CN104066853A - 改进的dna聚合酶活性测定和允许检测活微生物的方法 - Google Patents

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Abstract

公开了一种执行用于检测包含活性DNA聚合酶的样本基质内的微生物体的存在性或者数量的诊断测定的方法。该方法利用DNA聚合酶延伸活性的测量结果，其中所述测定包括步骤：利用选择的适当底物孵育样本基质中的DNA聚合酶，以及经由使用选择的适当核酸探针执行PCR循环和检测，从而检测样本基质中的内源性DNA聚合酶延伸活性，作为所述微生物体的存在性或者数量的指示。

Description

改进的DNA聚合酶活性测定和允许检测活微生物的方法
相关申请的交叉引用
本申请是非临时申请，其需要通过引用在此合并2012年1月5日提交的美国临时申请No.61/583,568并且要求该临时申请的优先权。
发明背景
本节中且在整个本公开中使用的参考编号引用本文的“参考文献”一节中阐述的文献。
DNA聚合物活性对于基因复制和跨所有生物域的生物体传播是必不可少的(1-3)。自从其初始表征(4)以来，体外驾驭DNA聚合酶活性的能力已经变成分子生物学研究领域的基本工具(5)。超越其在研究中确立的重要性，DNA聚合酶活性的体外测量潜在地在制药和临床设置中提供了众多的有用应用。例如，由于细菌DNA聚合酶正积极地作为用于开发新的抗微生物剂的靶(6，7)，因而能够测量DNA聚合酶活性的快速且灵敏的测定是所希望的。再者，DNA聚合酶活性的损失或增益密切地涉及人类疾病。例如，DNA聚合酶活性与基因畸变之间出现的联系将酶指定为用于抗癌治疗的靶(8，9)。DNA聚合酶活性的不足也与线粒体病相联系(10)。此外，DNA聚合酶活性的测量具有用作一种快速且灵敏的诊断工具的可能性，该诊断工具能够在其中期望无菌的给定环境或者生物基质中检测携带活性DNA聚合酶的几乎任何生物体。
用来体外测量DNA聚合酶活性的最常见方法取决于放射性标记的核苷酸的掺入(11)。然而由于与放射性同位素关联的内在的风险和限制的原因，这样的DNA聚合酶测定的常规使用是不合需要的。因此，在过去数十年，开发了许多非放射性体外聚合酶测定。一些依赖于由PicoGreenTM到双链DNA的结合(13，14)或者DNA单链结合蛋白质(12)的DNA聚合酶介导的释放而生成的荧光的测量结果。其他方法依赖于荧光标记的核苷酸的微板耦合和检测(15)。近来，开发了基于分子信标(16)和基于电化学(17)的DNA聚合酶测定。尽管成功地避免了放射性的使用，但是上面的测定受到这样因素的限制，这些因素例如差的灵敏度、小的线性动态测量范围或者使用纯化的聚合酶。
相关领域技术人员将会清楚明白的是，依照本文描述的本发明测量DNA聚合酶延伸活性代表一种具有非常广泛的应用的有用工具，这些应用例如但不限于体外筛选候选聚合酶抑制剂，或者在各种各样的样本类型内检测任何微生物(microbe)(携带活性DNA聚合酶)的存在性。这是相对于现有技术的重大改进，因为如果预期用于这些目的，那么掺入放射性标记的核苷酸的传统聚合酶测定的常规使用是没有吸引力的。因此，在最近几十年开发了许多非放射性DNA聚合酶延伸测定。尽管成功地避免了放射性的使用，但是当前的基于荧光的DNA聚合酶测定也遭受各种不同的缺陷。例如，经由若干现有的非放射性测定检测DNA聚合酶活性取决于PicoGreenTM到新生成的双链DNA的结合(13，14)。如果预期根据新近裂解的生物体分析DNA聚合酶活性，那么基于PicoGreenTM的测定很可能将经由PicoGreenTM到基因组DNA的结合而受到背景荧光的阻碍。也开发了基于微板的DNA聚合酶测定。出于许多原因，可以预期基于微板的测定的灵敏度降低，这些原因包括依赖于产品或底物到微板的中间结合和/或被DNA聚合酶改性的dNTP的低效掺入。近来，描述了经由分子信标对于DNA聚合酶活性的实时测量(16)。尽管改进了灵敏度，但是分子信标荧光的直接测量可能也潜在地受到暴露于粗(crude)细胞裂解物的妨碍。
发明内容
