JP6388540B2 - 改良したｄｎａポリメラーゼ活性アッセイおよび生菌の検出を可能にする方法 - Google Patents
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Description
（関連出願の相互参照）
本願は２０１２年１月５日に出願した米国仮特許出願番号第６１／５８３，５６８号の優先権を主張するものであり、参照により組み込むものである。
本願は２０１２年１月５日に出願した米国仮特許出願番号第６１／５８３，５６８号の優先権を主張するものであり、参照により組み込むものである。
（背景技術）
本項目および本願を通して使用される文献番号は「文献」の項目に挙げる文献を参照するものである。
本項目および本願を通して使用される文献番号は「文献」の項目に挙げる文献を参照するものである。
ＤＮＡポリメラーゼ活性は、あらゆる生物学的な領域に亘りゲノム複製および生物の繁殖のために不可欠なものである（１〜３）。その初期の特性評価（４）以来、ＤＮＡポリメラーゼ活性をインビトロで利用する能力は分子生物学研究の分野において基本的なツールとなっている（５）。研究において確立されたその重要性に加え、ＤＮＡポリメラーゼ活性のインビトロでの測定は医薬および臨床の場において数多くの有益な用途を提供し得る。例えば、細菌ＤＮＡポリメラーゼは新規な抗菌薬の開発のために積極的に標的とされているため（６，７）、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定できる迅速かつ高感度のアッセイが望まれている。更に、ＤＮＡポリメラーゼ活性の消失または獲得はヒトの疾患に密接に関与する。例えば、ＤＮＡポリメラーゼ活性と遺伝子異常の関連性が明らかになりつつあり、その酵素は抗癌療法の標的と呼ばれる（８，９）。ＤＮＡポリメラーゼ活性の不足は、ミトコンドリア異常（１０）にも関係している。更に、ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定は、無菌状態が期待される所定の環境マトリクスまたは生体マトリクス内部において、活性ＤＮＡポリメラーゼを有する事実上いかなる生物も検出することができるものとして、迅速かつ高感度な診断ツールとして使用される可能性を有するものである。
ＤＮＡポリメラーゼ活性をインビトロで測定するために使用される最も一般的な方法は放射性標識ヌクレオチドの取り込みに依存するものである（１１）。しかしながら、係るＤＮＡポリメラーゼアッセイの日常的な使用は放射性同位体に関連する固有のリスクおよび制約により望ましくない。結果として、過去数十年に亘って、数多くの非放射性インビトロポリメラーゼアッセイが開発されてきている。あるものは、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡポリメラーゼ仲介放出により（１２）、あるいは二本鎖ＤＮＡへのＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）の結合により（１３，１４）生成される蛍光の測定に依存する。他の方法は、蛍光標識ヌクレオチドのマイクロプレートカップリングおよび検出に依存する（１５）。最近、分子ビーコンに基づき（１６）かつ電気化学に基づく（１７）ＤＮＡポリメラーゼアッセイが開発されてきている。上記のアッセイは、放射能の使用をうまく避けることができるが、感度の低さや、測定の線形ダイナミックレンジの狭さや、精製ポリメラーゼの使用といった要因によって制約される。
当業者に自明なように、本願に記載の本発明によるＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の測定は、候補ポリメラーゼ阻害剤をインビトロでスクリーニングする用途や、様々なタイプの試料内部の任意の微生物（活性ＤＮＡポリメラーゼを有する）の存在を検出する用途といった広範囲に及ぶ用途に有益なツールである（但しこれらに限定されない）。このことは最先端の技術に対する実質的な改善であって、なぜなら、これらの目的を意図するのであれば、放射性標識ヌクレオチドを取り込む従来のポリメラーゼアッセイの日常的な使用は魅力的ではないからである。結果として、最近数十年に亘って数多くの非放射性ＤＮＡポリメラーゼ伸長アッセイが開発されてきている。現在の蛍光ベースのＤＮＡポリメラーゼアッセイは、放射能の使用をうまく避けることができるが、様々な欠陥も抱えている。例えば、いくつかの既存の非放射性アッセイによるＤＮＡポリメラーゼ活性の検出は、新しく生成された二本鎖ＤＮＡにＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）を結合させことに依存する（１３，１４）。新たに溶解した生物からＤＮＡポリメラーゼ活性を分析することを意図するのであれば、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ベースのアッセイはゲノムＤＮＡとＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）の結合によるバックグラウンド蛍光によっておそらく阻害されるだろう。マイクロプレートベースのＤＮＡポリメラーゼアッセイも開発されてきている（１５）。数多くの理由によってマイクロプレートベースのアッセイの感度の低下が予想され、その理由には、産物または基質とマイクロプレートの中間結合への依存、および／またはＤＮＡポリメラーゼによる修飾ｄＮＴＰの非効率的な取り込みが含まれる。最近、分子ビーコンによるリアルタイムのＤＮＡポリメラーゼ活性の測定が報告されている（１６）。感度の向上にもかかわらず、分子ビーコン蛍光の直接測定もまた、粗細胞溶解物（ライセート）への曝露により阻害され得る。
本発明は、上記の技術を改良するものであり、精製酵素から、または粗微生物溶解物を含む微生物溶解物から直接に、ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を測定することができる迅速で高感度な定量的アッセイを提供するものである。本願に記載の本発明は、所定の試料マトリクス内に活性ＤＮＡポリメラーゼを含有する潜在的に任意の微生物を高感度に検出するために著しくかつ予想外の進歩を提供する。本発明は、酵素テンプレートの生成および増幅（ＥＴＧＡ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））のための方法が含まれる。従って、定量ＰＣＲの読み出しと組み合わせたＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の測定に基づく新規なＥＴＧＡ法の最初の特性評価を本明細書に記載する。本明細書において、本発明によって提供されるこのタイプの診断アッセイはＤＰＥ−ＰＣＲと呼ばれる。本発明のＤＰＥ−ＰＣＲアッセイは低レベルの精製酵素を測定するのに使用することができ、微生物細胞溶解物から直接に内在性ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を検出することができる。
