CN103328652A - 测量用于测定未纯化的样品中细胞生活力的酶活性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明一般地涉及微生物的检测领域，特别是细菌的检测，涉及测量酶活性如DNA聚合酶活性的方法，特别是涉及针对微生物粗裂解物进行的该方法，用于测定可以与扩增信号发生器如实时聚合酶链反应（PCR）技术相关联的微生物酶活性，从而能够测定样品如未纯化的血液和其它体液中的微生物病原体。本发明还涉及用于该方法的试剂，以及涉及包括用于实施该方法的该试剂的检测试剂盒。

Description

测量用于测定未纯化的样品中细胞生活力的酶活性的方法

相关申请的交叉引用

本申请为非临时申请，将其以引用方式并入本文，并要求提交于2010年4月16日的第61/324,939号美国临时申请、提交于2010年4月16日的第61/324,949号美国临时申请和提交于2010年4月19日的第61/325,413号美国临时申请的部分优先权。

发明领域

本发明一般涉及检测微生物的领域，特别是细菌的检测。本发明也提供了检测微生物的改进方法，该方法灵敏度高，适用于未纯化的样品，并具有多种用途，以及检测试剂盒，所述检测试剂盒依赖作为细菌生活力的指示剂的连接酶和/或磷酸酶的存在。

发明背景

在许多情况下，测量与细胞生活力相关的某些分子的存在和水平是很重要的。例如，在哺乳动物细胞中测量ATP的水平对于生长分析和毒理学目的是有用的。

培养方法可以用于检测少量的细菌，但该技术需要数日完成，尤其当试图检测少量细菌以及当检测生长较缓慢的微生物时。

作为另外一种选择，可基于对分子存在的测定进行试验，所述分子的存在与在污染的细胞或生物体的样品中的存在相关。最常检测的分子为三磷酸腺苷（ATP）。虽然死亡后细胞中可变的核酸留存导致DNA和RNA的存在和生活力之间的联系不明确，但也提出了DNA和RNA的检测（Keer& Birch,Journal of Microbiological Methods 53(2003)175-183）。也提出了作为生活力指示剂的腺苷酸激酶的检测（Squirrell DJ,Murphy MJ,LeslieRL,Green JCD:A comparison of ATP and adenylate kinase as bacterial cellmarkers:correlation with agar plate counts,in Bioluminescence andChemiluminescence Progress and Current Applications.Edited by:Stanley RA,Kricka LJ.John Wiley and Sons;2002和WO 96/02665）。通常采用的测定ATP水平的方法涉及生物发光的利用。该方法利用反应的ATP依赖性，在所述反应中发光的荧光素酶催化荧光素的氧化。方法可用于测量相对低浓度的ATP。利用生物发光检测ATP有用的试剂盒可商购得自Roche、NewHorizons Diagnostics Corp、Celsis等。然而，生物发光检测存在许多问题。例如，在来自非微生物源的ATP存在下仅检测到微生物ATP可能是个问题。通过使用可以从ATP的非细菌源分离细菌的滤器，在一定程度上解决了该问题，从而提供更加准确的信号。

因此，可以看出微生物检测的常规技术存在许多问题。为了进一步解决这样的问题，提出了连接酶的检测，如公开于1996年2月1日的专利申请公开WO/1996/002665中所描述，其公开了用于测定存在于样品中的微生物和/或其细胞内物质的存在和/或量的方法，其特征在于通过将样品与二磷酸腺苷（ADP）混合，测定样品由来自该ADP的样品产生的三磷酸腺苷（ATP）的量，并将如此产生的ATP的量与腺苷酸激酶的存在/或量以及微生物和/或其细胞内物质相关联，来估计样品中的腺苷酸激酶的量，其中在足以允许ADP向ATP最大转化的摩尔浓度的镁离子存在下进行ADP向ATP的转化。所存在的镁的量优选为使得足以为一摩尔ADP提供一摩尔镁，以使所有ADP分子可以与至少一个镁离子相关联。

在于2009年1月15日公开的名称为DETECTION OFMICRO-ORGANISMS BASED ON THEIR NAD-DEPENDENT DNALIGASE ACTIVITY的专利申请公开WO/2009/007719中公开了作为样品中（存活）微生物存在的有用指示剂的连接酶，特别是NAD-依赖性连接酶。连接酶为催化核酸分子连接的酶。连接反应根据所涉及的连接酶需要ATP或NAD+作为辅因子。在本公开中，利用NAD-依赖性连接酶活性作为样品中（存活）微生物存在的指示剂。由于允许该酶的活性用作样品中存活微生物细胞，特别是细菌源的存活微生物细胞的指示剂，NAD-依赖性连接酶活性和生活力之间的联系是在该申请中所公开的发明的核心（Korycka-Machala等人,Antimicrobial Agents and Chemotherapy,Aug.2007,第2888-2897页）。然而，在引导本发明形成的实验中，发现在该专利申请公开WO/2009/007719中所描述的技术和教导无法应用于未纯化样品中的存活微生物的测定，所述未纯化样品如粗微生物裂解物、血液或血液培养物，从而构成如该参考文献所述技术的主要缺陷。然而，已发现这些方法也有问题。例如，如上述引用的专利申请所公开，已发现当用于其预定的样品类型时（血液衍生的微生物粗细胞裂解物），一般地常规连接酶底物检测设计和其所产生的检测信号无连接酶特异性。这些正是本发明所要解决和克服的问题。

发明概述

与上述常规方法相反，在一个方面，本发明涉及酶如聚合酶的检测，在优选的实施方案中所述聚合酶为DNA或RNA聚合酶，所述酶作为样品中（存活）微生物或微生物存在的有用指示剂，特别是样品例如粗微生物裂解物或未纯化的血液或血液培养物。根据本发明发现的酶活性例如聚合酶活性和微生物（micoorganism）或微生物（microbe）的生活力之间的关联使得这些酶的活性检测可用作样品中存活微生物细胞，特别是细菌来源的存活微生物细胞的指示剂。