本发明改进了如上面所描述的背景技术的技术，并且提供了一种快速、高度灵敏和定量的测定，其能够从纯化的酶或者直接从包括粗制微生物裂解物的微生物裂解物测量DNA聚合酶延伸活性。如本文所描述的发明提供了一种朝着给定样本基质内潜在地任何包含活性DNA聚合酶的微生物体(microorganism)的灵敏检测的显著且意外的进步。本发明涉及用于酶模板生成和扩增(ETGA)的方法。因此，本文描述了基于耦合到定量PCR读出器的DNA聚合酶延伸活性的测量的新颖ETGA方法的第一表征。对于本文的公开内容的其余部分，由本发明提供的这种类型的诊断测定称为DPE-PCR。本发明的DPE-PCR测定可以用来测量低水平的纯化酶并且能够直接从微生物细胞裂解物检测内源性DNA聚合酶延伸活性。
附图说明
图1为依照本发明的优选DPE-PCR诊断测定的示意性概览，并且其中：(步骤A)利用由预先退火的寡核苷酸(Oligo)-1和Oligo-2组成的底物孵育DNA聚合酶。(步骤B)在37℃下的20分钟孵育期间，DNA聚合酶仅仅延伸Oligo-1的3’端。(步骤C)随后将3μL的反应混合物置于包含尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)的热启动qPCR反应中。在激活Tag之前，UDG降解Oligo-2内的脱氧尿苷，只留下Oligo-1衍生的聚合酶介导的延伸的单链产物。(步骤D)在激活Taq之后，经由结合到Oligo-1延伸产物的引物起始扩增。(步骤E)经由Tagman探针的PCR循环和检测。
图2为使用依照本发明一个优选实施例的DPE-PCR的纯化DNA聚合酶的灵敏检测的示意性表示，并且其中：(A)在每次反应2x10-5个单位(U)处开始以10倍增量向下至每次反应2x10-11U重复测定商业来源的DNA聚合酶I。对于每个聚合酶加样水平和无加样对照(NIC)示出了代表性DPE-PCR曲线。(B)根据取自两个独立实验的每个聚合酶加样水平n＝4个数据点构造曲线图，并且执行线性回归分析。(C)包含2x10-7U的DNA聚合酶I的重复三次的反应，与NIC相比较测定Klenow、Klenow(Exo-)和大肠杆菌DNA连接酶。对于每种测定的酶和NIC给出代表性DPE-PCR曲线。(D)在包含dNTP混合物的反应物中将DPE-PCR信号与dCTP或ddCTP比较，代表用于在DNA底物中掺入dCTP或ddCTP的可用位点的示意图邻近DPE-PCR曲线给出。
图3为将珠裂解耦联到依照本发明一个优选实施例的DPE-PCR的示意性概览。
图4为依照本发明的DPE-PCR的执行如何经由测量粗裂解物中的DNA聚合酶延伸活性而允许革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的灵敏和定量检测的图形表示，并且其中：(A)将数量减少的大肠杆菌cfu插入珠裂解耦联的DPE-PCR中。无加样对照(NIC)也被包括以便监视试剂背景水平。所有cfu示踪(spike)和NIC重复进行三次。在下面对于每个细菌加样水平示出代表性DPE-PCR曲线。在获得置于每个反应中的实际cfu的更高估计的努力中执行菌落计数平板培养(plating)和gsPCR，并且在补充图3中给出。(B)给出大肠杆菌DNA聚合酶活性和线性回归分析的曲线图。图形使用从范围为1x105–1x101cfu的细菌示踪物的三次重复反应获得的平均Ct值生成。(C和D)完全如上面针对在获得置于每次反应中的实际cfu的更高估计的努力中执行的大肠杆菌计数平板培养和gsPCR所描述的，对于金黄色葡萄球菌执行cfu滴定实验。
