ES2644258T3 - Métodos de medición de la actividad enzimática útiles para determinar la viabilidad celular en muestras no purificadas - Google Patents
Métodos de medición de la actividad enzimática útiles para determinar la viabilidad celular en muestras no purificadas Download PDFInfo
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Description
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DESCRIPCION
Metodos de medicion de la actividad enzimatica utiles para determinar la viabilidad celular en muestras no purificadas
Referencia cruzada con solicitudes relacionadas
La presente solicitud es una solicitud no provisional, que reivindica la prioridad, en parte, de la Solicitud Provisional de EE. UU. N° 61/324.939, presentada el 15 de abril de 2010, la Solicitud Provisional de EE. UU. N° 61/324.949, presentada el 16 de abril de 2010 y la Solicitud Provisional de EE. UU. N° 61/325.413, presentada el 19 de abril de 2010.
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere en general al campo de la deteccion de microorganismos, y mas particularmente a la deteccion de bacterias. Tambien se proporcionan metodos mejorados de deteccion de microorganismos que son altamente sensibles, son aplicables a muestras no purificadas, y tienen numerosas aplicaciones, junto con kits de ensayo, que se basan en la presencia de ligasas y/o fosfatasas como indicador de la viabilidad bacteriana. El alcance de proteccion se define por las reivindicaciones adjuntas.
Antecedentes de la invencion
La medicion de la presencia y niveles de ciertas moleculas que se asocian con la viabilidad celular es importante en distintos contextos. Por ejemplo, la medicion de los niveles de ATP en las celulas de mairnferos para los analisis de crecimiento y con fines toxicologicos. El documento WO92/04467 mide la actividad de la polimerasa para detectar microorganismos. Se pueden utilizar estrategias de cultivo para detectar pequenas cantidades de bacterias pero dichas tecnicas necesitan varios dfas para completarse, especialmente cuando se intenta detectar pocas cantidades de bacterias y tambien cuando se detectan microorganismos de crecimiento mas lento.
De manera alternativa, se pueden llevar a cabo ensayos basados en la medicion de la presencia de una molecula que se puede ligar a la presencia en la muestra de una celula u organismo contaminante. La molecula que se detecta mas comunmente es el Trifosfato de Adenosina (ATP). Tambien se ha propuesto la deteccion de ADN y ARN, aunque la correlacion entre la presencia de ADN y ARN y la viabilidad no esta clara debido a la persistencia variable de acidos nucleicos en las celulas tras la muerte (Keer & Birch, Journal of Microbiological Methods 53 (2003) 175-183). Se ha propuesto la deteccion de adenilato cinasa como indicador de viabilidad (Squirrell DJ, Murphy MJ, Leslie RL, Green JCD: A comparison of ATP and adenylate kinase as bacterial cell markers: correlation with agar plate counts, in Bioluminescence and Chemiluminescence Progress and Current Applications. Editado por: Stanley RA, Kricka LJ. John Wiley and Sons; 2002 y documento WO 96/02665). Un metodo de rutina empleado para determinar los niveles de ATP implica el uso de bioluminiscencia y. El metodo utiliza la dependencia del ATP de la reaccion en la que la luciferasa que emite luz cataliza la oxidacion de la luciferina. El metodo se puede utilizar para medir concentraciones relativamente bajas de AT. Los kits utiles para detectar el ATP que utilizan bioluminiscencia estan disponibles en el mercado en Roche, New Horizons Diagnostics Corp, Celsis etc. Sin embargo, existen varios problemas con respecto a la deteccion de bioluminiscencia. Por ejemplo, la deteccion solo de ATP microbiano, en presencia de ARP de fuentes no microbianas puede ser un problema. Este problema se ha resuelto hasta cierto grado mediante el uso de filtros que pueden separar las fuentes bacterianas de las no bacterianas de ATP, proporcionando de esta manera una senal mas precisa.
En consecuencia, se puede ver que existen varios problemas con respecto a la tecnica convencional de la deteccion de microbios. Con el fin de afrontar adicionalmente dichos problemas, se ha propuesto la deteccion de ligasas, tal como los que se describen en la solicitud de patente publicada WO/1996/002665, publicada el 1 de febrero de 1996, donde se describe un metodo para la determinacion de la presencia y/o cantidad de microorganismos y/o su material intracelular presente en una muestra que se caracteriza porque la cantidad de adenilato cinasa en la muestra se estima mezclandola con difosfato de adenosina (ADP), determinando la cantidad de trifosfato de adenosina (ATP) producida en la muestra a partir de este ADP, y relacionando la cantidad de ATP asf producido con la presencia y/o cantidad de adenilato cinasa y con los microorganismos y/o su material intracelular, donde la conversion de ADP a ATP se lleva a cabo en presencia de iones de magnesio con una concentracion molar suficiente para permitir la maxima conversion de ADP a ATP. La cantidad de magnesio presente es preferente tal que haya suficiente para proporcionar un mol de magnesio por cada mol de ADP de manera que todas las moleculas de ADP se puedan asociar con al menos un ion de magnesio.
En la solicitud de patente publicada WO/2009/007719, publicada el 15 de enero de 2009, titulada DETECTION OF MICRO-ORGANISMS BASED ON THEIR NAD-DEPENDENT DNA LIGASE ACTIVITY, se desvelan ligasas, en particular ligasas dependientes de NAD como indicadores utiles de la presencia de un microorganismo (viable) en una muestra. Las ligasas son enzimas que catalizan la union de moleculas de acido nucleico. La reaccion de union necesita o ATP o NAD+ como co-factor dependiendo de la ligasa a la que se refiera. En esta divulgacion, el uso de la actividad de ligasa dependiente de NAD se utiliza como un indicador de la presencia de un microorganismo
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Sumario de la invencion
Al contrario que con los metodos convencionales descritos anteriormente, en un aspecto, la presente invencion se refiere a la deteccion de enzimas tales como polimerasas, en realizaciones preferidas, ADN o ARN polimerasa, como indicadores utiles de la presencia de un microorganismo o microbio (viable) en una muestra, en particular una muestra que es, por ejemplo, un lisado microbiano en bruto o sangre o un cultivo sangumeo sin purificar. La asociacion descubierta de acuerdo con la presente invencion entre la enzima, por ejemplo, la actividad de polimerasa, y la viabilidad de los microorganismos o microbios hace posible que la deteccion de la actividad de estas enzimas se utilicen como un indicador de celulas microbianas viables, en particular de origen bacteriano, en la muestra.
De manera similar, la invencion proporciona, en una realizacion preferida, metodos para la deteccion de ADN o ARN polimerasa como indicador de la presencia de un microorganismo en una muestra. Dicho metodo puede comprender:
(a) poner en contacto la muestra con una molecula de acido nucleico que actua como sustrato de la actividad polimerasa en la muestra;
(b) incubar la muestra que se ha puesto en contacto de esta manera en condiciones adecuadas para la actividad polimerasa; y
(c) determinar espedficamente la presencia (y/o la cantidad) de una molecula de acido nucleico que resulta de la accion de la polimerasa del microorganismo sobre el sustrato por amplificacion de acido nucleico de la molecula de acido nucleico, indicando de esta manera la presencia del microorganismo. Ademas, la presente memoria descriptiva proporciona reactivos utiles en los metodos descritos anteriormente, y kits de ensayo que comprenden dichos reactivos utiles para llevar a cabo los metodos.
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona mejoras de los metodos, composiciones y kits descritos en la solicitud de patente publicada WO/2009/007719, publicada el 15 de enero de 2009, titulada DETECTION OF MICROORGANISMS BASED ON THEIR NAD-DEPENDENT DNA LIGASE ACTIVITY, cuya solicitud publicada identifica ligasas, en particular ligasas dependientes de NAD, como indicadores utiles de la presencia de un microorganismo o microbio (viable).