同样地，本发明在一个优选实施方案中提供了用于检测作为样品中微生物存在的指示剂的DNA或RNA聚合酶的方法。该方法可以包括：

（a）将样品与核酸分子接触，所述核酸分子用作样品中聚合酶活性的底物；

（b）在适合于聚合酶活性的条件下孵育这样接触的样品；和

（c）测定由微生物聚合酶作用于底物核酸分子而产生的核酸分子的存在（和/或量）测定，从而指示微生物的存在。

此外，本发明提供了用于上述方法中的试剂，以及包括该试剂的检测试剂盒以进行该方法。

另一个方面，本发明提供了于2009年1月15日公开的名称为DETECTION OF MICRO-ORGANISMS BASED ON THEIRNAD-DEPENDENT DNA LIGASE ACTIVITY的专利申请公开WO/2009/007719中所述方法、组合物和试剂盒的改进，所述申请公开识别作为（存活）微生物（micoorganism）或微生物（microbe）存在的有用指示剂的连接酶，特别是NAD-依赖性连接酶。

将所述WO/2009/007719包含的整个公开内容以引用方式并入本文，并使其成为本申请的一部分。

因此，本发明提供了如WO/2009/007719中所公开的检测作为样品中微生物存在的指示剂的酶的方法、组合物和基于其的试剂盒的改进，所述酶选自NAD-依赖性连接酶或磷酸酶或上述的混合物，所述改进的方法包括：

（a）将样品与核酸分子接触，同时不允许来自DNA聚合酶的干扰信号，所述核酸分子用作样品中酶活性的底物；

（b）在适合酶活性的条件下孵育这样接触的样品；和

（c）测定由所选择的酶或混合物作用于底物核酸分子而产生的酶修饰的核酸分子的存在（和/或量），以指示微生物的存在。

因此，应认识到本发明的改进的方法用于识别表达（或已表达）该类酶或其混合物的所有微生物。

如本文所述，方法中的第一步包括将样品与核酸分子接触，同时不允许来自DNA聚合酶的干扰信号，所述核酸分子用作样品中酶活性的底物。因此应认识到一旦连接变可以特异性检测到的任何合适的可连接分子可以用于本发明的方法中。

附图的简要说明

图1，图A至D显示了通过根据本文所述的本发明进行的实验所产生的结果的模板图和图示说明。

图2，图A至D为图示说明，其显示不可连接的有利于聚合酶的底物在得自微生物的粗细胞裂解物中具有敏感性和特异性。

图3为图示说明，其显示不可连接的有利于聚合酶的底物在得自微生物加标血液培养物的粗细胞裂解物中具有敏感性和特异性。

发明详述

因此，从之前的描述中可以认识到本发明所述方法可用于识别表达（或已表达）酶如合适的聚合酶的所有微生物。在某些实施方案中，将本发明所述方法应用于存活微生物的检测，因此可视为检测样品中存活微生物的方法。特别地，在一个优选的实施方案中，本发明所述方法可以用于识别细菌或微生物，其中核酸聚合酶基因及其翻译的活性蛋白聚合酶是其存活所必需的。然而，最近提出的非存活（例如通过使用抗菌剂处理）微生物，如细菌可以保留可检测的聚合酶活性，直到酶被降解。

在本发明的开发中，发现在功能性细胞生化成分的样品制备中发生了模式转变，这是由于本发明使得能够直接对来自温和裂解细胞的样品进行检测，不需通过传统且通常极端的基于变性的分离方案加入昂贵的复杂物质。因此，发现本发明能够检测样品中的存活微生物，如粗临床裂解物，包括但不限于来自全血和/或血液培养物的细胞成分，和来自较大体积的全血和/或血液培养物的细胞成分，大体积通常为10-20ml，优选为0.1-100ml。本发明特别用于检测与败血症相关的和与包括但不限于菌血症、真菌血症的疾病和病毒及寄生虫疾病相关的所有生物体。意外地发现根据本发明可以实现在如上所述的该未纯化样品中对该生物体进行检测，相比之下，当对未纯化样品进行时，常规技术的教导中的得自样品的聚合酶抑制，以及干扰蛋白酶和核酸酶的存在一直是该检测方法的障碍。

如上所述，已公开连接酶，特别是NAD-依赖性连接酶作为样品中（存活）微生物存在的假定有用指示剂。然而，相反地，本发明提供了其它不是连接酶的得自存活微生物细胞的酶，类似地可以将所述酶用于将其来自存活细胞的活性与高灵敏度的信号发生器相联系，如通过技术如PCR等扩增。本发明的该特征也可能能够区别细菌与真菌。在本发明的一个实施方案的实例中，可以使用以下物质：

a.激酶加PO4可用于启动连接酶或停止聚合酶

b.磷酸盐可用于除去PO4并启动聚合酶

c.DNA和RNA聚合酶可用于延伸底物以启动下游传统PCR或等温扩增

d.等温扩增可使核酸内切酶的酶活性降低

e.核糖体

f.miRNA机理

g.促旋酶

h.解旋酶

i.核酸外切酶，5'-3'，3'-5'即除去封闭基团如PO4、TaqMan等

j.核酸内切酶

k.蛋白酶

l.DNA酶

m.RNA酶

n.尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDGlycosolase）

o.修复酶

在本发明的一个优选的实施方案中，发现根据本发明进行的DNA聚合酶活性的测定使得测定来自微生物粗裂解物的细胞生活力成为可能。这可以通过使用更多选择性修饰的寡核苷酸底物与选择性非常强的“热启动”（如本领域熟知的）组合，以及控制RT，37，60C活性来证实。

在本发明的一个实施方案中，本发明应用于血液产品筛选，尤其是血小板的筛选，这是由于在该应用中任何微生物生长均由丢弃产品所导致，并且不需要区分细菌和真菌。在本发明的另一个实施方案中，可以采用磷酸酶，由于它们可除去5'或3'磷酸酯而留下-OH，从而可以通过所包括的设计的5'Taq的去除或连接酶（除去3'）启动任何聚合酶，因此该磷酸酶很可能为另一种极好的启动聚合酶活性的候选酶。此外，磷酸酶较稳固并有助于通过优化pH而区分酵母和细菌。因此应认识到如通过本文的教导所预期的能够启动聚合酶的任何合适的酶可以用于实施本发明。