图5示出了由依照本发明另一个优选实施例的DPE-PCR检测细菌的图形表示，并且其中：(A)将5μL的大肠杆菌悬浮液添加到由包含50μM dCTP或者50μM ddCTP的dNTP混合物组成的珠裂解耦联的DNA聚合酶测定。给出了表示大肠杆菌衍生的DNA聚合酶活性的DPE-PCR曲线。如通过平板培养所确定的近似cfu加样在qPCR曲线图的左上区域中给出。(B)将5μL的大肠杆菌悬浮液添加到包含由具有50μM dCTP或者50μM ddCTP的dNTP混合物组成的50μL反应缓冲液的珠裂解管。在裂解之前，将1μL dCTP[2.5mM0.25mM0.025mM0.0025mM]添加到包含选择的ddCTP的反应中。并行地运行单独包含dCTP或者单独包含ddCTP的反应，作为“非终止”和“终止”比较器。给出表示大肠杆菌衍生的DNA聚合酶活性的所得到的DPE-PCR曲线。如通过平板培养所确定的近似cfu加样在qPCR曲线图的左下区域中给出。(C)也在用于图2B中给出的DNA聚合酶检测的相同裂解物上执行特定于大肠杆据基因的PCR。示出了细菌DNA聚合酶检测的依赖于dCTP的拯救与基因组DNA的gsPCR的关系的线性曲线图。曲线图使用来自所指示的条件下的三次重复反应的平均qPCR Ct值生成。(D-F)完全如上面对于大肠杆菌所描述的对于金黄色葡萄球菌执行ddCTP终止和dCTP拯救实验。
图6为其中DPE-PCR为响应于热处理的大肠杆菌生存能力的指示物的本发明另一个实施例的图形说明，并且其中：(A)在25℃、45℃、65℃、85℃和105℃下孵育200μL等份试样的大肠杆菌悬浮液(～2000cfu/μL)20分钟。在加热之后，将每个细菌储备液(stock)冷却到室温，并且将5μL转移至珠裂解耦联的DPE-PCR测定。给出表示每个所指示的温度处理之后的大肠杆菌衍生的DNA聚合酶活性的DPE-PCR曲线。(B)曲线图根据大肠杆菌悬浮液的所指示的温度处理之后三次重复的DPE-PCR反应和(来自相同裂解物的)基因组DNA的gsPCR而生成。也对于每个处理的大肠杆菌悬浮液重复三次执行并行的平板培养。曲线图下面给出了代表性cfu监视平板，其揭示了在每个温度下处理之后的细菌生存能力状态。(C)响应于不同温度处理，将DPE-PCR与基因组DNA的gsPCR比较。使用所指示的方程计算“qPCR信号的成倍减小”，并且将获得的值用于生成比较条形图。
图7为其中DPE-PCR为响应于热处理的金黄色葡萄球菌生存能力的指示物的本发明另一个实施例的图形说明，并且其中：(A)在25℃、45℃、65℃、85℃和105℃下孵育200μL等份试样的金黄色葡萄球菌悬浮液(～2000cfu/μL)20分钟。在加热之后，将每个细菌储备液冷却到室温，并且将5μL转移至珠裂解耦联的DPE-PCR测定。给出表示每个所指示的温度处理之后的金黄色葡萄球菌衍生的DNA聚合酶活性的DPE-PCR曲线。(B)曲线图根据金黄色葡萄球菌悬浮液的所指示的温度处理之后三次重复的DPE-PCR反应和(来自相同裂解物的)基因组DNA的gsPCR而生成。也对于每个处理的金黄色葡萄球菌悬浮液重复三次执行并行的平板培养。曲线图下面给出了代表性cfu监视平板，其揭示了在每个温度下处理之后的细菌生存能力状态。(C)响应于不同温度处理，将DPE-PCR与基因组DNA的gsPCR比较。使用所指示的方程计算“qPCR信号的成倍减小”，并且将获得的值用于生成比较条形图。
图8阐明了如本文所引用的表1，其中阐明了这样的结果，这些结果示出依照本发明教导的17个附加的临床相关微生物种类的灵敏和线性的检测。
具体实施方式
在过去五十年，DNA聚合酶活性的体外测量已经变成一种必不可少的分子生物学工具。用来体外测量DNA聚合酶活性的传统方法由于使用放射性核苷酸的原因而不合需要。已经开发了基于荧光的DNA聚合酶测定；然而，它们也遭受各种不同的限制。本文公开了一种快速、高度灵敏和定量的测定，其能够从纯化的酶或者直接从微生物裂解物测量DNA聚合酶延伸活性。当利用纯化的DNA聚合酶测试时，发现该测定在展示卓越的线性(R2＝0.992)的同时检测少至2x10-11U的酶(≈50个分子)。当耦联到珠磨机裂解时，该测定也能够检测下至至少10个菌落形成单位的加样革兰氏阳性或者革兰氏阴性细菌的内源性DNA聚合酶延伸活性，同时维持R2＝0.999。此外，本文给出的实验证据表明，如测定信号与细菌菌落形成之间的可复现强烈一致性所展示的，DNA聚合酶延伸活性是细菌生存能力的一种指示物。总之，本文描述的发明的新颖技术代表一种朝着给定样本基质内潜在地任何包含活性DNA聚合酶的微生物体的灵敏检测的显著进步。
为了进一步说明本发明的前述概念和优点，提供以下实例说明本发明，但是这些实例绝不应当被视为限制了本发明。