La presente divulgacion en consecuencia proporciona mejoras en los metodos, y composiciones y kits que se basan en ellos como se desvelan en el documento WO/2009/007719, de deteccion de una enzima que se selecciona de entre el grupo de ligasa dependiente de NAD, o una fosfatasa, o una mezcla de las anteriores, como indicador de la presencia de un microorganismo en una muestra, cuyos metodos mejorados comprenden:
(a) poner en contacto la muestra con una molecula de acido nucleico que actua como sustrato para la actividad enzimatica en la muestra, mientras que no se permiten senales de interferencia de ADN polimerasa,
(b) incubar la muestra puesta en contacto de esta manera en condiciones adecuadas para la actividad enzimatica; y
(c) determinar la presencia (y/o la cantidad) de una molecula de acido nucleico modificada por la enzima o la mezcla sobre el sustrato de moleculas de acido nucleico para indicar la presencia del microorganismo.
Por lo tanto, se apreciara que los metodos mejorados de la invencion son utiles para identificar todos los microorganismos en los que se expresan (o se han expresado) dichas enzimas o mezclas de las mismas.
Como se establece en el presente documento, la primera etapa del metodo comprende la puesta en contacto de la muestra con una molecula de acido nucleico que actua como sustrato de la actividad enzimatica en la muestra, mientras que no se permiten las senales de interferencia de la ADN polimerasa. Por lo tanto se apreciara que cualquier molecula capaz de unirse que se pueda detectar una vez unida se puede utilizar en los metodos de la invencion.
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Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1, dibujos A a D, muestran los diagramas de la matriz y las representaciones graficas de los resultados producidos por los experimented de acuerdo con la presente invencion como se describen en el presente documento.
La Figura 2, dibujos A a D, son representaciones graficas que muestran que los sustratos favorables a la polimerasa incapaces de unirse son sensibles y espedficos en lisados celulares en bruto derivados de microbios.
La Figura 3 es una representacion grafica que muestra que los sustratos favorables a polimerasa incapaces de unirse son sensibles y espedficos de lisados celulares en bruto derivados de un Cultivo sangumeo con microbios anadidos.
Descripcion detallada de la invencion
Por lo tanto, a partir de la descripcion anterior se puede apreciar que los metodos de la presente invencion son utiles para identificar todos los microorganismos en los que se expresa (o se ha expresado una polimerasa adecuada. En ciertas realizaciones, los metodos de la invencion se aplican a la deteccion de microorganismos viables y por lo tanto se puede considerar como un metodo para detectar un microorganismo viable en una muestra. En particular, en una realizacion preferida, los metodos de la invencion pueden ser utiles para la identificacion de bacterias o microorganismos en los que el acido nucleico del gen de polimerasa y su polimerasa proteica activa traducida es esencial para la viabilidad. Sin embargo, los microorganismos, tales como las bacterias, que se convirtieron recientemente en no viables (por ejemplo, mediante un tratamiento con antibacterianos) pueden mantener una actividad de polimerasa detectable hasta que se degrade la enzima.
En el desarrollo de la presente invencion, se descubrio un cambio de paradigma en la preparacion de la muestra de componentes bioqmmicos celulares funcionales que hace posible que los ensayos de la presente invencion se lleven a cabo directamente en las muestras de celulas lisadas suavemente, sin las caras complicaciones que se anaden en los protocolos de aislamiento basados en la desnaturalizacion tradicional, y a menudo extrema. Por lo tanto, se ha descubierto que la presente invencion hace posible la deteccion de organismos viables en muestras tales como los lisados clmicos en bruto, incluyendo sin limitacion fracciones celulares de sangre completa y/o cultivos sangumeos y a partir de grandes volumenes de las mismas, que son normalmente de 10-20 ml, preferentemente en el intervalo de 0,1-100 ml. La invencion es particularmente util para la deteccion de todos los organismos asociados con septicemia y los asociados con afecciones que incluyen, pero no se limitan a bacteriemia, fungemia, y afecciones vmcas y parasitarias. Se ha descubierto inesperadamente que de acuerdo con la presente invencion, la deteccion de dichos organismos se puede conseguir en dichas muestras no purificadas como se ha descrito anteriormente, al contrario que en las ensenanzas de la tecnica convencional en las que la inhibicion de la polimerasa derivada de la muestra, asf como la presencia de proteinasas y nucleasas de interferencia, ha sido una barrera para dichos metodos de ensayo cuando se llevaban a cabo en muestras no purificadas.
Como se ha descrito anteriormente, se han descritos ligasas, en particular ligasas dependientes de NAD como indicadores supuestamente utiles de la presencia de un microorganismo (viable) en una muestra. Sin embargo, por el contrario, la presente invencion proporciona otras enzimas derivadas de celulas microbianas viables, mas utiles que las ligasas, que pueden utilizarse, de manera similar, para ligar su actividad de las celulas viables a un generador de senal de alta sensibilidad tal como la amplificacion por tecnicas tales como la PCR y similares. Esta caractenstica de la invencion tambien hace potencialmente posible la diferenciacion entre bacterias y hongos. En un ejemplo de una realizacion de la invencion, se puede utilizar a este respecto lo siguiente:
a. Se podnan utilizar cinasas con adicion de PO4 para capacitar una ligasa o parar una polimerasa
b. Se pueden utilizar fosfatos para eliminar el PO4 y capacitar las polimerasas
c. Se pueden utilizar ADN y ARN polimerasas para extender los sustratos para facilitar las amplificaciones corriente abajo de PCR tradicional o isotermicas
d. Las amplificaciones isotermicas se pueden ejecutar sin actividad enzimatica de endonucleasas
e. Ribosomas
f. Mecanismos de ARNm
g. Girasa
h. Helicasa
i. Exonucleasas, 5'-3', 3'-5' es decir, eliminando grupos de bloqueo tales como PO4, TaqMan, etc.
j. Endonucleasas
k. Proteasas
l. DNasas
m. RNasas
n. UDGlicosolasas
o. Enzimas de reparacion
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En una realizacion preferida de la presente invencion, se ha descubierto que la medicion de la actividad de ADN polimerasa, de acuerdo con la invencion, hace posible la determinacion de la viabilidad celular a partir de lisados microbianos en bruto. Esto se puede verificar utilizando oligosustratos modificados mas selectivos en combinacion con muy selectivos con “arranque en caliente” (como se conocen bien en la tecnica) y que controlan actividades a TA, 37 0C, 60 0C.
En una realizacion de la invencion, la invencion se aplica a la exploracion de un producto sangumeo, especialmente de plaquetas ya que en la presente solicitud cualquier crecimiento bacteriano causa el desecho de productos, y la diferenciacion entre bacterias y hongos no es necesaria. En una realizacion adicional de la invencion, se pueden emplear fosfatasas y probablemente son otra enzima candidata excelente para hacer posible la actividad polimerasa, ya que eliminan un fosfato 5' o 3' dejando un -OH pudendo capacitar de esta manera cualquier polimerasa mediante la retirada de un Taq 5' que este incluido, o una ligasa (por eliminacion del 3'). Ademas, las fosfatasas son robustas y pueden diferenciar entre levaduras y bacterias mediante la optimizacion del pH. Por lo tanto se apreciara que cualquier enzima adecuada que facilite la polimerasa como se contempla por las ensenanzas del presente documento puede ser util en la practica de la presente invencion.