在本发明的实施中，微生物的检测可以包括最近存活的微生物，视情况而定，直到DNA聚合酶已降解的点。如果需要区别存活和最近存活的微生物，那么在适当的条件下，简单的时程或两个或多个时间点之间的聚合酶活性的比较应足以测定聚合酶活性是否随时间推移升高、保持或降低。在一个优选的实施方案中，如果发现聚合酶活性在长时间内或在（一个或多个）更晚的时间点（与初始测量相比）保持或升高，这可以表明微生物为存活的。如果聚合酶活性在（一个或多个）更晚的时间点降低，这可以表明所检测的活性来自最近存活的微生物。当应用于抗生素敏感试验（AST）以及其它合适的疗法的测定时，该时程测量方法尤其有用。本文详细讨论了检测方法。在本发明的优选的具体实施方案中，微生物为如本文所述的细菌，并且本发明所述的方法具有更加普遍的应用性（Wilkinson等人,Molecular Microbiology(2001)40(6),1241-1248）。细菌也可以为例如嗜温性细菌和/或嗜热细菌。

本发明的上下文中的“样品”定义为包括需要测试微生物，特别是细菌的存在的任何样品。因此样品可以例如由临床提供的粗微生物裂解物组成，或可包括血液或血液培养物的临床样品，或包括适合于体外检测系统的样品。样品也可以包括饮品或食品样品或其制剂，或药品或化妆品如个人护理产品，包括洗发剂、护发素、保湿剂等，按常规针对微生物污染对其所有进行测试。样品可以包括组织或细胞，并且可以包括痰或血小板样品。此外，本发明所述的方法和试剂盒可以用于监测表面污染，例如制品食品的位置。在一个优选的实施方案中，聚合酶活性的存在表明有污染。污染可以来自任何微生物源，特别是细菌污染。此外，本发明也用于监测环境条件如供水、废水、海洋环境等。本发明也用于在发酵过程和空气采样中监测细菌生长，其中可以在医院、工业设备或生物防御应用中评估细菌或孢子含量。

本发明所述方法依赖于以下事实，即如果样品中存在一种或多种（存活）微生物特别是细菌，那么会存在酶活性，优选DNA聚合酶活性。因此在适当的条件下，酶可以催化反应以生成新型可检测的核酸分子（在随后的过程中）。可以通过任何合适的装置如下文所述的装置检测新型核酸分子，从而可测定待测样品中微生物的存在。

因此，如果样品中不存在微生物，样品中就没有酶（例如，聚合酶）活性，因此不会生成新型的可检测的核酸分子。

本发明所述方法提供了显著的技术优点，在很大程度上是由于生成新型核酸分子作为方法的一部分的事实。在本发明所述方法中，未反应的核酸分子不影响信号，因此当实施方法时不会产生假阳性信号。

此外，本发明提供的方法高度灵敏，并可以提供低至毫微微克，甚至可能为微微微克水平的存在于样品中的酶（例如，聚合酶）的检测。灵敏度来自以下事实：每个细菌细胞含有成千上万种酶分子，因此在合适的条件下每种酶分子可以催化多个事件。与直接PCR方法不同，所述PCR方法必须靶向每个细胞中基因的一个或数个拷贝，或使用其它步骤或试剂检测核糖体或信使RNA，而本文所述的方法以简单的检测形式靶向每个细胞中酶的多拷贝的检测。

如本文所述，根据本发明所述的方法中的第一步包括将样品与核酸分子接触，所述核酸分子用作样品中酶例如聚合酶活性的底物。

以下更详细地描述用于本发明的合适的底物核酸分子。核酸分子可视情况掺入合成的核苷酸类似物或可以是例如基于RNA或DNA的核酸分子，或其混合物。在某些实施方案中可以使用如荧光标记，或FRET对对核酸分子进行标记以便于检测。本文描述了合适的检测方法。

“核酸”在本文中定义为包括任何天然核酸和天然或合成类似物，它们通过聚合酶的作用能够生成可检测的核酸分子。合适的核酸分子可由例如双链或单链DNA和双链或单链RNA构成。

虽然核酸底物可以包括平端双链DNA分子，但是在本发明的一个实施方案中聚合酶的核酸底物包括两个双链DNA分子，在其要连接的末端具有互补的突出端（overhang）和5'磷酸酯基团。在一个具体实施方案中，互补的突出端为2至10个碱基对，如3或5个碱基对。在可选的实施方案中，核酸底物包括DNA分子，其具有含有5'磷酸酯的切口。合成的核酸分子可商购得到，并可以定做为连接的末端5'磷酸酯基团。100%的本发明所述方法中所使用的核酸分子将标记5'磷酸酯基团具有技术优势。

在特别优选的本发明的实施方案中，如果样品中存在聚合酶，其会催化并形成新型核酸分子（掺入整个新型序列），在如本文详细描述的该核酸分子通过随后的过程中（例如PCR）可以检测到。

因此，事实上底物核酸分子视情况可以包括两个或多个核酸分子。这通常适用于本发明所述方法和试剂盒。

在某些实施方案中，核酸底物包括具有单链互补突出端的两个双链核酸分子。

应认识到，通过采集疑似含有聚合酶和连接酶两者的样品并在不同的反应容器中针对聚合酶和连接酶两者进行平行测试，然后减去信号，本发明所述的新型方法可以用于区分连接酶和聚合酶，从而真正确定样品中发现的真实连接酶水平。这可以由以下方程式表示：

[聚合酶信号-连接酶信号（聚合酶+连接酶）=真实连接酶信号]

