miR-320c, hsa-miR-92a, hsa-miR- 486-5p, hsa-miR-630, hsa-miR-1246, hsa-miR-1225-5p, hsa-miR-1275, hsa-miR-720, hsa-miR-1202, hsa-miR-1207-5p, Examples include a method using a microRNA selected from the group consisting of hsa-miR-320d, hsa-miR-483-5p, and combinations thereof. From the viewpoint of improving the accuracy of classification, it is preferable to use a plurality of the 15 microRNAs, more preferably all (see Table 6 below).
  • Embodiments using non-coding RNA in the method of classifying chronic hepatitis B or normal liver which is the classification method of the fifth embodiment, include hsa-miR-638, hsa-miR-762, hsa-miR-320c, hsa-miR-451a, hsa-miR-1974, hsa-miR-1246, hsa-miR-92a-3p, hsa-miR-486-5p, hsa-miR-630, hsa-miR-1271-5p, hsa- Examples include a method using non-coding RNA selected from the group consisting of miR-22-3p and combinations thereof. From the viewpoint of improving the accuracy of classification, it is preferable to use a plurality of the 11 non-coding RNAs, and it is more preferable to use all of them (see Table 3 below).
  • hsa-miR-451, hsa-miR-638, hsa-miR-762, hsa-miR-320c, hsa-miR-92a, hsa-miR- Examples include a method using microRNA selected from the group consisting of 486-5p, hsa-miR-630, hsa-miR-1246, and combinations thereof. From the viewpoint of improving the accuracy of classification, it is preferable to use a plurality of the eight microRNAs, and it is more preferable to use all of them (see Table 6 below).
  • Embodiments using non-coding RNA in the method for classifying chronic hepatitis B or chronic hepatitis C which is the classification method of the sixth embodiment, include hsa-miR-638, hsa-miR-762, hsa-miR- 320c, hsa-miR-451a, hsa-miR-1974, hsa-miR-1246, hsa-miR-92a-3p, hsa-miR-486-5p, hsa-miR-630, hsa-miR-1225-5p, hsa-miR-1275, hsa-miR-720, hsa-miR-1207-5p, hsa-miR-1202, hsa-miR-1915-3p, hsa-miR-320d, hsa-miR-483-5p, hsa- Examples thereof include
  • Embodiments using microRNA in the classification method of the sixth embodiment include hsa-miR-451, hsa-miR-638, hsa-miR-762, hsa-miR-320c, hsa-miR-92a, hsa-miR- 486-5p, hsa-miR-630, hsa-miR-1246, hsa-miR-1225-5p, hsa-miR-1275, hsa-miR-720, hsa-miR-1202, hsa-miR-1207-5p, A micro selected from the group consisting of hsa-miR-320d, hsa-miR-22, hsa-miR-1915, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-320b, hsa-miR-1268, and combinations thereof
  • microRNAs other than those in Table 1 may be used.
  • a test body fluid sample is obtained from all or part of the results of the classification methods of the first to sixth embodiments, and chronic hepatitis C, chronic hepatitis B, non-alcohol is obtained.
  • This method is classified into either steatohepatitis B (NASH) or normal liver.
  • the expression level of the non-coding RNA shown in Table 1 in the body fluid can be used to classify chronic hepatitis C, chronic hepatitis B, non-alcoholic steatohepatitis (NASH), and normal liver in the test body fluid sample as described above. .
  • the present disclosure provides, in other embodiments, hsa-miR-638, hsa-miR-762, hsa-miR-320c, hsa-miR-451a, hsa-miR-1974, hsa-miR-1246, hsa-miR -92a-3p, hsa-miR-486-5p, hsa-miR-630, hsa-miR-1225-5p, hsa-miR-1275, hsa-miR-720, hsa-miR-1207-5p, hsa-miR -1202, hsa-miR-1915-3p, hsa-miR-320d, hsa-miR-1271-5p, hsa-miR-22-3p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-320b,
  • the present disclosure relates to a quantitative PCR kit used in the classification method of the present disclosure, which includes a primer and a reagent that can measure the expression level of one or more non-coding RNAs in a test body fluid sample.
  • the one or a plurality of non-coding RNAs may be all or a part of Table 1.
  • the primer can be appropriately selected according to the classification method of the first to seventh embodiments described above.
  • the kit of the present disclosure further relates to a kit including instructions describing the classification method of the present disclosure.
  • the kit of the present disclosure may include a case where the instructions are provided on the web without being bundled with the kit of the present disclosure.
  • the kit of the present disclosure may include primers and reagents for synthesizing cDNA.
  • the present disclosure relates to the use of the kit in the classification method of the present disclosure, and specifically to the use in the measurement of one or more non-coding RNAs.
  • the present disclosure is a kit for performing the classification method of the present disclosure on a next-generation sequencer, which includes a primer and a reagent that can measure the expression level of one or more non-coding RNAs in a test body fluid sample About the kit.
  • this aspect is a sample preparation kit for performing the classification method of the present disclosure on a next-generation sequencer.
  • the one or a plurality of non-coding RNAs may be all or a part of Table 1.
  • the primer can be appropriately selected according to the classification method of the first to seventh embodiments described above.
  • the kit of the present disclosure further relates to a kit including instructions describing the classification method of the present disclosure. Note that the kit of the present disclosure may include a case where the instructions are provided on the web without being bundled with the kit of the present disclosure.
  • the reagent of the present disclosure examples include an enzyme, a labeling sequence, and / or a buffer.
  • the present disclosure relates to the use of the next-generation sequencer in the classification method of the present disclosure, and specifically, the expression level of one or more non-coding RNAs in the test body fluid sample is determined using the next-generation sequencer. It relates to the use of next-generation sequencers, including measuring.
  • the next-generation sequencer refers to a sequencer classified in contrast to a fluorescent capillary sequencer that uses the Sanger sequencing method, which is a “first generation sequencer”, and does not use the Sanger sequencing method. Includes generations, fourth generations, and future sequencers.
  • the present disclosure relates to a microarray that is used in the classification method of the present disclosure and includes a probe that can measure the expression level of one or more non-coding RNAs in a test body fluid sample.
  • the one or a plurality of non-coding RNAs may be all or a part of Table 1.
  • the probe can be appropriately selected according to the classification method of the first to seventh embodiments described above.
  • the present disclosure relates to the use of the microarray in the disclosed classification method, and specifically to the use of one or more non-coding RNAs in measurement.
  • the present disclosure provides for hsa-miR-638, hsa-miR-762, hsa-miR-320c, hsa-miR-451a, hsa-miR-1974, hsa-miR-1246, hsa- miR-92a-3p, hsa-miR-486-5p, hsa-miR-630, hsa-miR-1225-5p, hsa-miR-1275, hsa-miR-720, hsa-miR-1207-5p, hsa- miR-1202, hsa-miR-1915-3p, hsa-miR-320d, hsa-miR-1271-5p, hsa-miR-22-3p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-320b, hs
  • CHC chronic hepatitis C
  • CHB chronic hepatitis B
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • NL normal liver
  • Peripheral blood samples were obtained from 64 CHC patients, 4 CHB patients, 7 NASH patients, and 20 normal livers.