En la practica de la presente invencion, la deteccion de microorganismos puede incluir microorganismos recientemente viables, hasta el punto en el que se ha degradado la ADN polimerasa, segun sea apropiado. Si es necesaria una distincion entre microorganismos viables y recientemente viables, debena ser suficiente un simple transcurso del tiempo o comparacion de la actividad de polimerasa entre dos o mas puntos de tiempo, en condiciones apropiadas, para determinar si la actividad de polimerasa aumenta, persiste o disminuye con el tiempo. En una realizacion preferida, si se descubre que la actividad de polimerasa persiste, o aumenta durante un extenso periodo o un punto de tiempo posterior (en comparacion con la medicion inicial), puede indicar que los microorganismos son viables. Si la actividad de polimerasa disminuye en un punto de tiempo posterior, puede indicar que la actividad detectada era de microorganismos recientemente viables. Esta estrategia de medicion en el transcurso del tiempo puede ser especialmente util cuando se aplica en el ensayo de susceptibilidad a antibioticos (AST) y asf como en la determinacion de otras terapias apropiadas. Los metodos de deteccion se exponen con detalle en el presente documento, y los metodos de la invencion se pueden aplicar mas generalmente (Wilkinson et al., Molecular Microbiology (2001) 40(6), 1241-1248). Las bacterias pueden, tambien, ser bacterias mesofilas y/o termofilas, por ejemplo.
Una “muestra” en el contexto de la presente invencion se define para incluir cualquier muestra en la que es deseable ensayar la presencia de un microorganismo, en particular una bacteria. Por lo tanto, la muestra puede consistir en un lisado microbiano en bruto proporcionado clmicamente, o puede comprender una muestra clmica de sangre o cultivo sangumeo, o comprende una muestra adecuada para un sistema de ensayo in vitro, por ejemplo. Las muestras tambien pueden comprender muestras de bebidas o alimentos o preparaciones de los mismos, o productos farmaceuticos o cosmeticos tales como productos de higiene personal que incluyen champus, acondicionadores, hidratantes, etc., los cuales se ensayan en cuanto a contaminacion microbiana de manera rutinaria. La muestra puede comprender tejidos o celulas y puede comprender esputo o una muestra de plaquetas. Ademas, los metodos y kits de la invencion se pueden utilizar para controlar la contaminacion de superficies, tales como por ejemplo, en localizaciones en las que se preparar un alimento. En una realizacion preferida, la contaminacion se indica por la presencia de actividad de polimerasa. La contaminacion puede ser de cualquier fuente microbiana, en particular contaminacion bacteriana. Ademas, la invencion tambien es util para controlar condiciones ambientales tales como el suministro de agua, aguas residuales, ambientes marinos, etc. La invencion tambien es util para controlar el crecimiento bacteriano en procedimientos de fermentacion y en el muestreo del aire cuando se puede evaluar el contenido de bacterias o esporas en un hospital, instalaciones industriales o en aplicaciones de biodefensa.
Los metodos de la invencion se basan en el hecho de que si hay uno o mas microorganismos (viables), en particular bacterias, presentes en una muestra, estara presente una actividad enzimatica, preferentemente una actividad de ADN polimerasa. La enzima por lo tanto, puede, en condiciones adecuadas, catalizar una reaccion para generar una nueva molecula de acido nucleico (en un procedimiento posterior). La nueva molecula de acido nucleico se puede detectar por cualquier medio adecuado tal como se describe posteriormente en el presente documento, permitiendo de esta manera la determinacion de la presencia de los microorganismos en la muestra en ensayo.
Por lo tanto, si el microorganismo no esta presente en la muestra, no habra actividad enzimatica (por ejemplo, de polimerasa) en la muestra y por lo tanto no se generara una nueva molecula de acido nucleico detectable.
Los metodos de la presente invencion proporcionan ventajas tecnicas significativas, debido en gran parte al hecho de que la nueva molecula de acido nucleico se genera como parte del metodo. En los metodos de la presente invencion, la molecula de acido nucleico que no reacciona no contribuira a la senal, y como resultado no se debenan producir de senales positivas falsas cuando se lleven a cabo los metodos.
Ademas, los metodos proporcionados por la invencion son altamente sensibles, y pueden proporcionar la deteccion de la enzima (por ejemplo, polimerasa) presente en la muestra por debajo de femtogramos y posiblemente incluso a niveles de attogramos. La sensibilidad se deriva del hecho de que cada celula bacteriana contiene miles de moleculas enzimaticas, y por lo tanto cada una puede catalizar multiples eventos en condiciones adecuadas. A
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diferencia de las estrategias de PCR directas, que pueden dirigirse a una o pocas copias de un gen por celula o el uso de etapas o reactivos adicionales para detectar el ARN ribosomico o mensajero, la estrategia descrita en el presente documento se dirige a la deteccion de multiples copias de la enzima por celula en un simple formato de ensayo.
Como se establece en el presente documento, la primera etapa en un metodo de acuerdo con la invencion comprende poner en contacto la muestra con una molecula de acido nucleico que actua como sustrato para la actividad de una enzima, por ejemplo polimerasa, en la muestra.
Las moleculas de acido nucleico del sustrato adecuado para el uso en la invencion se describen posteriormente con mas detalle. Las moleculas de acido nucleico pueden incorporar analogos sinteticos de nucleotidos segun sea apropiado o pueden basarse por ejemplo en ARN o ADN, o mezclas de los mismos. Se pueden marcar, tal como utilizando un marcador fluorescente, o un par FRET, en ciertas realizaciones para facilitar la deteccion. Los metodos de deteccion adecuados se describen en el presente documento.
“Acido nucleico” se define en el presente documento para incluir cualquier acido nucleico natural o analogos naturales o sinteticos que son capaces de generar una molecula de acido nucleico por accion de la polimerasa. Las moleculas de acido nucleico adecuadas pueden estar compuestas, por ejemplo, por ADN de cadena doble o sencilla y ARN de cadena doble o sencilla.
Aunque el sustrato de acido nucleico puede comprender una molecula de ADN de doble cadena con los extremos romos, en una realizacion de la invencion el acido nucleico sustrato de la polimerasa comprende moleculas de ADN de doble cadena con una protuberancia complementaria y grupos fosfato 5' en los extremos que se van a unir. En una realizacion espedfica, la protuberancia complementaria tiene entre 2 y 10, tal como 3 o 5 pares de bases. En una realizacion alternativa, el sustrato de acido nucleico comprende una molecula de ADN con una muesca que contiene un fosfato 5'. Las moleculas de acido nucleico sintetizadas estan disponibles en el mercado y se pueden fabricar a medida con un grupo fosfato unido en el extremo 5'. Esto tiene la ventaja tecnica de que el 100 % de las moleculas de acido nucleico que se utilizan en los metodos de la invencion se marcaran con un grupo fosfato en 5'.
En realizaciones espedficamente preferidas de la invencion, si la polimerasa esta presente en la muestra, catalizara y se formara una nueva molecula de acido nucleico (que se incorpora a la nueva secuencia total) que se pueda detectar por un procedimiento posterior, como se detalla en el presente documento (tal como por ejemplo PCR).
Por lo tanto, el sustrato de molecula de acido nucleico, en hecho, comprende dos o mas moleculas de acido nucleico segun sea apropiado. Esto se aplica en general a los metodos y kits. En ciertas realizaciones, el sustrato de acido nucleico comprende dos moleculas de acido nucleico de doble cadena con protuberancias complementarias de cadena sencilla.