也应认识到在本发明的任意实施方案中，聚合酶对核酸的作用是众所周知的，因此可以看出可以选择使用如本文所述的许多不同类型的核酸底物，该核酸底物在本发明所述的新型方法中具有利用优势。优选地，存在比样品中的聚合酶过量的核酸底物，特别是较大的摩尔过量。这是优于现有技术方法的重要技术区别。由于检测到新型聚合核酸分子，只有样品中的该分子的出现对有效进行检测方法是必要的。因此，如果样品中存在其它核酸分子，本发明所述的方法不会受到损害，如来自待检测细菌的核酸分子或例如在待测样品中发现的来自哺乳动物或真菌来源的核酸分子。

可以通过参照根据本发明进行的实验工作的以下实施例来更加充分地描述本发明。此外，虽然以上对本发明的某些优选实施方案进行描述并具体例示，但不意味着本发明局限于该实施方案。

实施例1连接酶独立性机理的发现：

将三种不同的DNA底物（A）与大肠杆菌（E.coli）连接酶一起或在无连接酶的情况下孵育并在UNG存在/不存在下进行PCR，所述PCR含有全长DNA连接酶底物特异性PCR引物。通过SYBR绿（qPCR）监测PCR，并对产生的反应进行凝胶分析（B）。将三种不同的DNA底物（A）与大肠杆菌连接酶或在无连接酶的情况下孵育并在UNG存在/不存在下进行PCR，所述PCR含有S1-延伸检测引物。通过市场上可获得的Zeus-探针（qPCR）方法（Zeus Scientific,Inc.,Raritan,NJ）监测PCR，并对产生的反应进行凝胶分析（C）。将降低量的不可连接的DNA底物（仅有S1/AS）与三种不同的市场上可获得的DNA聚合酶一起孵育，并进行Zeus-探针qPCR分析。图1以图表形式描述了这些实验的结果。

实施例2发现不可连接的有利于聚合酶的底物在得自微生物的粗细 胞裂解物中具有敏感性和特异性：

通过玻珠研磨裂解降低量的微生物，并将其在DNA聚合酶缓冲液和dNTP的存在下在37℃下与DNA底物（仅有S1/AS）一起孵育30min（A）。然后对裂解物进行含有S1-延伸特异性引物的Zeus-探针qPCR。结果以图表形式显示在图2中。

实施例3发现不可连接的有利于聚合酶的底物在得自微生物加标血 液培养物的粗细胞裂解物中具有敏感性和特异性：

通过玻珠研磨裂解降低量的微生物，并将其在DNA聚合酶缓冲液和dNTP的存在下在37℃下与DNA底物（仅有S1/AS）一起孵育30min（A）。然后对裂解物进行含有S1-延伸特异性引物的Zeus-探针qPCR。结果以图表形式显示在图3中。

因此，在另一个方面，本发明对WO/2009/007719所描述和要求的发明进行了改进。根据本发明，已发现根据所述WO/2009/007719的公开内容假定的DNA连接酶特异性底物产生来自纯化DNA聚合酶或纯化DNA连接酶的稳定信号，使得当应用于预定样品类型如败血症样品中时，其中所记载的方法不能使DNA连接酶具有特异性。例如，在本发明的开发中，将使用由WO/2009/007719所教导的样品制备方法制备的败血症样品输入到其教导的检测方案中，作为含有大量DNA聚合酶的粗微生物细胞裂解物。所有活细胞均含有丰富的DNA聚合酶。发现当输入非连接酶纯化样品时，如WO/2009/007719所公开的检测不能区分任何DNA聚合酶和DNA连接酶产生的信号，由于如该参考文献所公开，当试图获得来自临床样品的结果时，分离连接酶既不现实也不是常规程序，因此从实际角度出发，所述非连接酶纯化样品包括所有临床样品输入。相反，发现根据该参考文献的教导进行的实验产生了被DNA聚合酶所污染的检测信号，而不是DNA连接酶特异性信号，这显然是根据该参考文献的所需结果。

上述这些结果与根据WO/2009/007719的教导所产生的系统的特异性检测存活细胞中的DNA连接酶的能力相反。由于活性聚合酶普遍存在于所有存活细胞中并且不能区分于该检测系统中的任何连接酶，因此进一步排除了该参考文献所公开的检测的用于区分存活细胞衍生的NAD依赖性细菌连接酶与ATP依赖性真菌连接酶的预定能力。因此，识别该参考文献或任何其它已知领域显然未预料到的这一关键问题后，本发明通过提供如下文所述的可供选择的、替代的DNA底物，提供了能够从未纯化的连接酶样品中检测特异性连接酶信号的改进，其不允许检测到来自DNA聚合酶的干扰信号。

因此本发明也提供了检测作为样品中微生物存在的指示剂的酶的改进的方法、组合物和基于其的试剂盒，所述酶选自NAD-依赖性连接酶、或磷酸酶或其混合物，所述方法包括：

（a）将样品与核酸分子接触，同时不允许出现来自DNA聚合酶的干扰信号，所述核酸分子用作样品中酶活性的底物；

（b）在适合于酶活性的条件下孵育这样接触的样品；和

（c）对由所选择的酶或混合物作用于底物核酸分子而产生的酶修饰的核酸分子的存在（和/或量）进行测定，从而指示微生物的存在。

因此，本发明所述的改进方法用于识别其中表达（或已表达）NAD依赖性连接酶、或磷酸酶、或其混合物的所有微生物。

在本发明的一个优选实施方案中，本文所公开的改进的方法中的第一步包括将样品与核酸分子接触，同时不允许出现来自DNA聚合酶的干扰信号，所述核酸分子用作样品中NAD依赖性连接酶活性的底物。一旦连接后可以特异性检测到的任何合适的酶修饰的、或可连接的分子可以用于本发明的方法中。

用于本发明所述的方法中和包括在试剂盒中的底物核酸分子必须具有使得NAD依赖性连接酶可以作用于分子从而产生可检测的酶修饰的或连接的（新型）核酸分子，并且使得不允许来自DNA聚合酶的干扰信号的序列和结构。