  • the patients include either type 1 or type 2 HIV co-infection, decompensated liver disease, organ transplantation, immunosuppression, autoimmune disease, alcohol consumption over 20 g / day, or a history of intravenous drug abuse. Those who fall under are not included.
  • the patients also have a liver biopsy. NASH patients were judged histologically. CHC and CHB were determined by viral infection and liver function tests. All the patients or their guardians submitted informed consent forms. All aspects of this study have been approved by the Ogaki City Hospital, Kyoto University graduate School of Medicine, and the Ethics Committee of the School of Medicine, in accordance with the Declaration of Helsinki.
  • Peripheral blood was collected directly from each individual into a serum tube before antiviral treatment.
  • the serum tube was centrifuged at 1500 g for 10 minutes at 4 ° C.
  • the collected serum part was further centrifuged at 2000 g to completely remove the cells, and a serum sample was obtained.
  • the serum samples were stored at -80 ° C.
  • RNA was prepared from 200 ⁇ l of serum sample using miRNeasy mini kit (Qiagen) according to the instruction manual.
  • Exosome-rich fraction RNA was prepared using Exoquick (System Biosciences). Specifically, 900 ⁇ l serum sample is mixed with 250 ⁇ l Exoquick and incubated at 4 ° C. for 12 hours. Then, centrifuge for 30 minutes at 1500 g at room temperature and discard the supernatant. The remaining pellet was dissolved in 200 ⁇ l of PBS, and RNA was prepared using miRNeasy mini kit (Qiagen) according to the instruction manual.
  • miRNA microarray For detection of miRNA in serum samples by microarray, human microRNA Microarray Kit (Rel 14.0) (Agilent Technologies) is used, and according to the instruction manual (Agilent microRNA microarrays Version 1.0), 60 ng of RNA is labeled, Hybridized. Hybridization signals were detected using a DNA microarray scanner G250B (Agilent Technologies). The scan image was analyzed using Agilent feature extraction software (v9.5.3.1). Raw data (gProcessedSignal) was used to normalize each expression with zero mean and unit sample variance. This process was performed using R.
  • Table 3 below shows the miRNAs used for the 6 2-group discrimination in Table 2. The expression level of miRNA indicated by “*” in Table 3 below was used.
  • Table 2 The results of Table 2 are summarized in a 4-partition table, and the results of calculating the accuracy are shown in Table 4 below.
  • liver disease CHC, CHB, NASH
  • normal liver can be classified from the expression levels of miRNA shown in Table 2 in blood samples.
  • has-miR-1974 is a dead entry and is considered to be a mitochondrial tRNA in Release 18 data. Therefore, miRNA that can be discriminated with good accuracy was selected for six pairs selected from liver disease (CHC, CHB, NASH) and normal liver without using has-miR-1974. The results are shown in Table 5 below (Tables 5-1 to 5-6).
  • Table 6 below shows the miRNAs used for the 6 2-group discrimination in Table 5. The expression level of miRNA indicated by “*” in Table 6 below was used.
  • Table 7 shows the results of calculating the accuracy by compiling the results of Table 5 into a 4-partition table.
  • liver disease CHC, CHB, NASH
  • normal liver can be classified from the expression level of miRNA shown in Table 5 in the blood sample.
  • This disclosure is useful in drug development related to liver disease, medical field of liver disease, research field of liver disease, and the like.
  • SEQ ID NOs: 1 to 23 Non-coding RNA sequences (see Table 1)

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Abstract

テスト体液サンプルを、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び正常肝臓からなる４つのグループから選択される２つのグループのどちらかに分類する方法の提供。一又は複数の実施形態において、テスト体液サンプルを、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び正常肝臓からなる４つのグループから選択される２つのグループのどちらかに分類する方法に関する。該方法は、前記テスト体液サンプル中の１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定することを含む。

Description

テスト体液サンプルの分類方法
　本開示は、テスト体液サンプルを、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び正常肝臓からなる４つのグループから選択される２つのグループのどちらかに分類する方法、該方法に用いるキット若しくはマイクロアレイ又はそれらの使用、並びに、前記方法に使用するデータセットに関する。
　マイクロＲＮＡは、慢性肝疾患、すなわち、慢性肝炎から肝細胞癌に至るまで、の病態に深く関係している（特許文献１、非特許文献１及び２）。また、エキソソーム由来のマイクロＲＮＡをバイオマーカーとして用いて癌を診断・検出する方法も開示されている（特許文献２）。
特開２０１１－２１７６１７号公報 特開２０１０－５３４４８０号公報
Murakami Y et al. PLoS ONE vol.6 e16081 (2011) Murakami Y et al. BMC Medical Genomics 3:48 (2010)
　本開示は、一又は複数の実施形態において、テスト体液サンプルを、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び正常肝臓からなる４つのグループから選択される２つのグループのどちらかに分類する方法を提供する。
　本開示は、一又は複数の実施形態において、末梢血サンプルを、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び正常肝臓からなる４つのグループから選択される２つのグループのどちらかに分類する方法に関する。前記テスト体液サンプル中の１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定することを含む。
　本開示は、一又は複数の実施形態において、テスト体液サンプルを、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び正常肝臓からなる４つのグループから選択される２つのグループのどちらかに分類できる。
　本開示は、以下の態様、すなわち、
［１］　テスト体液サンプルを、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び正常肝臓からなる４つのグループから選択される２つのグループのどちらかに分類する方法であって、前記テスト体液サンプル中の１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定することを含む、方法；
［２］　前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡがhsa-miR-451aを含む、［１］記載の方法；
［３］　さらに、前記テスト体液サンプル中の前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量と、前記２つのグループの標本体液サンプルから得られた標本データ情報とを使用して、前記テスト体液サンプルが前記２つのグループのいずれに属するか判別することを含む、［１］又は［２］に記載の方法；
［４］　テスト体液サンプルを非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）か正常肝臓かに分類する方法であって、前記テスト体液サンプル中の１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定することを含み、前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡが、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、hsa-miR-1246、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-1202、hsa-miR-1915-3p、hsa-miR-320d、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-1、hsa-miR-16-5p、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法；