Se tiene que apreciar que los nuevos metodos de la presente invencion se pueden utilizar para diferenciar la ligasa de la polimerasa tomando una muestra sospechosa de contener ambas y ensayando la polimerasa y ligasa en paralelo en vasos de reaccion separados, entonces se restan las senales, determinando de hecho los niveles verdaderos de ligasa que se encuentran en la muestra. Esto puede representarse por la siguiente ecuacion:
[ senal de polimerasa - senal de ligasa (polimerasa + ligasa) = senal verdadera de ligasa ]
Tambien se tiene que apreciar que en cualquier realizacion de la presente invencion, la accion de las polimerasas sobre los acidos nucleicos es bien conocida y por lo tanto se puede ver que se pueden seleccionar muchos tipos diferentes de sustratos de acido nucleico para su uso y tendran las ventajas de la utilizacion en los nuevos metodos de la invencion, como se describen en el presente documento. Preferentemente, el sustrato de acido nucleico esta presente en exceso, y en particular en un gran exceso molar, sobre la polimerasa de la muestra. Esto es una importante distincion tecnica respecto a los metodos de la tecnica anterior. Debido a que se detecta solamente una nueva molecula de acido nucleico polimerizado es esencial la presencia de esta molecula en la muestra para que los metodos de deteccion funcionen eficazmente. Por lo tanto, no es perjudicial para los metodos de la invencion si estan presentes otras moleculas de acido nucleico en la muestra tales como de bacterias que se van a detectar o de fuentes de mairnfero u hongos que se pueden encontrar en la muestra que por ejemplo se va a ensayar.
La presente invencion se puede describir completamente en referencia a los siguientes ejemplos del trabajo experimental que se lleva a cabo de acuerdo con la invencion. Tambien, aunque ciertas de las realizaciones preferidas de la presente invencion se han descrito y ejemplificado anteriormente, no se tiene la intencion de que la invencion se limite a dichas realizaciones.
Ejemplo 1. Descubrimiento de un mecanismo independiente de la ligasa:
Se incubaron tres sustratos de ADN diferentes (A) con ligasa de E. coli o sin ligasa y se sometio a una PCR que contema los cebadores de PCR espedficos del sustrato de ADN de ligasa en presencia/ausencia de UNG. Se controlo la PCR mediante SYBR verde (qPCR) y las reacciones resultantes se sometieron a analisis en gel (B). Se
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incubaron tres sustratos de ADN diferentes (A) con ligasas de E. coli o sin ligasa y se sometio a una PCR que contema cebadores de deteccion de la Extension S1 en presencia/ausencia de UNG. Se controlo la PCR mediante la metodolog^a de sonda Zeus disponible en el mercado (Zeus Scientific, Inc., Raritan, NJ) y las reacciones resultantes se sometieron a analisis en gel (C). Se incubaron cantidades menguantes de un sustrato de ADN no ligable (S1/AS solo) con tres ADN polimerasas diferentes disponibles en el mercado y se sometieron a un analisis de qPCR con sonda Zeus. Los resultados de estos experimented se ilustran graficamente en la Figura 1.
Ejemplo 2. Se descubrio que los sustratos favorables a polimerasas incapaces de unirse eran sensibles y especificos en lisados celulares en bruto derivados de microbios
Se lisaron en una moledora de lecho cantidades menguantes de microbios y se incubaron con un sustrato de ADN (S1/AS solo) en presencia de tampon de ADN polimerasa y dNTP a 37 °C durante 30 min. (A). Los lisados se sometieron entonces a qPCR con sonda Zeus que conteman cebadores especificos de extension de S1. Los resultados se representan graficamente en la Figura 2.
Ejemplo 3.
Se descubrio que los sustratos favorables a polimerasa, incapaces de unirse eran sensibles y especificos en lisados celulares en bruto derivados de un cultivo sanguineo con microbios anadidos.
Se anadieron cantidades menguantes de microbios en 10 ml de un caldo sanguineo. Los microbios se recuperaron posteriormente, se sometieron a lisis en una moledora y se incubaron con un sustrato de ADN (S1/AS solo) en presencia de tampon de ADN polimerasa y dNTP a 37 °C durante 30 min. (A). Los lisados se sometieron entonces a qPCR con sonda Zeus que contema cebadores especificos de extension S1. Los resultados se representan graficamente en la Figura 3.
En consecuencia, en otro aspecto mas la presente invencion mejora la invencion descrita y reivindicada en el documento WO/2009/007719. De acuerdo con la presente invencion, se habfa descubierto que el supuesto sustrato espedfico de ADN ligasa de acuerdo con la divulgacion de dicho documento WO/2009/007719 produce senales robustas de ADN polimerasa purificada o ADN ligasa purificada, de manera que los metodos expuestos no hadan que la ADN ligasa fuera espedfica cuando se aplicaba al tipo de muestra que se pretendfa, tal como las muestras de septicemia. Por ejemplo, en el desarrollo de la presente invencion, se introdujeron muestras de septicemia utilizando los metodos de preparacion de muestras que se ensenan en el documento WO/2009/007719 en los protocolos de ensayo como se ensena en el mismo como lisados celulares microbianos en bruto que conteman una alta abundancia de ADN polimerasas. Las ADN polimerasas son abundantes en todas las celulas vfas. Se descubrio que los ensayos que se desvelan en el documento WO/2009/007719 son incapaces de discriminar entre senales derivadas de ADN polimerasa y ADN ligasa, cuando se introducen en muestras sin ligasa purificada, que desde un punto de vista practico incluyen todas las introducciones de muestras clmicas, debido a que el aislamiento de ligasa no es ni un procedimiento practico no de rutina como se desvela en esta referencia, cuando se intentan obtener resultados de muestras clmicas. Ademas, se descubrio que los experimentos que se llevan a cabo de acuerdo con lo que se ensena en esta referencia produdan una senal de ensayo contaminada con ADN polimerasa, no una senal espedfica de ADN ligasa, que es el resultado claramente deseado de acuerdo con la presente referencia.
Estos hallazgos descritos anteriormente son contrarios a la capacidad de un sistema, que se produce de acuerdo con las ensenanzas del documento WO/2009/007719, para detectar espedficamente la ADN ligasa de celulas viables. Ademas se descarta la capacidad que se pretende en el ensayo desvelado en esta referencia para diferenciar la ligasa bacteriana dependiente de NAD derivada de celulas viables de la ligasa fungica dependiente de ATP, ya que las polimerasas activas son comunes en todas las celulas viables y no se pueden diferenciar de las ligasas en dicho sistema de ensayo. Teniendo identificado por tano este problema cntico, que claramente no se prevefa en esa referencia o en cualquier otra tecnica conocida, la presente invencion proporciona mejoras que hacen posibles las senales de ligasa que se van a detectar de muestras con ligasa no purificadas, tal como los lisados microbianos en bruto, proporcionando sustratos de ADN alternativos, sustitutivos, como se describe posteriormente en el presente documento, que no permiten que se detecten las senales de interferencia de las ADN polimerasas.
La presente divulgacion por lo tanto tambien proporciona metodos mejorados, y composiciones i kits que se basan en los mismos, de deteccion de una enzima que se selecciona de entre el grupo que consiste en ligasa dependiente de NAD, o fosfatasa, o una mezcla de las mismas como indicador de la presencia de un microorganismo en una muestra, comprendiendo los metodos:
(a) poner en contacto la muestra con una molecula de acido nucleico que actua como un sustrato para la
actividad enzimatica en la muestra mientras que no se periten las senales de interferencia de la ADN
polimerasa.,
(b) incubar la muestra que se ha puesto en contacto de esta manera en condiciones adecuadas para la actividad
enzimatica; y
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(c) determinar la presencia (y/o la cantidad) de una molecula de acido nucleico modificada por la enzima que resulta de la accion de la enzima selecciona da o una mezcla sobre el sustrato de molecula de acido nucleico para indicar la presencia del microorganismo.