应认识到在本发明的开发中，注意到由于确定其为必须独立解决的独立的检测系统问题，因而在本公开内容的范围之外，所以对于在如WO/2009/007719公开的目前的底物设计中所发现的特异性的缺乏，消除聚合酶链反应（PCR）Taq-DNA聚合酶产生的背景不是可行的解决方案。

因此，在引出本发明的实验的情况中，具体地设定以不干扰连接酶的抑制剂添加剂阻断所有DNA聚合酶活性的目标。为了实现这一目标，指出DNA聚合酶具有充分证实的需要中和/控制酶功能：

（a）5'-3'DNA聚合酶活性

（b）3'-5'核酸外切酶活性

（c）5'-3'核酸外切酶活性

（d）内在酯酶活性

已根据本发明确定用于本发明所述的新型方法中的合适的底物核酸分子策略可以包括但不限于以下物质，所述策略适合取代WO/2009/007719所述方法中使用的已公开的底物分子：

1.抑制聚合酶的任何活性的修饰的核苷酸

2.双脱氧核苷酸ddCTP，ddGTP，其在第一个碱基加入时停止聚合酶并使用dATP隔绝-中和其活性，同时使连接酶具有产出性反应

3.防止AS寡核苷酸被延伸的双脱氧核苷酸

4.S1寡核苷酸，其掺入了聚合酶抑制修饰的碱基以阻断其对该DNA底物的活性

5.抑制该活性的DNA聚合酶特异性抗体-这在PCR领域中众所周知

6.适体寡核苷酸抑制复合物

7.DNA底物杂交策略，其通过缩短与真正的“热启动”，本领域已知该术语结合的5'侧的AS来消除聚合酶延伸的底物以防止在下游扩增如PCR中被检测到

8.DNA底物杂交策略，其通过缩短3'侧的AS来消除聚合酶以防止结合和延伸，但不影响连接酶

9.与聚合酶延伸长度结合的相对速率动力学，其平衡有利于连接酶

10.Per-PCR S13'-二脱氧竞争（全长，或与AS的3'互补的13聚体）

11.Pre-PCR S13'磷酸酯竞争

12.使用最佳的UNG（标准UNG酶）条件完全去除AS

13.使用热稳定UNG（NEB）完全去除AS。可热处理UNG以消除污染的连接酶/聚合酶，PCR mm必须具有dTTP

14.制备具有脱氧尿苷（去除UNG）和其余RNA碱基的AS，以允许在PCR之前进行UNG/RNA酶共处理

15.需要得到双脱氧3'AS

16.缩短AS的3'端以降低较高温度（即65度）下的Taq对接

17.在连接/延伸步骤中共价连接于固体支持物上的AS

18.3'-双脱氧S2反向互补物（全长，或可能仅为与S1 Pol延伸互补的13聚体）

19.用于背景降低-本领域所熟知的“热启动”策略-100%消除不需要的寡核苷酸或延伸的寡核苷酸杂交

a.真正有形的-由于所有接触材料必须在约90℃的热温度下，并且必须不能降至约65℃的温度阈值以下而不易进行，应避免转移过程产生温度下降的问题。

b.非酶热启动，例如滴入2mM MgCl（1mM EDTA保护的），引物，dNTP或其它必需成分

c.化学-引物热启动

虽然已显示可以通过以本文所述的合适的底物核酸分子取代WO/2009/007719中所描述的那些来实现本发明的改进，但应认识到本发明并不限于本文所述的具体实施方案的范围。事实上根据以上描述，除本文所述以外的本发明的各种修改对于本领域技术人员是显而易见的。所有这样的修改均将落入本发明的范围内。此外，认为本文所描述的所有实施方案可广泛应用并可视情况与任何和所有其它一致的实施方案相结合。

本领域普通技术人员应认识到广泛的基本原理和本发明的教导能够用于优化所有各种生物组织样品（包括但不限于血液、体液和软组织）的能够变性的粗裂解物（玻珠研磨和超声）-直接探针/SYBR-PCR分析的改变，其不仅针对如上具体所述的微生物（microorganism）或微生物（microbe），也可针对各种病原体，如任何细菌、真菌、病毒、寄生虫等。

虽然本文具体参照PCR，但应进一步认识到本发明的改进不限于PCR或类似方法。预期用于本发明的扩增检测（amplification assay）包括但不限于，其它熟知的基于核酸的技术如DNA扩增检测、掺入热稳定性聚合酶的PCR检测（PCR assay）和等温扩增方法。应认识到本领域技术人员可以设想将用于实施本发明的各种合适的扩增方法，因此本发明将不被其限制。

也应认识到本发明可应用于任何及所有涉及DNA诊断的方法、程序和过程中。该应用的实例包括但不限于涉及食品、水安全、生物恐怖活动、医疗/药物的应用和/或涉及病原体检测的任何应用。在食品工业中，本发明可以用于监测防腐剂的疗效。本发明的方法有可能应用于所有细胞。虽然在实例中例示了细菌细胞，但本领域普通技术人员可以容易地看出本发明所述方法可以应用于许多其它细胞类型。本发明也可以用于识别可以破坏膜和/或杀死细胞例如细菌细胞的物质。由于多药耐药生物体活跃并在医疗机构和患者中传播，因此识别新的消毒剂和/或抗生素为优先事项。

应进一步认识到本发明所述方法与定量PCR组合作为一种工具可以迅速和成功地识别消毒剂和/或抗生素的影响，无需花费时间培养细胞并等待生长。在某些情况下，需要数日至数周培养生物体，因此会花费大量时间来看候选物质是否能够杀死细胞，如微生物。在其它情况下，某些生物体不会在细胞培养物中生长，因此使得难以确定物质是否有效。因此，应用本发明所述的新型方法可以节省用于识别新型消毒剂和/或抗生素的时间和资源。