实例
材料和方法：
DNA底物制备
DNA底物(以及下文给出的qPCR引物)的序列根据先前用来经由T4DNA连接酶测量细菌衍生的ATP(18)的DNA寡核苷酸(Oligos)进行调适(18)。简言之，对Oligo1和Oligo2(参见图1)预先退火并且稀释到0.01μΜ的工作浓度。
使用商业聚合酶的DNA聚合酶活性反应
在Tris EDTA(T.E.)pH8.0中将DNA Pol I(NEB cat#M0209L)、Klenow(NEB cat#M0210S)和Klenow exo(-)(NEB cat#M0212S)稀释至所指示的U/μL储备液。开始，将每个浓度下的2μL DNA聚合酶储备液置于包含以下成分的50μL聚合酶测定混合物中：50μΜ dNTP，20mM Tris pH8.0，10mM硫酸铵，10mM氯化钾，2mM硫酸镁，1％BSA，0.1％Triton，0.1％Tween以及0.001μΜ预先退火的DNA底物。对反应物进行短暂的涡旋振荡，并且置于37℃下20分钟。在20分钟之后，将3μL的每个反应立即置于定量PCR(qPCR)反应中。
通过qPCR检测
使用以下成分制备qPCR反应主混合物：LightCycler480主混合物(Roche cat#04707494001)，333nM的每个引物，166nM的靶探针(FAM)，166nM的内参探针(TxRed)以及1.2U的UDG(Biolinecat#BIO-20744)。作为监视PCR抑制的工具，每个qPCR反应也包括40个拷贝的竞争性内参DNA。对于每个qPCR反应，将3μL的DNA聚合酶反应物添加到27μL的主混合物中，并且在SmartCycler(Cepheid,Sunnyvale CA)上如下运行两步qPCR：初始孵育40℃10分钟，50℃10分钟并且95℃5分钟(以便活化Taq)，接着95℃下5s的变性和65℃下20s的退火/延伸循环45次。循环阈值(Ct)通过SmartCycler软件使用出现的qPCR曲线的2阶导数分析自动地生成。
细菌菌株和培养基
在该研究中使用了金黄色葡萄球菌(Staphylococcus arueus)(ATCC25923)和大肠杆菌(Escherichia coli)(ATCC25922)。培养物在脑心灌注液体培养基/琼脂(Teknova)中/上生长。图5中列出了用于附加的17个测试的微生物体的ATCC参考编号和生长培养基。
珠磨裂解之后的细菌DNA聚合酶活性的检测
将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌培养物生长为1.0±0.2的OD600(近似1x109cfu/mL)。对于每种生物体，将1mL的培养物沉淀，并且在T.E.中洗涤三次。用T.E.连续稀释细菌悬浮液，并且将5μL的每个储备液添加到包含50μL的裂解反应缓冲液的珠裂解反应物中。对于每种生物体，重复三次执行1x105至1x100cfu/反应物的滴定曲线，包括没有悬浮液的三次重复反应(无加样对照)。在添加5个细菌储备液(或者无加样对照)之后，在2800rpm下对裂解/反应管珠研磨6分钟，接着在37℃下孵育20分钟。在20分钟的孵育之后，将样本加热到95℃5分钟，并且移走以便在室温下冷却。然后，在12k x g下旋转样本30秒，并且将3μL的每个反应物置于qPCR中。对五微升的每个细菌储备液平板培养以获得更精确的cfu加样水平。生物体特异性的PCR也在用于DNA聚合酶检测的相同裂解物上执行。图2中列出了用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌基因的特异性PCR的引物和探针序列。
双脱氧终止法实验
利用ddCTP终止纯化的DNA聚合酶延伸活性：
如上面所描述的利用包含50μΜ dCTP或者50μΜ ddCTP(Affymetrix#77332)的dNTP混合物准备DNA聚合酶测定反应。利用2x10-9U的DNA聚合酶I(新英格兰生物实验室#M0209)对包含dNTP混合物的反应物示踪。反应物在37℃下孵育20分钟，并且随后将3μL的每个反应物置于qPCR中。