過去５０年間、ＤＮＡポリメラーゼ活性のインビトロでの測定は不可欠な分子生物学ツールとなっている。ＤＮＡポリメラーゼ活性をインビトロで測定するのに使用される従来の方法は、放射性ヌクレオチドを使用するため望ましくない。蛍光ベースのＤＮＡポリメラーゼアッセイが開発されているが、これも様々な制約を抱える。精製酵素からまたは微生物溶解物から直接に、ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を測定することができる、迅速で高感度の定量的アッセイが本明細書に開示される。このアッセイは、精製ＤＮＡポリメラーゼを用いて検査すると、優れた線形性（Ｒ２＝０．９９２）を示しながら、わずか２×１０−１１Ｕの酵素（≒５０分子）を検出することが分かった。この検査はまた、ビーズミル溶菌と組み合わせると、Ｒ２＝０．９９９を維持しながら、少なくとも１０コロニー形成単位までの投入量のグラム陽性菌またはグラム陰性菌の内在性ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を検出することもできた。更に、本明細書に記載された実験のエビデンスは、アッセイシグナルと細菌コロニー形成の再現可能な強い一致により示されるように、ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性が細菌生存率の指標であることを示唆する。合わせて、本明細書において記載された本発明の新規な方法は、所定の試料マトリクス内に活性ＤＮＡポリメラーゼを含有する潜在的に任意の微生物を高感度に検出するための著しい進歩を呈する。
本発明の上記のコンセプトおよび利点を更に説明するために、以下の実施例を本発明の説明として記載するが、これらは限定的なものとして解釈されるべきではない。
実施例
材料および方法：
ＤＮＡ基質の調製
ＤＮＡ基質（および以下に示される定量ＰＣＲプライマー）の配列は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりバクテリア由来のＡＴＰを測定するために先に使用したＤＮＡオリゴから作り変えた（１８）。手短に言うと、オリゴ１およびオリゴ２（図１を参照）をあらかじめアニールし、０．０１μΜの作用濃度に希釈した。
材料および方法：
ＤＮＡ基質の調製
ＤＮＡ基質（および以下に示される定量ＰＣＲプライマー）の配列は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりバクテリア由来のＡＴＰを測定するために先に使用したＤＮＡオリゴから作り変えた（１８）。手短に言うと、オリゴ１およびオリゴ２（図１を参照）をあらかじめアニールし、０．０１μΜの作用濃度に希釈した。
市販のポリメラーゼを用いたＤＮＡポリメラーゼ活性反応
ＤＮＡポリメラーゼＩ （ＮＥＢ ｃａｔ＃Ｍ０２０９Ｌ），クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）（ＮＥＢ ｃａｔ＃Ｍ０２１０Ｓ）およびクレノウｅｘｏ（−） （ＮＥＢ ｃａｔ＃Ｍ０２１２Ｓ）を、トリス（Ｔｒｉｓ）ＥＤＴＡ （Ｔ．Ｅ．）ｐＨ８．０中で指示されたＵ／μＬのストックにまで希釈した。初めに、各濃度のＤＮＡポリメラーゼストック２μＬを、次の成分を包含する５０μＬのポリメラーゼアッセイ混合物中に入れた： ５０μΜのｄＮＴＰ，２０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）ｐＨ８．０， １０ｍＭの硫酸アンモニウム，１０ｍＭの塩化カリウム，２ｍＭの硫酸マグネシウム，１％ＢＳＡ，０．１％トリトン，０．１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ），および０．００１μΜのあらかじめアニールしたＤＮＡ基質。反応溶液を短時間ボルテックスし、３７°Ｃに２０分間置いた。２０分後、各反応溶液の３μＬを直ちに定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）反応にかけた。
ＤＮＡポリメラーゼＩ （ＮＥＢ ｃａｔ＃Ｍ０２０９Ｌ），クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）（ＮＥＢ ｃａｔ＃Ｍ０２１０Ｓ）およびクレノウｅｘｏ（−） （ＮＥＢ ｃａｔ＃Ｍ０２１２Ｓ）を、トリス（Ｔｒｉｓ）ＥＤＴＡ （Ｔ．Ｅ．）ｐＨ８．０中で指示されたＵ／μＬのストックにまで希釈した。初めに、各濃度のＤＮＡポリメラーゼストック２μＬを、次の成分を包含する５０μＬのポリメラーゼアッセイ混合物中に入れた： ５０μΜのｄＮＴＰ，２０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）ｐＨ８．０， １０ｍＭの硫酸アンモニウム，１０ｍＭの塩化カリウム，２ｍＭの硫酸マグネシウム，１％ＢＳＡ，０．１％トリトン，０．１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ），および０．００１μΜのあらかじめアニールしたＤＮＡ基質。反応溶液を短時間ボルテックスし、３７°Ｃに２０分間置いた。２０分後、各反応溶液の３μＬを直ちに定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）反応にかけた。
定量ＰＣＲによる検出
定量ＰＣＲ反応のマスターミックスは次の成分を使用して調製した：
ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）４８０マスターミックス（Ｒｏｃｈｅ ｃａｔ＃０４７０７４９４００１）， ３３３ｎＭの各プライマー，１６６ｎＭの標的プローブ（ＦＡＭ），１６６ｎＭのインターナルコントロールプローブ（ＴｘＲｅｄ），および１．２ＵのＵＤＧ（Ｂｉｏｌｉｎｅ ｃａｔ＃ＢＩＯ−２０７４４）。ＰＣＲの阻害を監視するツールとして、各定量ＰＣＲ反応には競合するインターナルコントロールＤＮＡも４０コピー含めた。各定量ＰＣＲ反応のために、３μＬのＤＮＡポリメラーゼ反応溶液を２７μＬのマスターミックスに加え、次のように２ステップの定量ＰＣＲをスマートサイクラー（ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ）（Ｃｅｐｈｅｉｄ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）で実行した。最初のインキュベーションは４０°Ｃで１０分間、５０°Ｃで１０分間および９５°Ｃで５分間（Ｔａｑを活性化するため）、そして次に，９５°Ｃで５秒の変性および６５°Ｃで２０秒のアニーリング／伸長を４５サイクル。サイクル閾値（Ｃｔ）は出現した定量ＰＣＲ曲線の第２のセカンドデリバティブ分析を用いたスマートサイクラーのソフトウェアによって自動的に生成された。
定量ＰＣＲ反応のマスターミックスは次の成分を使用して調製した：
ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）４８０マスターミックス（Ｒｏｃｈｅ ｃａｔ＃０４７０７４９４００１）， ３３３ｎＭの各プライマー，１６６ｎＭの標的プローブ（ＦＡＭ），１６６ｎＭのインターナルコントロールプローブ（ＴｘＲｅｄ），および１．２ＵのＵＤＧ（Ｂｉｏｌｉｎｅ ｃａｔ＃ＢＩＯ−２０７４４）。ＰＣＲの阻害を監視するツールとして、各定量ＰＣＲ反応には競合するインターナルコントロールＤＮＡも４０コピー含めた。各定量ＰＣＲ反応のために、３μＬのＤＮＡポリメラーゼ反応溶液を２７μＬのマスターミックスに加え、次のように２ステップの定量ＰＣＲをスマートサイクラー（ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ）（Ｃｅｐｈｅｉｄ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）で実行した。最初のインキュベーションは４０°Ｃで１０分間、５０°Ｃで１０分間および９５°Ｃで５分間（Ｔａｑを活性化するため）、そして次に，９５°Ｃで５秒の変性および６５°Ｃで２０秒のアニーリング／伸長を４５サイクル。サイクル閾値（Ｃｔ）は出現した定量ＰＣＲ曲線の第２のセカンドデリバティブ分析を用いたスマートサイクラーのソフトウェアによって自動的に生成された。