根据本发明所述的新型方法的另一个优点是其易于使用。例如，使用这些方法可以容易地测试大量样品中存活细胞例如细菌的存在。例如，可以测试样品中具有完整细胞膜的潜在活细菌的存在。在另一个实施方案中，可以测试环境样品中存活细胞例如细菌的存在。这些样品可以例如从土壤中收集而来或为植物的部分。如本发明所述的方法可以进一步用于在释放之前和之后测试处理的废水。

根据本发明所述的方法可以进一步用于测试医药样品，例如粪便样品、血液培养物、痰、组织样本（和切片）、伤口材料、尿，和来自呼吸道、植入物和导管表面的样品。

根据本发明所述的方法的另一个应用领域可以为食品的控制。在其它实施方案中，食物样品得自牛奶或牛奶制品（酸奶、奶酪、甜奶酪、黄油和脱脂乳）、饮用水、饮品（柠檬汁、啤酒和果汁）、烘培制品或肉制品。本发明所述方法可以测定食物中的防腐剂或对食物进行抗菌处理（如巴氏灭菌）是否阻止细胞生长。根据本发明所述的方法的再一个应用领域为药品和化妆品的分析，例如软膏剂、乳膏剂、酊剂、果汁、溶液剂、滴剂等。

此外，本发明所述的方法可以识别用于生态学研究的微生物群落的潜在存活的成员、用于农业和/或生态系统的特定土壤的卫生状况。传统上使用基于培养的方法或平板计数进行细菌菌落的识别。菌落计数越多，估计原始样品中的细菌就越多。然而，有时较长的培养时间（数日）所产生的问题使该方法不适合于及时和准确的结果。这些缺点利用本发明所述的方法。

可以使用本发明所述的方法进行分析或使用本发明所述的方法检测样品中潜在生活力的细菌的非限定性实例包括例如：百日咳鲍特菌（B.pertussis）、波蒙那钩端螺旋体（Leptospira pomona）、甲型和乙型副伤寒沙门菌（S.paratyphi A and B）、白喉杆菌（C.diphtheriae）、破伤风梭菌（C.tetani）、肉毒梭菌（C.botidinum）、产气荚膜梭菌（C.perfringens）、费氏梭菌（C.feseri）和其它气性坏疽细菌、炭疽杆菌（B.anthracis）、鼠疫巴斯德菌（P.pestis）、多杀性巴斯德菌（P.multocida）、脑膜炎奈瑟菌（Neisseriameningitidis）、淋病奈瑟菌（N.gonorrheae）、流感嗜血杆菌（Hemophilusinfluenzae）、放线菌属（Actinomyces）（例如，诺卡氏菌（Norcardia））、不动杆菌属（Acinetobacter）、芽孢杆菌科（Bacillaceae）（例如，炭疽杆菌（Bacillus anthrasis））、拟杆菌属（Bacteroides）（例如，脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis））、芽生菌（Blastomycosis）、博德特氏菌（Bordetella）、疏螺旋体属（Borrelia）（例如，伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi））、布鲁氏菌（Brucella）、弯曲杆菌属（Campylobacter）、衣原体属（Chlamydia）、球孢子菌属（Coccidioides）、棒状杆菌属（Corynebacterium）（例如，白喉杆菌（Corynebacterium diptheriae））、大肠杆菌（E.coli）（例如，肠产毒性大肠埃希菌（Enterotoxigenic E.coli）和肠出血型大肠埃希菌（Enterohemorrhagic E.coli））、肠杆菌属（Enterobacter）（例如，产气肠杆菌（Enter obacter aerogenes））、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）（克雷伯氏杆菌属（Klebsiella））、沙门氏菌属（Salmonella）（例如，伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）、肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）、沙雷氏菌属（Serratia）、耶尔森氏菌属（Yersinia）、志贺氏菌属（Shigella））、丹毒丝菌属（Erysipelothrix）、嗜血杆菌属（Haemophilus）（例如，B型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenza type B））、螺杆菌属（Helicobacter）、军团杆菌属（Legionella）（例如，嗜肺军团菌（Legionella pneumophila））、钩端螺旋体属（Leptospira）、李斯特菌属（Listeria）（例如，单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes））、支原体属（Mycoplasma）、分支杆菌属（Mycobacterium）（例如，麻风分支杆菌（Mycobacterium leprae）和结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis））、弧菌属（Vibrio）（例如，霍乱弧菌（Vibrio cholerae））、Pasteurellacea、变形菌属（Proteus）、假单胞菌属（Pseudomonas）（例如，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa））、立克次体科（Rickettsiaceae）、螺旋菌属（Spirochetes）（例如，密螺旋体属（Treponema spp.）、细螺旋体属（Leptospira spp.）、疏螺旋体属（Borreliaspp.））、志贺菌属（Shigella spp.）、脑膜炎球菌（Meningiococcus）、肺炎球菌属（Pneumococcus）和所有链球菌属（Streptococcus）（例如，肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）和甲、乙、丙型链球菌（Groups A3B,andC Streptococci）)、尿原体（Ureaplasmas）。苍白密螺旋体（Treponemapollidum）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、溶血巴斯德菌（Pasteurella haemolytica）、白喉棒状杆菌类毒素（Corynebacteriumdiptheriae toxoid）、脑膜炎球菌多糖菌（Meningococcal polysaccharide）、百日咳博德特氏菌（Bordetella pertusis）、肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）、破伤风梭菌类毒素（Clostridium tetani toxoid），和牛型结核菌（Mycobacterium bovis）。以上列举仅为说明性的，绝不意味着将本发明限定于对那些特定细菌生物体的检测。

本发明的一个特别优选的实施方案利用PCR。第4,683,195号美国专利（Mullis等人）和第4,683,202号美国专利（Mullis等人）教导了PCR的一般程序。然而，用于每个扩增反应的最佳PCR条件通常凭经验确定或通过本领域技术人员通常采用的计算机软件估算。许多参数影响反应的成功。其中参数为退火温度和时间、延伸时间、Mg²⁺、pH，和引物、模板及脱氧核糖核苷酸的相对浓度。通常，在聚合酶反应前通过加热至至少约95℃1至10分钟使模板核酸变性。通过在90℃至96℃变性0.05至1分钟，在48℃至72℃的温度下退火0.05至2分钟，以及在68℃至75℃下延伸至少0.1分钟完成大约具有最佳终循环的20-99个扩增循环。在一个实施方案中，PCR反应可以包含约100ng模板核酸，20uM上游和下游引物，和0.05至0.5mm每种dNTP，和0.5至5单位市场上可获得的热稳定DNA聚合酶。