［５］　テスト体液サンプルを非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）か慢性Ｃ型肝炎かに分類する方法であって、前記テスト体液サンプル中の１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定することを含み、前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡが、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、hsa-miR-1246、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-1202、hsa-miR-1915-3p、hsa-miR-320d、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1268a、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法；
［６］　テスト体液サンプルを非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）か慢性Ｂ型肝炎かに分類する方法であって、前記テスト体液サンプル中の１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定することを含み、前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡが、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、hsa-miR-1246、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-720、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法；
［７］　テスト体液サンプルを、慢性Ｃ型肝炎か正常肝臓かに分類する方法であって、前記テスト体液サンプル中の１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定することを含み、前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡが、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、hsa-miR-1246、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-1207-5p、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法；
［８］　テスト体液サンプルを、慢性Ｂ型肝炎か正常肝臓かに分類する方法であって、前記テスト体液サンプル中の１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定することを含み、前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡが、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、hsa-miR-1246、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-22-3p、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法；
［９］　テスト体液サンプルを、慢性Ｂ型肝炎か慢性Ｃ型肝炎かに分類する方法であって、前記テスト体液サンプル中の１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定することを含み、前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡが、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、hsa-miR-1246、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-1202、hsa-miR-1915-3p、hsa-miR-320d、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1268a、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法；
［１０］　前記ノンコーディングＲＮＡが、マイクロＲＮＡである、［１］から［３］のいずれかに記載の方法；
［１１］　テスト体液サンプルを、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）か正常肝臓かに分類する方法であって、前記テスト体液サンプル中の１又は複数のマイクロＲＮＡの発現量を測定することを含み、前記１又は複数のマイクロＲＮＡが、hsa-miR-451、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-92a、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1246、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1202、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-320d、hsa-miR-22、hsa-miR-1915、hsa-miR-1、hsa-miR-16、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法；
［１２］　テスト体液サンプルを、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）か慢性Ｃ型肝炎かに分類する方法であって、前記テスト体液サンプル中の１又は複数のマイクロＲＮＡの発現量を測定することを含み、前記１又は複数のマイクロＲＮＡが、hsa-miR-451、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-92a、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1246、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1202、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-320d、hsa-miR-22、hsa-miR-1915、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1268、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法；
［１３］　テスト体液サンプルを、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）か慢性Ｂ型肝炎かに分類する方法であって、前記テスト体液サンプル中のマイクロＲＮＡの発現量を測定することを含み、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-451である、方法；
［１４］　テスト体液サンプルを、慢性Ｃ型肝炎か正常肝臓かに分類する方法であって、前記テスト体液サンプル中の１又は複数のマイクロＲＮＡの発現量を測定することを含み、前記１又は複数のマイクロＲＮＡが、hsa-miR-451、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-92a、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1246、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1202、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-320d、hsa-miR-483-5p、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法；
［１５］　テスト体液サンプルを、慢性Ｂ型肝炎か正常肝臓かに分類する方法であって、前記テスト体液サンプル中の１又は複数のマイクロＲＮＡの発現量を測定することを含み、前記１又は複数のマイクロＲＮＡが、hsa-miR-451、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-92a、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1246、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法；
［１６］　テスト体液サンプルを、慢性Ｂ型肝炎か慢性Ｃ型肝炎かに分類する方法であって、前記テスト体液サンプル中の１又は複数のマイクロＲＮＡの発現量を測定することを含み、前記１又は複数のマイクロＲＮＡが、hsa-miR-451、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-92a、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1246、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1202、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-320d、hsa-miR-22、hsa-miR-1915、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1268、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法；
［１７］前記体液サンプルが、血液サンプルである、［１］から［１６］のいずれかに記載の方法；
［１８］　前記ノンコーディングＲＮＡ又は前記マイクロＲＮＡが、前記体液サンプルのエキソソームリッチフラクションにおけるＲＮＡである、［１］から［１７］のいずれかに記載の方法；
［１９］　テスト体液サンプルを、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び正常肝臓からなる４つのグループのいずれかに分類する方法であって、［１］から［１８］のいずれかに記載の方法を用いて前記末梢血サンプルを分類することを含む、方法；
［２０］　hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、hsa-miR-1246、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-1202、hsa-miR-1915-3p、hsa-miR-320d、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1268a、hsa-miR-1、hsa-miR-16-5p、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるノンコーディングＲＮＡの使用であって、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、及び／又は非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）のマーカーとしての使用；