細菌の菌株および培地
黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ ２５９２３）および大腸菌（ＡＴＣＣ ２５９２２）をこの研究に使用した。培養菌はブレインハートインフュージョン液体培地／寒天培地（Ｔｅｋｎｏｖａ．）で培養した。検査した追加の微生物１７種のＡＴＣＣ参照番号および生育培地を図５に挙げる。
黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ ２５９２３）および大腸菌（ＡＴＣＣ ２５９２２）をこの研究に使用した。培養菌はブレインハートインフュージョン液体培地／寒天培地（Ｔｅｋｎｏｖａ．）で培養した。検査した追加の微生物１７種のＡＴＣＣ参照番号および生育培地を図５に挙げる。
ビーズミル溶菌後の細菌ＤＮＡポリメラーゼ活性の検出
黄色ブドウ球菌および大腸菌の培養物をＯＤ６００が１．０±０．２（約１×１０９ｃｆｕ／ｍＬ）になるまで培養した。各微生物について、１ｍＬの培養物をペレット状にし、Ｔ．Ｅ．中で３回洗浄した。細菌懸濁液をＴ．Ｅ．で連続希釈し、５μＬの各ストックを、５０μＬの溶菌−反応緩衝液を含有するビーズ溶菌−反応に加えた。１×１０５〜１×１００ｃｆｕ／反応の滴定曲線を、各微生物について三重に行い、これには細菌懸濁液を含有しない三重の反応（無投入コントロール）を含めた。５μＬの細菌ストック（または無投入コントロール）を追加した後、溶菌／反応チューブを２８００ｒｐｍで６分間ビーズミル粉砕した。次に、３７°Ｃで２０分間インキュベートした。２０分間インキュベートした後、試料を５分間で９５°Ｃまで加熱してから、取り出して室温まで冷却した。その後、試料を１２ｋ×ｇで３０秒間回転させ、３μＬの各反応溶液を定量ＰＣＲにかけた。５マイクロリットルの各細菌ストックを平板培養し、より正確なｃｆｕ投入レベルを得た。更に、ＤＮＡポリメラーゼ検出に用いた同一の溶解物に対して微生物特異的なＰＣＲも行った。黄色ブドウ球菌および大腸菌遺伝子特異的なＰＣＲのプライマーおよびプローブ配列を図２に示す。
黄色ブドウ球菌および大腸菌の培養物をＯＤ６００が１．０±０．２（約１×１０９ｃｆｕ／ｍＬ）になるまで培養した。各微生物について、１ｍＬの培養物をペレット状にし、Ｔ．Ｅ．中で３回洗浄した。細菌懸濁液をＴ．Ｅ．で連続希釈し、５μＬの各ストックを、５０μＬの溶菌−反応緩衝液を含有するビーズ溶菌−反応に加えた。１×１０５〜１×１００ｃｆｕ／反応の滴定曲線を、各微生物について三重に行い、これには細菌懸濁液を含有しない三重の反応（無投入コントロール）を含めた。５μＬの細菌ストック（または無投入コントロール）を追加した後、溶菌／反応チューブを２８００ｒｐｍで６分間ビーズミル粉砕した。次に、３７°Ｃで２０分間インキュベートした。２０分間インキュベートした後、試料を５分間で９５°Ｃまで加熱してから、取り出して室温まで冷却した。その後、試料を１２ｋ×ｇで３０秒間回転させ、３μＬの各反応溶液を定量ＰＣＲにかけた。５マイクロリットルの各細菌ストックを平板培養し、より正確なｃｆｕ投入レベルを得た。更に、ＤＮＡポリメラーゼ検出に用いた同一の溶解物に対して微生物特異的なＰＣＲも行った。黄色ブドウ球菌および大腸菌遺伝子特異的なＰＣＲのプライマーおよびプローブ配列を図２に示す。
ジデオキシ停止実験
ｄｄＣＴＰによる精製ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の停止：
ＤＮＡポリメラーゼアッセイ反応溶液を５０μΜのｄＣＴＰまたは５０μΜのｄｄＣＴＰ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＃７７３３２．）を含有するｄＮＴＰ混合物を用いて上記の通り調製した。いずれかのｄＮＴＰ混合物を含有する反応溶液に、２×１０−９ＵのＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＃Ｍ０２０９）を加えた。反応溶液を３７°Ｃで２０分間インキュベートし、続いて３μＬの各反応溶液を定量ＰＣＲにかけた。
ｄｄＣＴＰによる精製ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の停止：
ＤＮＡポリメラーゼアッセイ反応溶液を５０μΜのｄＣＴＰまたは５０μΜのｄｄＣＴＰ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＃７７３３２．）を含有するｄＮＴＰ混合物を用いて上記の通り調製した。いずれかのｄＮＴＰ混合物を含有する反応溶液に、２×１０−９ＵのＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＃Ｍ０２０９）を加えた。反応溶液を３７°Ｃで２０分間インキュベートし、続いて３μＬの各反応溶液を定量ＰＣＲにかけた。
ｄｄＣＴＰによる微生物検出の消去：
黄色ブドウ球菌および大腸菌の培養物を、上記の通り培養し、洗浄し、希釈した。微生物ＤＮＡポリメラーゼのｄｄＣＴＰ依存性停止を実証するために、５μＬの細菌ストックを、５０μΜのｄＣＴＰまたは５０μΜのｄｄＣＴＰが入った５０μＬの反応緩衝液を含有するビーズ溶菌チューブに加えた。溶菌、インキュベーションおよび定量ＰＣＲを上記の通り行った。５マイクロリットルの各細菌ストックを平板培養し、より正確なｃｆｕ投入レベルを測定した。更に、ＤＮＡポリメラーゼ検出に用いた同一の溶解物に対してゲノムＤＮＡの遺伝子特異的ＰＣＲも行った。
黄色ブドウ球菌および大腸菌の培養物を、上記の通り培養し、洗浄し、希釈した。微生物ＤＮＡポリメラーゼのｄｄＣＴＰ依存性停止を実証するために、５μＬの細菌ストックを、５０μΜのｄＣＴＰまたは５０μΜのｄｄＣＴＰが入った５０μＬの反応緩衝液を含有するビーズ溶菌チューブに加えた。溶菌、インキュベーションおよび定量ＰＣＲを上記の通り行った。５マイクロリットルの各細菌ストックを平板培養し、より正確なｃｆｕ投入レベルを測定した。更に、ＤＮＡポリメラーゼ検出に用いた同一の溶解物に対してゲノムＤＮＡの遺伝子特異的ＰＣＲも行った。
微生物検出のｄＣＴＰレスキュー：
黄色ブドウ球菌および大腸菌の培養物を、上記の通り培養し、洗浄し、希釈した。５マイクロリットルの細菌ストックを、５０μΜのｄｄＣＴＰが入った５０μＬの反応緩衝液を含有するビーズ溶菌チューブに加えた。溶菌の前に、２．５ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．０２５ｍＭ、０．００２５ｍＭのｄＣＴＰを１μＬ、ｄｄＣＴＰ含有反応溶液に加えた。５０μΜのｄＣＴＰのみおよびｄｄＣＴＰのみを含有する反応を「非停止（ｎｏｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ）」および「停止（ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ）」コンパレータとして並行して実行した。溶菌、インキュベーションおよび定量ＰＣＲを上記の通り行った。５マイクロリットルの各細菌ストックを平板培養し、より正確なｃｆｕ投入レベルを測定した。更に、ＤＮＡポリメラーゼ検出に用いた同一の溶解物に対して遺伝子特異的ＰＣＲも行った。