经由ddCTP的微生物检测的消除：
如上面所描述的生长、洗涤和稀释金黄色葡萄球菌和大肠杆菌培养物。为了展示微生物DNA聚合酶的ddCTP依赖性的终止，将5μL的细菌储备液添加到包含具有50μM dCTP或者50μM ddCTP的50μL反应缓冲液的珠裂解管中。如上面所描述的执行裂解、孵育和qPCR。对五微升的每个细菌储备液平板培养以便确定更精确的cfu加样水平。基因组DNA的基因特异性PCR也在用于DNA聚合酶检测的相同裂解物上执行。
微生物检测的dCTP拯救(rescue)：
如上面所描述的生长、洗涤和稀释金黄色葡萄球菌和大肠杆菌培养物。将五微升的细菌储备液添加到包含具有50μM ddCTP的50μL反应缓冲液的珠裂解管。在裂解之前，将2.5mM、0.25mM、0.025mM、0.0025mM下的1μL dCTP添加到包含ddCTP的反应物中。并行地运行单独包含50μM dCTP和单独包含ddCTP的反应，作为“非终止”和“终止”比较物。如上面所描述的执行裂解、孵育和qPCR。对五微升的每个细菌储备液平板培养以便确定更精确的cfu加样水平。基因特异性的PCR也在用于DNA聚合酶检测的相同裂解物上执行。
活力评估实验
如上面所描述的生长、洗涤和稀释金黄色葡萄球菌和大肠杆菌培养物。在25℃、45℃、65℃、85℃和105℃下孵育(在T.E.中)近似2000cfu/μL的二百微升的细菌储备液20分钟。在加热之后，将样本冷却到室温，并且将5μL的每个细菌储备液添加到包含50μL反应缓冲液的珠裂解管。如上面所描述的执行裂解、孵育和qPCR。也将(在不同温度下处理的)五微升的每个细菌储备液添加到1mL的T.E.中并且为了菌落计数测定对50μL进行平板培养。基因特异性的PCR也在用于DNA聚合酶检测的相同裂解物上执行。
结果和讨论
在本发明的发展中，着手开发一种快速、简单、高度灵敏和定量的测定，其能够测量从纯化的商业来源或者新近裂解的细胞衍生的DNA聚合酶延伸活性，这将改进前面描述的现有技术的方法并且克服其缺点。图1示出了将DNA聚合酶延伸活性耦联到qPCR涉及的机制的示意性概览。值得注意的是，在Taq活化之前通过尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)移除Oligo2(参见图1的步骤C)，从而正好在PCR循环之前防止底物的非特异性延伸。先前已经报道了一种将T4DNA连接酶活性与PCR扩增相联系的微生物检测方法(18)，其包含与我们的DPE-PCR测定的相似性并且是ETGA方法的另一个实例。然而，在本发明的发展期间，旨在检测依赖于NAD的DNA连接酶活性的这种方法的一个修改版本遭受各种不同的限制(未公布的数据)，导致如本文所描述的本发明的新颖的基于DNA聚合酶的方法的开发。
纯化的DNA聚合酶延伸活性的灵敏性和线性的检测
使用商业上可用的DNA聚合酶I执行实验，确定DPE-PCR测定的近似分析灵敏度。如图2A中所示，在大范围的加样酶上实现DNA聚合酶I的检测。事实上，实现了向下少至2x10-11个单位(U)的酶(等效于近似50个聚合酶分子)的DNA聚合酶I延伸活性的测量。据我们所知，在现有的DNA聚合酶测定中，该水平的DNA聚合酶延伸活性的检测是无与伦比的。理论上，这种灵敏度水平可以允许实现单个微生物检测，因为大肠杆菌被报道每细胞包含近似400个DNA聚合酶I分子(11)。在用曲线图表示来自检测实验的两个独立极限的数据之后，回归分析也表明DPE-PCR循环阈值(Ct)与加样商业DNA聚合酶I的单位数之间的强正线性相关性(图2B)。在执行灵敏度和线性度实验之后，重要的是确定DPE-PCR测定信号是否独立于内在的核酸外切酶活性。为此目的，我们随后将通过2x10-7U的DNA聚合酶I生成的信号与缺乏5’→3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶I(Klenow)以及根据缺乏所有核酸外切酶活性的酶的另一版本(Klenow exo-)生成的信号进行比较。为了附加的特异性和背景信号确定，并行地测试无加样对照(NIC)和2x10-7U的大肠杆菌DNA连接酶。