Por lo tanto, los metodos mejorados son utiles para la identificacion de todos los microorganismos en los que se expresa (o se ha expresado) una ligasa dependiente de NAD, o una fosfatasa, o mezclas de las mismas.
En un ejemplo preferido la primera etapa en el metodo mejorado desvelado en el presente documento comprende poner en contacto la muestra con una molecula de acido nucleico que actua como sustrato para la actividad de ligasa dependiente de NAD en la muestra, mientras que no se permiten las senales interferentes de ADN polimerasa. Cualquier molecula de enzima adecuada, o ligable, que se pueda detectar, una vez ligada, se puede utilizar en los metodos de la invencion.
El sustrato de moleculas de acido nucleico para su uso en los metodos, y la inclusion en los kits, debe ser de una secuencia y estructura de manera que la ligasa dependiente de NAD pueda actuar sobre las moleculas para producir una (nueva) molecula de acido nucleico modificada por una enzima o ligada detectable, y de manera que no permite senales de interferencia de ADN polimerasa.
Se tiene que apreciar que en el desarrollo de la presente invencion, se senala que la eliminacion de la senal de fondo derivada de la aDn polimerasa Taq en la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) no era una solucion viable para la falta de especificidad que se hada encontrado en el sustrato actual como se desvela en el documento WO/2009/007719, ya que se determino como un sistema de deteccion separado que tendna que abordarse por separado y esta por lo tanto fuera del alcance de la presente divulgacion.
En consecuencia, en el presente caso para los experimentos que dan lugar a la presente invencion se fijaba espedficamente como un objetivo bloquear toda la actividad de ADN polimerasas con un aditivo inhibidor que no interfiera con la ligasa. Con el fin de conseguir esto, se senalo que las ADN polimerasas teman funciones enzimaticas bien documentadas que se necesitan neutralizar/controlar:
(a) actividad de ADN polimerasa 5'-3'
(b) actividad exonucleasa 3'-5'
(c) actividad exonucleasa 5'-3'
(d) actividad esterasa inherente
Se ha determinado de acuerdo con la presente invencion que las estrategias de sustrato adecuado de molecula de acido nucleico para su uso en nuevos metodos de la presente invencion, que son adecuados en sustitucion de las moleculas de sustrato desveladas como se utilizan en los metodos del documento WO/2009/007719 puede incluir, pero no se limita lo siguiente:
1. Nucleotidos modificados que inhiben cualquier actividad de la polimerasa
2. Didesoxinucleotidos ddCTP, ddGTP que detienen la polimerasa al anadir la primera base y secuestra - neutraliza su actividad mientras que la ligasa disfruta de reacciones productivas utilizando el dATP.
3. Didesoxinucleotidos que evitan que se extienda el oligo AS
4. Oligos S1 con bases modificadas para la inhibicion de polimerasa que se incorporan para bloquear su actividad en este sustrato de ADN.
5. Anticuerpos espedficos de ADN polimerasa que inhiben esta actividad - estos se conocen bien en la tecnica del PCR
6. Complejos inhibidores de oligos aptameros
7. Estrategias de sustrato de ADN que impide que se detecten los sustratos de polimerasa extendidos en amplificaciones corriente abajo tales como acortamiento de AS por PCR en el lado 5' combinadas con un verdadero “arranque en caliente”, como se conoce dicho termino en la tecnica
8. Las estrategias de hibridacion del sustrato de ADN que eliminan la union de polimerasa y la extension por acortamiento de AS en el lado 3' pero no el efecto de ligasa
9. fndice cinetico relativo combinado con la extension de la longitud de polimerasa inclinado a favor de la ligasa.
10. Competicion Per-PCR S1 3'-didesoxi (de longitud completa, o un l3mero que es el complementario al 3' de la AS)
11. Competicion Pre-PCR S1 3' fosfato
12. Retirada completa de AS utilizando condiciones optimas de UNG (enzima UNG convencional)
13. Retirada completa de AS utilizando UNG termoestable (NEB). Hara posible el tratamiento por calor de UNG para eliminar la ligasa/polimerasa contaminante, la PCRmm debe tener dTTP
14. Hacer una AS que tenga desoxiuridina (retirada de UNG) y el resto de bases de ARN para permitir el co- tratamiento de UNG/RNasa antes de la PCR
15. Se necesita obtener didesoxi 3' AS
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16. Acortamiento del extremo 30 de la AS para reducir el atraque de Taq a altas temperatures (es decir 68 grados)
17. AS unido covalentemente a un soporte solido durante la etapa de union/extension
18. complemento inverso 3'-didesoxi S2 (longitud completa, o puede ser solo un 13mero que es complementary de la extension S1 Pol
19. Para la reduccion del fondo - Se conocen bien en la tecnica estrategias de “arranque en caliente” - 100 % de eliminacion de oligos o hibridaciones de oligos extendidos no deseados
a. Ffsica verdadera - no es facil de hacer todos los materiales que contacten deben estar a una temperatura caliente de aproximadamente 90 grados C, y nunca debe caer por debajo de aproximadamente 65 grados C, siendo el problema que el proceso de transferencia crea una bajada de temperatura que se debena evitar.
b. Sin arranque en caliente enzimatico, por ejemplo dejar en 2 mM de MgCl (0,1 mM de EDTA protegido), cebadores, dNTP u otros componentes esenciales.
c. Qmmico- cebador de arranque en caliente
Aunque se ha demostrado que las mejoras de la presente invencion se pueden realizar por la sustitucion de sustrato adecuado de moleculas de acido nucleico que se describen en el presente documento para los descritos en el documento WO/2009/007719, se tiene que apreciar que la presente invencion no se limita al alcance de las realizaciones espedficas descritas en el presente documento. Ademas, distintas modificaciones de la invencion ademas de las descritas en el presente documento seran evidentes para los expertos en la tecnica a partir de la descripcion anterior. Se tiene la intencion que dichas modificaciones se encuentren en el alcance de la presente invencion. Ademas, todas las realizaciones descritas en el presente documento se pueden aplicar ampliamente y combinar con cualquiera de otras realizaciones consistentes, segun sea apropiado.
Se apreciara para los expertos habituados en la tecnica que los principios fundamentales amplios y las ensenanzas de la presente invencion son capaces de aplicarse para optimizar todas las variaciones de analisis PCR-SYBR/de sonda directa-lisado en bruto (por moledora o ultrasonidos)-capacitados pos desnaturalizante de distintas muestras biologicas tisulares (incluyendo pero sin limitarse a, sangre, fluidos corporales y tejidos blandos) para no solo microorganismos o microbios como se ha descrito anteriormente espedficamente, sino tambien para distintos agentes patogenos, tales como cualquier bacteria, hongos, virus, parasitos, etc.
Aunque se han hecho referencias espedficas a la PCR en el presente documento, se apreciara adicionalmente que las mejoras de la presente invencion no se limitan a la PCR o metodologfas similares. Los ensayos de amplificacion contemplados para su uso en la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, otras tecnicas basadas en acidos nucleicos bien conocidas tales como ensayos de amplificacion de ADN, ensayos de PCR que incorporan polimerasas termoestables, y metodos de amplificacion isotermica. Se tiene que apreciar que un experto en la tecnica puede concebir distintos metodos de amplificacion adecuados que seran utiles en la practica de la presente invencion, y que por lo tanto la invencion no tiene la intencion de limitarse por estos.