黄色ブドウ球菌および大腸菌の培養物を、上記の通り培養し、洗浄し、希釈した。５マイクロリットルの細菌ストックを、５０μΜのｄｄＣＴＰが入った５０μＬの反応緩衝液を含有するビーズ溶菌チューブに加えた。溶菌の前に、２．５ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．０２５ｍＭ、０．００２５ｍＭのｄＣＴＰを１μＬ、ｄｄＣＴＰ含有反応溶液に加えた。５０μΜのｄＣＴＰのみおよびｄｄＣＴＰのみを含有する反応を「非停止（ｎｏｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ）」および「停止（ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ）」コンパレータとして並行して実行した。溶菌、インキュベーションおよび定量ＰＣＲを上記の通り行った。５マイクロリットルの各細菌ストックを平板培養し、より正確なｃｆｕ投入レベルを測定した。更に、ＤＮＡポリメラーゼ検出に用いた同一の溶解物に対して遺伝子特異的ＰＣＲも行った。
生存率評価実験
黄色ブドウ球菌および大腸菌の培養物を、上記の通り培養し、洗浄し、希釈した。約２０００ｃｆｕ／μＬ（Ｔ．Ｅ．中で）の細菌ストック２００マイクロリットルを、２５°Ｃ，４５°Ｃ，６５°Ｃ，８５°Ｃおよび１０５°Ｃで２０分間インキュベートした。加熱後、試料を室温まで冷却し、５μＬの各細菌ストックを５０μＬの反応緩衝液を含有するビーズ溶菌チューブに加えた。溶菌、インキュベーションおよび定量ＰＣＲを上記の通り行った。更に５マイクロリットルの各細菌ストック（様々な温度で処理されたもの）を１ｍｌのＴ．Ｅに加え、５０μＬを平板培養してコロニー数を測定した。更に、ＤＮＡポリメラーゼ検出に用いた同一の溶解物に対して遺伝子特異的なＰＣＲも行った。
黄色ブドウ球菌および大腸菌の培養物を、上記の通り培養し、洗浄し、希釈した。約２０００ｃｆｕ／μＬ（Ｔ．Ｅ．中で）の細菌ストック２００マイクロリットルを、２５°Ｃ，４５°Ｃ，６５°Ｃ，８５°Ｃおよび１０５°Ｃで２０分間インキュベートした。加熱後、試料を室温まで冷却し、５μＬの各細菌ストックを５０μＬの反応緩衝液を含有するビーズ溶菌チューブに加えた。溶菌、インキュベーションおよび定量ＰＣＲを上記の通り行った。更に５マイクロリットルの各細菌ストック（様々な温度で処理されたもの）を１ｍｌのＴ．Ｅに加え、５０μＬを平板培養してコロニー数を測定した。更に、ＤＮＡポリメラーゼ検出に用いた同一の溶解物に対して遺伝子特異的なＰＣＲも行った。
結果および考察
本発明の開発において、精製された商業的供給源または新鮮な溶解細胞に由来するＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を測定できる迅速でシンプルかつ高感度な定量的アッセイの開発を目指すものであり、これは上記の従来技術の方法の欠点を改善し、かつ克服するものである。図１は、ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性と定量ＰＣＲの組み合わせに関与する機構の概略図を示す。注目すべきは、Ｔａｑが活性化する前にウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）によってオリゴ２（図１、ステップＣを参照）が除去され、よってＰＣＲサイクリングの直前に基質の非特異的伸張を妨げていることである。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ活性をＰＣＲ増幅に結び付ける微生物検出法が以前に報告されており（１８）、これは、我々のＤＰＥ−ＰＣＲアッセイに類似するものを含んでおり、ＥＴＧＡ法の別の実施例である。しかしながら、本発明の開発中に、この方法の改変バージョンは、ＮＡＤ依存性ＤＮＡリガーゼ活性の検出を目指し、様々な制約を抱え（未発表データ）、本明細書に記載の発明の新規なＤＮＡポリメラーゼに基づくアプローチの開発に至った。
本発明の開発において、精製された商業的供給源または新鮮な溶解細胞に由来するＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を測定できる迅速でシンプルかつ高感度な定量的アッセイの開発を目指すものであり、これは上記の従来技術の方法の欠点を改善し、かつ克服するものである。図１は、ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性と定量ＰＣＲの組み合わせに関与する機構の概略図を示す。注目すべきは、Ｔａｑが活性化する前にウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）によってオリゴ２（図１、ステップＣを参照）が除去され、よってＰＣＲサイクリングの直前に基質の非特異的伸張を妨げていることである。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ活性をＰＣＲ増幅に結び付ける微生物検出法が以前に報告されており（１８）、これは、我々のＤＰＥ−ＰＣＲアッセイに類似するものを含んでおり、ＥＴＧＡ法の別の実施例である。しかしながら、本発明の開発中に、この方法の改変バージョンは、ＮＡＤ依存性ＤＮＡリガーゼ活性の検出を目指し、様々な制約を抱え（未発表データ）、本明細書に記載の発明の新規なＤＮＡポリメラーゼに基づくアプローチの開発に至った。
精製ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の高感度かつ線形の検出
市販のＤＮＡポリメラーゼＩを用いてＤＰＥ−ＰＣＲアッセイの近似分析感度を測定するために実験を行った。図２Ａに示すように、ＤＮＡポリメラーゼＩの検出は広範囲にわたる投入量の酵素で達成された。実際には、ＤＮＡポリメラーゼＩ伸長活性の測定は、わずか２×１０−１１単位（Ｕ）の酵素（約５０分子のポリメラーゼに相当する）まで達成される。我々の知る限り、このレベルでのＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の検出は既存のＤＮＡポリメラーゼアッセイにおいて他を凌駕する。大腸菌は１細胞あたり約４００個のＤＮＡポリメラーゼＩ分子を含有すると報告されているため、理論上、このレベルの感度は単一の微生物検出を可能にし得る（１１）。検出実験の２つの独立した限界のデータをグラフ化した後に、回帰分析は更に、ＤＰＥ−ＰＣＲサイクル閾値（Ｃｔ）と投入した市販ＤＮＡポリメラーゼＩの単位との間に強い正の線形相関（Ｒ２＝０．９９２）を示した（図２Ｂ）。感度および線形性の実験を行った後に、ＤＰＥ−ＰＣＲアッセイシグナルが内因性エキソヌクレアーゼ活性と無関係であるか否かを判定することが重要であった。そのため、我々はその後、２×１０−７ＵのＤＮＡポリメラーゼＩによって生成されたシグナルを、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ）および全てのエキソヌクレアーゼ活性を欠く別バージョンの酵素（クレノウｅｘｏ−）から生成されたシグナルと比較した。