JP6603956B2 - ポリメラーゼ活性を指標として非精製サンプル中の微生物の存在を検出する方法 - Google Patents
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Description
本出願は非仮出願であり、部分的に、2010年4月16日に出願された米国仮出願番号第61/324,939号、2010年4月16日に出願された米国仮出願番号第61/324,949号および2010年4月19日に出願された米国仮出願番号第61/325,413号を出典明示により包含させ、これらの優先権の利益を主張する。
本発明は、一般的に、微生物の検出の分野、さらに特に細菌の検出に関する。また、本発明により、細菌生存能力の指標としてリガーゼおよび/またはホスファターゼの存在に依存する、高感度で、非精製サンプルに適用することができ、多数の用途を有する改善された微生物検出方法が、アッセイキットと共に提供される。
細胞生存能力と関連する特定の分子の存在およびレベルを測定することは、多くの情況において重要である。例えば、ATPのレベルを測定することは、増殖分析および毒物学的目的のために哺乳動物細胞において有用である。
上記慣用の方法と対照的に、1つの局面において、本発明は、サンプル、特に、例えば、粗微生物溶解物または非精製血液または血液培養物であるサンプル中の(生存能力のある)微生物または細菌の存在の有用な指標としての、酵素、例えば、ポリメラーゼ、好ましい態様において、DNAまたはRNAポリメラーゼの検出に向けられる。本発明にしたがって見出された、酵素、例えばポリメラーゼ活性と微生物または細菌の生存能力との間の関連は、これらの酵素の活性の検出を、サンプル中の生存能力のある微生物細胞、特に細菌起源の指標として使用可能にする。
(a)サンプルを、サンプル中でポリメラーゼ活性に対する基質として作用する核酸分子と接触させること;
(b)このように接触されたサンプルをポリメラーゼ活性に適した条件下でインキュベートすること;および
(c)基質核酸分子に対する微生物ポリメラーゼの作用から生じる核酸分子の存在および/または量を決定し、微生物の存在を示すこと
を含むことができる。
(a)サンプルと、DNAポリメラーゼ由来の干渉シグナルを許容しない一方、サンプル中で酵素活性に対する基質として作用する核酸分子とを接触させること、
(b)このように接触されたサンプルを酵素活性に適した条件下でインキュベートすること;および
(c)基質核酸分子に対する選択される酵素または混合物の作用から生じる酵素修飾核酸分子の存在および/または量を決定し、微生物の存在を示すこと
を含む方法を提供する。
したがって、前記から、本発明の方法が、酵素、例えば、適当なポリメラーゼが発現される(または発現されている)全ての微生物を同定するために有用であることを認識することができる。1つの態様において、本発明の方法は、生存能力のある微生物の検出に適用され、したがって、サンプル中の生存能力のある微生物を検出するための方法として考えられ得る。特に、好ましい態様において、本発明の方法は、核酸ポリメラーゼ遺伝子およびその翻訳された活性タンパク質ポリメラーゼが生存能力のために必須である細菌または微生物を同定するために有用であり得る。しかしながら、(例えば、抗菌剤での処理により)最近生存不能にされた微生物、例えば、細菌は、酵素が分解されるまで、検出可能なポリメラーゼ活性を保持し得る。
a.キナーゼが、リガーゼを使用可能にするか、またはポリメラーゼを停止するために使用することができたPO4を付加する
b.リン酸は、PO4を除去し、ポリメラーゼを使用可能にするために使用することができる
c.DNA&RNAポリメラーゼは、下流の従来のPCRまたは等温増幅を可能にするように基質を伸長するために使用することができる
d.等温増幅は、エンドヌクレアーゼ酵素活性から逃れることができる
e.リボソーム
f.miRNAメカニズム
g.ジャイレース
h.ヘリカーゼ
i.エキソヌクレアーゼ、5’−3’、3’−5’、すなわちブロッキング基、例えば、PO4、TagManなどを除去するもの
j.エンドヌクレアーゼ
k.プロテアーゼ
l.DNase
m.RNase
n.UDGlycosolase
o.修復酵素