如图2C中所示，当与野生型DNA聚合酶I相比较时，检测相似水平的Klenow和Klenow exo-，这提供了DPE-PCR测定信号来自DNA聚合酶依赖的延伸而不是内在的核酸外切酶活性得到的证据。除了使用无核酸外切酶的聚合酶之外，我们着手进一步证明DPE-PCR测定信号从qPCR之前DNA底物的DNA聚合酶依赖的延伸得到。由于掺入双脱氧核苷酸是一种用于终止DNA聚合酶链延伸活性的行之有效的方法(19，20)，我们选择在我们的反应混合物内用双脱氧CTP(ddCTP)代替dCTP。图2D中所示的示意图揭示了可以通过DNA聚合酶掺入ddCTP的底物内的第一可能位置。如果ddCTP掺入到该位置，那么Oligo1的延伸产物长度不够qPCR引物1的后续检测(图1)。如图2D中所示，用ddCTP代替dCTP消除了由DNA聚合酶I生成的信号，因此证明了DPE-PCR测定信号依赖于qPCR之前底物的DNA聚合酶延伸。低拷贝内部扩增对照的存在证实了qPCR不受从DNA聚合酶测定试剂遗留的少量ddCTP的存在的抑制(补充图1C)。另外，我们感到重要的是要注意，在不存在加样DNA聚合酶(无加样对照)的情况下我们零星地观察到微弱但是可检测的信号。由于DPE-PCR测定的敏锐的灵敏度的原因，我们证明了微弱背景噪声信号可以从若干潜在来源得到，这些来源例如但不限于反应装配之前试剂中存在的DNA聚合酶污染物，在实验设置期间由操作者引入的DNA聚合酶和/或在Taq激活(未公布的数据)之前Oligo2的不完全降解(图1)。值得注意的是，这些不规则的背景噪声源可通过制定更加严格的试剂制备过程和良好的无菌技术而控制。
通过直接从细胞裂解物测量内源性DNA聚合酶延伸活性进行微生物的灵敏度通用检测
除了检测纯化的聚合酶活性之外，非常需要一种简单的测量微生物衍生的DNA聚合酶活性的通用方法。如果实现的话，这种方法可以允许在积极生长的培养物中筛选候选抗微生物剂，从而允许将DNA聚合酶延伸活性与生物体增殖相比较。另外，DNA聚合酶延伸活性的测量结果可以用来针对任何携带活性DNA聚合酶的微生物体的存在筛选环境或生物样本。为此目的，我们开发了一种将微生物裂解耦联到本发明提供的DPE-PCR测定的简单方法。如图3中所示，将已知包含或者怀疑包含微生物的液体样本添加到珠磨裂解管，使其分裂并且立即转变为DPE-PCR测定。我们选择一种革兰氏阴性细菌(大肠杆菌)和一种革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌)以证明我们的测定测量粗制细胞裂解物中的微生物衍生的DNA聚合酶延伸活性的能力。如图4A中所示，当与珠磨裂解相联系时，DPE-PCR测定能够检测向下至且低于每裂解管10个菌落形成单位(cfu)的大动态范围的加样大肠杆菌。也执行了向下至10cfu的加样细菌的大肠杆菌检测的线性回归分析，并且其表明如0.999的R2值所指示的加样cfu与DNA聚合酶延伸活性信号之间的强正线性相关性(图4B)。并行地运行菌落计数平板培养和特异特定于大肠杆菌基因的qPCR(gsPCR)，证实每次反应的cfu加样水平以及根据完全相同的裂解物监视完整的基因组DNA的能力。来自金黄色葡萄球菌裂解物的DNA聚合酶延伸活性被检测到相似加样水平(图4C)。绘制了金黄色葡萄球菌检测向下至10cfu的加样细菌，并且也表明加样cfu与DNA聚合酶延伸活性信号之间的强线性相关性(R2＝0.999，图4D)。菌落计数平板培养和gsPCR并行地执行以便证实每个珠裂解管中存在的金黄色葡萄球菌的数量以及可直接分析的基因组DNA的存在。用于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的平板培养、gsPCR和DNA聚合酶活性结果的完整表格可以见图3和图4。我们随后测试DPE-PCR测定从十七个附加的临床相关微生物体测量DNA聚合酶活性的能力。如表1中所示，我们能够从包括六个革兰氏阴性细菌、六个革兰氏阳性细菌和五个念珠菌属的所有十七个附加生物体检测DNA聚合酶活性。这十七个附加微生物的检测以检测的令人印象深刻的下限表现出与加样cfu的强正线性相关性。迄今为止且没有失败地，我们进行了类似的测试，并且检测了总共31个不同的微生物种类(数据未示出)。上线性动态范围仍然有待完全表征。图8中给出了包含用于17个附加微生物中的每一个的并行平板培养数据和DPE-PCR结果的更多结果。总之，这些数据支持以下意见：依照本发明教导的DPE-PCR的执行具有用作用于在正常无菌环境下灵敏地检测任何微生物的通用“平底锅(pan)”测试的可能性。