更なる特異性およびバックグラウンドシグナルを測定するために、２×１０−７Ｕの大腸菌ＤＮＡリガーゼと無投入コントロール（ＮＩＣ）を並行して検査した。図２Ｃに示すように、野生型ＤＮＡポリメラーゼＩと比較したところ、クレノウとクレノウｅｘｏ−の両方が同等のレベルで検出され、ＤＰＥ−ＰＣＲアッセイシグナルがＤＮＡポリメラーゼ依存性伸長に由来し、内因性エキソヌクレアーゼ活性に由来しないというエビデンスを提供した。エキソヌクレアーゼフリーのポリメラーゼの使用に加えて、ＤＰＥ−ＰＣＲアッセイシグナルが定量ＰＣＲの前のＤＮＡ基質のＤＮＡポリメラーゼ依存性伸長に由来すことを更に実証しようと試みた。ジデオキシヌクレオチドの取り込みは、ＤＮＡポリメラーゼの鎖伸長活性の停止に使用される十分に確立された方法であるため（１９、２０）、我々は反応混合物の中でｄＣＴＰをジデオキシＣＴＰ（ｄｄＣＴＰ）と置き換えることを選択した。図２Ｄに示す概略図は、ｄｄＣＴＰがＤＮＡポリメラーゼによって取り込まれ得る基質内部の第１の可能な位置を明らかにする。ｄｄＣＴＰがこの位置に取り込まれた場合、オリゴ１の伸長生成物は、定量ＰＣＲプライマー１によるその後の検出のための長さが不十分となるだろう（図１）。図２Ｄに示すように、ｄＣＴＰをｄｄＣＴＰと置き換えることで、ＤＮＡポリメラーゼＩによって生成されるシグナルを消去し、よってＤＰＥ−ＰＣＲアッセイシグナルが定量ＰＣＲの前の基質のＤＮＡポリメラーゼ伸長に依存することを実証する。低コピーのインターナル増幅コントロールの存在は、定量ＰＣＲが、ＤＮＡポリメラーゼアッセイ試薬から持ち込まれた少量のｄｄＣＴＰの存在によって阻害されなかったことを裏付ける（補足的図１Ｃ）。加えて、我々は、投入ＤＮＡポリメラーゼ非存在下（無投入コントロール）で、弱いが検出可能なシグナルを散発的に観察してきたことに留意することが重要であると考える。ＤＰＥ−ＰＣＲアッセイの絶妙な感度のお陰で、我々は、弱いバックグラウンドノイズのシグナルがいくつかの潜在的な発生源に由来し得ることを実証した。例えば、反応組み立て前に試薬中に存在するＤＮＡポリメラーゼのコンタミネーション、実験セットアップ中に作業者によって持ち込まれたＤＮＡポリメラーゼ、および／またはＴａｑが活性化する前のオリゴ２（図１）の不完全分解（未発表データ）などであるが、但しこれらに限定されない。注目すべきは、これらのバックグラウンドノイズの変則的な発生源は、より厳重な試薬調製手順および有効な無菌操作を導入することによって制御可能であるということである。
市販のＤＮＡポリメラーゼＩを用いてＤＰＥ−ＰＣＲアッセイの近似分析感度を測定するために実験を行った。図２Ａに示すように、ＤＮＡポリメラーゼＩの検出は広範囲にわたる投入量の酵素で達成された。実際には、ＤＮＡポリメラーゼＩ伸長活性の測定は、わずか２×１０−１１単位（Ｕ）の酵素（約５０分子のポリメラーゼに相当する）まで達成される。我々の知る限り、このレベルでのＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の検出は既存のＤＮＡポリメラーゼアッセイにおいて他を凌駕する。大腸菌は１細胞あたり約４００個のＤＮＡポリメラーゼＩ分子を含有すると報告されているため、理論上、このレベルの感度は単一の微生物検出を可能にし得る（１１）。検出実験の２つの独立した限界のデータをグラフ化した後に、回帰分析は更に、ＤＰＥ−ＰＣＲサイクル閾値（Ｃｔ）と投入した市販ＤＮＡポリメラーゼＩの単位との間に強い正の線形相関（Ｒ２＝０．９９２）を示した（図２Ｂ）。感度および線形性の実験を行った後に、ＤＰＥ−ＰＣＲアッセイシグナルが内因性エキソヌクレアーゼ活性と無関係であるか否かを判定することが重要であった。そのため、我々はその後、２×１０−７ＵのＤＮＡポリメラーゼＩによって生成されたシグナルを、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ）および全てのエキソヌクレアーゼ活性を欠く別バージョンの酵素（クレノウｅｘｏ−）から生成されたシグナルと比較した。更なる特異性およびバックグラウンドシグナルを測定するために、２×１０−７Ｕの大腸菌ＤＮＡリガーゼと無投入コントロール（ＮＩＣ）を並行して検査した。図２Ｃに示すように、野生型ＤＮＡポリメラーゼＩと比較したところ、クレノウとクレノウｅｘｏ−の両方が同等のレベルで検出され、ＤＰＥ−ＰＣＲアッセイシグナルがＤＮＡポリメラーゼ依存性伸長に由来し、内因性エキソヌクレアーゼ活性に由来しないというエビデンスを提供した。エキソヌクレアーゼフリーのポリメラーゼの使用に加えて、ＤＰＥ−ＰＣＲアッセイシグナルが定量ＰＣＲの前のＤＮＡ基質のＤＮＡポリメラーゼ依存性伸長に由来すことを更に実証しようと試みた。ジデオキシヌクレオチドの取り込みは、ＤＮＡポリメラーゼの鎖伸長活性の停止に使用される十分に確立された方法であるため（１９、２０）、我々は反応混合物の中でｄＣＴＰをジデオキシＣＴＰ（ｄｄＣＴＰ）と置き換えることを選択した。図２Ｄに示す概略図は、ｄｄＣＴＰがＤＮＡポリメラーゼによって取り込まれ得る基質内部の第１の可能な位置を明らかにする。ｄｄＣＴＰがこの位置に取り込まれた場合、オリゴ１の伸長生成物は、定量ＰＣＲプライマー１によるその後の検出のための長さが不十分となるだろう（図１）。図２Ｄに示すように、ｄＣＴＰをｄｄＣＴＰと置き換えることで、ＤＮＡポリメラーゼＩによって生成されるシグナルを消去し、よってＤＰＥ−ＰＣＲアッセイシグナルが定量ＰＣＲの前の基質のＤＮＡポリメラーゼ伸長に依存することを実証する。低コピーのインターナル増幅コントロールの存在は、定量ＰＣＲが、ＤＮＡポリメラーゼアッセイ試薬から持ち込まれた少量のｄｄＣＴＰの存在によって阻害されなかったことを裏付ける（補足的図１Ｃ）。加えて、我々は、投入ＤＮＡポリメラーゼ非存在下（無投入コントロール）で、弱いが検出可能なシグナルを散発的に観察してきたことに留意することが重要であると考える。ＤＰＥ−ＰＣＲアッセイの絶妙な感度のお陰で、我々は、弱いバックグラウンドノイズのシグナルがいくつかの潜在的な発生源に由来し得ることを実証した。例えば、反応組み立て前に試薬中に存在するＤＮＡポリメラーゼのコンタミネーション、実験セットアップ中に作業者によって持ち込まれたＤＮＡポリメラーゼ、および／またはＴａｑが活性化する前のオリゴ２（図１）の不完全分解（未発表データ）などであるが、但しこれらに限定されない。注目すべきは、これらのバックグラウンドノイズの変則的な発生源は、より厳重な試薬調製手順および有効な無菌操作を導入することによって制御可能であるということである。
細胞溶解物から直接に内在性ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を測定することによる微生物の高感度な汎用検出