常规PCR的改变为逆转录PCR反应（RT-PCR），其中逆转录酶首先将RNA分子转化为单链的cDNA分子，然后在聚合酶链反应中采用该单链的cDNA分子作为模板进行后续扩增。本领域熟知RNA的分离。在进行RT-PCR时，通常在将靶核酸加热变性后将逆转录酶加入到反应样品中。然后将反应在合适温度下（例如30-45℃）保持足够的时间（10-60分钟），以在预定的扩增循环发生前生成cDNA模板。本领域技术人员应认识到如果需要定量结果，必须注意使用保持或控制扩增核酸的相对拷贝数的方法。“定量”扩增的方法为本领域技术人员所熟知。例如，定量PCR可以涉及使用相同引物同时共扩增已知量的对照序列。这提供了可以用于校正PCR反应的内标。

另一种PCR替代方案为定量PCR（qPCR）。可以通过竞争性技术，采用内部同源对照来运行qPCR，所述内部同源对照通过较小的插入或缺失而与靶标大小不同。然而，也可以使用非竞争性和动态定量PCR。将沿着靶序列可以同时检测到的实时、动态PCR检测与内部同源对照组合在一起可以是有利的。

用于PCR、RT-PCR和/或qPCR的引物选自区域内或特定的细菌，所述引物仅会扩增针对该具体生物体选择的DNA区域。作为另外一种选择，选择将杂交和扩增所有生物体共有的DNA片段的引物。本领域公知引物的选择和构建。通常，一条引物位于待扩增序列的每端。该引物长度通常为10至35个核苷酸，并且优选的长度为18至22个核苷酸。可以被扩增的最小序列的长度为约50个核苷酸（例如，正向和反向引物长度均为20个核苷酸，其在序列中的位置至少间隔10个核苷酸）。可以扩增更长的序列。一个引物称为“正向引物”并位于待扩增的区域左端。正向引物与DNA的上游链的区域中的序列相同（当使用显示上游链具有5'至3'方向极性的惯例绘制双链DNA时）。正向引物的序列是这样的，使其杂交于与DNA上游链互补的DNA链。另一种引物称为“反向引物”，并且位于待扩增的区域右端。反向引物的序列是这样的，使其在序列上与DNA上游链的区域互补，即其为DNA上游链的区域中的序列的反向互补物。反向引物与DNA的上游端杂交。也应选择符合许多其它条件的PCR引物。PCR引物应足够长（优选长度为10至30个核苷酸）以尽量减少其与模板中多于一个区域的杂交。如果可能，应避免单碱基长时间运行的引物。引物应优选地具有40%至60%的G+C百分含量。如果可能，引物的3'端的G+C百分含量应高于引物的5'端的G+C百分含量。引物不应包含可以杂交于引物中另一个序列的序列（即回文序列）。在相同PCR反应中使用的两条引物不应能够互相杂交。虽然PCR引物的选择优选符合以上建议，但引物不需与这些条件一致。其它引物也可以有效，但产生良好结果的几率稍低。

可以使用许多可用的计算机程序中的一种选择可以用于在给定序列内扩增DNA的PCR引物。该程序选择用于扩增给定序列的最佳引物（即，该程序选择符合上述条件以及可以使PCR引物的功能最大化的其它条件的引物）。一个计算机程序为Genetics Computer Group（GCG最近成为Accelrys）分析软件包，其具有选择PCR引物的程序。

以下公开的寡核苷酸引物和探针可以由多种方法制成。一种制备这些寡核苷酸的方法为使用市场上可获得的核酸合成器来合成。存在许多该合成器并且为本领域技术人员熟知。

也可以通过杂交方法检测核酸。在这些方法中，可以将标记的核酸加入到含有标记或未标记的核酸探针的底物中。作为另外一种选择，可以将标记或未标记的核酸加入到含有标记的核酸探针的底物中。杂交方法公开于例如Micro Array Analysis,Marc Schena,John Wiley and Sons,HobokenN.J.2003中。

检测核酸的方法可以包括使用标记。例如，可以使用感光胶片或磷光影像分析仪（phosphoimager）（用于检测和定量放射性磷酸酯的掺入）来检测放射性标记。可以使用光检测器检测并定量荧光标记物以检测发射的光（参见针对典型装置的第5,143,854号美国专利）。通常通过向酶提供底物并测量酶作用于底物而产生的反应产物来检测酶标记。通过简单地使有色标记可视化来检测比色标记。在一个实施方案中，通过使用核酸嵌入染料直接对扩增产物进行染色来使扩增的核酸分子可视化。如对本领域技术人员显而易见的，示例性的染料包括但不限于SYBR绿、SYBR蓝、DAPI、碘化丙啶和溴化乙锭。嵌入到扩增的DNA分子中的荧光染料的量直接与扩增的产物的量成比例，所述荧光染料的量可以根据制造商的说明，使用传统检测装置方便地定量。该方法的一个改变是扩增产物的凝胶电泳，接着对所选择的嵌入染料进行染色和可视化。作为另外一种选择，标记的寡核苷酸杂交探针（例如，荧光探针如荧光共振能量转移（FRET）探针和比色探针）可以用于检测扩增。需要时可以通过测序或显示扩增的产物具有预测的大小、显示预测的限制性酶切图谱、或杂交至正确的克隆核苷酸序列来证实代表被测试的生物实体的基因组序列的特异性扩增。