Tambien se tiene que apreciar que la presente invencion tiene aplicaciones en todos y cada uno de los metodos, procedimientos y procesamientos que implica el diagnostico de aDn. Ejemplos de dichas aplicaciones incluyen pero no se limitan a los que implican seguridad alimentaria y del agua, bioterrorismo, detecciones medicas/de medicamentos y/o cualquier cosa que implique la deteccion de agentes patogenos. En la industria alimentaria, la presente invencion se puede utilizar para controlar la eficacia de los conservantes. El metodo de la invencion tiene el potencial de aplicarse a todas las celulas. Aunque las celulas bacterianas se ejemplifican en el ejemplo, un experto en la tecnica puede ver facilmente que los metodos de la invencion se pueden aplicar a otros muchos tipos celulares. La invencion se puede utilizar tambien para la identificacion de sustancias que pueden alterar las membranas y/o destruir celulas, por ejemplo, celulas bacterianas. La identificacion de nuevos desinfectantes y/o antibioticos son actualmente una prioridad debido a organismos con resistencia multifarmaco que florecen y se diseminan en las instituciones de salud y los pacientes.
Se apreciara adicionalmente que los metodos de la invencion, en combinacion con una PCR cuantitativa es una herramienta que identifica rapida y satisfactoriamente el impacto de un desinfectante y/o un antibiotico sin tener que perder tiempo en cultivarlas celulas y esperar su crecimiento. En algunos casos, los organismos pueden necesitar dfas a semanas para cultivarse, y por lo tanto pueden gastar un tiempo significativo para ver si la sustancia candidata ha sido capaz de eliminar celulas, tales como microorganismos. En otros casos, ciertos organismos no creceran en un cultivo celular, haciendo por lo tanto diffcil determinar si una sustancia era eficaz. Por lo tanto, la aplicacion de los nuevos metodos de la invencion puede ahorrar tiempo y recursos para la identificacion de nuevos desinfectantes o antibioticos.
Una ventaja adicional de los nuevos metodos de acuerdo con la invencion es su uso facil. Por ejemplo, utilizando estos metodos, se pueden ensayar grandes cantidades de muestra en cuanto a la presencia de celulas viables, por ejemplo, bacterias. Por ejemplo, se pueden ensayar muestras en cuanto a la presencia de bacterias potencialmente vivas con membranas intactas. En otra realizacion las muestras ambientales se pueden ensayar en cuanto a la presencia de celulas viables, por ejemplo, bacterias. Estas muestras pueden recolectarse, por ejemplo, del suelo o ser parte de las plantas. Los metodos de acuerdo con la invencion se pueden utilizar adicionalmente para ensayar
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aguas residuales tratadas tanto antes como despues de la liberacion.
Los metodos de acuerdo con la invencion se pueden utilizar adicionalmente para ensayar muestras medicinales, por ejemplo, muestras de heces, cultivos de sangre, esputo, muestras tisulares (tambien cortes), material de heridas, orina y muestras del tracto respiratorio, superficies de implantes y cateteres.
Otro campo de aplicacion de los metodos de acuerdo con la invencion puede ser el control de productos alimentarios. En otras realizaciones, las muestras de alimento se obtienen de la leche o productos lacteos (yogur, queso, mantequilla, y suero de mantequilla), agua potable, bebidas (limonadas, cerveza, y zumos), productos de panadena y productos carnicos. El metodo de la invencion puede determinar si los conservantes de la comida o el tratamiento antimicrobiano de la comida (tal como la pasteurizacion) ha evitado el crecimiento celular. Un campo adicional de aplicacion del metodo de acuerdo con la invencion es el analisis de productos farmaceuticos y cosmeticos, por ejemplo, unguentos, cremas, tintes, extractos, soluciones, gotas, etc.
Ademas, los metodos de la invencion pueden identificar miembros potencialmente viables de una comunidad microbiana para estudios ecologicos, la salud de suelos espedficos para los sistemas agncolas y/o ecologicos. Tradicionalmente, la identificacion de una comunidad bacteriana se llevaba a cabo utilizando estrategias basadas en el cultivo o recuentos en placas. Cuanto mas colonias se cuentan mas bacteria se estima que estan en la muestra original. Sin embargo, surgen problemas de algunas veces la larga incubacion (en el intervalo de dfas) haciendo este metodo no adecuado para unos resultados adecuados y precisos. Estos inconvenientes son utilizando los metodos de la invencion.
Ejemplos no limitantes de bacterias que se pueden someter analisis utilizando los metodos de la invencion o para detectar la viabilidad potencial en una muestra utilizando el metodo de la invencion comprenden, por ejemplo: B. pertussis, Leptospira pomona, S. paratyphi A y B, C. diphtheriae, C. tetani, C. botulinum, C. perfringens, C. feseri y otras bacterias de gangrena gaseosa, B. anthracis, P. pestis, P. multocida, Neisseria meningitidis, N. gonorrheae, Hemophilus influenzae, Actinomyces {por ejemplo, Nocardia), Acinetobacter, Bacillaceae {por ejemplo, Bacillus anthracis), Bacteroides {por ejemplo, Bacteroides fragilis), Blastomycosis, Bordetella, Borrelia {por ejemplo, Borrelia burgdorferi), Brucella, Campylobacter, Chlamydia, Coccidioides, Co-rynebacterium {por ejemplo, Corynebacterium diptheriae), E. coli {por ejemplo, E. coli Enterotoxigenica y E. coli Enterohemorragica), Enterobacter (por ejemplo Enterobacter aerogenes), Enterobacteriaceae (Klebsiella, Salmonella (por ejemplo, Salmonella typhi, Salmonella enteritidis, Serratia, Yersinia, Shigella), Erysipelothrix, Haemophilus (por ejemplo, Haemophilus influenza tipo B), Helicobacter, Legionella (por ejemplo, Legionella pneumophila), Leptospira, Listeria (por ejemplo, Listeria monocytogenes), Mycoplasma, Mycobacterium (por ejemplo, Mycobacterium leprae y Mycobacterium tuberculosis), Vibrio (por ejemplo , Vibrio cholerae), Pasteurellaceae, Proteus, Pseudomonas (por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa), Rickettsiaceae, Espiroquetas (por ejemplo, Treponema spp., Leptospira spp., Borrelia spp.), Shigella spp., Meningococcus, Pneumococcus y todos los Streptococcus (por ejemplo, Streptococcus pneumoniae y Grupos A3 B, y C de Estreptococos), Ureaplasmas. Treponema pallidum, Staphylococcus aureus, Pasteurella haemolytica, toxoide de Corynebacterium diptheriae, polisacaridos meningococicos, Bordetella pertusis, Streptococcus pneumoniae, toxoide de Clostridium tetani, y Mycobacterium bovis.
Una realizacion particularmente preferida de la presente invencion utiliza la PCR. Los procedimientos generales se ensenan en la Pat de EE. UU. N° 4.683.195 (Mullis, et al.) y Pat de EE. UU. N° 4.683.202 (Mullis, et al.). Sin embargo, las condiciones optimas de PCR que se utilizan para cada reaccion de amplificacion se determinan en general de manera empmca o se estima con un software de computadora que se emplea comunmente por los expertos en el campo. Varios parametros tienen influencia en el exito de la reaccion. Entre estos estan la temperatura de hibridacion y el tiempo, el tiempo de extension, el Mg2+, pH y la concentracion relativa de cebadores, matrices y desoxirribonucleotidos. En general, la matriz de acido nucleico se desnaturaliza por calor hasta de al menos aproximadamente 95 °C durante 1 a 10 minutos antes de la reaccion de polimerasa. Aproximadamente se ejecutaron 20-99 ciclos de amplificacion utilizando la desnaturalizacion a un intervalo de 90 °C a 96 °C durante 0,05 a 1 minuto, hibridacion a una temperatura que vana desde 48 °C a 72 °C durante 0,05 a 2 minutos, y de extension a 68 °C a 75 °C durante al menos 0,1 minutos con un ciclo final optimo. En una realizacion, una reaccion PCR puede contener aproximadamente 100 ng de matriz de acido nucleico, 20 uM de cebadores corriente arriba y corriente abajo, y 0,05 a 0,5 mm de dNTP de cada tipo, y 0,5 a 5 unidades de ADN polimerasas termoestables disponibles en el mercado.