［２１］　hsa-miR-451、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-92a、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1246、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1202、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-320d、hsa-miR-22、hsa-miR-1915、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1268、hsa-miR-1、hsa-miR-16、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡの使用であって、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、及び／又は非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）のマーカーとしての使用；
［２２］　［１］から［１９］に記載の方法に使用するリアルタイムＰＣＲキットであって、テスト体液サンプル中の前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を検出できるプライマー及び試薬を含むキット；
［２３］　［１］から［１９］に記載の方法に使用するマイクロアレイであって、
テスト体液サンプル中の前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を検出できるプローブを含むマイクロアレイ；
［２４］　［２２］記載のキット又は［２３］記載のマイクロアレイの使用方法であって、［１］から［１９］のいずれかに記載の方法における前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡの測定を前記キット又は前記マイクロアレイを用いて行うことを含む、使用方法；
［２５］　体液サンプルにおけるhsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、hsa-miR-1246、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-1202、hsa-miR-1915-3p、hsa-miR-320d、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1268a、hsa-miR-1、hsa-miR-16-5p、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現データを含むデータセットであって、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び正常肝臓からなる４つのグループから選択される１つ以上のグループに属する個体の標本体液サンプルから得られた前記ノンコーディングＲＮＡの発現データを含み、［１］から［１９］のいずれかに記載の方法に使用するためのデータセット；
［２６］　［１］から［１９］のいずれかに記載の方法における次世代シーケンサーの使用であって、次世代シーケンサーを用いて前記テスト体液サンプル中の１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定することを含む使用；
［２７］　［１］から［１９］のいずれかに記載の方法を次世代シーケンサーで行うためのキットであって、テスト体液サンプル中の前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定できるプライマー及び試薬を含むキット；
に関する。
　一又は複数の実施形態において「ノンコーディングＲＮＡ（non-coding RNA）」は、マイクロＲＮＡ及びｔＲＮＡを含む。一又は複数の実施形態において「マイクロＲＮＡ（microRNA/miRNA）」は、低分子ノンコーディングＲＮＡの一種をいい、当該技術分野において使用される通常の意味を示す。本明細書においてＩＤを用いて言及するマイクロＲＮＡは、データベースを参照できる。特に言及の無い場合、本明細書におけるマイクロＲＮＡの名称及びアクセッション番号は、miRBase (http://www.miRbase.org/)のRelease 18（2011年11月）のデータを参照する。また、本明細書においてマイクロＲＮＡは、特に言及がない場合、成熟型の１６～２５塩基からなるマイクロＲＮＡをいう。
　本明細書において「体液」は、エキソソームを含む体液を含み、一又は複数の実施形態において、血液、リンパ液、腹水、胸膜液、唾液、尿、及び母乳を含みうる。採取のし易さ及び採取される被験者への負担軽減の点から、血液は末梢血が好ましい。一又は複数の実施形態において、「体液サンプル」は、前記体液又は前記体液から得られうるサンプルを含みうる。一又は複数の実施形態において、体液サンプルとして血漿、血清の形態が挙げられる。さらに、前記体液サンプルは、一又は複数の実施形態において、前記体液中のエキソソームが濃縮若しくは粗精製されたフラクション（以下、「エキソソームリッチフラクション」とも言う。）の形態或いは前記体液から単離若しくは精製されたエキソソームの形態であってもよい。体液サンプルは、一又は複数の実施形態において、ノンコーディングＲＮＡ又はマイクロＲＮＡの発現量の検出の再現性の点から、エキソソームリッチフラクション或いは単離若しくは精製されたエキソソームの形態であることが好ましい。エキソソームリッチフラクションの調製及び／又はエキソソームの単離若しくは精製は、公知方法や市販のキット等を用いて行うことができ、また、後述する実施例の記載に従って行うことができる。よって、一又は複数の実施形態において、採取のし易さ及び採取される被験者への負担軽減の点、並びに、ノンコーディングＲＮＡ又はマイクロＲＮＡの発現量の検出の再現性の点から、前記体液サンプルとしては、末梢血の血漿又は血清から調製したエキソソームリッチフラクションであることが好ましい。
　本明細書において「テスト体液サンプル」とは、分類方法によって分類される体液サンプルをいう。本明細書において「標本体液サンプル」とは、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、又は正常肝臓のいずれかに属することが既知の個体から得られた体液サンプルをいう。なお、本明細書において特に言及の無い場合、「体液サンプル」は、前記テスト体液サンプル及び前記標本体液サンプルを含みうる。
　本明細書において「エキソソーム(exosome)」とは、細胞から分泌される膜小胞の１つであって、一般に、電子顕微鏡観察により直径が３０～１００ｎｍと観察され、密度勾配超遠心分離により密度が１．１３ｇ／ｍｌ前後の画分に分布するとされるものをいう。細胞は、細胞質内の不要なタンパク質やアミノ酸などを膜構造体（エキソソーム）で包んだうえで細胞外に輸送する。エキソソームは、体液中を循環することが知られている。さらに、最近ではエキソソームが細胞肝の情報伝達に関わっていることが報告されている。また、がん細胞が自らのマイクロＲＮＡをエキソソームに封入して分泌することが明らかになってきた（例えば、上記特許文献２）。
　前記体液を供与する個体は、一又は複数の実施形態において、ヒト又は非ヒト動物が挙げられる。前記非ヒト動物としては、一又は複数の実施形態において、哺乳類が挙げられ、中でも、霊長類、げっ歯類などが挙げられる。
　本明細書において「慢性Ｃ型肝炎」とは、Ｃ型慢性肝炎とも呼ばれ、一般に、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染し、肝機能の異常（肝炎）が持続的に続く（一般的には６カ月以上続く）状態の疾患をいう。以下、慢性Ｃ型肝炎を「ＣＨＣ」と表すこともある。本明細書において「慢性Ｂ型肝炎」とは、Ｂ型慢性肝炎とも呼ばれ、一般に、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染し、肝機能の異常（肝炎）が持続的に続く（一般的には６カ月以上続く）状態の疾患をいう。以下、慢性Ｂ型肝炎を「ＣＨＢ」と表すこともある。慢性肝炎は、多くの場合、徐々に病気が進行し、肝硬変となり、さらには肝がんに移行すると言われる。慢性Ｃ型肝炎及び慢性Ｂ型肝炎は、通常、血液検査によるＣ型／Ｂ型肝炎ウイルスの感染及び肝炎（肝機能の異常）の検出、超音波検査、ＣＴ／ＭＲＩなどの情報に基づき、医師により診断される。さらに詳細な疾患の検査や進行の程度を知るために肝生検が行われることもある。一般に、血液検査による肝炎又は肝機能異常の検出は、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ＧＯＴ（グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ）とも言う。）及びＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ、ＧＰＴ（グルタミン酸ピルビン酸トランスフェラーゼ）ともいう。）の酵素量（例えば、ＩＵ／Ｌの単位）を測定することで行われるが、これに限定されない。
　本明細書において「非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）」とは、中性脂肪を主とする脂肪の蓄積が幹細胞に起こり、非飲酒者（例えば、エタノール換算で１日２０ｇ未満）にもかかわらずアルコール性肝障害と同様の病理所見が認められる疾患をいう。従来、脂肪肝は両性の可逆性疾患であると考えられてきたが、脂肪肝の中でも、ＮＡＳＨのように肝硬変、肝がんへと進行する可能性のあるものがあることが分かり、生活習慣病の１つとして重要性が認識されている。ＮＡＳＨの診断は、一般に下記３項目を満たすことが条件とされる；１）非飲酒者である（例えば、エタノール換算で１日２０ｇ未満）、２）肝組織所見が脂肪肝炎（大滴性の脂肪沈着、炎症細胞浸潤、肝細胞の風船様腫大など）である、３）他の原因による肝疾患の除外。
　すなわち、現時点ではＮＡＳＨの診断における肝生検はゴールドスタンダードである。しかし、肝生検は、患者に負担がかかる（侵襲的である）と言える。よって、肝生検を回避して臨床情報を得ることができれば、患者の負担を軽減できる。一又は複数の実施形態において、本開示は、テスト体液サンプル中の１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量又は発現パターンに基づいて、テスト体液サンプルを、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び正常肝臓からなる４つのグループから選択される２つのグループのどちらかに分類できるという知見に基づく。
　本明細書において「正常肝臓」とは、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）には診断されない肝臓をいい、一又は複数の実施形態において、血液検査（例えば、ＡＳＴやＡＬＴの測定）において肝炎又は肝機能異常の検出がされない肝臓をいう。以下、正常肝臓を「ＮＬ」と表すこともある。
　［分類方法］
　一又は複数の実施形態において、本開示は、テスト体液サンプルを、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び正常肝臓からなる４つのグループから選択されうる２つのグループのどちらかに分類する方法（以下、「本開示の分類方法」ともいう。）に関する。本開示の分類方法は、一態様において、客観的又は統計学的な分類方法であって、診断には該当しない、或いは、診断を含まない。本開示の分類方法による結果は、診断の基礎となるデータとなる場合もある。
　第１実施形態の分類方法として、テスト体液サンプルを、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）か正常肝臓かに分類する方法が挙げられる。第２実施形態の分類方法として、テスト体液サンプルを、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）か慢性Ｃ型肝炎かに分類する方法が挙げられる。第３実施形態の分類方法として、テスト体液サンプルを、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）か慢性Ｂ型肝炎かに分類する方法が挙げられる。第４実施形態の分類方法として、テスト体液サンプルを、慢性Ｃ型肝炎か正常肝臓かに分類する方法が挙げられる。第５実施形態の分類方法として、テスト体液サンプルを、慢性Ｂ型肝炎か正常肝臓かに分類する方法が挙げられる。第６実施形態の分類方法として、テスト体液サンプルを、慢性Ｂ型肝炎か慢性Ｃ型肝炎かに分類する方法が挙げられる。なお、第１～第６の実施形態の分類方法には、「慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び正常肝臓からなる４つのグループから２つのグループを選択する工程」が含まれなくてもよく、含まれてもよい。第７実施形態の分類方法として、第１～第６の実施形態の分類方法の結果の全部又は一部から、テスト体液サンプルを、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び正常肝臓のいずれかに分類する方法が挙げられる。