精製ポリメラーゼ活性を検出することに加え、微生物由来のＤＮＡポリメラーゼ活性を測定するシンプルで汎用性のある方法が極めて望ましい。その場合、係る方法は、活発に増殖している培養物中の候補抗菌薬のスクリーニングを可能にし、よってＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を微生物増殖と比較することを可能にする。加えて、ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の測定は活性ＤＮＡポリメラーゼを有するあらゆる微生物の存在に関して環境試料または生体試料をスクリーニングするために使用され得る。このために、本発明によって提供されるＤＰＥ−ＰＣＲアッセイに微生物溶解を組み合わせたシンプルな方法を我々は開発した。図３に示すように、微生物を含有すると分かっているか、もしくは微生物を含有すると思われる液体試料をビーズミル溶菌チューブに加え、破壊し、そして直ちにＤＰＥ−ＰＣＲアッセイに移行する。我々は、グラム陰性菌１種（大腸菌）およびグラム陽性菌１種（黄色ブドウ球菌）を選択し、我々のアッセイが粗細胞溶解物中で微生物由来ＤＮＡポリメラーゼの伸長活性を測定する能力を実証した。図４Ａに示すように、ビーズミル溶菌と結び付けると、ＤＰＥ−ＰＣＲアッセイは１溶菌チューブあたり１０コロニー形成単位（ｃｆｕ）以下の広いダイナミックレンジの投入大腸菌を検出することができる。更に、大腸菌検出の線形回帰分析を１０ｃｆｕの投入細菌まで行い、投入ｃｆｕとＤＮＡポリメラーゼ伸長活性シグナルとの間に０．９９９のＲ２値で示される強い正の線形相関を示した（図４Ｂ）。コロニー計数プレーティングおよび大腸菌遺伝子特異的定量ＰＣＲ（ｇｓＰＣＲ）を並行して実行し、１反応あたりのｃｆｕ投入レベルと、全く同一の溶解物の無傷のゲノムＤＮＡをモニターする能力の両方を確認した。黄色ブドウ球菌溶解物のＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を同様の投入レベルで検出した（図４Ｃ）。黄色ブドウ球菌の検出を１０ｃｆｕの投入細菌までプロットし、更に、投入ｃｆｕとＤＮＡポリメラーゼ伸長活性シグナルとの間の強い線形相関を示した（Ｒ２＝０．９９９，図４Ｄ）。コロニー計数プレーティングおよびｇｓＰＣＲを並行して行い、各ビーズ溶菌チューブ中に存在する黄色ブドウ球菌の量と、直接に解析可能なゲノムＤＮＡの存在とを確認した。大腸菌および黄色ブドウ球菌のプレーティング、ｇｓＰＣＲ、ＤＮＡポリメラーゼ活性の結果の全部の表を図３および４に見ることができる。我々はその後、ＤＰＥ−ＰＣＲアッセイが追加の臨床的に意義のある微生物１７種のＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する能力を検査した。表１に示すように、我々はグラム陰性菌６種、グラム陽性菌６種およびカンジダ種５種を含む１７種の追加の微生物全てのＤＮＡポリメラーゼ活性を検出することができた。１７種の追加の微生物の検出は投入ｃｆｕに対する強い正の線形相関を示し、低い検出下限が印象的であった。今日まで失敗することなく、合計３１種の異なる微生物種を同様に検査し検出している（データ非掲載）。上方線形ダイナミックレンジはまだ十分に特性評価されていない。１７種の追加の微生物のそれぞれの並行プレーティングデータおよびＤＰＥ−ＰＣＲ結果を含む更なる結果を図８に示す。合わせて、これらのデータは、本発明の教示によるＤＰＥ−ＰＣＲの性能が通常の無菌環境におけるあらゆる微生物の高感度な検出のために万能な「汎（ｐａｎ）」試験として有用である可能性を有するという見解を支持する。
精製ポリメラーゼ活性を検出することに加え、微生物由来のＤＮＡポリメラーゼ活性を測定するシンプルで汎用性のある方法が極めて望ましい。その場合、係る方法は、活発に増殖している培養物中の候補抗菌薬のスクリーニングを可能にし、よってＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を微生物増殖と比較することを可能にする。加えて、ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の測定は活性ＤＮＡポリメラーゼを有するあらゆる微生物の存在に関して環境試料または生体試料をスクリーニングするために使用され得る。このために、本発明によって提供されるＤＰＥ−ＰＣＲアッセイに微生物溶解を組み合わせたシンプルな方法を我々は開発した。図３に示すように、微生物を含有すると分かっているか、もしくは微生物を含有すると思われる液体試料をビーズミル溶菌チューブに加え、破壊し、そして直ちにＤＰＥ−ＰＣＲアッセイに移行する。我々は、グラム陰性菌１種（大腸菌）およびグラム陽性菌１種（黄色ブドウ球菌）を選択し、我々のアッセイが粗細胞溶解物中で微生物由来ＤＮＡポリメラーゼの伸長活性を測定する能力を実証した。図４Ａに示すように、ビーズミル溶菌と結び付けると、ＤＰＥ−ＰＣＲアッセイは１溶菌チューブあたり１０コロニー形成単位（ｃｆｕ）以下の広いダイナミックレンジの投入大腸菌を検出することができる。更に、大腸菌検出の線形回帰分析を１０ｃｆｕの投入細菌まで行い、投入ｃｆｕとＤＮＡポリメラーゼ伸長活性シグナルとの間に０．９９９のＲ２値で示される強い正の線形相関を示した（図４Ｂ）。コロニー計数プレーティングおよび大腸菌遺伝子特異的定量ＰＣＲ（ｇｓＰＣＲ）を並行して実行し、１反応あたりのｃｆｕ投入レベルと、全く同一の溶解物の無傷のゲノムＤＮＡをモニターする能力の両方を確認した。黄色ブドウ球菌溶解物のＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を同様の投入レベルで検出した（図４Ｃ）。黄色ブドウ球菌の検出を１０ｃｆｕの投入細菌までプロットし、更に、投入ｃｆｕとＤＮＡポリメラーゼ伸長活性シグナルとの間の強い線形相関を示した（Ｒ２＝０．９９９，図４Ｄ）。コロニー計数プレーティングおよびｇｓＰＣＲを並行して行い、各ビーズ溶菌チューブ中に存在する黄色ブドウ球菌の量と、直接に解析可能なゲノムＤＮＡの存在とを確認した。大腸菌および黄色ブドウ球菌のプレーティング、ｇｓＰＣＲ、ＤＮＡポリメラーゼ活性の結果の全部の表を図３および４に見ることができる。我々はその後、ＤＰＥ−ＰＣＲアッセイが追加の臨床的に意義のある微生物１７種のＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する能力を検査した。表１に示すように、我々はグラム陰性菌６種、グラム陽性菌６種およびカンジダ種５種を含む１７種の追加の微生物全てのＤＮＡポリメラーゼ活性を検出することができた。１７種の追加の微生物の検出は投入ｃｆｕに対する強い正の線形相関を示し、低い検出下限が印象的であった。今日まで失敗することなく、合計３１種の異なる微生物種を同様に検査し検出している（データ非掲載）。上方線形ダイナミックレンジはまだ十分に特性評価されていない。１７種の追加の微生物のそれぞれの並行プレーティングデータおよびＤＰＥ−ＰＣＲ結果を含む更なる結果を図８に示す。合わせて、これらのデータは、本発明の教示によるＤＰＥ−ＰＣＲの性能が通常の無菌環境におけるあらゆる微生物の高感度な検出のために万能な「汎（ｐａｎ）」試験として有用である可能性を有するという見解を支持する。