Una variacion de la PCR convencional es la reaccion PCR de transcripcion inversa (RT-PCR), en la que primero una transcriptasa inversa convierte moleculas de ARN en moleculas de ADNc de cadena sencilla, que se emplea entonces como la matriz para la amplificacion posterior en la reaccion en cadena de la polimerasa. El aislamiento de ARN se conoce bien en la tecnica. Para llevar a cabo la RT-PCR, la transcriptasa inversa se anade generalmente a la muestra de reaccion tras desnaturalizarse el acido nucleico diana por calor. La reaccion se mantiene entonces a una temperatura adecuada (por ejemplo, de 30-45 °C) durante una cantidad de tiempo suficiente (10-60 minutos) para generar la matriz de ADNc antes de que tuvieran lugar los ciclos de amplificacion programados. Un experto habituado en la tecnica apreciaran que si se desea un resultado cuantitativo, se tiene que tener cuidado de utilizar un metodo que mantenga o controle las copias relativas del acido nucleico amplificado. Los metodos de amplificacion cuantitativa” se conocen bien por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, una PCR cuantitativa puede
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implicar simultaneamente la co-amplificacion de una cantidad conocida de una secuencia de control utilizando los mismos cebadores. Esto proporciona una referencia interna que se puede utilizar para calibrar la reaccion de PCR.
Otra alternativa de PCR es la PCR cuantitativa (qPCR). La qPCR se puede ejecutar por tecnicas competitivas que emplean un control homologo interno que se diferencia de tamano de la diana por una pequena eliminacion o insercion. Sin embargo, tambien se pueden utilizar las PCR cuantitativas no competitivas y cineticas. La combinacion de deteccion por PCR cinetica, en tiempo real junto con un control interno homologo que se pueden detectar simultaneamente junto con las secuencias diana puede ser ventajosa.
Los cebadores para la PCR, RT-PCR y/o PCR se seleccionan de regiones o bacterias espedficas que solo amplificaran una region de ADN que se selecciona para ese organismo espedfico. De manera alternativa, se seleccionan cebadores que se hibridaran y amplificaran una seccion de ADN que es comun para todos los organismos. La seleccion y construccion de cebadores se conoce en general en la tecnica. En general, un cebador se localiza en cada extremo de la secuencia que se va a amplificar. Dichos cebadores normalmente tendran entre 10 a 35 nucleotidos de longitud y tienen una longitud preferida de entre 18 a 22 nucleotidos. La secuencia menor que se puede amplificar es aproximadamente de 50 nucleotidos de longitud (por ejemplo, un cebador directo e inverso, ambos de 20 nucleotidos de longitud, cuya localizacion en las secuencias se separa por al menos 10 nucleotidos). Se pueden amplificar secuencias mucho mas largas. Un cebador se denomina “cebador directo” y se localiza en el extremo izquierdo de la region que se va a amplificar. El cebador directo es identico en secuencia a una region en la cadena superior del ADN (cuando se representa un ADN de doble cadena utilizando la convencion en la que la cadena superior se muestra con polaridad en la direccion 5' a 3'). La secuencia del cebador directo es de tal manera que se hibrida a la cadena del ADN que es complementaria a la cadena superior del ADN. El otro cebador se denomina “cebador inverso” y se localiza en el extremo derecho de la region que se va a amplificar. La secuencia de la region en la cadena superior del ADN es complementaria en secuencia a, es decir, es la complementaria inversa de una secuencia en, una region de la cadena superior del ADN. El cebador inverso se hibrida al extremo superior del ADN. Los cebadores de PCR debenan escogerse segun varias de otras condiciones. Los cebadores de PCR debenan ser suficientemente largos (preferentemente de 10 a 30 nucleotidos del longitud) para minimizar la hibridacion mayor que una region de la matriz. Los cebadores con largas repeticiones de una unica base se debenan evitar, si es posible. Los cebadores debenan tener preferentemente un porcentaje de contenido G+C de entre 40 y 60 %. Si es posible, el porcentaje de contenido en G+C del extremo 3' del cebador debena ser mayor que el porcentaje de G+C en el extremo 5' del cebador. Los cebadores no debenan contener secuencias que puedan hibridarse con otras secuencias del cebador (es decir, palmdromos) Dos cebadores que se utilicen en la misa reaccion de PCR no debenan ser capaces de hibridarse entre ellos. Aunque los cebadores de PCR se escogen preferentemente segun las recomendaciones anteriores, no es necesario que los cebadores cumplan estas condiciones. Otros cebadores pueden funcionar, pero tienen una oportunidad menor de producir buenos resultados.
Los cebadores de PCR que se pueden utilizar para amplificar ADN en una secuencia determinada se pueden escoger utilizando uno de varios programas de computadora que estan disponibles. Dichos programas escogen cebadores que son optimos para la amplificacion de una determinada secuencia (es decir, dichos programas escogen cebadores segun las condiciones establecidas anteriormente, mas otras condiciones que pueden maximizar la funcionalidad de los cebadores de PCR). Un programa de computadora es el paquete de analisis Genetics Computer Group (GCG convertido recientemente en Accelrys) que tiene una rutina para la seleccion de cebadores de PCR.
Los cebadores o sondas oligonucleotidicos desvelados posteriormente se pueden fabricar de distintas maneras. Una manera para fabricar estos oligonucleotidos es sintetizarlos utilizando un sintetizador de acidos nucleicos disponible en el mercado. Existe una variedad de dichos sintetizadores y son bien conocidos por los expertos en la tecnica.
Tambien se pueden detectar acidos nucleicos por metodos de hibridacion. En estos metodos, el acido nucleico marcado se puede anadir a un sustrato que contiene sondas de acido nucleico marcadas o no marcadas. De manera alternativa, el acido nucleico marcado o no marcado se puede anadir a un sustrato que contenga las sondas de acido nucleico marcadas o no marcadas. Los metodos de hibridacion se desvelan, por ejemplo, en Micro Array Analysis, Marc Schena, John Wiley and Sons, Hoboken N.J. 2003.
Los metodos de deteccion de acidos nucleicos pueden incluir el uso de un marcador. Por ejemplo, se pueden detectar radiomarcadores utilizando una pelfcula fotografica o un detector de imagen fosfoestimulable (para detectar y cuantificar la incorporacion de fosfato radioactivo). Se pueden detectar y cuantificar marcadores fluorescentes utilizando un fotodetector para detectar la luz emitida (vease la Pat. de EE. UU N° 5.143.854 para un aparato ejemplar) Los marcadores enzimaticos se detectan normalmente proporcionando la enzima con un sustrato y midiendo el producto de reaccion producido por la accion de la enzima sobre el sustrato. Los marcadores colorimetricos se detectan visualizando simplemente el marcador coloreado. En una realizacion, las moleculas de acido nucleico amplificado se visualizan por tincion directa de los productos amplificados con un acido nucleico intercalado con el colorante. Como es evidente para un experto en la tecnica, los colorantes ejemplares incluyen pero no se limitan a SYBR verde, SYBR azul, DAPI, yoduro de propidio, y bromuro de etidio. La cantidad de colorantes luminiscentes intercalados en las moleculas de ADN amplificado es directamente proporcional a la cantidad de productos amplificados, que se pueden cuantificar convenientemente utilizando dispositivos de
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deteccion convencionales de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una variacion de dicha estrategia es la electroforesis en gel de los productos amplificados seguida por la tincion y visualizacion del colorante intercalado seleccionado. De manera alternativa, las sondas de hibridacion oligonucleotidicas marcadas (por ejemplo, sondas fluorescentes tales como las sondas de transferencia de energfa de resonancia fluorescentes (FRET) y sodas colorimetricas) se pueden utilizar para detectar la amplificacion. Cuando se desee, se puede verificar una amplificacion espedfica de las secuencias genomicas representativas de la entidad biologica que se va a ensayar, secuenciando o demostrando que los productos amplificados tienen el tamano previsto, presentan el patron de digestion por restriccion previsto, o se hibridan con las secuencias nucleotfdicas clonadas correctas.