　本開示の分類方法は、テスト体液サンプル中の１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定することを含む。本明細書において、「体液サンプル中のノンコーディングＲＮＡの発現量の測定」とは、体液サンプル中に含まれる所定の配列のＲＮＡの量を求めることをいう。ＲＮＡの量は、一又は複数の実施形態において、絶対値であってもよく、内部標準に対する相対値であってもよい。ノンコーディングＲＮＡの量の測定方法は、公知の方法及び今後開発される方法で行ってよく、適宜市販のキットを利用できる。限定されない具体例としては、体液サンプル中のＲＮＡからｃＤＮＡを合成した後、定量ＰＣＲ、リアルタイム定量ＰＣＲ、又はマイクロアレイ等で測定することが挙げられる。なお、本明細書において「分類方法に用いるノンコーディングＲＮＡ」とは、発現量を測定する対象の１又は複数のノンコーディングＲＮＡをいい、分類方法においてその（それらの）ノンコーディングＲＮＡの発現量を測定することをいう。
　本開示の分類方法は、一又は複数の実施形態において、さらに、前記テスト体液サンプル中の前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量と、前記２つのグループの標本体液サンプルから得られた標本データ情報とを使用して、前記テスト体液サンプルが前記２つのグループのいずれに属するか判別することを含む。
　上述のとおり、標本体液サンプルは、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、又は正常肝臓のいずれかのグループに属することが既知の個体から得られた体液サンプルをいう。個体が前記グループに属するか否かは、医師の診断に基づくことができる。一又は複数の実施形態において、各グループに属する個体には、複数のグループに属する個体、１型又は２型ＨＩＶの重感染、非代償性肝疾患、臓器移植、免疫抑制、自己免疫疾患、２０ｇ／日を超えるアルコール摂取、又は静注薬物乱用の既往歴のいずれかに該当する個体は含まれないとすることができる。
　本明細書において「標本データ情報」は、一又は複数の実施形態において、分類するグループの標本体液サンプルの１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量のデータ及び／又は該データから得られた情報をいう。前記標本データ情報に含まれうる標本体液サンプル数は、グループごとに１以上であり、分類の正確性の向上の点から２以上が好ましく、より好ましくは４以上、さらに好ましくは７以上であり、多いほど好ましい。標本体液サンプル数の上限は特に制限されず、判別の計算が可能な数が挙げられる。また、一又は複数の実施形態において、テスト体液サンプルの１又は複数のノンコーディングＲＮＡと標本体液サンプルの１又は複数のノンコーディングＲＮＡは共通する。
　前記判別は、一又は複数の実施形態において、判別分析で行うことができる。前記判別分析は、一又は複数の実施形態において、判別関数を用いた判別であってもよく、又は、距離による判別であってもよい。前記判別関数は、一又は複数の実施形態において、線形関数であってもよく、非線形関数であってもよい。前記距離による判別は、一又は複数の実施形態において、マハラノビス距離を使用できる。前記判別分析は、一又は複数の実施形態において、Ｒ等の統計解析ソフトを用いて行うことができる。したがって、前記「標本データ情報」は、一又は複数の実施形態において、前記判別分析の変数となる発現量をもたらすノンコーディングＲＮＡの種類及びその発現量のデータに加えて、或いは換えて、判別のための判別関数や判別閾値を含んでもよい。
　分類の正確性の向上の点から、テスト体液サンプルのノンコーディングＲＮＡの発現量の測定方法と、標本データ情報に含まれる或いは用いられるノンコーディングＲＮＡの発現量の測定方法は、共通していることが好ましい。
　［分類に用いるノンコーディングＲＮＡ］
　本開示の分類方法は、一又は複数の実施形態において、分類に用いるノンコーディングＲＮＡとして、少なくともhsa-miR-451aを含む。また、本開示の分類方法は、一又は複数の実施形態において、下記表１で示すノンコーディングＲＮＡの全部又は一部を分類に用いるノンコーディングＲＮＡとすることができる。なお、下記表１に示すノンコーディングＲＮＡは、has-miR-1974を除き、miRBase (http://www.miRbase.org/)のRelease 18（2011年11月）のデータに登録されるマイクロＲＮＡである。一方、has-miR-1974は、現在はミトコンドリアｔＲＮＡであるとされている。したがって、本開示の分類方法は、一又は複数の実施形態において、has-miR-1974を含む「ノンコーディングＲＮＡを用いる実施形態」が挙げられ、その他の一又は複数の実施形態において、has-miR-1974を用いない「マイクロＲＮＡを用いる実施形態」が挙げられる。
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　第１実施形態の分類方法である、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）か正常肝臓かに分類する方法におけるノンコーディングＲＮＡを用いる実施形態として、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、hsa-miR-1246、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-1202、hsa-miR-1915-3p、hsa-miR-320d、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-1、hsa-miR-16-5p、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるノンコーディングＲＮＡを用いる方法が挙げられる。分類の正確性の向上の点からは、前記２０個のノンコーディングＲＮＡのうち複数個を用いることが好ましく、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、及びhsa-miR-1246の５つの組み合わせ又は前記２０個全部を用いることがより好ましい（下記表３参照）。なお、本明細書において「ｘ１、ｘ２、・・・ｘｎ、及び、これらの組み合わせ」における組み合わせは、ｘ１、ｘ２、・・・及びｘｎからなる群から選択される２～ｎ個の要素からなる組み合わせを含むことを意味する。
　第１実施形態の分類方法におけるマイクロＲＮＡを用いる実施形態として、hsa-miR-451、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-92a、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1246、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1202、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-320d、hsa-miR-22、hsa-miR-1915、hsa-miR-1、hsa-miR-16、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡを用いる方法が挙げられる。分類の正確性の向上の点からは、前記１８個のマイクロＲＮＡのうち複数個を用いることが好ましく、全部用いることがより好ましい（下記表６参照）。
　第２実施形態の分類方法である、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）か慢性Ｃ型肝炎かに分類する方法におけるノンコーディングＲＮＡを用いる実施形態として、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、hsa-miR-1246、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-1202、hsa-miR-1915-3p、hsa-miR-320d、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1268a、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるノンコーディングＲＮＡを用いる方法が挙げられる。分類の正確性の向上の点からは、前記１９個のノンコーディングＲＮＡのうち複数個を用いることが好ましく、全部用いることがより好ましい（下記表３参照）。
　第２実施形態の分類方法におけるマイクロＲＮＡを用いる実施形態として、hsa-miR-451、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-92a、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1246、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1202、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-320d、hsa-miR-22、hsa-miR-1915、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1268、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡを用いる方法が挙げられる。分類の正確性の向上の点からは、前記１９個のマイクロＲＮＡのうち複数個を用いることが好ましく、全部用いることがより好ましい（下記表６参照）。
　第３実施形態の分類方法である、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）か慢性Ｂ型肝炎かに分類する方法におけるノンコーディングＲＮＡを用いる実施形態として、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、hsa-miR-1246、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-720、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるノンコーディングＲＮＡを用いる方法が挙げられる。分類の正確性の向上の点からは、前記１０個のノンコーディングＲＮＡのうち複数個を用いることが好ましく、全部用いることがより好ましい（下記表３参照）。
　第３実施形態の分類方法におけるマイクロＲＮＡを用いる実施形態として、hsa-miR-451を用いる方法が挙げられる（下記表６参照）。
　第４実施形態の分類方法である、慢性Ｃ型肝炎か正常肝臓かに分類する方法におけるノンコーディングＲＮＡを用いる実施形態として、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、hsa-miR-1246、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-1207-5p、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるノンコーディングＲＮＡを用いる方法が挙げられる。分類の正確性の向上の点からは、前記９個のノンコーディングＲＮＡのうち複数個を用いることが好ましく、全部用いることがより好ましい（下記表３参照）。
　第４実施形態の分類方法におけるマイクロＲＮＡを用いる実施形態として、hsa-miR-451、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-92a、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1246、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1202、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-320d、hsa-miR-483-5p、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡを用いる方法が挙げられる。分類の正確性の向上の点からは、前記１５個のマイクロＲＮＡのうち複数個を用いることが好ましく、全部用いることがより好ましい（下記表６参照）。