[ポリメラーゼシグナル − リガーゼシグナル(ポリメラーゼ+リガーゼ)=真のリガーゼシグナル]
3つの異なるDNA基質(A)を大腸菌リガーゼと共に、またはリガーゼを用いないでインキュベートし、UNGの存在/非存在下で全長のDNAリガーゼ基質に特異的なPCRプライマーを含むPCRに付した。PCRをSYBR グリーン(gPCR)を介してモニタリングし、得られた反応物をゲル分析に付した(B)。3つの異なるDNA基質(A)を大腸菌リガーゼと共に、またはリガーゼを用いないでインキュベートし、UNGの存在/非存在下でS1−伸長検出プライマーを含むPCRに付した。PCRを市販されているZeusProbe(qPCR)方法論(Zeus Scientific, Inc., Raritan, NJ)を介してモニタリングし、得られた反応物をゲル分析に付した(C)。ライゲーション不可能なDNA基質(S1/ASのみ)の量を徐々に減らして、市販されている3つの異なるDNAポリメラーゼとインキュベートし、Zeus−Probe gPCR分析に付した(D)。これらの実験の結果は、図1においてグラフで説明される。
複数の微生物が、量を徐々に減らしつつ、ビーズミル溶解され、37℃で30分間、DNAポリメラーゼバッファーおよびdNTPの存在下でDNA基質(S1/ASのみ)とインキュベートされた(A)。次に、溶解物をS1−伸長に特異的なプライマーを含むZeus−Probe qPCRに付した。該結果は、図2においてグラフで説明される。
ライゲート不可能でポリメラーゼに好都合な基質が、微生物添加血液培養物由来の粗細胞溶解物に感受性であり、特異的であることを見出した:
微生物の量を徐々に減らして、10mlの血液培養液中に加えた。次に、微生物を回収し、ビーズミル溶解に付し、37℃で30分間、DNAポリメラーゼバッファーおよびdNTPの存在下でDNA基質(S1/ASのみ)とインキュベートした(A)。次に、溶解物をS1−伸長特異的プライマーを含むZeus−Probe qPCRに付した。該結果は、図3においてグラフで説明される。
(a)DNAポリメラーゼ由来の干渉シグナルを許容しないがサンプル中で酵素活性に対する基質として作用する核酸分子とサンプルとを接触させること;
(b)このように接触されたサンプルを酵素活性に適した条件下でインキュベートすること;および
(c)基質核酸分子に対する選択された酵素または混合物の作用から生じる酵素修飾核酸分子の存在および/または量を決定し、微生物の存在を示すこと
を含む方法、ならびにその方法に基づく組成物およびキットを提供する。
(a)5’−3’DNAポリメラーゼ活性
(b)3’−5’エキソヌクレアーゼ活性
(c)5’−3’エキソヌクレアーゼ活性
(d)固有のエステラーゼ活性
を有することに注目した。
1.ポリメラーゼのいかなる活性をも阻害する修飾ヌクレオチド
2.最初の塩基付加でポリメラーゼを停止し、その活性を封鎖する−中和するが、リガーゼがdATPを使用して生産反応を享有する、ジデオキシヌクレオチドddCTP、ddGTP
3.ASオリゴの伸長を妨げるジデオキシオリゴヌクレオチド
4.DNA基質における活性をブロックするように組み込まれるポリメラーゼ阻害修飾塩基を有するS1オリゴ
5.DNAポリメラーゼの活性を阻害するDNAポリメラーゼ特異的抗体−これらは、PCRの分野でよく知られている
6.アプタマーオリゴ阻害性複合体
7.当分野で知られている真の「ホットスタート(Hot Start)」と組み合わせられた5’側のASを短縮することにより、ポリメラーゼ伸長基質を下流の増幅、例えば、PCRにおいて検出されるものから除外するDNA基質ハイブリダイゼーション戦略
8.ポリメラーゼを3’側のASの短縮により結合および伸長から除去するが、リガーゼに影響しないDNA基質ハイブリダイゼーション戦略
9.リガーゼに有利なようにバランスされたポリメラーゼ伸長の長さと組み合わせられた相対速度動力学
10.Per−PCR S1 3’−ジデオキシ競合(全長、または、ASの3’に相補的である13mer)
11.Pre−PCR S1 3’リン酸競合
12.最適UNG(標準UNG酵素)条件を使用するASの完全除去
13.熱安定性のUNG(NEB)を使用するASの完全除去。UNGの加熱処理により、夾雑リガーゼ/ポリメラーゼの除去を可能にし、PCR mmがdTTPを有するべきであること