La presente divulgacion tambien comprende kits. Por ejemplo, el kit puede comprender un sustrato que contienen una molecula de acido nucleico para la actividad de la enzima o mezcla de enzimas seleccionada en la muestra (mientras que no se permiten las senales de interferencia de senales de la ADN polimerasa), medios de incubacion para incubar la muestra y el sustrato en condiciones adecuadas para la actividad enzimatica, y medios para determinar espedficamente la presencia (y/o la cantidad) de una molecula de acido nucleico que resulta de la accion de la enzima o mezcla seleccionada sobre el sustrato de molecula de acido nucleico (como una indicacion de la presencia del microorganismo). Dicho kit tambien comprende otros reactivos adecuados para llevar a cabo los nuevos metodos de la invencion, para explorar normalmente fluidos corporales esteriles en cuanto a la presencia o ausencia de microorganismos en la misma y proporcionar una informacion diagnostica, del pronostico del manejo del paciente, asf como cebadores utiles para amplificar la molecula de acido nucleico correspondiente a organismos espedficamente o generalmente, tampones y reactivos para aislar el ADN, y reactivos para la PCR. El kit puede incluir adicionalmente oligonucleotidos marcados de manera detectable, que se hibridan con una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido correspondiente a los organismos de interes. El kit puede contener tambien una muestra de control o una serie de muestras de control que se pueden ensayar y comparar con una muestra de ensayo contenida. Cada componente del kit se puede envasar en un envase individual y los distintos envases pueden estar en un unico paquete, junto con las instrucciones para interpretar los resultados de los ensayos que se llevan a cabo utilizando el kit.
Tambien se tiene que apreciar que los metodos proporcionados por la invencion comprende adicionalmente llevar a cabo el analisis de secuencia del genoma y/o transcriptoma parcial o completo del microorganismo utilizando los principios y ensenanzas proporcionadas en el presente documento, y donde el analisis de secuencia del transcriptoma y/o genoma completo o parcial del microorganismo se puede llevar a cabo simultaneamente, de manera concertada, o en paralelo utilizando una preparacion de muestra unica como se ha descrito en el presente documento. Tambien se tiene que apreciar que los nuevos metodos del presente documento de la invencion puede proporcionar la medicion y deteccion de agentes con actividad antimicrobiana y/o anti polimerasa, utiles en el manejo de pacientes.
La descripcion detallada anterior se ha dado solo para clarificar el entendimiento y no se debenan deducir innecesarias limitaciones de la misma ya que habra modificaciones obvias para los expertos en la tecnica. No es una admision de que cualquier informacion proporcionada en el presente documento sea tecnica anterior o relevante para la invencion reivindicada actualmente, o que cualquier publicacion referenciada espedficamente o implfcitamente sea una tecnica anterior.
A menos de que se defina otra cosa, todos los terminos tecnicos y cientfficos que se utilizan en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto en la tecnica a la que la presente invencion pertenece.
Aunque la presente invencion se ha descrito en detalle, los ejemplos espedficos del presente documento se proporcionaron a modo de ilustracion espedfica de realizaciones de la invencion y con el objetivo de clarificar el entendimiento. Sera facilmente evidente para los expertos habituados en la tecnica, a la luz de las ensenanzas de la presente invencion como se exponen en el presente documento, que se pueden hacer muchos cambios y modificaciones en estas realizaciones descritas de esta manera sin alejarse del espmtu o alcance de la invencion.
Aunque la invencion se ha descrito en conexion con realizaciones espedficas de la misma, se entendera que son posibles modificaciones adicionales y que esta solicitud pretende cubrir cualquiera de las variaciones, usos, o adaptaciones de la invencion que sigan, en general, los principios de la invencion y que incluyan dichos alejamientos de la presente divulgacion que vengan por la practica conocida o a medida en la tecnica a la que la invencion pertenece y que se puedan aplicar a las caractensticas esenciales expuestas anteriormente y que sigan en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Claims (13)
- 51015202530354045REIVINDICACIONES1. Un metodo para detectar la presencia de un microorganismo en una muestra, donde se detecta la actividad de la polimerasa como indicador de la presencia de dicho microorganismo en dicha muestra, cuyo metodo comprende:(a) poner en contacto la muestra con una molecula de acido nucleico que actua como un sustrato para la actividad polimerasa en la muestra;(b) incubar la muestra que se pone en contacto de esta manera en condiciones adecuadas para la actividad polimerasa; y(c) determinar espedficamente la presencia (y/o cantidad) de una molecula de acido nucleico que resulta de la accion de la polimerasa del microorganismo sobre el sustrato por amplificacion de acido nucleico de la molecula de acido nucleico, para indicar de esta manera la presencia del microorganismo.
- 2. El metodo de la reivindicacion 1, donde la polimerasa es una ADN o ARN polimerasa.
- 3. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, donde el microorganismo detectado es un microorganismo viable de la muestra.
- 4. El metodo de la reivindicacion 1, donde el microorganismo detectado es un microorganismo intacto en la muestra.
- 5. El metodo de la reivindicacion 4, donde el microorganismo intacto detectado es uno en el que el acido nucleico del gen de la polimerasa y su polimerasa proteica traducida activa son esenciales para la viabilidad del microorganismo.
- 6. El metodo de la reivindicacion 1, donde el sustrato de la polimerasa esta inmovilizado.
- 7. El metodo de la reivindicacion 1, donde la muestra en la que se detecta el microorganismo es un fluido corporal normalmente esteril.
- 8. El metodo de la reivindicacion 1, donde la muestra se prepara utilizando un metodo de preparacion de muestra con lisis celular diferencial, permitiendo de esa manera que solo la actividad de polimerasa derivada de un microorganismo viable modifique el sustrato espedfico de polimerasa.
- 9. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la muestra en la cual se detecta el microorganismo se prepara a partir de lisados celulares en bruto o fracciones celulares purificadas.
- 10. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el metodo comprende ademas llevar a cabo un analisis de secuencia del genoma y/o transcriptoma completo o parcial del microorganismo.
- 11. El metodo de la reivindicacion 10, donde el analisis de la secuencia del genoma y/o transcriptoma completo o parcial del microorganismo se puede llevar a cabo simultaneamente, de manera concertada, o en paralelo utilizando una unica preparacion de la muestra.
- 12. El metodo de la reivindicacion 10, donde el analisis de la secuencia del genoma y/o transcriptoma completo o parcial del microorganismo comprende ademas un metodo para la medida diagnostica y deteccion de agentes con actividad anti-microbiana y/o anti-polimerasa utiles para el manejo de los pacientes.
- 13. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 donde la muestra comprende una muestra de sangre o cultivo sangumeo.
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