如图2D中所示，在反应混合物中用ddCTP代替dCTP代表一种用于在我们的测定中阻断依赖于DNA聚合酶的延伸活性的检测的强大工具。为了证明从细菌示踪物得到的信号依赖于它们的DNA聚合酶延伸活性而不是裂解物中存在的其他内源性细菌酶活性，我们设定比较使用包含(dATP，dTTP，dGTP，dCTP)的标准DNA聚合酶反应混合物与包含(dATP，dTTP，dGTP，ddCTP)的反应混合物从大肠杆菌和金黄色葡萄球菌获得的DPE-PCR信号的实验。如图5A中所示，当与标准反应混合物比较时，ddCTP的代替阻断了生成从大肠杆菌cfu示踪物得到的信号(图5A)。随后，通过将来自包含100％ddCTP(50μΜ)的反应混合物中裂解的细菌的DNA聚合酶延伸活性与包含用增加数量的dCTP示踪的50μΜddCTP的的DNA聚合酶活性进行比较而执行dCTP拯救实验(参见用于拯救实验的详细描述的材料和方法)。图5B展示了增加数量的dCTP具有的对于从大肠杆菌裂解物得到的可量化DNA聚合酶延伸活性的拯救效果。除了测量微生物DNA聚合酶延伸活性之外，并行地运行gsPCR以便验证等效数量的大肠杆菌存在于每个测定的裂解物中。图5C中给出了DNA聚合酶活性与基因组DNA的存在性的图形比较。随后，利用金黄色葡萄球菌重复信号终止(经由ddCTP)和dCTP拯救实验，并且获得相似的结果(图5D-F)。包含用于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌二者的DPE-PCR和gsPCR数据的表格可以见诸图6和图7。提供qPCR内参值以证明带入qPCR中的低水平ddCTP不是抑制性的，并且因此对DNA聚合酶活性信号的消失不负责(图6A和图7A)。总之，图5中给出的数据强烈支持以下主张：DPE-PCR专门检测微生物DNA聚合酶延伸活性，并且信号不从经由不同于DNA聚合酶的酶活性的底物修饰而得到。
作为细菌生存能力的指示物的DNA聚合酶延伸活性的测量
传统的用于确定细菌生存能力的方法依赖于特定微生物在固体培养基上的生长和可视化(21)。尽管细菌生长和可视化是目前的行业黄金标准，但是传统的cfu生存能力确定方法由于cfu形成所需的时间长度的原因而不合需要。此外，在固体培养基上或者在液体培养物中生长的能力可能从一种微生物到另一种微生物剧烈地变化，从而可能地限制某些需要复杂营养苛求的生物体的检测(22)。由于传统方法的前述限制的原因，在各种各样的制药(23)、环境、食品处理和临床测试领域存在对于微生物生存能力的快速评估的不断增长的需求。因此，在快速评估给定基质内的微生物生存能力状态的努力中开发了许多分子学方法(24)。尽管快速且灵敏，但是检测核酸的存在性的分子学方法经常缺乏对于细胞生存能力的精确测量的表示。例如，由于细胞死亡之后核酸的存留，内源性DNA或RNA的扩增是细菌生存能力的差的指示物(25，26)。我们着手确定将DNA聚合酶延伸活性用作细菌生存能力指示物的可行性。为此目的，设计了将不同的热处理量之后作为细菌生存能力的指示物的基因组DNA的PCR介导的检测与DNA聚合酶延伸活性的检测相比较的实验。开始时，在增加的温度下处理大肠杆菌悬浮液达固定时间段。在热处理之后，随后对于DNA聚合酶延伸活性和基因组DNA的存在性测定细菌。也并行地对热处理的和未热处理的细菌储备液平板培养以便经由可见cfu的存在性监视细菌生存能力。图6A表示所指示的热处理量之后测量的大肠杆菌DNA聚合酶延伸活性的水平。值得注意的是，在45℃与65℃之间孵育细菌悬浮液之后观察到大肠杆菌DNA聚合酶延伸活性的显著下降(图6A)。形成对照的是，从相同裂解物获得的gsPCR信号在所有温度下保持相对恒定，并且在图6B中在图形上与DNA聚合酶活性相比较。