本发明还包括试剂盒。例如，试剂盒可以包括含有针对样品中所选择的酶或混合物活性的核酸分子的底物（同时不允许来自DNA聚合酶的干扰信号），用于在适合于酶活性的条件下孵育样品和底物的孵育装置和用于特异性测定由所选择的酶或混合物作用于底物核酸分子而产生的核酸分子的存在（和/或量）的装置（作为微生物存在的指示）。该试剂盒也可以包括其它适合于进行本发明所述新型方法的试剂，用于筛选正常无菌体液中微生物的存在或不存在，并提供诊断性、预后性患者管理信息，以及用于扩增与生物体特异性或一般性对应的核酸分子的引物，用于分离DNA的缓冲液和试剂，和用于PCR的试剂。试剂盒可以进一步包括与核酸序列杂交的可检测的标记寡核苷酸，所述核酸序列编码与所关注生物体对应的多肽。试剂盒也可以包含可以对其进行检测并与所包含的测试样品进行比较的一种对照样品或一系列对照样品。可以将试剂盒的每种成分封闭在单独的容器中，并且所有各种容器可以与解释使用该试剂盒进行的检测结果的说明书一起置于单个包装中。

也应认识到本发明所提供的方法进一步包括利用本文提供的原理和教导进行完整的或部分的微生物基因组和/或转录组序列分析，并且其中可以使用如本文所述的单一样品制剂同时、一致、或平行地进行所述完整或部分微生物基因组和/或转录组序列分析。也应认识到本发明所述的新型方法可以提供用于患者管理的具有抗微生物或抗聚合酶活性的药物的诊断性测量和检测。

在贯穿本申请中所引用的所有参考文献、专利和公布的专利申请的内容均以引用方式并入本文，其引用的程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请具体而独立地以引用方式并入。

前面的详细描述是仅出于理解清楚的目的给出的，并且由于修改对本领域技术人员是显而易见的，因此不应从其中推断出不必要的限定。未承认本文所提供的任何信息为现有技术或与目前所要求保护的发明相关，或任何具体或隐含引用的出版物为现有技术。

除非另有规定，本文所使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义相同。

虽然对本发明进行了详细描述，但是以具体举例说明本发明实施方案的方式并出于清楚理解的目的来提供本文的具体实例。根据本文所述的本发明的教导，在不背离本发明的精神或范围的前提下，对由此所描述的这些实施方案进行许多变化和修改对于本领域普通技术人员是显而易见的。

虽然结合其具体实施方案对本发明进行了描述，但应理解能够进一步修改，并且该申请期待通常根据发明的原理涵盖本发明的任何变化、使用或修改，并且当在本发明涉及的领域内的已知或习惯实施的范围内，以及当可应用于上文所述的和在如下所附权利要求的范围内的必要特征时，包括该与本发明的偏离。

Claims (17)

1.一种用于检测作为样品中微生物存在的指示剂的聚合酶活性的方法，所述方法包括：

（a）将样品与核酸分子接触，所述核酸分子用作样品中聚合酶活性的底物；

（b）在适合于聚合酶活性的条件下孵育这样接触的样品；和

（c）特异性测定由微生物聚合酶作用于底物核酸分子而产生的核酸分子的存在（和/或量），从而指示微生物的存在。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶为DNA聚合酶或RNA聚合酶。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所检测的微生物为样品中的存活微生物。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所检测的微生物为样品中的完整微生物。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所检测的完整微生物为其中核酸聚合酶基因及其翻译的活性蛋白聚合酶是微生物存活所必需的微生物。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶底物为固定化的。

7.根据权利要求1所述的方法，其中在其中检测微生物的样品为正常无菌体液。

8.根据权利要求1所述的方法，其中使用有差别的细胞裂解样品制备方法来制备所述样品，从而仅使得自存活微生物的聚合酶活性来修饰聚合酶特异性底物。

9.根据权利要求1所述的方法，其中在其中检测微生物的样品由粗细胞裂解物或纯化的细胞部分制备。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述方法还包括进行完整的或部分的微生物基因组和/或转录组序列分析。

11.根据权利要求10所述的方法，其中可以使用单一样品制剂同时、一致或平行地进行所述完整或部分微生物基因组和/或转录组序列分析。

12.根据权利要求10所述的方法，其中微生物的完整或部分微生物基因组和/或转录组序列分析还包括用于诊断性测量和检测用于患者管理的具有抗微生物和/或抗聚合酶活性的药物的方法。

13.一种检测试剂盒，其由用于权利要求1至12中任一项所述的方法中的试剂组成，该试剂盒用于筛选正常无菌体液中微生物的存在或缺乏，并提供诊断性、预后性患者管理信息。

14.一种检测作为样品中微生物存在的指示剂的酶的方法，所述酶选自NAD-依赖性连接酶或磷酸酶或其混合物，所述方法包括：

（a）将样品与核酸分子接触，同时不允许来自DNA聚合酶的干扰信号，所述核酸分子用作样品中所选择的酶或混合物的酶活性的底物；

（b）在适合于酶活性的条件下孵育这样接触的样品；和

（c）特异性测定由所选择的酶或混合物作用于底物核酸分子而产生的酶修饰的核酸分子的存在（和/或量），从而指示微生物的存在。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述微生物为表达（或已表达）所选择的酶或混合物的微生物。

16.根据权利要求14或权利要求15所述的方法，其中使用有差别的细胞裂解样品制备方法来制备所述样品，从而仅使得自存活微生物的连接酶和/或磷酸酶活性修饰连接酶特异性底物。

17.一种检测试剂盒，其能够进行用于检测作为样品中微生物存在的指示剂的酶的检测，所述酶选自NAD-依赖性连接酶或磷酸酶或其混合物，所述试剂盒包括：

（a）含有针对样品中所选择的酶或混合物活性的核酸分子的底物，同时不允许来自DNA聚合酶的干扰信号；

（b）用于在适合于酶活性的条件下孵育样品和底物的孵育装置；和

（c）用于特异性测定作为微生物存在指示的、由所选择的酶或混合物作用于底物核酸分子而产生的核酸分子的存在（和/或量）的装置。

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