図２Ｄに示すように、反応混合物中のｄＣＴＰをｄｄＣＴＰと置き換えることは、我々のアッセイ内部でＤＮＡポリメラーゼ依存性伸長活性の検出を遮断するための強力なツールとなる。細菌添加に由来するシグナルがそれらのＤＮＡポリメラーゼ伸長活性に依存し、溶解物中に存在する他の内在性細菌酵素活性に依存するものではなかったことを実証するために、我々は、（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ）を含有する標準的なＤＮＡポリメラーゼ反応混合物を（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄｄＣＴＰ）を含有する反応混合物と対比して用いて、大腸菌および黄色ブドウ球菌から得られたＤＰＥ−ＰＣＲシグナルを比較する実験を試みた。図５Ａに示すように、標準的な反応混合物と比較すると、ｄｄＣＴＰの置き換えは大腸菌ｃｆｕ添加由来のシグナルの生成を遮断した（図５Ａ）。その後、１００％ｄｄＣＴＰ（５０μΜ）を含有する反応混合物中で溶解された細菌のＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を、ｄＣＴＰ量を増加させながら添加した５０μΜ ｄｄＣＴＰを含有する反応混合物と比較することにより、ｄＣＴＰレスキュー実験を行った（レスキュー実験の詳細な説明のための材料および方法を参照）。図５Ｂは、ｄＣＴＰ量の増加が大腸菌溶解物由来の定量化可能なＤＮＡポリメラーゼ伸長活性に対するレスキュー効果を有することを実証する。微生物ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の測定に加えて、ｇｓＰＣＲを並行して実行し、等量の大腸菌が、アッセイされた溶解物のそれぞれに存在することを検証した。ＤＮＡポリメラーゼ活性とゲノムＤＮＡの存在のグラフによる比較を図５Ｃに示す。その後、黄色ブドウ球菌を用いてシグナル停止（ｄｄＣＴＰによる）およびｄＣＴＰレスキュー実験を繰り返し、同様の結果を得た（図５Ｄ〜Ｆ）。大腸菌および黄色ブドウ球菌の両方に関するＤＰＥ−ＰＣＲおよびｇｓＰＣＲのデータを含む表を図６および７に示す。定量ＰＣＲのインターナルコントロールの値を提供し、定量ＰＣＲに持ち込まれた低レベルのｄｄＣＴＰは阻害性ではなく、よってＤＮＡポリメラーゼ活性シグナルの消失の原因ではないことを実証する（図６Ａおよび７Ａ）。合わせて、図５に示すデータは、ＤＰＥ−ＰＣＲアッセイが微生物ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を特異的に検出し、シグナルがＤＮＡポリメラーゼ以外の酵素活性による基質修飾に由来しないという主張を強く支持するものである。
細菌生存率の指標としてのＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の測定
細菌生存率を測定する従来の方法は、固体培地上の特定微生物の増殖および可視化に依存するものである（２１）。細菌の増殖および可視化は現在の業界のゴールドスタンダードであるが、従来のｃｆｕ生存率測定法は、ｃｆｕ形成に要する時間のせいで望ましいものではない。更に、固体培地上または液体培養物中で増殖する能力は微生物によって劇的に異なり得、よって特定の選好性生物の検出を制限し得る（２２）。従来の方法の上記制限・制約によって、幅広い医薬分野（２３）、環境分野、食品加工分野および臨床検査分野において微生物生存率の迅速な評価に対する必要性が高まっている。結果として、所定のマトリクス内の微生物生存状態を迅速に評価するために数多くの分子的手法が開発されている（２４）。迅速かつ高感度であるにも関わらず、核酸の存在を検出する分子的手法は細胞生存率の正確な測定を示すには不十分なことが多い。例えば、内在性ＤＮＡまたはＲＮＡの増幅は細菌生存率の指標としては劣っており、これは細胞が死んだ後の核酸の残存によるものである（２５，２６）。我々は、細菌生存率の指標としてＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を用いることの実行可能性を判定しようと試みた。このため、様々な量の熱処理後の細菌生存率の指標として、ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の検出と、ゲノムＤＮＡのＰＣＲ仲介検出とを比較するように実験をデザインした。まず、温度を上昇させて大腸菌懸濁液を一定時間処理した。熱処理の後、次に細菌をＤＮＡポリメラーゼ伸長活性およびゲノムＤＮＡの両方の存在に関してアッセイした。更に、熱処理した細菌ストックおよび熱処理しなかった細菌ストックを並行して平板培養し、目に見えるｃｆｕの存在により細菌生存率をモニターした。図６Ａは、指示された量の熱処理の後に測定した大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性のレベルを示す。注目すべきは、４５°Ｃ〜６５°Ｃで細菌懸濁液をインキュベートした後に大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の著しい低下が観察されたことである（図６Ａ）。対照的に、同一の溶解物から得られたｇｓＰＣＲシグナルは、全ての温度で比較的一定を維持しており、図６ＢでグラフによりＤＮＡポリメラーゼ活性と比較している。グラフの下に示したプレーティングの結果は、熱処理レベルの上昇がｃｆｕ形成を妨げるのに十分であり、ＤＮＡポリメラーゼ活性の劇的な消失に近似することを更に実証する；しかしながら、死細胞がなお最初の投入レベルに非常に近いゲノムＤＮＡレベルをもたらし、ｇｓＰＣＲが生存細胞の存在の指標として劣っていることを裏付けている（図６Ｂ）。図６Ｃにおいて、棒グラフは、致死量の熱処理に反応したｃｆｕの消失をモニターするＤＰＥ−ＰＣＲおよびｇｓＰＣＲの相対的能力を更に強調するものである。その後、我々はＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の測定がグラム陽性菌の生存状態を同様に示すのに使用できるか否かを検査したいと考えた。同一条件下で黄色ブドウ球菌を用いて以前の大腸菌実験を繰り返した。
細菌生存率を測定する従来の方法は、固体培地上の特定微生物の増殖および可視化に依存するものである（２１）。細菌の増殖および可視化は現在の業界のゴールドスタンダードであるが、従来のｃｆｕ生存率測定法は、ｃｆｕ形成に要する時間のせいで望ましいものではない。更に、固体培地上または液体培養物中で増殖する能力は微生物によって劇的に異なり得、よって特定の選好性生物の検出を制限し得る（２２）。従来の方法の上記制限・制約によって、幅広い医薬分野（２３）、環境分野、食品加工分野および臨床検査分野において微生物生存率の迅速な評価に対する必要性が高まっている。結果として、所定のマトリクス内の微生物生存状態を迅速に評価するために数多くの分子的手法が開発されている（２４）。迅速かつ高感度であるにも関わらず、核酸の存在を検出する分子的手法は細胞生存率の正確な測定を示すには不十分なことが多い。例えば、内在性ＤＮＡまたはＲＮＡの増幅は細菌生存率の指標としては劣っており、これは細胞が死んだ後の核酸の残存によるものである（２５，２６）。我々は、細菌生存率の指標としてＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を用いることの実行可能性を判定しようと試みた。このため、様々な量の熱処理後の細菌生存率の指標として、ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の検出と、ゲノムＤＮＡのＰＣＲ仲介検出とを比較するように実験をデザインした。まず、温度を上昇させて大腸菌懸濁液を一定時間処理した。熱処理の後、次に細菌をＤＮＡポリメラーゼ伸長活性およびゲノムＤＮＡの両方の存在に関してアッセイした。更に、熱処理した細菌ストックおよび熱処理しなかった細菌ストックを並行して平板培養し、目に見えるｃｆｕの存在により細菌生存率をモニターした。図６Ａは、指示された量の熱処理の後に測定した大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性のレベルを示す。