　第５実施形態の分類方法である、慢性Ｂ型肝炎か正常肝臓かに分類する方法におけるノンコーディングＲＮＡを用いる実施形態として、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、hsa-miR-1246、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-22-3p、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるノンコーディングＲＮＡを用いる方法が挙げられる。分類の正確性の向上の点からは、前記１１個のノンコーディングＲＮＡのうち複数個を用いることが好ましく、全部用いることがより好ましい（下記表３参照）。
　第５実施形態の分類方法におけるマイクロＲＮＡを用いる実施形態として、hsa-miR-451、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-92a、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1246、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡを用いる方法が挙げられる。分類の正確性の向上の点からは、前記８個のマイクロＲＮＡのうち複数個を用いることが好ましく、全部用いることがより好ましい（下記表６参照）。
　第６実施形態の分類方法である、慢性Ｂ型肝炎か慢性Ｃ型肝炎かに分類する方法におけるノンコーディングＲＮＡを用いる実施形態として、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、hsa-miR-1246、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-1202、hsa-miR-1915-3p、hsa-miR-320d、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1268a、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるノンコーディングＲＮＡを用いる方法が挙げられる。分類の正確性の向上の点からは、前記１９個のノンコーディングＲＮＡのうち複数個を用いることが好ましく、全部用いることがより好ましい（下記表３参照）。
　第６実施形態の分類方法におけるマイクロＲＮＡを用いる実施形態として、hsa-miR-451、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-92a、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1246、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1202、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-320d、hsa-miR-22、hsa-miR-1915、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1268、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡを用いる方法が挙げられる。分類の正確性の向上の点からは、前記１９個のマイクロＲＮＡのうち複数個を用いることが好ましく、全部用いることがより好ましい（下記表６参照）。
　上記第１～第６実施形態の分類方法は、一又は複数の実施形態において、上記表１以外のマイクロＲＮＡを使用してもよい。
　第７実施形態の分類方法は、上述のとおり、第１～第６の実施形態の分類方法の結果の全部又は一部から、テスト体液サンプルを、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び正常肝臓のいずれかに分類する方法である。
　［マーカー］
　体液における表１に示すノンコーディングＲＮＡの発現量は、上述のとおり、テスト体液サンプルの慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び正常肝臓の分類に使用できる。したがって、本開示は、その他の態様において、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、hsa-miR-1246、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-1202、hsa-miR-1915-3p、hsa-miR-320d、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1268a、hsa-miR-1、hsa-miR-16-5p、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるノンコーディングＲＮＡの使用であって、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、及び／又は非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）のマーカーとしての使用に関する。これらのマーカーは、一又は複数の実施形態において、上述の第１～第７実施形態の分類方法のノンコーディングＲＮＡを用いる実施形態に使用できる。
　また、本開示は、さらにその他の態様において、hsa-miR-451、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-92a、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1246、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1202、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-320d、hsa-miR-22、hsa-miR-1915、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1268、hsa-miR-1、hsa-miR-16、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡの使用であって、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、及び／又は非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）のマーカーとしての使用に関する。これらのマーカーは、一又は複数の実施形態において、上述の第１～第７実施形態の分類方法のマイクロＲＮＡを用いる実施形態に使用できる。
　［キット］
　本開示は、その他の態様において、本開示の分類方法に使用する定量ＰＣＲキットであって、テスト体液サンプル中の１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定できるプライマー及び試薬を含むキットに関する。前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡは、一又は複数の実施形態において、前記表１に記載の全部又は一部が挙げられる。前記プライマーは、一又は複数の実施形態において、上述の第１～第７実施形態の分類方法に応じて適宜選択できる。本開示のキットは、一又は複数の実施形態において、さらに、本開示の分類方法が記載された説明書を含むキットに関する。なお、本開示のキットは、説明書が本開示のキットの同梱されることなくウェブ上で提供される場合も含みうる。本開示のキットは、一又は複数の実施形態において、ｃＤＮＡを合成するためのプライマー及び試薬を含んでもよい。本開示は、さらにその他の態様において、前記キットの本開示の分類方法における使用に関し、具体的は、１又は複数のノンコーディングＲＮＡの測定における使用に関する。
　本開示は、その他の態様において、本開示の分類方法を次世代シーケンサーで行うためのキットであって、テスト体液サンプル中の１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定できるプライマー及び試薬を含むキットに関する。本態様は、一又は複数の実施形態において、本開示の分類方法を次世代シーケンサーで行うためのサンプル調製用キットである。前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡは、一又は複数の実施形態において、前記表１に記載の全部又は一部が挙げられる。前記プライマーは、一又は複数の実施形態において、上述の第１～第７実施形態の分類方法に応じて適宜選択できる。本開示のキットは、一又は複数の実施形態において、さらに、本開示の分類方法が記載された説明書を含むキットに関する。なお、本開示のキットは、説明書が本開示のキットの同梱されることなくウェブ上で提供される場合も含みうる。本開示の試薬としては、酵素、標識配列、及び／又はバッファーなどが挙げられる。本開示は、さらにその他の態様において、次世代シーケンサーの本開示の分類方法における使用に関し、具体的は、次世代シーケンサーを用いて前記テスト体液サンプル中の１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定することを含む次世代シーケンサーの使用に関する。本開示において、次世代シーケンサーとは、“第一世代シーケンサー”であるSangerシーケンス法を利用した蛍光キャピラリーシーケンサーに対比して分類されるシーケンサーをいい、Sangerシーケンス法を利用しない第二世代、第三世代、第四世代、及び今後開発されるシーケンサーを含む。
　［マイクロアレイ］
　本開示は、その他の態様において、本開示の分類方法に使用するマイクロアレイであって、テスト体液サンプル中の１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定できるプローブを含むマイクロアレイに関する。前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡは、一又は複数の実施形態において、前記表１に記載の全部又は一部が挙げられる。前記プローブは、一又は複数の実施形態において、上述の第１～第７実施形態の分類方法に応じて適宜選択できる。本開示は、さらにその他の態様において、前記マイクロアレイの本開示の分類方法における使用に関し、具体的には、１又は複数のノンコーディングＲＮＡの測定における使用に関する。
　［データセット］
　本開示は、その他の態様において、体液サンプルにおけるhsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、hsa-miR-1246、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-1202、hsa-miR-1915-3p、hsa-miR-320d、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1268a、hsa-miR-1、hsa-miR-16-5p、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現データを含むデータセットであって、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び正常肝臓からなる４つのグループから選択される１つ以上のグループに属する個体の標本体液サンプルから得られた前記ノンコーディングＲＮＡの発現データを含むデータセットに関する。本開示のデータセットは、一又は複数の実施形態において、本開示の分類方法における前記標本データ情報として使用できる。
　末梢血のmiRNA発現パターンを使用し、以下の方法及び条件により、ＣＨＣ（慢性Ｃ型肝炎）、ＣＨＢ（慢性Ｂ型肝炎）、ＮＡＳＨ（非アルコール型脂肪性肝炎）及びＮＬ（正常肝臓）の分類できるマイクロＲＮＡの組み合わせを探索した。
　１．血液（末梢血）サンプル
　６４人のＣＨＣ患者、４人のＣＨＢ患者、７人のＮＡＳＨ患者、及び２０人の正常肝臓者から末梢血サンプルを得た。前記患者らには、１型又は２型ＨＩＶの重感染、非代償性肝疾患、臓器移植、免疫抑制、自己免疫疾患、２０ｇ／日を超えるアルコール摂取、又は静注薬物乱用の既往歴のいずれかに該当する者は含まれていない。また、前記患者らは、肝臓のバイオプシーを受けている。ＮＡＳＨ患者は組織学的に判断された。ＣＨＣ及びＣＨＢは、ウイルス感染と肝機能検査等により判断された。すべての前記患者又はその保護者はインフォームドコンセント書面を提出した。また、本研究に関するすべての態様が、ヘルシンキ宣言に従って、大垣市民病院、京都大学大学院医学研究科、及び同学医学部の倫理委員会により承認されている。