曲线图下面给出的平板培养结果进一步证明增加的热处理水平足以防止cfu形成并且与DNA聚合酶活性的急剧损失并行；然而，死亡细胞仍然促成基因组DNA水平非常接近其原始加样水平，这证实gsPCR是活细胞存在性的一种差的指示物(图6B)。在图6C中，条形图进一步突出了DPE-PCR和gsPCR监视cfu响应于致命的热处理量而消失的相对能力。随后，我们想要测试DNA聚合酶延伸活性的测量结果是否也可以用来指示革兰氏阳性生物体的生存能力状态。先前的大肠杆菌实验在相同的条件下利用金黄色葡萄球菌重复。
图7A-C示出了从利用金黄色葡萄球菌重复的热处理实验获得的相似结果。总的来说，图4、图6、图7和图8的表1中所示的cfu的存在性与DNA聚合酶延伸活性之间的强一致性证明了依照本发明执行的DPE-PCR具有用作细胞生存能力的一般指示物的可能性，并且另外可以给出从暴露于旨在降低细胞增殖或生存能力的其他临床或药物相关制剂(抑菌的和杀菌的)的微生物测量DNA聚合酶延伸活性的可能性。
总而言之，依照本发明，开发了一种新颖、高度灵敏、定量且快速的DPE-PCR测定。除了定量检测极低水平的纯化酶之外，我们证明了DPE-PCR经由耦联到珠裂解从小于10cfu的细菌可复现地测量DNA聚合酶延伸活性的能力。我们也通过测试一组由七个革兰氏阴性细菌、七个革兰氏阳性细菌和五个念珠菌属组成的微生物体证明了DPE-PCR普遍地检测微生物的可能性。此外，DPE-PCR测定可以用来评估细菌生存能力的初步证据经由如cfu的存在性所指示的增殖与DNA聚合酶延伸活性之间的可复现强相关性而提供。考虑本文公开的数据，目前相信诸如如本文公开的优选DPE-PCR之类的本发明的新颖方法和技术具有变成用于制药学、环境、食品和临床设置内的大范围的测试应用的有用工具的可能性。
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除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
尽管结合其具体实施例描述了本发明，但是应当理解的是，其能够做出进一步修改，并且本申请预期覆盖总体上遵循本发明的原理以及包括这样的落入本发明所属领域内的已知或习惯实践且可以适用于之前阐述的基本特征的与本公开内容的偏离的本发明的任何变型、用途或者调适。
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Claims (10)

1.一种执行用于通过测量DNA聚合酶延伸活性检测包含活性DNA聚合酶的样本基质内的微生物体的存在性或者数量的诊断测定的方法，所述测定包括步骤：利用选择的适当底物孵育样本基质中的DNA聚合酶，以及经由使用选择的适当核酸探针执行PCR循环和检测，从而检测样本基质中的内源性DNA聚合酶延伸活性，作为所述微生物体的存在性或者数量的指示。
2.权利要求1的方法，其中DNA聚合酶延伸活性的测量结果是所述样本基质中的细菌生存能力的指示物。
3.权利要求1的方法，其中样本基质为血清。
4.权利要求1的方法，其中样本基质为血浆。
5.权利要求1的方法，其中样本基质选自由纯化的酶、微生物裂解物和粗微生物裂解物所组成的组。
6.权利要求1的方法，其中所述测定特别地检测微生物DNA聚合酶延伸活性，并且信号不从经由不同于DNA聚合酶的酶活性的所述底物的修饰而得到。
7.权利要求5的方法，其中在执行测定之前，该方法包括附加步骤：将已知包含或者怀疑包含微生物体的微生物裂解物或者粗微生物裂解物添加到珠磨裂解管，使微生物细胞分裂并且将分裂的细胞转移至测定的孵育步骤。
8.权利要求6的方法，包括另一步骤：在该方法的执行中在适当点处将阻断剂添加到样本混合物以便确保测定特异地检测微生物DNA聚合酶延伸活性，并且测定信号不从经由不同于DNA聚合酶的酶活性的所述底物的修饰而得到。
9.权利要求1的方法，其中样本基质为生物样本。
10.权利要求1的方法，其中样本基质为环境样本。
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