14.PCR前に、UNG/Rnase共処理を可能にするために、デオキシウリジン(UNG除去)および残りのRNA塩基を有するASを作製すること
15.ジデオキシ3’ASを得るための必要性
16.より高い温度(すなわち65℃)でのTaqドッキングを減少させるためのASの3’末端の短縮
17.ライゲーション/伸長工程中に固体支持体に共有的に結合されるAS
18.3’−ジデオキシS2リバース補体(全長、またはおそらく、S1 Pol伸長に相補的であるちょうど13mer)
19.背景減少のために−当分野でよく知られている「ホットスタート」戦略−望ましくないオリゴまたは伸長オリゴハイブリダイゼーションの100%除去
b.非酵素ホットスタート、例えば、2mMのMgCl(.1mMのEDTA保護)、プライマー、dNTPまたは他の重要な成分に投入
c.Chem−プライマー ホットスタート
(付記1)
サンプル中の微生物の存在の指標として、ポリメラーゼ活性を検出するための方法であって、
(a)サンプルを、サンプル中でポリメラーゼ活性に対する基質として作用する核酸分子と接触させること;
(b)このように接触されたサンプルをポリメラーゼ活性に適当な条件下でインキュベートすること;および
(c)基質核酸分子に対する微生物ポリメラーゼの作用から生じる核酸分子の存在(および/または量)を特異的に決定し、それにより、微生物の存在を示すこと
を含む方法。
(付記2)
ポリメラーゼが、DNAまたはRNAポリメラーゼのいずれかである、付記1に記載の方法。
(付記3)
検出される微生物が、サンプル中の生存微生物である、付記1に記載の方法。
(付記4)
検出される微生物が、サンプル中の無傷な微生物である、付記1に記載の方法。
(付記5)
検出される無傷な微生物が、核酸ポリメラーゼ遺伝子およびその翻訳された活性タンパク質ポリメラーゼが、該微生物の生存能力に必須であるものである、付記4に記載の方法。
(付記6)
ポリメラーゼ基質が固定されている、付記1に記載の方法。
(付記7)
微生物が検出されるサンプルが、正常滅菌体液である、付記1に記載の方法。
(付記8)
サンプルを差示的な細胞溶解サンプル調製方法を使用して調製し、それにより、生存能力のある微生物由来のポリメラーゼ活性のみがポリメラーゼ特異的基質を修飾することができる、付記1に記載の方法。
(付記9)
微生物が検出されるサンプルが、粗細胞溶解物または精製細胞画分から調製される、付記1に記載の方法。
(付記10)
完全または部分的微生物ゲノムおよび/またはトランスクリプトーム配列分析を行うことをさらに含む、付記9に記載の方法。
(付記11)
完全または部分的微生物ゲノムおよび/またはトランスクリプトーム配列分析が、単一のサンプル調製を使用して、同時に、一斉に、または並行して行うことができる、付記10に記載の方法。
(付記12)
微生物の完全または部分的微生物ゲノムおよび/またはトランスクリプトーム配列分析が、患者の管理において有用な抗−微生物および/または抗−ポリメラーゼ活性を有する薬剤の診断測定および検出のための方法をさらに含む、付記10に記載の方法。
(付記13)
微生物の非存在または存在に関して、正常滅菌体液をスクリーニングし、診断、予後患者管理情報を提供するための、付記1から12のいずれかに記載の方法において有用な試薬を含むアッセイキット。
(付記14)
サンプル中の微生物の存在の指標として、NAD−依存性リガーゼまたはホスファターゼからなる群から選択される酵素またはそれらの混合物を検出するための方法であって、
(a)サンプルを、サンプル中で選択される酵素または混合物の酵素活性に対する基質として作用するが、DNAポリメラーゼ由来のシグナルを干渉できない核酸分子と接触させること;
(b)このように接触されたサンプルを酵素活性に適当な条件下でインキュベートすること;および
(c)基質核酸分子に対する選択される酵素または混合物の作用から生じる酵素修飾核酸分子の存在(および/または量)を特異的に決定し、それにより、微生物の存在を示すこと
を含む方法。
(付記15)
微生物が、選択される酵素または混合物を発現する(または発現している)微生物である、付記14に記載の方法。
(付記16)
サンプルが差示的な細胞溶解サンプル調製方法を使用して調製され、それにより、生存能力のある微生物由来のリガーゼおよび/またはホスファターゼ活性のみがリガーゼ特異的基質を修飾することができる、付記14または付記15に記載の方法。