　末梢血は、抗ウイルス処理をする前に各個体から直接血清チューブに回収した。前記血清チューブを4℃、1500ｇで10分間遠心分離を行った。回収した血清部分をさらに2000ｇで遠心分離を行って細胞を完全に除去し、血清サンプルとした。前記血清サンプルは－80℃で保存した。
　２．ＲＮＡの調製
　トータルRNAは、200μlの血清サンプルからmiRNeasy mini kit （Qiagen社製）を用い取扱説明書に従って調製した。エキソソームリッチ分画RNAは、Exoquick（System Biosciences社製）を用いて調製した。具体的には、900μlの血清サンプルを250μlのExoquickと混合し、4℃で12時間インキュベートする。その後、室温、1500ｇで30分間遠心分離を行い、上清を捨てる。残ったペレットを200μlのPBSで溶解し、RNAをmiRNeasy mini kit （Qiagen社製）を用い取扱説明書に従って調製した。
　３．miRNAマイクロアレイ
　血清サンプル中のmiRNAのマイクロアレイによる検出は、Human microRNA Microarray Kit (Rel 14.0)（Agilent Technologies社製）を用い、取扱説明書（Agilent microRNA microarrays Version 1.0用）に従って、60ngのRNAを標識し、ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションのシグナルはDNA microarray scanner G250B（Agilent Technologies社製）を用いて検出した。スキャンイメージはAgilent feature extraction software (v9.5.3.1)を用いて分析した。生データ（gProcessedSignal）を使用し、各発現をゼロ平均及び単位標本分散を持つようにノーマライズした。このプロセスはＲを用いて行った。
　４．リアルタイムｑＰＣＲ
　血清サンプル中のmiRNAのリアルタイム定量ＰＣＲによる検出は、TaqMan（商標）microRNA assay（Applied Biosystems社製）を用いて行った。miR-16の発現量を内部コントロールとして使用した。cDNAはTaqMan（商標）miRNA RT Kit（Applied Biosystems社製）を使用して作製した。miRNAの発現の検出は、Chromo 4 detector（BIO-RAD社製）で行った。
　５．統計解析
　離散値を持つ症状について、２つの組み合わせを、ウイルコクスン順位和検定（片側）で比較し、或いは、相関係数からＰ値を計算した。いずれの場合も、ＦＤＲ（false discovery rate）が０．０５未満の場合に有意とした。
　〔肝臓疾患にユニークな特徴を示すmiRNAの選択〕
　肝臓疾患（ＣＨＣ，ＣＨＢ，ＮＡＳＨ）及び正常肝臓から選ばれるペアについて、ノーマライズしたmiRNAの発現量を主成分分析によって主成分スコアに変換した。より大きな第１主成分スコア及び第２主成分スコアを持つmiRNAを選択した。次に、各サンプルの前記第１主成分スコアを選択したmiRNAのみの発現量に基づいて計算した。これらから最適な数の第１主成分スコアを使用して肝臓疾患及び正常肝臓を分類した。これらの作業はＲで行った。
　６．結果
（１）血清サンプル中のmiRNAの発現量は、再現性の点から、血清サンプルから回収したトータルRNAよりも、血清サンプルからエキソソームリッチ分画を調製し、そこから回収したRNAの方が優れることが分かった（データ示さず）。
（２）肝臓疾患（ＣＨＣ，ＣＨＢ，ＮＡＳＨ）及び正常肝臓（ＮＬ）から選ばれる６つのペアについて、上述のとおりにそれぞれ適切なmiRNAを選択することにより、下記表２に示すとおり、良好な正確性で判別できることが示された（表２－１～２－６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２における６つの２群判別に使用したmiRNAを下記表３に示す。下記表３において「＊」で示されたmiRNAの発現量を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　また、表２の結果を４分割表にまとめて正確性を計算した結果を下記表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表２～４に示す通り、血液サンプル中の表２に示されるmiRNAの発現量から肝臓疾患（ＣＨＣ，ＣＨＢ，ＮＡＳＨ）及び正常肝臓の分類ができることが示された。
　７．has-miR-1974を使用しない形態
　表３のmiRNAは、has-miR-1974を除き、miRBase (www.mirbase.org)のRelease 18のデータを参照する。一方、has-miR-1974は、Release 18データでは、dead entryであり、ミトコンドリアtRNAであるとされている。そこで、has-miR-1974を使用せずに、肝臓疾患（ＣＨＣ，ＣＨＢ，ＮＡＳＨ）及び正常肝臓から選ばれる６つのペアについて、良好な正確性で判別できるmiRNAの選択を行った。その結果を下記表５（表５－１～５－６）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５における６つの２群判別に使用したmiRNAを下記表６に示す。下記表６において「＊」で示されたmiRNAの発現量を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　また、表５の結果を４分割表にまとめて正確性を計算した結果を下記表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表５～７に示す通り、血液サンプル中の表５に示されるmiRNAの発現量から肝臓疾患（ＣＨＣ，ＣＨＢ，ＮＡＳＨ）及び正常肝臓の分類ができることが示された。
　８．ＮＡＳＨ患者からのサンプルを増やした場合の解析結果
　２０人のＮＡＳＨ患者及び２４人の正常肝臓者から末梢血サンプルを得て、ＮＡＳＨと正常肝臓（ＮＬ）のペアについて、解析を行った。ノンコーディングＲＮＡとしてhsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、及びhsa-miR-1246からなる５つの組み合わせを使用する他は、上記表２－１と同様に行った。その結果を下記表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　上記表８に示す通り、ＮＡＳＨと正常肝臓（ＮＬ）とが良好な正確性で判別できることが示された。
　本開示は、肝臓疾患に関する医薬開発、肝臓疾患の医療分野、肝臓疾患の研究分野等において有用である。
配列番号1～23：ノンコーディングＲＮＡの配列（表１参照）

Claims (27)

  1. テスト体液サンプルを、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び正常肝臓からなる４つのグループから選択される２つのグループのどちらかに分類する方法であって、
    前記テスト体液サンプル中の１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定することを含む、方法。
  2. 前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡがhsa-miR-451aを含む、請求項１記載の方法。
  3. さらに、前記テスト体液サンプル中の前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量と、前記２つのグループの標本体液サンプルから得られた標本データ情報とを使用して、前記テスト体液サンプルが前記２つのグループのいずれに属するか判別することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. テスト体液サンプルを、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）か正常肝臓かに分類する方法であって、
    前記テスト体液サンプル中の１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定することを含み、
    前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡが、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、hsa-miR-1246、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-1202、hsa-miR-1915-3p、hsa-miR-320d、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-1、hsa-miR-16-5p、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
  5. テスト体液サンプルを、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）か慢性Ｃ型肝炎かに分類する方法であって、
    前記テスト体液サンプル中の１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定することを含み、
    前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡが、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、hsa-miR-1246、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-1202、hsa-miR-1915-3p、hsa-miR-320d、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1268a、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
  6. テスト体液サンプルを、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）か慢性Ｂ型肝炎かに分類する方法であって、
    前記テスト体液サンプル中の１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定することを含み、
    前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡが、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、hsa-miR-1246、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-720、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
  7. テスト体液サンプルを、慢性Ｃ型肝炎か正常肝臓かに分類する方法であって、
    前記テスト体液サンプル中の１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定することを含み、
    前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡが、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、hsa-miR-1246、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-1207-5p、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
  8. テスト体液サンプルを、慢性Ｂ型肝炎か正常肝臓かに分類する方法であって、
    前記テスト体液サンプル中の１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定することを含み、
    前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡが、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、hsa-miR-1246、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-22-3p、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