注目すべきは、４５°Ｃ〜６５°Ｃで細菌懸濁液をインキュベートした後に大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の著しい低下が観察されたことである（図６Ａ）。対照的に、同一の溶解物から得られたｇｓＰＣＲシグナルは、全ての温度で比較的一定を維持しており、図６ＢでグラフによりＤＮＡポリメラーゼ活性と比較している。グラフの下に示したプレーティングの結果は、熱処理レベルの上昇がｃｆｕ形成を妨げるのに十分であり、ＤＮＡポリメラーゼ活性の劇的な消失に近似することを更に実証する；しかしながら、死細胞がなお最初の投入レベルに非常に近いゲノムＤＮＡレベルをもたらし、ｇｓＰＣＲが生存細胞の存在の指標として劣っていることを裏付けている（図６Ｂ）。図６Ｃにおいて、棒グラフは、致死量の熱処理に反応したｃｆｕの消失をモニターするＤＰＥ−ＰＣＲおよびｇｓＰＣＲの相対的能力を更に強調するものである。その後、我々はＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の測定がグラム陽性菌の生存状態を同様に示すのに使用できるか否かを検査したいと考えた。同一条件下で黄色ブドウ球菌を用いて以前の大腸菌実験を繰り返した。
図７Ａ〜Ｃは、黄色ブドウ球菌を用いて繰り返した熱処理実験から得られた同様の結果を示す。包括して、図４、６、７、および図８の表１に示すｃｆｕの存在とＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の強い一致は、本発明により行ったＤＰＥ−ＰＣＲが細胞生存率の一般的指標として使用される可能性があることを実証し、細胞の増殖または生存率の減少を目的とする他の臨床的または薬学的に意義のある薬剤（静菌性および殺菌性）に曝露された微生物のＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を測定する可能性を更に示し得る。
要約すると、本発明によると、新規な高感度の定量的および迅速なＤＰＥ−ＰＣＲアッセイが開発された。極めて低いレベルの精製酵素の定量的検出に加えて、ビーズ溶菌との組み合わせにより１０ｃｆｕ未満の細菌のＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を再現可能な方法で測定するＤＰＥ−ＰＣＲの能力を我々は実証した。我々は更に、グラム陰性菌７種、グラム陽性菌７種およびカンジダ種５種からなる微生物パネルを検査することによって、ＤＰＥ−ＰＣＲが微生物を汎用的に検出する可能性を実証した。更に、ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性とｃｆｕの存在により示される増殖の再現可能な強い相関により、ＤＰＥ−ＰＣＲアッセイを用いて細菌生存率を評価できるという予備的エビデンスを提供した。本明細書に記載したデータを検討するに、本明細書に記載した好適なＤＰＥ−ＰＣＲアッセイといった本発明の新規な方法および技術は幅広い医薬分野、環境分野、食品分野および臨床分野において幅広い検査用途の有用なツールになる可能性を有すると現在考えられる。
本願において引用した全ての文献、特許および特許出願の内容は、それぞれ本願に援用する。
上述の詳細な説明は理解を明確にするために与えられたものであり、その改変は当業者にとって自明であるため不必要な限定を意図するものではない。本明細書において記載された情報はいずれも先行技術であると認めているわけではなく、また請求項記載の発明に関連すると認めているわけではなく、具体的もしくは暗示的に引用したすべての文献が先行技術であると認めているわけではない。
他に別段の定めのない限り、本願において使用される全ての技術用語および科学用語は当業者が通常理解するのと同一の意味を有する。
本発明は特定の実施形態に関連付けられて説明してきたが、更なる改変が可能であり、本発明の原理に概して従う本発明の様々なバリエーション、使用、または改造もカバーし、かつ、本発明の技術分野における慣行または既知の技術に該当する本願開示内容から逸脱するもの、ならびに上記に記載の不可欠な特徴に適用され得る本願開示内容から逸脱するものも含む。
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大腸菌細胞における生存率の指標としての逆転写ＰＣＲによるｍＲＮＡの検出Appl. Environ. Microbiol. 64, 1313-1318.
Claims (10)
- ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の測定により活性ＤＮＡポリメラーゼを含有する試料マトリクス内部の微生物の存在または量の検出のための診断アッセイを行う方法であって、前記アッセイは、
前記試料マトリクス中のＤＮＡポリメラーゼを、予めアニールした２つの一本鎖オリゴヌクレオチドを含み、該２つの一本鎖オリゴヌクレオチドのうちの１つがデオキシウリジンヌクレオシドを含む基質とともにインキュベートするステップと、
ＰＣＲサイクリングを行うステップと、
選択された適切な核酸プローブの使用による検出を行い、これにより前記微生物の存在または量の表示として前記試料マトリクス中の内在性ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を検出するステップと、を備え、
前記ＰＣＲサイクリングの前に、前記ＤＮＡポリメラーゼは、デオキシウリジンヌクレオシドを含まない前記一本鎖オリゴヌクレオチドの３'末端のみを伸長させ、続いて、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを添加して、デオキシウリジンヌクレオシドを含む前記一本鎖オリゴヌクレオチドを分解し、ポリメラーゼ仲介伸長に由来する一本鎖産物のみが前記ＰＣＲサイクリングに進むようにする、方法。 - ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性の測定が、前記試料マトリクス中の細菌生存率の指標である、請求項１に記載の方法。
- 前記試料マトリクスが血清である、請求項１に記載の方法。
- 前記試料マトリクスが血漿である、請求項１に記載の方法。
- 前記試料マトリクスが、精製酵素、微生物溶解物および粗微生物溶解物からなるグループから選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記アッセイが、微生物ＤＮＡポリメラーゼ伸長活性を特異的に検出し、シグナルがＤＮＡポリメラーゼ以外の酵素活性による前記基質の修飾に由来しない、請求項１に記載の方法。
- 前記アッセイを行う前に、前記方法が、微生物を含有するか微生物を含有すると思われる微生物溶解物または粗微生物溶解物をビーズミル溶菌チューブに加え、前記微生物細胞を破壊し、この破壊された細胞を前記アッセイの前記インキュベーションステップに移す追加のステップを備える、請求項５に記載の方法。
- 遮断薬を前記試料混合物に加えるステップを更に備える、請求項６に記載の方法。
- 前記試料マトリクスが生体試料である、請求項１に記載の方法。
- 前記試料マトリクスが環境試料である、請求項１に記載の方法。
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