(付記17)
サンプル中の微生物の存在の指標として、NAD−依存性リガーゼまたはホスファターゼからなる群から選択される酵素またはそれらの混合物を検出するためのアッセイを行うことができるアッセイキットであって、
(a)DNAポリメラーゼ由来のシグナルを干渉できない、サンプル中で選択される酵素または混合物の活性に対する核酸分子を含む基質;
(b)酵素活性に適当な条件下で該サンプルおよび基質をインキュベートするためのインキュベート手段;および
(c)微生物の存在を示すものとして、基質核酸分子に対する選択される酵素または混合物の作用から生じる核酸分子の存在(および/または量)を特異的に決定するための手段
を含むキット。
Claims (13)
- サンプル中の微生物の存在または不存在を検出する方法であって、該サンプル中の前記微生物の存在の指標として、DNAポリメラーゼ活性が検出され、該方法は、
(a)サンプルを、サンプル中のDNAポリメラーゼ活性に対するDNA鋳型として作用する第1のオリゴヌクレオチド分子と接触させること;
(b)このように接触されたサンプルをDNAポリメラーゼ活性に適した条件下でインキュベートすること;および
(c)微生物ポリメラーゼの前記DNA鋳型への作用によって生じる第2のオリゴヌクレオチド分子の存在および/または量を前記第2のオリゴヌクレオチド分子の核酸増幅によって特異的に決定し、それにより、微生物の存在を示すことを含む方法。 - 検出される微生物が、サンプル中の生存微生物である、請求項1に記載の方法。
- 検出される微生物が、サンプル中の無傷な微生物である、請求項1に記載の方法。
- 検出される無傷な微生物が、核酸ポリメラーゼ遺伝子およびその翻訳された活性タンパク質ポリメラーゼを該微生物の生存能力に必須とするものである、請求項3に記載の方法。
- ポリメラーゼ鋳型が固定されている、請求項1に記載の方法。
- 微生物が検出されるサンプルが、正常であれば滅菌されている体液である、請求項1に記載の方法。
- サンプルを差示的な細胞溶解サンプル調製方法を使用して調製し、それにより、生存能力のある微生物由来のポリメラーゼ活性のみがポリメラーゼ特異的オリゴヌクレオチドを修飾することができる、請求項1に記載の方法。
- 微生物が検出されるサンプルが、粗細胞溶解物または精製細胞画分から調製される、請求項1に記載の方法。
- 完全または部分的微生物ゲノムおよび/またはトランスクリプトーム配列分析を行うことをさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 完全または部分的微生物ゲノムおよび/またはトランスクリプトーム配列分析が、単一のサンプル調製を使用して、同時に、一斉に、または並行して行うことができる、請求項9に記載の方法。
- 微生物の完全または部分的微生物ゲノムおよび/またはトランスクリプトーム配列分析が、抗−微生物および/または抗−ポリメラーゼ活性を有する薬剤の評価および検出のための方法をさらに含む、請求項9に記載の方法。
- 前記サンプルが、血液又は血液培養サンプルを含む、請求項1ないし請求項11のいずれかに記載の方法。
- サンプル中の微生物の存在の指標としてDNAポリメラーゼ活性を検出する方法に使用するアッセイキットであって、
(a)センスオリゴヌクレオチドストランドとアンチセンスオリゴヌクレオチドストランドとからなるライゲート不可能なオリゴヌクレオチドであって、前記センスオリゴヌクレオチドストランドとアンチセンスオリゴヌクレオチドストランドとは、重なり合って二重鎖領域を形成し、アンチセンスストランドの単一鎖部分は、プライマーとして作用する二重鎖領域のセンスストランドに対してDNA鋳型として作用することで、DNAポリメラーゼ活性の存在下で伸長生成物を生成する、オリゴヌクレオチド、
(b)DNAポリメラーゼ活性の存在下で生成された前記伸長生成物と特異的にハイブリダイズする別個のリバースプライマー、及び、
(c)前記リバースプライマーからの増幅生成物と特異的にハイブリダイズする別個のフォワードプライマー
を含む、アッセイキット。
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