  9. テスト体液サンプルを、慢性Ｂ型肝炎か慢性Ｃ型肝炎かに分類する方法であって、
    前記テスト体液サンプル中の１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定することを含み、
    前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡが、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、hsa-miR-1246、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-1202、hsa-miR-1915-3p、hsa-miR-320d、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1268a、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
  10. 前記ノンコーディングＲＮＡが、マイクロＲＮＡである、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  11. テスト体液サンプルを、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）か正常肝臓かに分類する方法であって、
    前記テスト体液サンプル中の１又は複数のマイクロＲＮＡの発現量を測定することを含み、
    前記１又は複数のマイクロＲＮＡが、hsa-miR-451、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-92a、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1246、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1202、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-320d、hsa-miR-22、hsa-miR-1915、hsa-miR-1、hsa-miR-16、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
  12. テスト体液サンプルを、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）か慢性Ｃ型肝炎かに分類する方法であって、
    前記テスト体液サンプル中の１又は複数のマイクロＲＮＡの発現量を測定することを含み、
    前記１又は複数のマイクロＲＮＡが、hsa-miR-451、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-92a、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1246、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1202、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-320d、hsa-miR-22、hsa-miR-1915、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1268、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
  13. テスト体液サンプルを、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）か慢性Ｂ型肝炎かに分類する方法であって、
    前記テスト体液サンプル中のマイクロＲＮＡの発現量を測定することを含み、
    前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-451である、方法。
  14. テスト体液サンプルを、慢性Ｃ型肝炎か正常肝臓かに分類する方法であって、
    前記テスト体液サンプル中の１又は複数のマイクロＲＮＡの発現量を測定することを含み、
    前記１又は複数のマイクロＲＮＡが、hsa-miR-451、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-92a、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1246、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1202、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-320d、hsa-miR-483-5p、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
  15. テスト体液サンプルを、慢性Ｂ型肝炎か正常肝臓かに分類する方法であって、
    前記テスト体液サンプル中の１又は複数のマイクロＲＮＡの発現量を測定することを含み、
    前記１又は複数のマイクロＲＮＡが、hsa-miR-451、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-92a、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1246、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
  16. テスト体液サンプルを、慢性Ｂ型肝炎か慢性Ｃ型肝炎かに分類する方法であって、
    前記テスト体液サンプル中の１又は複数のマイクロＲＮＡの発現量を測定することを含み、
    前記１又は複数のマイクロＲＮＡが、hsa-miR-451、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-92a、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1246、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1202、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-320d、hsa-miR-22、hsa-miR-1915、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1268、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
  17. 前記体液サンプルが、血液サンプルである、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
  18. 前記ノンコーディングＲＮＡ又は前記マイクロＲＮＡが、前記体液サンプルのエキソソームリッチフラクションにおけるＲＮＡである、請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
  19. テスト体液サンプルを、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び正常肝臓からなる４つのグループのいずれかに分類する方法であって、請求項１から１８のいずれかに記載の方法を用いて前記テスト体液サンプルを分類することを含む、方法。
  20. hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、hsa-miR-1246、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-1202、hsa-miR-1915-3p、hsa-miR-320d、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1268a、hsa-miR-1、hsa-miR-16-5p、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるノンコーディングＲＮＡの使用であって、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、及び／又は非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）のマーカーとしての使用。
  21. hsa-miR-451、hsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-92a、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1246、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1202、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-320d、hsa-miR-22、hsa-miR-1915、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1268、hsa-miR-1、hsa-miR-16、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡの使用であって、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、及び／又は非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）のマーカーとしての使用。
  22. 請求項１から１９に記載の方法に使用する定量ＰＣＲキットであって、
    テスト体液サンプル中の前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定できるプライマー及び試薬を含むキット。
  23. 請求項１から１９に記載の方法に使用するマイクロアレイであって、
    テスト体液サンプル中の前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定できるプローブを含むマイクロアレイ。
  24. 請求項２２記載のキット又は請求項２３記載のマイクロアレイの使用方法であって、請求項１から１９のいずれかに記載の方法における前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡの測定を前記キット又は前記マイクロアレイを用いて行うことを含む、使用方法。
  25. 体液サンプルにおけるhsa-miR-638、hsa-miR-762、hsa-miR-320c、hsa-miR-451a、hsa-miR-1974、hsa-miR-1246、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-720、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-1202、hsa-miR-1915-3p、hsa-miR-320d、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1268a、hsa-miR-1、hsa-miR-16-5p、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現データを含むデータセットであって、
    慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、非アルコール型脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び正常肝臓からなる４つのグループから選択される１つ以上のグループに属する個体の標本体液サンプルから得られた前記ノンコーディングＲＮＡの発現データを含み、請求項１から１９のいずれかに記載の方法に使用するためのデータセット。
  26. 請求項１から１９のいずれかに記載の方法における次世代シーケンサーの使用であって、
    次世代シーケンサーを用いて前記テスト体液サンプル中の１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定することを含む、使用。
  27. 請求項１から１９のいずれかに記載の方法を次世代シーケンサーで行うためのキットであって、
    テスト体液サンプル中の前記１又は複数のノンコーディングＲＮＡの発現量を測定できるプライマー及び試薬を含むキット。
     
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